專利名稱：生物細(xì)胞和其它對象的動態(tài)化學(xué)成像的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般地，本發(fā)明涉及的領(lǐng)域是拉曼光譜學(xué)和生物細(xì)胞的顯微成像。一般地，本發(fā)明還涉及動態(tài)化學(xué)成像。
背景技術(shù)：
了解，特別是在分子尺度上了解，在生物細(xì)胞內(nèi)部以及生物細(xì)胞之間正在發(fā)生什么，使得人們可以知曉細(xì)胞的行為并以期望的方式影響它們的行為。例如，大多數(shù)藥物基于它們對細(xì)胞的影響而發(fā)揮它們的藥學(xué)作用。但是，一直以來都難以在生物化學(xué)相關(guān)尺度上了解藥物對單個細(xì)胞或一小群細(xì)胞的影響。相反，已經(jīng)觀察到藥物對組織或整個有機(jī)體的宏觀影響，并且需要大量實驗和有根據(jù)的推測來了解藥物的作用的生物化學(xué)基礎(chǔ)。一個重要需求在于更好地觀察細(xì)胞相互之間和細(xì)胞與化學(xué)品之間的相互作用以及發(fā)生于它們環(huán)境中的現(xiàn)象(例如溫度或流體剪切應(yīng)力)的方法。本發(fā)明通過在與了解單個細(xì)胞和它們的亞細(xì)胞組分的行為和特征相關(guān)的尺度上提供動態(tài)成像化學(xué)和生物系統(tǒng)的方法滿足了這種需求。
Jian Ling和同事已經(jīng)描述了用于從細(xì)胞獲得有限的拉曼光譜信息的顯微系統(tǒng)。參見例如Ling et al.，2002，Appl.Optics 41(28)6006-6017；U.S.臨時申請60/189123，2000年3月14日提交；U.S.非臨時申請09/804774；和U.S.非臨時申請10/750603。所述Applied Optics論文描述了據(jù)稱被用于獲得顯示乳腺癌細(xì)胞中的紫杉醇(paclitaxel)分布的圖像的單變量方法。所述方法包括合并細(xì)胞的光學(xué)圖像和由以下方法獲得的細(xì)胞圖像從1000cm-1處(據(jù)稱在該拉曼位移(RS)值下，紫杉醇顯示峰)并合拉曼散射的和熒光發(fā)射的輻射減去1080cm-1處(據(jù)稱在該拉曼位移(RS)值下，由紫杉醇導(dǎo)致的散射是可忽略的)并合拉曼散射的和熒光發(fā)射的輻射。
不清楚Ling等人的數(shù)據(jù)是否支持他們的觀點，即他們在乳腺癌細(xì)胞中觀察紫杉醇。例如，他們獲得了粉末形式的紫杉醇的拉曼光譜(在所述論文中的圖3，所述專利申請中的圖1)并證明1002cm-1處的散射遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1080cm-1處的散射。紫杉醇+乙醇+CREMAPHOR(RTM)+PBS的拉曼光譜(在所述論文中的圖4)據(jù)稱顯示混合物中保留了1002cm-1處的紫杉醇拉曼峰(但是移到1000cm-1)并且1080cm-1處有很少的或沒有紫杉醇的RS。所述圖顯示了1000cm-1處的小峰以及1080cm-1處的可能的寬峰或肩峰，但是圖中沒有數(shù)據(jù)用來確定紫杉醇對1080cm-1特征做了什么貢獻(xiàn)(如果有的話)。對于熒光發(fā)射，也未校正該圖。
即使假設(shè)Ling等人能夠在所述論文的圖4中識別溶液中紫杉醇，但是卻仍然不清楚當(dāng)紫杉醇與細(xì)胞或細(xì)胞的組分例如微管締合時紫杉醇的拉曼光譜是什么樣子。簡言之，并不清楚Ling等人在用紫杉醇處理的細(xì)胞中觀察的拉曼信號能夠?qū)嶋H與紫杉醇的存在進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
比較所述拉曼圖像(所述Ling論文的圖8中的中間柱狀圖)，什么東西被成像仍然是不清楚的，盡管清楚地顯示(第一行)所有被成像的東西中的至少一些在用紫杉醇處理所述細(xì)胞之前就存在。不能確定是否微管結(jié)合的紫杉醇將預(yù)期會如圖8的圖片中拉曼活性實體(entities)顯示的那樣結(jié)塊。除了有絲分裂期間之外，微管通?；旧蠌V泛分布于整個細(xì)胞中。
分析據(jù)稱由紫杉醇引起的拉曼散射的單變量方法，即使它在據(jù)稱存在于Ling等人研究的混合物中的情形下(即，據(jù)稱對應(yīng)于紫杉醇的單拉曼強(qiáng)峰和特定的消卷積方案)是正確的，它也可能被限于在他們的實驗系統(tǒng)中的特定條件下使用。這樣的單變量分析不太可能廣泛應(yīng)用。例如，它對于用于分析比Ling等人描述的系統(tǒng)據(jù)稱顯示的拉曼光譜顯示更復(fù)雜拉曼光譜的系統(tǒng)就是不合適的方法。
Ling等人使用的光學(xué)系統(tǒng)的另一個缺點是它使用旋轉(zhuǎn)介電帶通濾光器(rotating dielectric bandpass filter)系統(tǒng)來選擇用于分析的拉曼位移值。這種系統(tǒng)需要物理旋轉(zhuǎn)以分析不同的拉曼位移值，使得不能快速分析多個拉曼位移值。此外，系統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)使圖像移位，需要重新排列拉曼和光學(xué)圖像。
Sharonov等人(1994，Analytica Chimica Acta 29040-47)描述了一種細(xì)胞成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于來自細(xì)胞和/或細(xì)胞環(huán)境中的化合物的熒光發(fā)射的評估?；跓晒鈾z測的成像系統(tǒng)的一個重要缺點是此類系統(tǒng)展示出相當(dāng)?shù)偷墓庾V分辨率，這是由于大部分(即使不是全部)熒光發(fā)射的寬譜寬。另一個缺點是所關(guān)注的很多分子和細(xì)胞組分并不發(fā)射熒光。除非被標(biāo)記(一種可以改變所述分子或組分的行為和特征的方法)，否則此類分子和組分不能被熒光成像。此外，活和死細(xì)胞通常顯示出強(qiáng)烈的熒光背景發(fā)射，而這種背景發(fā)射可能妨礙所關(guān)注目標(biāo)的熒光觀察。因為大部分熒光發(fā)射對于發(fā)射輻射的分子物質(zhì)并不是特異的，所以此類背景可能使得對熒光的有意義的解讀復(fù)雜化或不能解讀。
美國專利5784162公開了在含有細(xì)胞或組織的環(huán)境中三維定量檢測組分的方法。該專利公開了光譜成像方法。所述方法包括合并光譜和成像數(shù)據(jù)。在熒光顯微術(shù)的上下文中描述了光譜分離技術(shù)。所述系統(tǒng)包括使用具有用于調(diào)制光學(xué)干涉的物理可旋轉(zhuǎn)元件的光路。所述系統(tǒng)使用靜態(tài)檢測器，所述靜態(tài)檢測器被宣稱為顯示與樣品被成像區(qū)域的一一對應(yīng)。該專利描述了光譜成像，而不是化學(xué)成像。光譜成像分辨率低并且不能以光譜方式分辨單個分子物質(zhì)。在該專利中描述的這種技術(shù)適于分析大信號，例如熒光發(fā)射，但是不適于分析弱信號，例如拉曼散射的輻射。
美國專利6070583公開了二維和三維熒光和拉曼成像方法。所述方法基于時間分辨在圍繞被照射點的多個檢測點評估的非彈性散射的輻射以確定散射體與每一個檢測點的距離。從這些數(shù)據(jù)可以構(gòu)建被照射的系統(tǒng)的二維和三維圖像。該專利公開了散射的光的拉曼光譜特征可以用于表征散射體的化學(xué)身份。該專利沒有公開所述方法是否可以用于檢測小于組織損傷的散射體。此外，該專利沒有公開將空間分辨數(shù)據(jù)與光學(xué)成像數(shù)據(jù)合并，因為該專利涉及宏觀組織的平面斷層分析。
化學(xué)成像是本領(lǐng)域已知的。用于化學(xué)成像的儀器的一個例子教導(dǎo)于授予Treado等人的美國專利6002476中，名稱為“ChemicalImaging System”。美國專利6002476尤其教導(dǎo)了使用拉曼化學(xué)成像以分析靜態(tài)樣品，例如評估特定的組織樣品是否對應(yīng)于正常組織或乳腺癌組織。在本領(lǐng)域中存在用于評估靜態(tài)樣品的其它化學(xué)成像系統(tǒng)。
與現(xiàn)有技術(shù)相反，本發(fā)明使用化學(xué)成像來評估并觀察非靜態(tài)樣品(即隨時間發(fā)生變化的樣品)。本發(fā)明尤其是可以用于檢測在觀察周期期間樣品中發(fā)生的動態(tài)變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞成像方法。所述方法包括用基本單色的光照射細(xì)胞的至少一部分并在多個離散時間評估從被照射部分散射的拉曼位移光。可以在各個離散時間在多個拉曼位移(RS)值評估拉曼位移光，并且在各個離散時間可以選擇RS值以表征第一預(yù)選組分(例如藥物)。接下來可以是表征第二預(yù)選組分的RS值，所述第二預(yù)選組分例如是藥物的代謝產(chǎn)物或已知在細(xì)胞用化合物處理之前和之后顯示不同的拉曼光譜的細(xì)胞成分(cellular constituent)。
本發(fā)明還涉及可以用于實施本文所描述的方法的系統(tǒng)和方法，而與被成像的樣品是否含有細(xì)胞(活的，休眠的或死的細(xì)胞)無關(guān)。所述系統(tǒng)和方法使用樣品的一系列的至少第一和第二順序化學(xué)圖像，可用于檢測在第一時間間隔和第二時間間隔之間在樣品中發(fā)生的動態(tài)變化，其中第一化學(xué)圖像對應(yīng)于在第一時間間隔期間樣品的圖像而第二化學(xué)圖像對應(yīng)于在第一時間間隔之后樣品在第二時間間隔的圖像。
在第一時間間隔期間(i)用多個光子照射樣品并且光子被樣品散射或發(fā)射；(ii)使用檢測元件的二維陣列同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在第一預(yù)定波段(wavelength band)散射的或發(fā)射的光子；和(iii)此后檢測元件的二維陣列被額外使用一次或多次同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在一個或更多預(yù)定波段(其可以與第一波段相同或不同)散射的或發(fā)射的光子。然后，合并在第一時間間隔期間檢測元件的二維陣列的輸出以產(chǎn)生樣品的第一化學(xué)圖像。
在第二時間間隔期間(i)用多個光子照射樣品并且光子被樣品散射或發(fā)射；(ii)使用檢測元件的二維陣列同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在第一預(yù)定波段散射的或發(fā)射的光子；和(iii)此后檢測元件的二維陣列被額外使用一次或多次同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在一個或更多其它預(yù)定波段散射的或發(fā)射的光子。然后，合并在第二時間間隔期間檢測元件的二維陣列的輸出以產(chǎn)生樣品的第二化學(xué)圖像。
基于第一和第二化學(xué)圖像之間的一個或多個差異，檢測第一時間間隔和第二時間間隔之間樣品中發(fā)生的動態(tài)變化。
本發(fā)明使得可以以全空間信息快速觀察樣品，并且允許監(jiān)控樣品中自然進(jìn)行或發(fā)生的(即在平衡條件下)進(jìn)展和變化以及通過外界方式(例如施加到樣品的一種或多種外部場或力)產(chǎn)生非平衡條件而額外強(qiáng)制或強(qiáng)加的那些。在某些實施方案中，所述外界方式可以施加到樣品內(nèi)的特定位置(而不是整個樣品)。


圖1示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的儀器。
圖2示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明另一個實施方案的儀器。
具體實施例方式
化學(xué)系統(tǒng)的拉曼光譜分析可以產(chǎn)生反應(yīng)系統(tǒng)中存在的特定化學(xué)物質(zhì)的信息。拉曼化學(xué)成像可以進(jìn)一步指示化學(xué)物質(zhì)在系統(tǒng)中的物理位置、物理或化學(xué)信息(例如物質(zhì)的晶體狀態(tài)和關(guān)于存在物質(zhì)的環(huán)境的信息)和關(guān)于物質(zhì)在系統(tǒng)中或在系統(tǒng)中特定位置的數(shù)量或濃度的信息。
可以在化學(xué)系統(tǒng)中評估藥物(或具有一個或多個可區(qū)分拉曼光譜特征的任何其它化合物)，所述化學(xué)系統(tǒng)包括活細(xì)胞或死細(xì)胞，并受限于系統(tǒng)拉曼光譜分析的一般限制(例如，照射系統(tǒng)的相關(guān)部分以及從這些部分收集拉曼散射的光的能力)。因為單獨(dú)的細(xì)胞在拉曼光譜中的很多用于照射樣品的波長下或在很多發(fā)射被散射的輻射的波長下通常并不是不透光的，所以一般可以從單獨(dú)細(xì)胞的全部體積得到拉曼光譜數(shù)據(jù)和化學(xué)圖像(即通過在所述體積內(nèi)的或包括所述體積的多個焦平面評估所述細(xì)胞的所述體積)。這提供了當(dāng)細(xì)胞平放于用于拉曼檢測的底物上時所有化學(xué)品或藥物在整個細(xì)胞區(qū)域的投影。因此，應(yīng)該可以在單獨(dú)細(xì)胞的整個體積檢測拉曼活性化合物。
可以獲得單獨(dú)的細(xì)胞的拉曼光譜數(shù)據(jù)或從整個三維細(xì)胞物質(zhì)得到拉曼光譜數(shù)據(jù)，受限于拉曼光譜分析的一般限制。對于單個細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)使用不同的聚焦深度重復(fù)實施拉曼化學(xué)成像提供了在整個細(xì)胞體積內(nèi)拉曼化學(xué)圖像的此類投影的平面剖面。這些化學(xué)剖面顯示精細(xì)的變化，可以對其進(jìn)行匯集和加工以得到藥物在細(xì)胞中的三維圖像。這種立體成像取決于對每個‘化學(xué)’剖面(即每個焦平面)都精確地得到清晰和精確的藥物化學(xué)圖像，這對于這種全立體成像是至關(guān)重要的。因此對于立體成像來說，得到當(dāng)細(xì)胞平放于底物上時的細(xì)胞的單層、剖面或二維投影的精確化學(xué)圖像是重要的。
本文所描述的方法適合于基本上任何類型細(xì)胞的化學(xué)成像，包括一個或多個任何真核細(xì)胞或原核細(xì)胞(或甚至兩種或更多種細(xì)胞類型的混合樣品)。舉例來說，合適的細(xì)胞包括如下的細(xì)胞人，非人動物，農(nóng)業(yè)上重要的植物(例如農(nóng)作物和雜草)或其它植物，真菌，原生生物，真細(xì)菌，太古細(xì)菌和支原體。使用這些方法評估的細(xì)胞可以從樣品得到并且遠(yuǎn)程成像，任選地在將細(xì)胞保持于培養(yǎng)物中、用固定劑處理細(xì)胞、用藥物處理細(xì)胞、冷凍細(xì)胞或這些方式組合處理之后?；蛘撸?dāng)細(xì)胞的位置和本文所描述的設(shè)備的設(shè)計相配合時，可以原位成像所述細(xì)胞，例如在人組織中，在目標(biāo)表面，或在允許對其內(nèi)部至少一部分進(jìn)行拉曼光譜分析的三維物體的內(nèi)部。
影響大多數(shù)包含活細(xì)胞的生物系統(tǒng)(以及其它系統(tǒng))的拉曼光譜分析的復(fù)雜性在于活的和死的細(xì)胞通常含有當(dāng)使用用于拉曼分析的輻射照射時強(qiáng)烈發(fā)熒光的組分。因為熒光發(fā)射的譜寬通常遠(yuǎn)寬于單個拉曼特征的譜寬并且熒光發(fā)射的強(qiáng)度通常大于拉曼散射的輻射的強(qiáng)度，其掩蓋了拉曼信號使得難以從樣品辨別拉曼和熒光輻射，并且為了做到這一點可能需要使用光譜處理技術(shù)。
為了從此類背景和細(xì)胞中的其它化學(xué)信號分離所述弱拉曼信號，需要特殊的技術(shù)和分析。Ling等人，在本文中提及的AppliedOptics論文中，聲稱使用藥物的單一拉曼峰以成像其在細(xì)胞中的位置，這被稱為單變量分析。申請人已發(fā)現(xiàn)另一種更優(yōu)異的方法是使用分析物拉曼光譜的多個部分以收集化學(xué)圖像和使用分析物(例如藥物)的很多拉曼峰以及精細(xì)拉曼特征來確定其存在和在細(xì)胞環(huán)境中的位置。這種方法稱為多變量分析。因為需要從相對強(qiáng)的熒光背景分離單峰并且在空間上確定該峰出現(xiàn)的位置，因此單變量分析是存在更多問題的。使用拉曼光譜標(biāo)記圖的多個特征，所述標(biāo)記圖對應(yīng)于藥物的多個峰和它們的相對強(qiáng)度，使得可以在視場中的拉曼散射和熒光實體之間出現(xiàn)更有效的差別，從而提供從背景和可能出現(xiàn)的其它峰辨別所述藥物的顯著更強(qiáng)的能力。單變量方法的使用需要很多假設(shè)以從寬熒光背景以及從系統(tǒng)中的其它化學(xué)品和拉曼峰中消卷積單峰。通常由于細(xì)胞中的化學(xué)相互作用造成的藥物的這種單拉曼峰的任何變化都成為問題。
另一個非常重要的問題在于當(dāng)藥物與細(xì)胞或細(xì)胞組分結(jié)合時，所述藥物化合物內(nèi)通過拉曼檢測的一些振動通常將發(fā)生位移，這反應(yīng)了藥物在細(xì)胞內(nèi)相互作用和結(jié)合的類型。能夠檢測這些與成像模式無關(guān)的位移對于使用這些拉曼峰值來得到藥物在細(xì)胞中的進(jìn)一步詳細(xì)信息來說是關(guān)鍵的。在一個波長使用單個濾光器妨礙了觀察或成像此類重要變化。
細(xì)胞尺度拉曼成像系統(tǒng)在本申請的上下文中，拉曼成像系統(tǒng)(RIS)基本上可以是裝配有實施本文所描述的分析所需的儀器的任何拉曼顯微鏡。舉例來說，所述RIS基本上可以是任何授予Treado的美國專利6002476中描述的系統(tǒng)、ChemImage的FALCON(TM)裝置或類似裝置。本文描述了另一種合適的裝置和系統(tǒng)。
對于細(xì)胞內(nèi)分析物的分析，取決于分析中所需的細(xì)節(jié)程度(即目標(biāo)的尺寸或目標(biāo)的各部分的期望分辨率)，所述裝置應(yīng)該裝配有允許目測細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的放大光學(xué)系統(tǒng)。在表征分析物的一個或多個拉曼位移(RS)值下獲得了期望的目標(biāo)(例如細(xì)胞或細(xì)胞的一部分)的拉曼光譜數(shù)據(jù)幀(frame)。舉例來說，所述分析物可以是拉曼活性藥物分子或者細(xì)胞源的拉曼活性分子，其是已知的或預(yù)期將受藥物分子影響。在視場的焦平面中可以評估拉曼活性組分的存在、大致濃度或數(shù)量以及位置。拉曼光譜數(shù)據(jù)可以與通過其它光譜方法例如可見光反射顯微術(shù)得到的圖像數(shù)據(jù)幀合并(例如重疊)。所述其它光譜方法可以(并且優(yōu)選)使用和拉曼光譜分析相同的光路，或使用用于收集拉曼散射的光的光路的同一部分(穿過所述樣品)(即使使用各自的檢測器來評估拉曼散射的和其它的輻射)。
一旦得到拉曼光譜數(shù)據(jù)幀，就可以在遲一些的時間點得到拉曼光譜數(shù)據(jù)的第二幀，所述兩幀之間的間隔不少于從目標(biāo)得到拉曼光譜(以及任選地得到其它光譜)并記錄所述光譜花費(fèi)的時間。如果需要，幀之間的時間可以比那個時間間隔長。例如，在其中拉曼活性目標(biāo)的變化只有在不少于數(shù)秒的時間尺度上才可觀測的系統(tǒng)中，每秒獲得很多拉曼光譜數(shù)據(jù)幀可能幾乎沒有益處。因此，數(shù)據(jù)采集所需的時間幀(time frame)可以決定哪個生物或生化系統(tǒng)適合于用特定RIS進(jìn)行分析。例如，RIS可能不適合于評估其中期望觀察的變化的時間尺度明顯(例如幾個數(shù)量級)快于所述RIS的數(shù)據(jù)采集速率的過程。
因為本文所描述的RIS可以非?？焖俚卦谡麄€視場收集拉曼光譜數(shù)據(jù)，因此其可以為具有約數(shù)毫秒、數(shù)十毫米、數(shù)百毫秒或更長特征時間的過程收集有意義的數(shù)據(jù)。幾乎沒有藥物顯示以短于上述時間段的時限對細(xì)胞施加它們的生理作用。因此，本文所描述的RIS適合用于收集關(guān)于拉曼活性組分例如藥物和它們的代謝物的細(xì)胞和亞細(xì)胞位置的拉曼光譜信息。因為這種信息可以以連續(xù)數(shù)據(jù)幀快速收集并且這些數(shù)據(jù)幀可以存儲和重現(xiàn)，所以所述方法可用于檢查其中拉曼活性組分隨時間發(fā)生變化的過程。這些RIS克服了例如Ling等人的那些系統(tǒng)的缺點，因為它們不需要操縱移動部件并且能夠在適合于分析高速過程的時間幀中在多個RS值得到拉曼光譜數(shù)據(jù)。因此，使用Ling等人的論文作為例子，本文所描述的這種類型的RIS能夠收集對應(yīng)于每一幀中紫杉醇的更寬范圍的拉曼光譜數(shù)據(jù)，使得在紫杉醇和恰好1000cm-1處顯示拉曼散射的其它細(xì)胞組分(例如，參見Ling論文中紫杉醇預(yù)處理的細(xì)胞對照物)之間的差別更大。
本文所描述的動態(tài)化學(xué)成像方法可以與在其它Chem Image專利文獻(xiàn)(例如2004年6月30日提交的美國臨時專利申請(序列號60/584719和60/584718)，關(guān)于多模式和多點分析系統(tǒng))中公開的拉曼成像策略一起使用。在那些其它申請中描述的光譜分離和熒光校正方法可同等地適用于本文所描述的動態(tài)化學(xué)成像方法。
可以使用本文所描述的動態(tài)化學(xué)成像方法的過程的一個例子是評估拉曼活性顆粒(例如特定類型的細(xì)胞或聚合物球)在環(huán)境中的運(yùn)動，所述環(huán)境可包括拉曼可區(qū)分的液體、氣體或其它顆粒(例如一種或多種其它類型的細(xì)胞或其它種類的聚合物球)。所述動態(tài)化學(xué)成像方法也可用于評估其中目標(biāo)的形狀、尺寸或拉曼特征在多個數(shù)據(jù)采集幀期間發(fā)生變化的過程。舉例來說，此類方法可以用于評估晶體生長、分子的顆?；騾^(qū)域從一種拉曼活性形式到另一種拉曼活性形式或到拉曼非活性形式(反之亦然)的變化。
所述動態(tài)化學(xué)成像方法可以用于在評估所述顆粒的波長下跟蹤尺寸接近所使用光學(xué)系統(tǒng)分辨率極限的單個拉曼活性顆粒。甚至在其中單個拉曼活性顆粒不能相互區(qū)分開的系統(tǒng)中，包含此類顆粒的區(qū)域的拉曼光譜特征也可以指示(至少平均地)這些顆粒正在發(fā)生的情況。以這種方式，例如，可以觀察拉曼活性病毒顆粒的行為。
除了隨時間在焦平面中獲得拉曼光譜數(shù)據(jù)以外，通過評估多個相鄰的或隔開的焦平面(例如，對應(yīng)于通過樣品的多個平行的相鄰的‘切片’，對應(yīng)于多個平行的規(guī)則隔開的‘切片’或?qū)?yīng)于多個非平行的焦平面)可以得到第四維度的分析。得到每一組所述多個焦平面的拉曼光譜數(shù)據(jù)所需的時間可以限制與整個樣品相應(yīng)的數(shù)據(jù)采集速率。以這種方式，例如，通過重復(fù)評估來自含有細(xì)胞的體積的多個層疊‘切片’的拉曼散射可以以三維方式評估細(xì)胞中拉曼活性藥物(或其它拉曼活性物質(zhì))的存在、位置和大致濃度或數(shù)量。
拉曼數(shù)據(jù)采集的速度主要受限于拉曼散射的輻射的數(shù)量，而拉曼散射的輻射的數(shù)量通常是很小的。拉曼散射檢測系統(tǒng)的一個重要部分是其對偏振(polarization)敏感。也就是說，所述系統(tǒng)可以被設(shè)置使得它只檢測具有一個或多個特定偏振的被散射光。因為被樣品散射的拉曼散射的光不是在一個方向偏振化(其包括顯示所有偏振的光子)，所以在檢測階段可能損失大約一半的光強(qiáng)度。增加數(shù)據(jù)采集速度的一種方法是在多個偏振方向中檢測光(例如，通過檢測具有正交偏振的散射的光可以使速度加倍)。例如，這可以用兩個CCD照相機(jī)實現(xiàn)，兩個CCD照相機(jī)中的每一個都檢測獨(dú)立的偏振通道。這兩個照相機(jī)可以同時運(yùn)行，但是卻是在按時間順序交錯的模式下，從而當(dāng)一個照相機(jī)正部分處于其數(shù)據(jù)收集周期中(例如，大約半程)時，另一個照相機(jī)開始其數(shù)據(jù)收集周期。此外，因為被有序細(xì)胞(例如，在諸如膜、肌肉或神經(jīng)元組織的組織中以規(guī)定方式排列的細(xì)胞)散射的拉曼位移光可以顯示顯著地各向異性的偏振，所以評估具有不同方向或偏振度的散射的光也可以得到關(guān)于細(xì)胞的有用信息。可以容易地適用于分析拉曼散射的光的各向異性偏振的光學(xué)組件的例子描述于Tsuboi 2002，J.Biomed.Opt.7(3)435-441。此外，因為顯微視場中存在的細(xì)胞、藥物、亞細(xì)胞組分、底物和其它組分可以顯示各向異性偏振，所以所述RIS系統(tǒng)在這些偏振之中的辨析能力可以增加可從視場的拉曼分析得到的信息。
使用本文所描述的拉曼化學(xué)成像裝置(例如ChemImage的FALCON(TM)系統(tǒng))的一些優(yōu)點如下面所述。
因為使用固態(tài)檢測器(即沒有移動的部件)，所以RIS可以在多個波長并以高空間分辨率快速評估被散射的輻射的強(qiáng)度(即，不操縱移動的部件而可以在RS值之間快速切換)，所述RIS在同一時間(即，以平行方式)在整個視場得到這樣的數(shù)據(jù)，所述視場包括任意放大倍數(shù)下完整的一個或多個細(xì)胞，所述RIS可以用于從細(xì)胞和亞細(xì)胞區(qū)域收集拉曼光譜信息并且被收集的信息可以用于i)校正背景熒光和ii)以高特異性在所分析的視場中識別化學(xué)物質(zhì)。和Ling等人描述的系統(tǒng)不同，本文所描述的RIS可以在多個RS值收集拉曼光譜信息，使得可以更好地區(qū)別具有類似結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)并使得可以更好地校正熒光背景。商業(yè)軟件包，例如ChemImage Corporation的專有軟件CHEMIMAGE EXPERT(TM)，可用于對視場中的差不多每一個像素進(jìn)行拉曼活性物質(zhì)的多變量分析。本文所描述的RIS的速度還允許以實際用于分析細(xì)胞組成的時間尺度對細(xì)胞和細(xì)胞區(qū)域進(jìn)行拉曼光譜掃描。
例如，使用ChemImage FALCON(TM)儀器，只用一秒鐘就可以得到在單一RS值下的拉曼圖像。為了得到更好的空間分辨率，優(yōu)選使用更長的時間。例如，10-30秒每幀，或甚至60秒每幀，得到適于細(xì)胞分析的空間分辨率。可以在時間和分辨率(空間和光譜分辨率)進(jìn)行折衷。使用的確切參數(shù)取決于使用的設(shè)備和所需的空間和光譜分辨率。設(shè)備組件的改進(jìn)將增加可能采集數(shù)據(jù)時的速率。例如，目前，合適的照相機(jī)能夠以約50毫秒每幀的速率在單一RS值收集拉曼散射信息。其它系統(tǒng)組件的改進(jìn)最終可以使得數(shù)據(jù)采集速率接近該速度。數(shù)據(jù)采集速率還取決于被成像系統(tǒng)的復(fù)雜性。舉例來說，存在這樣的情況，其中能夠以0.1秒每幀的速率對局部的內(nèi)源性分子進(jìn)行拉曼成像。例子將包括巖石中的碳質(zhì)材料(隕石中的鉆石狀碳)、無機(jī)基體中的碳酸鹽、組織中的磷酸鹽(鈣化作用)和賦形劑中的高濃度藥物化合物。
可以以三維方式采集數(shù)據(jù)的速度取決于單幀的數(shù)據(jù)采集速率和改變所用儀器的焦平面所需時間。例如，可以使用本文所描述的設(shè)備以2秒每幀的采集時間來得到細(xì)胞的三維的單一RS圖像(通過改變細(xì)胞和顯微鏡物鏡之間的距離)。在z方向在13個位置移動所述焦平面使得總采集時間為大約30秒(包括用于幀讀出的一些時間)。在一些實施方案中，在大約半小時內(nèi)對于單一成像體積已經(jīng)得到多達(dá)180幀的數(shù)據(jù)。這可能比成像所述體積需要的數(shù)據(jù)量要多，但卻說明了本文所描述的系統(tǒng)的一些能力。因為細(xì)胞系統(tǒng)中的過程的特征時間(即，其中系統(tǒng)中的變化可以以有意義的方式相互關(guān)聯(lián)的時間段)變化(一些的特征時間為秒數(shù)量級，一些為小時、天或更長時間的數(shù)量級)，所以對特定RIS系統(tǒng)的要求取決于被觀察的細(xì)胞特征。
本文所描述的RIS的速度與較慢RIS相比，使得可以對以更大速率移動的目標(biāo)進(jìn)行拉曼化學(xué)成像。因此，可以分析離散顆粒的移動，即使這些離散顆粒與其它拉曼特征(Raman-distinct)顆?；旌显谝黄?。例如，可以近似實時地跟蹤細(xì)胞內(nèi)拉曼活性劑的移動。
因為本文所描述的RIS可以用于評估目標(biāo)的其它光譜特征(例如，光學(xué)顯微形態(tài)，熒光發(fā)射等)，所以可以容易地合并拉曼數(shù)據(jù)和其它光譜數(shù)據(jù)從而以多種信息方式呈現(xiàn)合并的信息。舉例來說，指示拉曼活性劑在視場中特定位置出現(xiàn)的拉曼數(shù)據(jù)可以與視場中細(xì)胞的可見顯微圖像合并以指示在細(xì)胞各個部分中所述試劑的位置和數(shù)量(相當(dāng)或絕對數(shù)量)。此外，因為所述RIS可以幾乎同時地在多個RS值下評估拉曼數(shù)據(jù)，所以可以近似實時地評估一種拉曼活性劑到另一種拉曼活性劑的轉(zhuǎn)化(例如，藥物到該藥物代謝物的轉(zhuǎn)化)。本文所描述的RIS能夠?qū)崿F(xiàn)快速和大規(guī)模的數(shù)據(jù)采集，這使得能夠進(jìn)行多變量分析。
雖然可以如上述的那樣實施所述方法，但是下面所述各項是改進(jìn)所述系統(tǒng)性能的一些方式。
能夠得到拉曼化學(xué)圖像(RCI)數(shù)據(jù)的“幀”的快速性決定了所述系統(tǒng)的響應(yīng)速率。降低得到數(shù)據(jù)幀所需時間的任何措施都將增加所述系統(tǒng)的響應(yīng)速率(即每單位時間的幀數(shù))。因此，測量系統(tǒng)響應(yīng)時間或采集拉曼數(shù)據(jù)(或與所述幀相應(yīng)的其它數(shù)據(jù)，如果所述其它數(shù)據(jù)限制數(shù)據(jù)采集速率的話)的速率或其兩者的縮短將改進(jìn)系統(tǒng)的響應(yīng)速率。在更大數(shù)值的RS值下收集RCI數(shù)據(jù)，拉曼數(shù)據(jù)采集所需時間越長。因此，選擇特別地相應(yīng)于所關(guān)注目標(biāo)(例如藥物)并且不相應(yīng)于被成像目標(biāo)所處環(huán)境(例如其它細(xì)胞成分)的RS值可以降低必須收集數(shù)據(jù)的RS值的數(shù)目并改進(jìn)響應(yīng)速率。類似地，縮短檢測器收集拉曼散射的輻射的時間段將改進(jìn)響應(yīng)速率(至少要到達(dá)可以區(qū)分信號和噪聲的程度)。
可以通過沿著不同于收集拉曼散射光的軸的軸照射所述目標(biāo)得到背景噪聲。
可以通過許多方法增強(qiáng)拉曼散射的光的強(qiáng)度。例如，與用較長波長的光照射目標(biāo)而散射的光相比，用較短波長的光照射目標(biāo)將得到更強(qiáng)的拉曼散射的光。但是，更短波長的光產(chǎn)生更多的熒光背景，所述熒光背景掩蓋或干擾(swamp)其它來自樣品的非彈性信號例如拉曼信號。此外，使用拉曼增強(qiáng)性底物來承載目標(biāo)(例如膠體銀或金底物，以及其它已知的拉曼增強(qiáng)性表面)可以改進(jìn)拉曼信號的強(qiáng)度。例如，可以在這樣的底物上培養(yǎng)細(xì)胞，或?qū)⒓?xì)胞沉積在包括這樣的材料的底物上。
對于任何光學(xué)系統(tǒng)，都可以通過減少光學(xué)損失和增加檢測器靈敏度改進(jìn)信號強(qiáng)度，因此，本發(fā)明描述的RIS基本上可以與目前已有的或今后開發(fā)的任何拉曼相容性光學(xué)系統(tǒng)和檢測器聯(lián)用。使用多變量統(tǒng)計圖像分析(“化學(xué)計量學(xué)”)將增加所述ChemImage RIS技術(shù)的靈敏度。優(yōu)選的實施方案包括使用下述的一項或多項i)關(guān)聯(lián)分析以改進(jìn)圖像像素內(nèi)藥物目標(biāo)信噪比(SNR)；ii)主成分分析(PCA)，作為噪聲降低技術(shù)；和iii)漸進(jìn)因子分析，作為檢測拉曼光譜中動態(tài)變化的手段。
可以使用化學(xué)成像標(biāo)準(zhǔn)疊加方法(Chemical Imaging StandardAddition Method，描述于Chem Image的美國專利6734962中，涉及NIR顯微術(shù))作為細(xì)胞濃縮物中定位和半定量檢測藥物的手段。
可以使用Radiometric SNR檢測器性能型號(performancemodels)以檢測細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度，而不用使用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物。
動態(tài)化學(xué)成像系統(tǒng)和方法在本部分中描述的方法可以使用用于檢測在第一時間間隔和第二時間間隔之間在樣品中發(fā)生的動態(tài)變化的系統(tǒng)或方法使用樣品的一系列的至少第一和第二順序化學(xué)圖像來進(jìn)行。所述第一化學(xué)圖像對應(yīng)于在第一時間間隔期間樣品的圖像。所述第二化學(xué)圖像對應(yīng)于在第一時間間隔之后樣品在第二時間間隔的圖像。
在所述第一時間間隔期間(i)用多個光子照射所述樣品從而產(chǎn)生被所述樣品散射的或發(fā)射的光子；(ii)然后使用檢測元件的二維陣列同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在第一預(yù)定波段散射的或發(fā)射的光子；和(iii)此后所述檢測元件的二維陣列被額外使用一次或多次同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在一個或更多其它預(yù)定波段散射的或發(fā)射的光子。然后，在第一時間間隔期間所述檢測元件的二維陣列的輸出被合并以產(chǎn)生所述樣品的第一化學(xué)圖像。
在所述第二時間間隔期間(i)用多個光子照射所述樣品從而產(chǎn)生被所述樣品散射的或發(fā)射的光子；(ii)然后使用檢測元件的二維陣列同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在第一預(yù)定波段散射的或發(fā)射的光子；和(iii)此后所述檢測元件的二維陣列被額外使用一次或多次同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在一個或更多其它預(yù)定波段散射的或發(fā)射的光子。然后，在第二時間間隔期間所述檢測元件的二維陣列的輸出被合并以產(chǎn)生所述樣品的第二化學(xué)圖像。
基于所述第一和第二化學(xué)圖像之間的一個或多個差異，檢測第一時間間隔和第二時間間隔之間樣品中發(fā)生的動態(tài)變化。
本發(fā)明使得可以以全空間信息快速觀察所述樣品，并且允許監(jiān)控樣品中自然進(jìn)行或發(fā)生的(即在平衡條件下)進(jìn)展和變化以及通過外界方式(例如施加到樣品的一種或多種外部場或力)產(chǎn)生非平衡條件而額外強(qiáng)制或強(qiáng)加的那些。在某些實施方案中，所述外界方式可以施加到樣品內(nèi)的特定位置(而不是整個樣品)。
圖1示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的儀器。圖1示出的儀器可以在不同放大倍數(shù)為微光成像提供高光通量。參見圖1，將樣品100放置在底物105上。底物105可以是任何常規(guī)顯微載玻片或者用于接收以及任選地固定樣品100的其它器具。設(shè)置光源110以向樣品100提供入射光。光源110可包括任何常規(guī)光子源，包括激光器、LED和其它IR或近IR裝置。也可以選擇光源110以提供樣品的迅衰照射。在一個實施方案中，所述光源的帶寬為約15-25cm-1。
仍舊參見圖1，應(yīng)該注意，設(shè)置光源110以相對于樣品100以一定的角度提供入射光，其與正交于樣品100發(fā)射(shining)的光相對。換句話說，用于照射所述樣品的輻射不需要經(jīng)過常規(guī)顯微鏡(或顯宏鏡)的光學(xué)系統(tǒng)；相反地，它可以以傾斜角度從樣品100上面或下面照射所述樣品。光子束112被反光鏡115接收并反射，穿過透鏡120。透鏡120可以任選地被用于將所述光聚焦在樣品100上?；蛘?，可以不需要反光鏡115而將光子束112引向樣品100。
到達(dá)樣品100的光束112中的眾多光子照射樣品并且被樣品散射或吸收，這可造成后續(xù)的在不同波長的發(fā)射(發(fā)光)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣，術(shù)語“發(fā)光”包括各種使用其它名稱描述的光學(xué)過程。這些包括熒光、磷光、光致發(fā)光、電致發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、聲致發(fā)光、熱致發(fā)光和甚至升頻轉(zhuǎn)換。被散射的光子示意性地表示為光束116和118，而被鏡反射的光子示意性地表示為光束114。發(fā)光發(fā)射的光子也表示為光束118。設(shè)置光學(xué)透鏡125以接收光子束116和118。光學(xué)透鏡125可以用于聚集并聚焦所接收的光子束。這包括聚集并聚焦偏振的和非偏振的光子。一般而言，樣品尺寸決定聚光光學(xué)透鏡125的選擇。例如，可以使用顯微鏡透鏡來分析亞微米至微米的樣本。對于更大的樣品，可以使用微距透鏡(macro lenses)。光學(xué)透鏡125(以及透鏡120)可包括具有更大數(shù)值孔徑的簡單的低分辨率/像差的透鏡，從而增加系統(tǒng)的光通量和效率。設(shè)置反光鏡130以將發(fā)射的或散射的光子束118引向可調(diào)諧濾光器140。應(yīng)該指出的是，反光鏡130的放置是任選的，并且在其中可調(diào)諧濾光器被置于樣品100上方的結(jié)構(gòu)中，反光鏡130可能是非必需的。
激光拒波濾光器135可以被置于可調(diào)諧濾光器140之前以過濾出光束116表示的散射的照射光并優(yōu)化系統(tǒng)的性能。換句話說，拒波濾光器135能夠在照射波長以光譜方式過濾光子。
可以使用常規(guī)可調(diào)諧濾光器(包括光電的、機(jī)械的或其它可調(diào)諧濾光器)以進(jìn)一步說明本公開的原理。合適的可調(diào)諧濾光器的例子包括液晶可調(diào)諧濾光器(“LCTF”)或可以使用聲-光可調(diào)諧濾光器(“AOTF”)來進(jìn)一步說明本公開的原理。取決于控制器(未在圖1中示出)加載在所述裝置上的控制信號，所述光電濾光器(或其它可調(diào)諧濾光器)允許特定波長或波長范圍的光作為圖像通過?？梢酝ㄟ^可調(diào)諧濾光器140的波長范圍可以為200納米(紫外)到2000納米(即，遠(yuǎn)紅外)。波長的選擇取決于期望的光學(xué)區(qū)域和/或被分析樣品的性質(zhì)。
圖像傳感器145可以是數(shù)字裝置，例如二維圖像焦平面陣列(“FPA”)或CCD或CMOS傳感器。用于表征所關(guān)注樣品的光學(xué)區(qū)域決定FPA檢測器的選擇。例如，硅電荷耦合裝置(“CCD”)檢測元件的二維陣列可以與可見光波長熒光和拉曼光譜一起使用，而砷化鎵(GaAs)和砷化銦鎵(GaInAs)FPA檢測器可以用于在近紅外波長下的圖像分析。此類裝置的選擇取決于被分析的樣品的類型。在一個實施方案中，用于形成圖像傳感器145的檢測元件的二維陣列中的每一個檢測元件都用于檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同空間位置散射的或發(fā)射的光子。在一個實施方案中，圖像傳感器145通過可調(diào)諧濾光器140的處理產(chǎn)生樣品的整個視圖的數(shù)字圖像。
圖2示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明另一個實施方案的儀器。更加具體地，圖2示意性地示出在不同放大倍數(shù)用于微光成像的高光通量結(jié)構(gòu)。聚光裝置與圖1中所示的類似，但是卻從樣品100的下面照射。
應(yīng)注意，在圖1和2中，樣品100相對于光束116和118均以傾斜角度被照射。具體參見圖2，光子束120和樣品100的平面軸限定了傾斜角度。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過傾斜照射，開發(fā)出所謂的“暗視場拉曼成像”。與常規(guī)明視場拉曼結(jié)構(gòu)不同，暗視場拉曼成像使激發(fā)輻射的輸送與圖像捕獲光學(xué)器件去偶。因此，入射輻射的內(nèi)散射和衰減被最小化以改進(jìn)信噪比(S/N)。此外，在光學(xué)系統(tǒng)之外的光源位置進(jìn)一步使得可以使用更低的成本、更低功率的照射源以及使得可以更簡單地、更便宜地將幾個照射源集成到系統(tǒng)中。這種結(jié)構(gòu)的使用并不限于拉曼和發(fā)光成像，其可成功用于例如常規(guī)光譜法。
在圖1和2所示的每一個實施方案中，可以將計算機(jī)或處理器(未在圖中示出)連接到光學(xué)裝置并用于控制光學(xué)裝置，所述光學(xué)裝置包括光源(110)、透鏡(120，125，135)、反光鏡(115，130)和可調(diào)諧濾光器(140)。所述計算機(jī)也可以連接到圖像傳感器145并用于從圖像傳感器145的輸出產(chǎn)生“化學(xué)圖像”。在一個實施方案中，每個化學(xué)圖像都是從多個“幀”形成的所述樣品的空間精確波長分辨的圖像；其中每一幀都具有多個空間維數(shù)并且由特定波長(或波數(shù))的光子或由特定波段(或波數(shù)段)中的光子產(chǎn)生，所述光子在樣品100上或樣品100內(nèi)從不同空間位置由圖像傳感器145同時收集。在每一個化學(xué)圖像中，可以合并多個幀以形成跨越整個所關(guān)注波長(波數(shù))的完整圖像。計算機(jī)產(chǎn)生的化學(xué)圖像可以進(jìn)一步通過計算機(jī)進(jìn)行分析和/或顯示給使用者。
本發(fā)明使用例如示于圖1和2中的那些儀器來使用樣品100的一系列的至少第一和第二順序化學(xué)圖像以檢測在第一時間間隔和第二后續(xù)時間間隔之間在樣品100中發(fā)生的動態(tài)變化。在所述第一時間間隔期間(i)用來自光源110的光子照射樣品100從而產(chǎn)生被樣品100散射的或發(fā)射的光子；(ii)然后使用圖像傳感器145同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在第一預(yù)定波段(通過可調(diào)諧濾光器140選擇)散射的或發(fā)射的光子；和(iii)對于一個或多個其它預(yù)定波段(每一個都使用可調(diào)諧濾光器140順序選擇)的每一個波段，然后使用圖像傳感器145同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置散射的或發(fā)射的光子。然后，檢測器145的輸出(對于在第一時間間隔期間通過可調(diào)諧濾光器140選擇的每一個波長或波段)通過計算機(jī)(未在圖中示出)被合并以產(chǎn)生所述樣品的第一化學(xué)圖像。
在所述第二后續(xù)時間間隔期間(i)用來自光源110的光子照射樣品100從而產(chǎn)生被樣品100散射的或發(fā)射的光子；(ii)然后使用圖像傳感器145同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在第一預(yù)定波段(通過可調(diào)諧濾光器140選擇)散射的或發(fā)射的光子；和(iii)對于一個或多個其它預(yù)定波段(每一個都使用可調(diào)諧濾光器140順序選擇)的每一個波段，然后使用圖像傳感器145同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置散射的或發(fā)射的光子。然后，檢測器145的輸出(對于在第一時間間隔期間通過可調(diào)諧濾光器140選擇的每一個波長或波段)通過計算機(jī)被合并以產(chǎn)生所述樣品的第二化學(xué)圖像。
基于所述第一和第二化學(xué)圖像之間的一個或多個差異，檢測第一時間間隔和第二時間間隔之間樣品中發(fā)生的動態(tài)變化。具有或不具有物理圖像的化學(xué)圖像的計算機(jī)分析可用于動態(tài)變化的檢測(或增強(qiáng)檢測)。所述動態(tài)變化也可以通過使用者觀察所述化學(xué)圖像的顯示進(jìn)行檢測。
在各種實施方案中，快速順序得到一系列的很多序列的化學(xué)圖像以產(chǎn)生樣品的“電影”。例如，為了基本實時地檢測樣品中的動態(tài)變化，可以得到所述樣品每秒多達(dá)100幅化學(xué)圖像。在一些實施方案中，序列中化學(xué)圖像的時間分辨率可以細(xì)達(dá)1毫秒，即系統(tǒng)將每一毫秒產(chǎn)生一幅樣品的化學(xué)圖像。也可以選擇其它的時間分辨率，包括例如一種折合為化學(xué)圖像以相鄰圖像之間多至15分鐘間隔的時間分辨率。當(dāng)使用本發(fā)明來監(jiān)控特定的過程或反應(yīng)時，所選的時間分辨率應(yīng)足以隨時間檢測樣品中發(fā)生的所關(guān)注的動態(tài)變化。
本發(fā)明因此使得可以以全空間信息快速觀察所述樣品100，并且允許監(jiān)控樣品100中自然進(jìn)行或發(fā)生的(即在平衡條件下)進(jìn)展和變化以及通過外界方式(例如施加到樣品的一種或多種外部場或力)產(chǎn)生非平衡條件而額外強(qiáng)制或強(qiáng)加的那些。在某些實施方案中，所述外界方式被施加到樣品100內(nèi)的特定位置(而不是整個樣品)。使用本發(fā)明的動態(tài)化學(xué)成像技術(shù)可以分析和觀察的樣品的例子包括隨時間發(fā)生變化的生物樣品或微流路。這些變化可包括移位、化學(xué)相互作用、化學(xué)狀態(tài)的變化、相變、生長、收縮、化學(xué)分解、化學(xué)代謝和物理應(yīng)變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可用于本發(fā)明的樣品/變化的各種其它例子，并且所述樣品/變化的各種其它例子同樣在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
如上面指出的那樣，本發(fā)明可用于檢測由于向樣品施加外部條件而導(dǎo)致的樣品中的動態(tài)變化。這些外部條件包括，例如，在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品100或在樣品100內(nèi)的電場或磁場；在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品或在樣品內(nèi)的外光場，其中所述外光場與開始用于照射樣品的光場不同；在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品或在樣品內(nèi)的光場，其中所述額外的光場是通過使用于照射樣品的光場發(fā)生脈沖產(chǎn)生的；在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品或在樣品內(nèi)的內(nèi)部產(chǎn)生的光子；在第一和第二時間間隔之間改變用于照射樣品的偏振光；在第一和第二時間間隔之間改變樣品的溫度；在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品的壓力；或在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品或在樣品內(nèi)的應(yīng)力。在其它實施方案中，與樣品相關(guān)的化學(xué)梯度(例如施加到樣品上的化學(xué)梯度)在第一和第二時間間隔之間發(fā)生變化。在另一個實施方案中，在第一和第二時間間隔之間在樣品中引發(fā)生理或生物應(yīng)力。在其它重要實施方案中，在多個時間觀察向樣品加入一種或多種化學(xué)物質(zhì)(例如藥物活性試劑、抗體或核酸)的動態(tài)效果。如本文中公開的那樣，這樣的樣品可以從活細(xì)胞制備或包含活細(xì)胞。
在一些實施方案中，序列中的每個化學(xué)圖像都是由所述樣品的多個分開的空間精確波長分辨的圖像(如上述那樣，每一個都從多個“幀”形成)組成；其中所述多個分開的空間精確波長分辨的圖像的每一個都對應(yīng)于樣品中多個不同深度中的一個。這些實施方案可用于檢測在樣品100整個體積中發(fā)生的化學(xué)變化，而不是在樣品的單個表面或平面上發(fā)生的變化。
在其它實施方案中，序列中各個化學(xué)圖像之間的差異可以與樣品的正交(即互補(bǔ))測量關(guān)聯(lián)起來(使用例如上述的計算機(jī)或通過使用者進(jìn)行)，所述正交測量在與所述序列相關(guān)聯(lián)的每個時間間隔期間進(jìn)行，從而增強(qiáng)樣品中動態(tài)變化的檢測或觀察?？梢允褂玫恼粶y量的例子包括使用下述形式進(jìn)行的測量拉曼散射、近紅外吸收(NIR)、可視圖像、視頻或發(fā)光。也可以使用其它正交測量，并且這些測量被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
定義如在本文中使用的那樣，下面每一個術(shù)語都具有在該部分中的與其相關(guān)的意義。
“帶寬”是指在一束輻射中的波長范圍，使用半峰全寬法進(jìn)行評估。
檢測器或其它系統(tǒng)的“帶通”是指所述檢測器或系統(tǒng)可以分辯的波長范圍，使用半峰全寬強(qiáng)度法進(jìn)行評估。
所述“半峰全寬”(“FWHM”)法是一種通過識別連續(xù)波長范圍來表征包括一定范圍波長的輻射的方法，即在單一波長的輻射中，在該波長范圍內(nèi)，某一特性的值(例如強(qiáng)度或檢測能力)等于所述特性的最大值的至少一半。
“光譜分辨率”是指輻射檢測系統(tǒng)分辨兩個光譜峰的能力。
雖然術(shù)語“光學(xué)的”和“光譜的”在本文中用于表示材料的性質(zhì)(以及表示評估這些性質(zhì)的方法)，但是，應(yīng)理解這兩個術(shù)語是指電磁輻射、電子或中子與所述材料的相互作用。例如，雖然電子顯微術(shù)通常并不被認(rèn)為是“光譜的”或“光學(xué)的”方法，但是這兩個術(shù)語在本文中以包含性地方式進(jìn)行使用，從而包括電子顯微術(shù)。
實施例現(xiàn)在參考下述實施例描述本發(fā)明。提供該實施例僅僅是用于說明目的，本發(fā)明并不限于該實施例而是包括在本發(fā)明的教導(dǎo)下而變得顯而易見的所有變化形式。
乳腺癌細(xì)胞中拉曼活性化合物的拉曼化學(xué)成像。
將拉曼活性化合物與乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行接觸。接著對細(xì)胞進(jìn)行拉曼化學(xué)成像。在所述細(xì)胞與所述化合物接觸之前和之后從所述細(xì)胞得到的拉曼光譜指示約900cm-1處和約2250cm-1處拉曼光譜特征的顯著變化。在所述細(xì)胞與所述化合物接觸之后所述細(xì)胞的拉曼化學(xué)成像證明了在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中顯示2250cm-1特征的化合物的位置。
本文引用的每一篇專利、專利申請和出版物的公開內(nèi)容都通過引用而全部引入本文中。
雖然已經(jīng)參考特定實施方案公開了本發(fā)明，但是顯而易見，在不背離本發(fā)明的真正精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以設(shè)計本發(fā)明的其它實施方案和變化形式。所附的權(quán)利要求包括所有這些實施方案和等價變化形式。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞成像方法，所述方法包括用基本單色的光照射細(xì)胞的至少一部分并在多個離散時間評估從被照射部分散射的拉曼位移光。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在各個離散時間在多個拉曼位移(RS)值評估拉曼位移光。
3.權(quán)利要求2的方法，其中在各個離散時間在表征第一預(yù)選組分的多個拉曼位移(RS)值評估拉曼位移光。
4.權(quán)利要求3的方法，其中該組分是藥物。
5.權(quán)利要求3的方法，其中該組分是細(xì)胞成分。
6.權(quán)利要求5的方法，其中該成分是一種在細(xì)胞用化合物處理之前和之后顯示出不同拉曼光譜的已知成分。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在用化合物處理細(xì)胞之前和之后評估拉曼位移光。
8.權(quán)利要求3的方法，其中在各個離散時間在表征第二預(yù)選組分的多個拉曼位移(RS)值評估拉曼位移光。
9.權(quán)利要求8的方法，其中第一組分是藥物，第二組分是藥物的代謝物。
10.權(quán)利要求8的方法，其中第一組分是結(jié)合到細(xì)胞成分的化合物，第二組分是沒有結(jié)合到該成分的化合物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中第一組分是共價結(jié)合到細(xì)胞成分的化合物，第二組分是沒有共價結(jié)合到該成分的化合物。
12.權(quán)利要求2的方法，其中拉曼位移(RS)值是預(yù)選的。
13.權(quán)利要求1的方法，其中在單一顯微視場中在基本上所有的被照射部分評估拉曼位移光。
14.權(quán)利要求1的方法，其中在單一顯微視場中僅在顯示出表征預(yù)選組分的另一種光譜性質(zhì)的被照射部分評估拉曼位移光。
15.權(quán)利要求14的方法，其中該組分是藥物。
16.權(quán)利要求14的方法，其中該組分是細(xì)胞成分。
17.權(quán)利要求14的方法，其中該成分選自特定的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)絡(luò)合物、隔室和膜。
18.權(quán)利要求14的方法，其中另一種光譜性質(zhì)選自吸收、熒光、衍射、偏振、顯微形態(tài)和與粒子運(yùn)動相關(guān)的光學(xué)性質(zhì)。
19.權(quán)利要求1的方法，其中在評估拉曼位移光之前，拉曼位移光透射過濾光器。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述濾光器選自法布里-珀羅角度調(diào)諧濾光器、聲-光可調(diào)諧濾光器、液晶可調(diào)諧濾光器、里奧濾光器、埃文斯分束元件液晶可調(diào)諧濾光器、索而克液晶可調(diào)諧濾光器、光譜多樣性濾光器、光子晶體濾光器、固定波長法布里-珀羅可調(diào)諧濾光器、空氣調(diào)諧法布里-珀羅可調(diào)諧濾光器、機(jī)械-調(diào)諧法布里-珀羅可調(diào)諧濾光器和液晶法布里-珀羅可調(diào)諧濾光器。
21.權(quán)利要求1的方法，其中在評估拉曼位移光之前，拉曼位移光透射過干涉儀。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述干涉儀選自與偏振無關(guān)的成像干涉儀、邁克耳孫干涉儀、沙哥納克干涉儀、泰曼-格林干涉儀、馬赫-曾德干涉儀和可調(diào)諧法布里-珀羅干涉儀。
23.權(quán)利要求1的方法，其中拉曼位移光被分束為使用各自檢測器評估的多個光束。
24.權(quán)利要求23的方法，其中至少兩個檢測器檢測具有不同偏振的拉曼位移光。
25.權(quán)利要求23的方法，其中至少兩個檢測器的檢測幀是按時間順序交錯的。
26.權(quán)利要求1的方法，其中該細(xì)胞是定向組織的細(xì)胞，并且在與照射角相關(guān)的多個角度評估拉曼位移光的散射。
27.權(quán)利要求1的方法，其中該細(xì)胞是動物細(xì)胞。
28.權(quán)利要求1的方法，其中該動物是人。
29.一種使用樣品的一系列的至少第一和第二順序化學(xué)圖像來檢測在第一時間間隔和第二時間間隔之間在樣品中發(fā)生的動態(tài)變化的方法，其中第一化學(xué)圖像對應(yīng)于在第一時間間隔期間樣品的圖像而第二化學(xué)圖像對應(yīng)于在第一時間間隔之后樣品在第二時間間隔的圖像，該方法包括(a)在第一時間間隔期間(i)用多個光子照射樣品從而產(chǎn)生被樣品散射的或發(fā)射的光子；(ii)使用檢測元件的二維陣列同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在第一預(yù)定波段散射的或發(fā)射的光子；和(iii)對于多個其它不同預(yù)定波段中的每一個，分別重復(fù)步驟(a)(ii)；(b)合并步驟(a)(ii)和(a)(iii)的結(jié)果以產(chǎn)生樣品的第一化學(xué)圖像；(c)在第二時間間隔期間(i)用多個光子照射樣品從而產(chǎn)生被樣品散射的或發(fā)射的光子；(ii)使用檢測元件的二維陣列同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在所述第一預(yù)定波段散射的或發(fā)射的光子；和(iii)對于多個其它不同預(yù)定波段中的每一個，分別重復(fù)步驟(c)(ii)；(d)合并步驟(c)(ii)和(c)(iii)的結(jié)果以產(chǎn)生樣品的第二化學(xué)圖像；(e)基于第一和第二化學(xué)圖像之間的一個或多個差異，檢測第一時間間隔和第二時間間隔之間樣品中發(fā)生的動態(tài)變化。
30.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品或在樣品內(nèi)的電場。
31.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品或在樣品內(nèi)的磁場。
32.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品或在樣品內(nèi)的外光場，其中該外光場與步驟(a)(i)中用于照射樣品的光場不同。
33.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品或在樣品內(nèi)的內(nèi)部產(chǎn)生的光子。
34.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括在第一和第二時間間隔之間改變用于照射樣品的偏振光。
35.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括在第一和第二時間間隔之間改變樣品的溫度。
36.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品的壓力。
37.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括在第一和第二時間間隔之間改變施加到樣品或在樣品內(nèi)的應(yīng)力。
38.權(quán)利要求29的方法，其中與樣品相關(guān)的化學(xué)梯度在第一和第二時間間隔之間發(fā)生變化。
39.權(quán)利要求29的方法，其中施加在樣品上的化學(xué)梯度在第一和第二時間間隔之間發(fā)生變化。
40.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括在第一和第二時間間隔之間在樣品中引發(fā)生理或生物應(yīng)力。
41.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括在第一時間間隔期間，對于樣品內(nèi)多個深度中的每一個，重復(fù)步驟(a)(ii)和(a)(iii)，其中樣品的第一化學(xué)圖像包括與樣品內(nèi)多個深度中的每一個相關(guān)的空間精確波長分辨的圖像化學(xué)圖像；和在第二時間間隔期間，對于樣品內(nèi)多個深度中的每一個，重復(fù)步驟(c)(ii)和(c)(iii)，其中樣品的第二化學(xué)圖像包括與樣品內(nèi)多個深度中的每一個相關(guān)的空間精確波長分辨的圖像化學(xué)圖像。
42.權(quán)利要求29的方法，其中步驟(e)進(jìn)一步包括將第一和第二化學(xué)圖像之間的差異與在第一和第二時間間隔期間進(jìn)行的樣品的正交測量關(guān)聯(lián)，其中所述正交測量對應(yīng)于使用至少下述形式之一進(jìn)行的測量拉曼散射、近紅外吸收(NIR)、可視圖像、視頻或發(fā)光。
43.一種使用樣品的一系列的至少第一和第二順序化學(xué)圖像來檢測在第一時間間隔和第二時間間隔之間在樣品中發(fā)生的動態(tài)變化的系統(tǒng)，其中第一化學(xué)圖像對應(yīng)于在第一時間間隔期間樣品的圖像而第二化學(xué)圖像對應(yīng)于在第一時間間隔之后樣品在第二時間間隔的圖像，所述系統(tǒng)包括(a)光源，其用多個光子照射樣品從而產(chǎn)生被樣品散射的或發(fā)射的光子；(b)檢測元件的二維陣列，其在第一時間間隔期間，(i)同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在第一預(yù)定波段散射的或發(fā)射的光子；和(ii)此后，對于多個其它不同預(yù)定波段中的每一個，同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置散射的或發(fā)射的光子；(c)處理器，其合并在第一時間間隔期間檢測元件的二維陣列的輸出以產(chǎn)生樣品的第一化學(xué)圖像；(d)其中，在第二時間間隔期間，檢測元件的二維陣列(i)同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置在第一預(yù)定波段散射的或發(fā)射的光子，和(ii)此后，對于多個其它不同預(yù)定波段中的每一個，同時檢測從樣品上或樣品內(nèi)的不同位置散射的或發(fā)射的光子；(e)其中，處理器合并在第二時間間隔期間檢測元件的二維陣列的輸出以產(chǎn)生樣品的第二化學(xué)圖像；和(f)其中，處理器基于第一和第二化學(xué)圖像之間的一個或多個差異檢測第一時間間隔和第二時間間隔之間樣品中發(fā)生的動態(tài)變化。
全文摘要
本發(fā)明涉及動態(tài)化學(xué)成像方法，包括細(xì)胞成像方法。所述方法包括用基本單色的光照射細(xì)胞的至少一部分并在多個離散時間評估從所述被照射部分散射的拉曼位移光?？梢栽诿總€所述離散時間在多個拉曼位移(RS)值評估所述拉曼位移光，并且在每個所述離散時間可以選擇RS值以表征預(yù)選組分。如此得到圖像的拉曼光譜特征的多變量分析可得到視場中組分的位置和化學(xué)身份。這種信息可以與從視場得到的其它光譜數(shù)據(jù)(例如可見顯微圖像)合并或重疊。
文檔編號G01N21/63GK101023331SQ200580029321
公開日2007年8月22日 申請日期2005年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者J·S·邁爾, P·J·特里多, T·C·福格特, D·塔謝爾 申請人:化學(xué)影像公司