專利名稱：細(xì)胞和組織的破碎的制作方法
背景RNA表達(dá)可用作體外診斷測試的基礎(chǔ)，其在疾病的篩選、診斷、預(yù)后、治療監(jiān)測和/或復(fù)發(fā)的隨訪中發(fā)揮作用。從細(xì)胞或組織提取完整的未降解的RNA對于RNA表達(dá)的有效檢測是很重要的。RNA表達(dá)在涉及大量基因的微陣列和PCR測試中尤為有用。
在大多數(shù)RNA提取法中，通過機械方式從細(xì)胞釋放RNA。這經(jīng)常是在存在例如胍鹽的RNA穩(wěn)定劑時進行的。這可在處理過程中使RNA受到的釋放自細(xì)胞或組織的RNA酶的降解作用最小化。用于機械破碎生物學(xué)樣品的裝置在下列例證性的美國專利中有公開Spelsberg的4,307,846；Rogalsy的5,197,483；Collis的5,840,878；DeStefano的5,829,696；Gautsch的6,235,501；以及Zoblinsky的5,567,050。在這種裝置中，使用元件進行碾磨、粉碎，或另外接觸含有待提取的細(xì)胞成份的樣品。在本說明書的全文中，該元件被稱為破碎元件。最通常地該裝置使用的元件是珠子或球，例如玻璃珠。
有持續(xù)的需要改進細(xì)胞和組織的破碎方法，以便使RNA提取變得更快速、更有效、更多產(chǎn)，以及服從于自動化操作。這在內(nèi)部可操作測試的情況中尤其需要。
發(fā)明概述本發(fā)明是破碎細(xì)胞和組織的方法。優(yōu)選地，該方法包括使用機械裝置并進行45秒或更短。
本發(fā)明的另一個方面是從細(xì)胞或組織樣品提取RNA的方法。優(yōu)選地，該樣品是淋巴結(jié)組織。在該方法中，細(xì)胞和/或組織是機械破碎的，優(yōu)選在45秒或更短時間內(nèi)。然后從受到破碎的樣品除去細(xì)胞碎片和例如氣泡的其它非RNA的物質(zhì)。再從樣品提取RNA。
在本發(fā)明的另一個方面，用于破碎細(xì)胞和組織的裝置包括其中可放置破碎元件的容器部分。破碎儀外部表面的空間(在珠子的情況中為圓周)剛好略小于容器部分的內(nèi)部尺寸(在試管的情況中為直徑)。
發(fā)明詳述在本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案中，使用機械的細(xì)胞和組織破碎儀，例如購自Qbiogene，Inc.of Carlsbad，CA的“FASTPREP”設(shè)備。這種破碎儀在美國專利5,567,050中有描述，其在此引入作為參考。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法使用包含“O-環(huán)”的2.0ml有螺旋帽的冷凍小瓶試管或其等同物。將大約30mg-400mg的組織和破碎元件一起放置到試管中。最優(yōu)選地，破碎元件是例如，可從Bartelesville，OK的BioSpec Products獲得的直徑為6.35mm的鋼珠。添加大約試管的一半或更多體積的勻漿緩沖液(例如，Qiagen公司的RLT緩沖液)到試管中。優(yōu)選地，當(dāng)使用2.0ml的試管時加入大約1ml的這種緩沖液。勻漿緩沖液含有RLT穩(wěn)定劑，優(yōu)選為胍鹽。然后破碎進行45秒或更短時間，離心樣品，優(yōu)選是在微量離心機中，以從樣品除去細(xì)胞碎片和氣泡。然后丟棄上清液。優(yōu)選地，將上清液轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)柱中，并用不同的洗滌緩沖液處理柱子，以純化RNA。如果需要，也可使用基于溶劑的RNA純化法來替代旋轉(zhuǎn)柱。
本發(fā)明的裝置是如上所述的破碎儀，但是提供的破碎元件的尺寸和/或組成可快速而有效地破碎組織，這種方式在以前是不可能的。如上所述，破碎元件是與組織接觸的裝置的一部分。優(yōu)選為珠子。本發(fā)明破碎元件的外部尺寸剛好略小于其中可處理樣品的容器的內(nèi)部尺寸。在優(yōu)選的實施方案中，容器是例如上述的試管，其內(nèi)部直徑為8.28mm，而破碎元件是6.35mm的鋼珠。也可使用其它的容器和破碎元件，只要它們具有相似比例關(guān)系的內(nèi)部和外部尺寸。珠子的密度也可促進改善發(fā)明裝置的性能。優(yōu)選地，珠子是由密度為8.03g/cm3或以上的不銹鋼制成的，而密度為7.0以上的珠子也是可以使用的。
實施例實施例1.不同珠子大小和組成的評估對于不同的珠子大小和材料評估其破碎冷凍的豬淋巴結(jié)組織的能力。使用具有8.28mm內(nèi)部直徑的2ml螺旋帽試管(BioSpec Products，Bartlesville，OK)。每個試管用珠子填充至半滿，含有6.35mm(0.25英寸)不銹鋼珠的試管除外，在此情況中每個試管加入單個的珠子。每個試管加入200-250mg的冷凍的、研磨成粉的豬淋巴結(jié)組織。用緩沖液RLT(Qiagen，Inc，Valencia CA)填滿試管，并且通過從BioSpect Products獲得的Mini-Bead Beater 8設(shè)備勻漿1、3或5分鐘。
從Biospec Products購買下列大小和組成的珠子0.1mm直徑的氧化鋯/氧化硅珠(cat 11107901z)、0.1mm直徑的玻璃珠(cat 11079101z)、0.5mm直徑的玻璃珠(cat 1107905)、0.5mm直徑的氧化鋯/氧化硅珠(cat 11079105z)、1.0mm直徑的玻璃珠(cat 11079110)、2.5mm直徑的氧化鋯/氧化硅珠(cat 11079125z)、6.35mm直徑的不銹鋼珠(cat 11079635ss)和6.35mm直徑的玻璃珠(110796325)。
這些研究的結(jié)果顯示在下列的表1中，并且表明最佳的組織破碎是用多個6.35mm直徑的玻璃珠或單個6.35mm直徑的不銹鋼珠，其用下列尺度目測確定(1)較差勻漿的組織，(2)部分勻漿的組織，以及(3)完全勻漿的組織。
表1.評估不同珠子大小和組成對淋巴結(jié)組織的勻漿作用*
*如上文所述目測確定組織破碎。
實施例2.珠子密度的影響實施例1說明利用直徑為6.35mm的破碎元件(珠子)可最佳實現(xiàn)完全的組織勻漿化作用。珠子的密度也影響勻漿作用的質(zhì)量。
在具有相等直徑(6.35mm)但不同密度的珠子之間進行比較。在含有1ml基于胍鹽，加入一個6.35mm的陶瓷珠、玻璃珠或不銹鋼珠的裂解緩沖液(Qiagen緩沖液RLT)的2ml螺旋帽小管中破碎大約225mg的豬淋巴結(jié)。在Biospec BeadBeater 8中處理包含珠子的組織樣品1分鐘、3分鐘和5分鐘。短暫離心樣品，并如實施例1中目測評估勻漿作用的質(zhì)量。
表2.各種密度的6.35mm珠子對豬淋巴結(jié)勻漿作用的性能
表2總結(jié)了利用下列尺度目測評分的3組重復(fù)實驗的平均結(jié)果(1)較差勻漿的組織，(2)部分勻漿的組織，以及(3)完全勻漿的組織。該實驗表明當(dāng)珠子材料的密度增加時，組織的破碎也提高，使用不銹鋼珠可獲得最佳的性能。
實施例4.使用BeadBeater設(shè)備和玻璃珠或不銹鋼珠的RNA產(chǎn)率和純度用6.35mm或更大的若干直徑的玻璃珠或不銹鋼珠確定RNA產(chǎn)率和純度。使用高速的Mini-Bead Beater 8進行1分鐘。條件如同先前在實施例1中所描述的。從Biospec Products獲得6.35mm的不銹鋼珠和玻璃珠。所有其它的珠子從Glen Mills Inc.Clifton，NJ購買。
組織破碎后，通過Eppendorf型號5415(Brinkman Instruments，Westbury NY)將所得到的勻漿物離心15秒，通過QIAGEN RNeasy Mini試劑盒(Qiagen Inc，Valencia CA)純化RNA。將一部分裂解物稀釋到濃度為30mg組織/ml的RLT緩沖液。將400微升的裂解物加入到含有400ul 70％乙醇的微量離心試管中，通過吹吸混合樣品。將樣品(700ul)施加到置于真空歧管中的RNeasy Mini柱上。施用真空并且在剩余的過濾步驟期間保持真空。用700ul的RWI緩沖液，然后是700ul的RPE緩沖液洗滌柱子。然后將旋轉(zhuǎn)柱放置到1.5ml的收集試管中，并以14,000RPM離心30秒以干燥柱子。將柱子轉(zhuǎn)移到新的1.5ml收集試管中。直接向膜上施加50微升無RNA酶的水，并將含有柱子的試管以14,000RPM離心30秒以洗脫RNA。將RNA樣品置于冰上，并在測試前于-80℃保存。
根據(jù)在Gene Spec III設(shè)備(MiraiBio，Alameda CA)上所確定的樣品的260/280nm分光光度比率來測量RNA的產(chǎn)率。Agilent 2100生物分析儀和AgilentRNA 6000 Nano Assay Regents和Supplies(Agilent Technologies，F(xiàn)oster City，CA)也用于確定RNA的產(chǎn)率和質(zhì)量。
結(jié)果總結(jié)在表3中，并且證明直徑為6.35mm的不銹鋼珠提供最高的RNA產(chǎn)率，并且如通過目測檢驗試管所確定的，其提供最佳的組織勻漿作用。此外，不銹鋼珠與相同直徑的玻璃珠相比，顯示顯著提高了產(chǎn)率。Agilent生物分析儀電泳圖譜證實，用快速的勻漿方法可獲得高質(zhì)量的RNA。在通過基于珠子的快速方法破碎的樣品中顯示出清楚界定的18s和28s核糖體峰，并且所有的樣品都具有大于1.5的18s與28s比率。
表3.使用不同大小和組成的RNA產(chǎn)率*
*根據(jù)下列尺度目測組織破碎1-沒有勻漿，2-較差勻漿，3-部分勻漿(幾乎沒有殘留組織碎片)，4-可觀察到細(xì)胞碎片，以及5-完全勻漿。
實施例3.在FastPrep設(shè)備中的組織破碎進行下列試驗以確定當(dāng)在FastPrep勻漿儀(Qbiogene，Inc，Carlsbad CA)中破碎時，重量在50和500mg之間的豬淋巴結(jié)樣品的RNA產(chǎn)率的精確度。用包含單個的6.35mm不銹鋼珠的2ml Sarstedt螺旋帽小管進行這些試驗。
在這些試驗中，將如表4中所示的不同重量的冷凍且研磨成粉的豬淋巴結(jié)組織加入每個試管包含一個6.35mm不銹鋼珠的2ml Sarstedt螺旋帽小管中。加入1ml的RLT緩沖液到試管中，并在FastPrep設(shè)備中以6.5米/秒的速度處理試管45秒。(為了進行該實驗，通過從輻條板移出墊圈，以使得該較大的試管尺寸能夠被容納而改進了FastPrep設(shè)備)。破碎后，然后將試管在Eppendorf型號5415C(Brinkman Instruments，Westbury，NY)中以14,000xg離心15秒，以從樣品沉淀細(xì)胞碎片并除去氣泡。將每個裂解物的一部分稀釋到濃度為30mg的組織/ml的RLT緩沖液，并通過吹吸而充分混合。處理該組織以提取RNA，并在實施例3中定量RNA。
表4.淋巴結(jié)重量對RNA產(chǎn)率和精確度的影響
這些研究結(jié)果證明，在少于400mg組織的樣品中總RNA的回收超過20ug。在400-500mg的豬淋巴結(jié)樣品中觀察到回收的總RNA略少。表明在這些實驗條件下組織破碎效果略差。
含有較低重量組織樣品的試管具有最高的不精確性。然而，在后繼的實驗中，我們已經(jīng)表明較低的淋巴結(jié)組織重量中的較高標(biāo)準(zhǔn)差可能是由于組織異質(zhì)性和取樣，因為當(dāng)將較大的組織研磨成粉，然后使用較小組織重量進行勻漿時，組織回收的精確度顯著提高。
實施例5.豬B-肌動蛋白基因表達(dá)的實時PCR檢測進行下列試驗來證明將在Fast Prep方法中快速勻漿后回收的RNA可在實時PCR測試中進行擴增。使用從實施例4純化的RNA。為了進行比較，引入對照，其中包括通過Omni組織勻漿器機械破碎的豬淋巴結(jié)組織和可任意處理的PCR探針(Omni International，Warrenton，VA)。Omni組織勻漿器不使用珠子來增強組織破碎。為了在Omni組織勻漿器中進行處理，將100-400mg的豬淋巴結(jié)組織與6ml的RLT緩沖液混合，并且用手動勻漿器(型號PCR258)勻漿1分鐘。將樣品與等體積的70％乙醇混合，取700ul施加于Qiagen旋轉(zhuǎn)柱，并且如實施例3中所描述的純化RNA。
如下轉(zhuǎn)錄RNA以制備cDNA拷貝將1μg的RNA加入主要混合物，該混合物是通過混合1.25μl的錨定Oligo dT23的75μM原液、0.31μl的10mM每種dNTP，和RNA酶處理的水(Sigma Chemical Co，St.Louis，Mo.)至體積為13μl而制備的，將溶液加熱到70℃ 5分鐘，然后置于冰上。再加入9.5μl的混合物，該混合物包括5μl的5×Superscript第一鏈緩沖液，2.5μl的0.1M二硫蘇糖醇，0.75μl的40U/μl Rnasin溶液(Promega Corp，Madison WI)，和1.25μl的200U/μlSuperscript II逆轉(zhuǎn)錄酶，將試管在42℃孵育50分鐘。加入5μl的5.0M NaOH到試管，試管在70℃孵育5分鐘，然后加入Tris-HCl緩沖液，(2.5μl，1M，pH7.0)，再加入67.4μl無RNA酶的水。假定RNA完全轉(zhuǎn)化為cDNA，并且轉(zhuǎn)化系數(shù)為1μg等于50,000個細(xì)胞等價物(CE)，對于所有隨后的實時PCR測試，使用濃度為在25mM Tris緩沖液中的500CE/μl。
由Invitrogen公司(Carlsbad，CA)合成豬B-肌動蛋白引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，而B-肌動蛋白Taqman探針(SEQ ID NO.3)來自SYNTHEGEN，LLC(Houston，TX)。對于所有的Taqman探針，使用羧基熒光素(FAM)和羧基四甲基羅丹明TAMRA)作為染料和淬滅劑對。
SEQ ID NO.1 CCACACGGTG CCCATCTACGSEQ ID NO.2 AGGATCTTCA TGAGGTAGTC GGTCAGSEQ ID NO.3 6-FAM-ACGCCCTGCC CCACGCCATC CTGCGTCTGG-TAMRA對于Taqman測試，通過加入25μl的2×Taqman Universial PCR混合物(Applied Biosystems，Inc)，1.25μl的10μM探針原液，和5μl的0.5μM每種引物的溶液來制備主要混合物。將cDNA(2μl)加入到每個光反應(yīng)微滴定平板的孔中。用光學(xué)蓋子蓋上后，將平板在ABI Prism 7900 HT序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)中處理。根據(jù)由制造商推薦的方案進行測試。通過Taqman測試的3個測定值的平均值如表5中所示。
這些結(jié)果總結(jié)在表5中，證明用本發(fā)明的方法可獲得與Omni勻漿器相當(dāng)?shù)腞NA產(chǎn)率。本發(fā)明的方法在可同時處理多個樣品時是有利的。此外，由于使用密封的試管，可最小化樣品與樣品之間的污染。
表5.經(jīng)Omni勻漿器和Fast Prep設(shè)備勻漿的RNA的Taqman測試
序列表<110>Veridex，LLCVeridex，LLCBelly，RobertHays，Dustin<120>細(xì)胞和組織的破碎<130>VDX-5001 USNP<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工的序列是引物<400>1ccacacggtg cccatctacg 20<210>2<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工的序列是引物<400>2aggatcttca tgaggtagtc ggtcag26<210>3<211>30<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工的序列是引物<400>3acgccctgcc ccacgccatc ctgcgtctgg30
權(quán)利要求
1.一種裝置，包括細(xì)胞或組織破碎儀，該破碎儀具有與樣品容器結(jié)合使用的破碎元件，其中所述破碎元件的外部尺寸略小于該容器的內(nèi)部尺寸。
2.權(quán)利要求1的裝置，其中破碎元件的外部尺寸是所述容器內(nèi)部尺寸的0.3倍以上。
3.權(quán)利要求1的裝置，其中破碎元件的外部尺寸是所述容器內(nèi)部尺寸的0.75倍以上。
4.權(quán)利要求1的裝置，其中破碎元件包括密度超過7.0的致密材料。
5.權(quán)利要求4的裝置，其中破碎元件包括鋼或密度等于或大于8.0的材料。
6.權(quán)利要求1的裝置，其中破碎元件是直徑為大約6mm的不銹鋼球，而所述容器是內(nèi)部直徑為大約8mm的試管。
7.用于破碎細(xì)胞或組織的方法，包括將含有細(xì)胞或組織的樣品放置到容器中，向所述容器加入核酸穩(wěn)定溶液，將破碎元件放置到所述的容器中，以及使用破碎裝置45秒或更短。
8.權(quán)利要求7的方法，其中受到破碎裝置作用的樣品是淋巴結(jié)樣品，丟棄從其得到的上清液并從其提取出核酸。
9.從組織或細(xì)胞樣品提取核酸的方法，包括將含有細(xì)胞或組織的樣品放置到容器中，向所述容器加入核酸穩(wěn)定溶液，將破碎元件放置到所述的容器中，使用破碎裝置45秒或更短，移出受到破碎裝置作用的樣品，以及從其提取出核酸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中破碎元件的外部尺寸略小于容器的內(nèi)部尺寸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中破碎元件的外部尺寸是所述容器內(nèi)部尺寸的0.3倍以上。
12.權(quán)利要求10的方法，其中破碎元件的外部尺寸是所述容器內(nèi)部尺寸的0.75倍以上。
13.權(quán)利要求10的方法，其中破碎元件包括致密材料。
14.權(quán)利要求10的方法，其中破碎元件包括鋼或密度等于或大于鋼密度的材料。
15.權(quán)利要求10的方法，其中破碎元件是直徑為大約6mm的不銹鋼球，而所述容器是內(nèi)部直徑為大約8mm的試管。
16.內(nèi)部操作進行的權(quán)利要求10的方法。
17.權(quán)利要求16的方法，其中樣品是淋巴結(jié)組織。
全文摘要
用于破碎細(xì)胞和/或組織的方法，該方法使用帶有破碎元件的破碎儀，該破碎元件的外部尺寸略小于放置待破碎樣品的容器的內(nèi)部尺寸。也提供用于破碎細(xì)胞和/或組織的裝置?？稍诶绾怂崽崛〉倪^程中使用該裝置和方法。
文檔編號C12N15/00GK1673354SQ20051005421
公開日2005年9月28日 申請日期2005年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月18日
發(fā)明者R·貝利, D·海斯 申請人:維里德克斯有限責(zé)任公司