專利名稱：高度靈敏的單克隆抗體殘留物檢測測定法的制作方法
高度靈敏的單克隆抗體殘留物檢測測定法
交叉引用相關(guān)優(yōu)先權(quán) 本申請要求2010年9月13日提交的美國臨時申請系列號61/382，413的優(yōu)先權(quán)利益，其在此處完整地通過引用并入本文。
1.介紹 本發(fā)明涉及用于在監(jiān)測產(chǎn)物遺留時檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物和/或用于在生物技術(shù)產(chǎn)物的生產(chǎn)中清潔驗(yàn)證的組合物和高度靈敏的方法。具體而言，本發(fā)明涉及免疫測定法，其中一種或多種捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段用于檢測與生物技術(shù)產(chǎn)物生產(chǎn)相關(guān)的殘留物。
2.發(fā)明背景 工藝設(shè)備清潔驗(yàn)證對于良好制造程序(Good Manufacturing Procedure , “GMP”)合規(guī)性是需要的，并且這樣的合規(guī)性意在確保治療性產(chǎn)物符合它們意在具有或代表具有的質(zhì)量和純度特征。作為GMP合規(guī)性的部分，總有機(jī)碳(“T0C”)測定已經(jīng)常規(guī)地用于驗(yàn)證清潔程序?qū)τ谌コ锛夹g(shù)產(chǎn)物殘留物的效率。在個別生產(chǎn)運(yùn)行之間以及當(dāng)不同產(chǎn)物之間切換生產(chǎn)場所時可以采用TOC測定。然而，TOC測定的重要限制在于，檢測限值〈0.1 ppm對于非常低劑量產(chǎn)物如某些抗體治療劑(其最大允許的遺留限值低于TOC檢測限值)監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或清潔驗(yàn)證可能是不適合的。
除關(guān)于符合非常低劑量產(chǎn)物的問題以外，美國食品和藥物管理局在2001年采用的關(guān)于人用藥品注冊的技術(shù)要求的協(xié)調(diào)的國際會議(International Conference OnHarmonization Of Technical Requirements For Registration Of Pharmaceuticals ForHuman Use, “ICH”)文件ICH Q7A以及加拿大衛(wèi)生部指南-0028，都推薦開發(fā)用于監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或清潔驗(yàn)證的活性藥物成分(“API”)特異性測定。因?yàn)門OC測定不是API特異性的，而是無論來源地測量總有機(jī)碳，所以它不符合這些推薦。
鑒于對于TOC測定的固有限制，更靈敏且API特異性的測定作為當(dāng)監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或用于清潔驗(yàn)證時檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的可替代或補(bǔ)充的方法將是期望的。本發(fā)明通過引入用于檢測痕量的核酸或蛋白殘留物包括單克隆抗體殘留物的一般分析測定(其可以用于監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或用于清潔驗(yàn)證)來滿足該需要。
3.發(fā)明概沭 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的方法，其中將測試樣品與包含捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段的基質(zhì)接觸，并且抗體-抗原復(fù)合物的檢測指示存在生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的方法，其中將測試樣品與包含捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段的基質(zhì)接觸，并且抗體-抗原復(fù)合物的檢測指示存在生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物，其中通過監(jiān)測能夠結(jié)合抗體-抗原復(fù)合物的標(biāo)記的檢測抗體的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)抗體-抗原復(fù)合物的檢測。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的方法，其中將測試樣品與包含捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段的基質(zhì)接觸，并且抗體-抗原復(fù)合物的檢測指示存在生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物，其中生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的存在指示產(chǎn)物遺留。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的方法，其中將測試樣品與包含捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段的基質(zhì)接觸，并且抗體-抗原復(fù)合物的檢測指示存在生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物，其中生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的存在指示清潔過程不足。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的方法，其中將測試樣品與包含捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段的基質(zhì)接觸，并且抗體-抗原復(fù)合物的檢測指示存在生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物，其中所述抗原源自核酸產(chǎn)物。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的方法，其中將測試樣品與包含捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段的基質(zhì)接觸，并且抗體-抗原復(fù)合物的檢測指示存在生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物，其中所述抗原源自酶；肽激素；多克隆抗體；人單克隆抗體；人源化單克隆抗體；嵌合單克隆抗體；單鏈抗體；Fab抗體片段；F (ab') 2抗體片段；Fd抗體片段；Fv抗體片段；分離的CDR ;雙抗體；和免疫粘附分子。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的方法，其中將測試樣品與包含捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段的基質(zhì)接觸，并且抗體-抗原復(fù)合物的檢測指示·存在生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物，其中所述抗原源自抗體產(chǎn)物。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的方法，其中將測試樣品與包含捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段的基質(zhì)接觸，并且抗體-抗原復(fù)合物的檢測指示存在生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物，其中所述捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段選自:抗人IgG (H + L)、抗人IgG F(ab’)2、抗人IgG κ、抗人IgGX、抗小鼠IgG(H + L)抗體及其組合。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測生物殘留物的方法，其中將測試樣品與包含兩種或更多種具有不同結(jié)合特異性的捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段的基質(zhì)接觸，并且其中抗體-抗原復(fù)合物的檢測指示存在所述基質(zhì)包含的生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物。在某些實(shí)施方案中，具有不同特異性的捕獲抗體將以特定比例存在于基質(zhì)上。
4.附圖簡沭

圖1描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在該實(shí)驗(yàn)中，使用SDS-PAGE和Western印跡測試選擇的檢測抗體(HRP綴合物)對于兩種產(chǎn)物的識別:Ab #1，本研究中的主要目標(biāo)，和Ab #2,作為暴露于清潔劑后測試識別的模型。將Ab #1和Ab #2與CIP-100 (2.5%)和CIP-200 (2.5%)在75° C孵育30分鐘以模擬嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)施清潔條件。孵育后，中和測試樣品。將完整分子和中和的處理樣品上樣至SDS-PAGE上，并且針對抗人IgG (H+L)進(jìn)行印跡。該圖特別描述了完整的(*)、CIP-100處理的(I)或CIP-200處理的(2) Ab #2和Ab #1的抗人IgG (H+L)的SDS-PAGE 和 Western 印跡。
圖2 描述了下列的 SDS-PAGE 分離:SeeBlue Plus2 STD (第 I 道)；Ab #1 (第 3道)；Ab #2 (第 4道)；Ab #11 (第 5 道)；Ab #3 (第 6 道)；Ab #13 (第 7 道)；Ab #9(第8道)；和SeeBlue Plus2 STD (第10道)。第3和9道是空白。
圖3描述了使用抗人IgG (H+L)抗體如圖2中所概述進(jìn)行的SDS-PAGE分離的Western印跡分析。
圖4描述了使用抗人IgG F(ab’) 2抗體如圖2中所概述進(jìn)行的SDS-PAGE分離的Western印跡分析。
圖5描述了使用抗人IgG λ抗體如圖2中所概述進(jìn)行的SDS-PAGE分離的Western印跡分析。
圖6描述了使用抗人IgG κ抗體如圖2中所概述進(jìn)行的SDS-PAGE分離的Western印跡分析。
圖7描述了使用抗小鼠IgG (H+L)抗體如圖2中所概述進(jìn)行的SDS-PAGE分離的Western印跡分析。
圖8描述了基于Ab #1、Ab #2和Ab #1用于檢測的靈敏度和適用性的組合，基于組合的Ab (如下文表5中所概述的)參考標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有曲線用二次擬合具有0.9999的相關(guān)系數(shù)，并且每種曲線范圍為0.25至8 ng/mL。
圖9描述了涉及建立本文所用的分析方法的線性的實(shí)驗(yàn)。分析方法的“線性”是其引發(fā)或直接或通過良好定義的數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換與目的分析物的濃度成比例的測試結(jié)果的能力。從Ab #1藥物物質(zhì)制備0.25至8 ng/mL范圍的標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品和緩沖液空白上樣至板上并且測試。圖顯示于圖9中:Ab #1標(biāo)準(zhǔn)曲線(板1，頂部；板#2，中部，和板#3，底部)。二次擬合的相關(guān)系數(shù)大于0.999。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度響應(yīng)與通過二次擬合的蛋白濃度成比例。
圖10描述了涉及建立本文所用的分析方法的范圍的實(shí)驗(yàn)。分析方法的“范圍”是分析物上部和下部水平之間的間隔，其可以用所述方法以合適的精度、準(zhǔn)確度和線性水平來確定。基于線性、準(zhǔn)確度、精度和定量限值，該測定的范圍被確定為0.25至8 ng/mL。二次擬合的相關(guān)系數(shù)值大于0.999。這表明，在0.25至8 ng/mL的范圍內(nèi)，吸光度響應(yīng)與通過二次擬合的蛋白濃度成比例。在兩種不同的進(jìn)程中樣品中以1.0、2.0和4.0 ng/mL水平的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行摻料回收研究?；厥章蕿?00 土 7.9%。這表明，在估計的范圍內(nèi)，該方法是精確和準(zhǔn)確的。結(jié)果總結(jié)于表17中，并且來自第一和第二批次的參考標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示于圖10中:使用第一(頂部)和第二(底部)批次Ab的Ab #1標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.發(fā)明詳沭 本發(fā)明涉及用于在監(jiān)測產(chǎn)物遺留時檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物和/或用于在這樣的生物技術(shù)產(chǎn)物的生產(chǎn)中清潔驗(yàn)證的組合物和高度靈敏的方法。具體而言，本發(fā)明涉及免疫測定法，其中一種或多種捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段用于檢測與生物技術(shù)產(chǎn)物生產(chǎn)相關(guān)的殘留物。
5.1遺留監(jiān)測和清潔驗(yàn)證 通過本發(fā)明的組合物和方法的遺留監(jiān)測和清潔驗(yàn)證可以針對其中材料的污染或遺留對API質(zhì)量構(gòu)成最大風(fēng)險的狀況和工藝步驟。然而，本發(fā)明的組合物和方法同樣適用于對API質(zhì)量構(gòu)成最小或沒有直接風(fēng)險、但其中另外需要使用本發(fā)明的組合物和方法的狀況和工藝步驟。影響這樣的實(shí)施的需要性的因素包括但不限于:雇員健康和安全、工藝設(shè)備維護(hù)、對于有效工藝開發(fā)優(yōu)化的需要，以及關(guān)于在生產(chǎn)生物技術(shù)產(chǎn)物中采用的設(shè)施和/或工藝設(shè)備的環(huán)境條件。
在某些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的組合物和方法監(jiān)測遺留和/或驗(yàn)證清潔程序被設(shè)計為反映實(shí)際設(shè)備使用模式。例如，但不是通過限制的方式，在其中使用相同設(shè)備生產(chǎn)多于一種API并且通過相同工藝清潔設(shè)備的情況下，可以選擇代表性API用于通過本發(fā)明的組合物和方法來驗(yàn)證。在可替代的實(shí)施方案中，可以選擇使用相同設(shè)備制造的API中的一種或多種的組合，或所有，用于通過本發(fā)明的組合物和方法來驗(yàn)證。在某些實(shí)施方案中，選擇API或API的組合基于各種因素，如但不限于，API的溶解度和清潔難度。此外，在某些實(shí)施方案中，殘留物限值的計算將基于各種因素，如但不限于，API的效價、毒性和穩(wěn)定性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及在特定工藝步驟取樣以監(jiān)測遺留或驗(yàn)證清潔程序。在某些實(shí)施方案中，取樣包括但不限于，擦拭、沖洗和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的獲得測試材料的任何可替代方法(例如，直接提取)。在某些實(shí)施方案中，進(jìn)行取樣以檢測不溶性殘留物。在可替代的實(shí)施方案中，進(jìn)行取樣以檢測可溶性殘留物。在某些實(shí)施方案中，進(jìn)行取樣以檢測不溶性和可溶性殘留物。
在某些實(shí)施方案中，在初始驗(yàn)證后的特定間隔監(jiān)測清潔程序以確保該程序在常規(guī)生產(chǎn)期間使用時仍然有效。在某些實(shí)施方案中，間隔將是在每次生產(chǎn)運(yùn)行之后。然而，可替代的間隔是本領(lǐng)域已知的，例如，但不限于，特定次生產(chǎn)運(yùn)行之后，替換特定工藝設(shè)備如過濾器或通風(fēng)孔之后，或引入特定生產(chǎn)組分如培養(yǎng)基之后。
5.2生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物檢測測定 本發(fā)明涉及生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物檢測測定，其包含一種或多種能夠結(jié)合一種或多種目的產(chǎn)物殘留物的捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中，在免疫測定的情況下采用捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段。這樣的免疫測定包括但不限于，夾心ELISA、抑制ELISA、放射免疫測定、熒光免疫測定和化學(xué)發(fā)光免疫測定。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，使用夾心ELISA。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，采用夾心ELISA以測定樣品的一種或多種生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物。一般來說，在夾心ELISA中，首先制備表面，使得可以結(jié)合一定量的捕獲抗體。然后封閉制備的表面上的任何非特異性結(jié)合位點(diǎn)。可以通過本領(lǐng)域一般已知的方法完成這樣的封閉，包括但不限于，將表面暴露于封閉蛋白，如但不限于牛血清白蛋白。封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，將表面與測試樣品接觸。將表面與測試樣品孵育以允許產(chǎn)物殘留物和捕獲抗體之間的結(jié)合，如果存在任何產(chǎn)物殘留物。一旦完成孵育期，洗滌該表面以除去未結(jié)合的分子。在某些實(shí)施方案中，然后加入能夠結(jié)合產(chǎn)物殘留物的第二種未標(biāo)記抗體。在這樣的實(shí)施方案中，加入對第二種抗體的恒定區(qū)特異性的第三種酶聯(lián)的或以其他方式標(biāo)記的抗體。然后洗滌表面，使得未結(jié)合的抗體-標(biāo)記綴合物被洗掉。然后加入化學(xué)劑以從標(biāo)記引發(fā)可以測量的信號，例如，顏色或電化學(xué)信號。測量該信號作為目標(biāo)片段的存在和量的指示。在可替代的實(shí)施方案中，第二種抗體本身是標(biāo)記的或連接至酶，從而忽略對第三種抗體的需要。
在某些實(shí)施方案中，用作進(jìn)行免疫測定的表面的固相可以是任何基本上水不溶性的惰性支持物或載體，包括表面、顆粒、多孔基質(zhì)等形式的支持物/載體。示例性支持物/載體包括由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制造的小薄片、Sephadex 、聚氯乙烯、塑料珠粒和測定板或測試管，包括96-孔微量滴定板，以及顆粒材料如濾紙、瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖和其他多糖?？商娲兀磻?yīng)性水不溶性基質(zhì)如溴化氰活化的碳水化合物和反應(yīng)性基質(zhì)可以適當(dāng)?shù)赜糜诓东@試劑固定化。
在特定實(shí)施方案中，將固定的捕獲抗體包被在微量滴定板上。例如，不是通過限制的方式，固相可以是多孔微量滴定板，其可用于一次分析多份樣品。微量滴定板的實(shí)例包括96 孔 Elisa 板，如 Maxisorb 或 Immulon (Nunc, Roskilde, Denmark)。此外，多重 ELISA技術(shù),如Luminex 技術(shù)可用于同時運(yùn)行幾百個ELISA(Millipore)。這樣的多重ELISA測定技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，除了 Luminex 技術(shù)外，包括多種涉及使用多種捕獲和/或檢測抗體用于同時詢問多種分析物的技術(shù)。這樣的多重測定中的各種檢測抗體間的區(qū)別涉及使用多種不同的標(biāo)記。可替代的多重測定技術(shù)包括LiquiChip 系統(tǒng)(Qiagen)和BD Cytometric Bead Array (BD Bioscience)。
本發(fā)明包括所有表現(xiàn)出本文描述的所需特征的捕獲抗體。例如，但不是通過限制的方式，具有本文例舉的反應(yīng)性模式的抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)，無論它們屬于的免疫球蛋白種類或亞類。在特定的實(shí)施方案中，合適的單克隆抗體可以是IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3種類或IgM、IgA種類,或任何其他已知的Ig種類或亞類。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何方法將本發(fā)明的選擇的捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段固定在合適的基質(zhì)上。在某些實(shí)施方案中，將抗體或抗原結(jié)合片段直接連接至基質(zhì)上選擇的官能團(tuán)?？商娲兀ㄟ^接頭或間隔子將抗體或抗原結(jié)合片段間接連接至基質(zhì)。在某些非限制性實(shí)施方案中，可以通過將捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段共價連接至鏈霉親和素(或生物素)，然后通過共價連接至基質(zhì)的生物素(或鏈霉親和素)間接進(jìn)行與基質(zhì)的連接?？商娲兀虼?末端硅烷可用于·包被基質(zhì)表面且異雙功能交聯(lián)劑，例如，N-Y-馬來酰亞胺丁?；趸牾啺孵?GMBS)可用于抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合。參見美國專利號5，077，210。使用該方法，可以以高密度(例如2 ng/mm2)固定抗體或其抗原結(jié)合片段。
另一種類型的表面固定技術(shù)使用聚合物水凝膠基質(zhì)。這些材料通常含有大量的水，是軟的，并且是生物惰性的。實(shí)例包括聚(乙烯醇)的交聯(lián)聚合物膜和羧甲基葡聚糖的膜。參見 Kobayashi, J.和 Y.1kada, “Covalent Immobilization ofProteins Onto the Surface of Poly (vinyl alcohol) HydrogeI，，，Biomaterials,12, (1991),第 747-751 頁；Johnsson, B.等人，“Immobilization of Proteinsto a Carboxymethyldextran-Modified Gold Surface for Biospecific InteractionAnalysis in Surface Plasmon Resonance Sensors,，，Anal.Biochem., 196, (1991),268-277; Lofas, S.和 B.Johnsson, “A Novel Hydrogel Matrix on Gold Surfacesin Surface Plasmon Resonance Sensors for Fast and Efficient CovalentImmobilization of Ligands,，，J.Chem.Soc.Commun., (1990),第 1526-1528 頁)。
本發(fā)明的捕獲抗體包括但不限于下列:a Hu IgG (H+L) ; a Hu IgG F(ab’)2;a Hu IgG λ ; a Hu IgG κ ;和 a Ms IgG (H+L)。
此外，可以使用傳統(tǒng)單克隆抗體的替代物實(shí)現(xiàn)捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段提供的功能，例如，特定生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物與基質(zhì)表面的結(jié)合。傳統(tǒng)單克隆抗體的替代物包括抗體模擬物，如但不限于，親和抗體(affibodies)、結(jié)構(gòu)域抗體、納米抗體和單抗體。
在某些實(shí)施方案中，多個具有不同結(jié)合特異性的捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至基質(zhì)表面。包括多種捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段允許同時檢測多種生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物。這樣的生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物可以源自相同或不同的產(chǎn)物。例如，但不是通過限制的方式，單一單克隆抗體產(chǎn)物的生產(chǎn)可以導(dǎo)致各種產(chǎn)物殘留物，包括但不限于，重鏈殘留物、輕鏈殘留物、可變區(qū)殘留物和恒定區(qū)殘留物。在某些實(shí)施方案中，各種捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段將以特定比例存在。這樣的捕獲抗體的混合物的一個非限制性實(shí)例概述在下面表5中，其中下述抗體:a Hu IgG (H+L) ; a Hu IgG F(ab’)2; a Hu IgG λ ； α Hu κ ;和α Ms IgG (H+L)以下述比例存在:1:2:16:8:8。
將選擇的捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段固定化至合適的基質(zhì)上并將該捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段暴露于樣品用于監(jiān)測遺留和/或用于清潔驗(yàn)證之后，有必要將生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的結(jié)合可視化。通常通過加入特異性結(jié)合生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物上的表位的檢測抗體完成這樣的可視化。
可以直接通過一些部分如熒光染料、化學(xué)發(fā)光和放射性標(biāo)記，或間接通過一些必須被反應(yīng)或衍生化的部分如酶來檢測檢測抗體。可以被直接檢測的部分的實(shí)例包括放射性同位素、熒光團(tuán)如稀土螯合物或熒光素及其衍生物；若丹明及其衍生物。必須被反應(yīng)或衍生化的部分的實(shí)例包括但不限于丹酰；傘形酮；熒光素酶；熒光素；2，3 - 二氫酞嗪二酮；辣根過氧化物酶；堿性磷酸酶；β -半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖類氧化酶；雜環(huán)氧化酶；生物素/親和素；生物素/鏈霉親和素；生物素/鏈霉親和素-HRP ；自旋標(biāo)記；噬菌體標(biāo)記；穩(wěn)定自由基等。常規(guī)方法可用于將這些可檢測部分與檢測抗體共價結(jié)合。例如，可以使用偶聯(lián)劑如二醛、碳化二亞胺、二馬來酰亞胺、雙-亞氨酸酯(imidates)、雙-重氮化聯(lián)苯胺(bis-diazotized benxidine)等為具有上述標(biāo)記的抗體加標(biāo)簽。
因?yàn)閵A心測定中的兩種抗體當(dāng)它們每個結(jié)合目標(biāo)抗原但不彼此相互作用或結(jié)合時工作最有效，所以測定固定的捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段與檢測抗體的反應(yīng)性，或在三抗體系統(tǒng)的情況下與第二種和檢測抗體的反應(yīng)性。捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段和檢測抗體之間優(yōu)選低反應(yīng)性，同時保持對于目標(biāo)抗·原的高親和力。此外，當(dāng)抗體對各自在不同位置結(jié)合目標(biāo)生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物時，它們將工作最有效。因此，應(yīng)當(dāng)評價抗體以避免配對具有重疊結(jié)合特異性的抗體。
使用針對生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段對于監(jiān)測遺留和/或驗(yàn)證清潔是有利的方法。由于單克隆抗體的高特異性和靈敏度，本發(fā)明的組合物和方法能夠檢測到遠(yuǎn)低于TOC測定的目前限值的非常低劑量生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物。此外，這樣的抗體檢測方法能夠特異性鑒定一種或多種目的API的存在，因此落在ICH Q7A和加拿大衛(wèi)生部指南-0028的推薦方案中。
5.3抗體生產(chǎn)的遺留監(jiān)測和清潔驗(yàn)證 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在生產(chǎn)其中API是抗體的藥物的情況下用于監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或用于清潔驗(yàn)證的組合物和方法。在某些實(shí)施方案中，抗體可用于藥物作為裸抗體、作為與伴侶分子(如但不限于毒素或標(biāo)記)綴合的抗體的情況下，或可以以其他方式修飾(如但不限于，通過包括修飾的氨基酸，或通過碳水化合物側(cè)鏈的添加、缺失或修飾)。在某些實(shí)施方案中，這樣的產(chǎn)物遺留監(jiān)測和/或清潔驗(yàn)證將在生產(chǎn)多克隆抗體的情況下。在某些實(shí)施方案中，這樣的產(chǎn)物遺留監(jiān)測和/或清潔驗(yàn)證將在生產(chǎn)單克隆抗體的情況下。在某些實(shí)施方案中，這樣的產(chǎn)物遺留監(jiān)測和/或清潔驗(yàn)證將在生產(chǎn)用于研究或診斷用途的抗體的情況下。在某些實(shí)施方案中，這樣的產(chǎn)物遺留監(jiān)測和/或清潔驗(yàn)證將在生產(chǎn)用于治療用途的抗體的情況下。
在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)物遺留監(jiān)測和/或清潔驗(yàn)證將在生產(chǎn)用于治療用途的單克隆抗體的情況下。目前在商業(yè)化生產(chǎn)中有三大類治療性單克隆抗體分子:完全人抗體、人源化抗體和嵌合抗體。完全人抗體分子是源自人細(xì)胞或源自表達(dá)人免疫球蛋白基因的非人細(xì)胞的抗體。相比而言，人源化抗體是在非人動物如小鼠中產(chǎn)生、但已經(jīng)隨后被修飾以反映人抗體序列的抗體。發(fā)生這種修飾主要為了使對抗體施用的免疫應(yīng)答最小化。然而，在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將保留一種或多種初始非人序列。通常進(jìn)行非人序列的這種保留以保持抗體的治療有效活性。最后，嵌合抗體分子由人源化恒定區(qū)的和非人可變區(qū)組成。通常使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)嵌合抗體以將非人動物中生產(chǎn)的抗體的可變(抗原結(jié)合)區(qū)可操作地連接至人抗體的恒定(免疫系統(tǒng)效應(yīng)物)區(qū)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在完全人抗體生產(chǎn)的情況下用于監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或用于清潔驗(yàn)證的組合物和方法。在可替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在人源化抗體生產(chǎn)的情況下用于監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或用于清潔驗(yàn)證的組合物和方法。在可替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在嵌合抗體生產(chǎn)的情況下用于監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或用于清潔驗(yàn)證的組合物和方法。在某些實(shí)施方案中，特別是其中正在用相同設(shè)施和/或工藝設(shè)備生產(chǎn)多種抗體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在完全人和人源化；完全人和嵌合；人源化和嵌合；或完全人、人源化和嵌合抗體生產(chǎn)的情況下用于監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或用于清潔驗(yàn)證的組合物和方法。
抗體包括但不限于治療性抗體中的額外多樣性發(fā)生在與特定重鏈和輕鏈(包含特定抗體)的連接中。免疫球蛋白分子由二硫鍵互連的4條多肽鏈-2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈組成。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)(CH)組成。重鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域一CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域一CL組成。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步分成稱為互補(bǔ)性·決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，由稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守區(qū)域點(diǎn)綴。每個VH和VL由3個⑶R和4個FR組成，從氨基末端到羧基末端以下述順序排列:FR1、⑶R1、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。例如，基于其重鏈的氨基酸序列，人抗體可以分成以下特定同種型=IgAp IgA2、IgD、IgE、IgGp IgG2、IgG3、IgG4和IgM。此外,根據(jù)其輕鏈的序列是否是kappa ( κ )或lambda ( λ )輕鏈序列,抗體可以分成兩組。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在IgAp IgA2, IgD、IgE、IgG1, IgG2, IgG3、IgGjPIgM抗體生產(chǎn)的情況下用于監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或用于清潔驗(yàn)證的組合物和方法。在可替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在κ或λ抗體生產(chǎn)的情況下用于監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或用于清潔驗(yàn)證的組合物和方法。在某些實(shí)施方案中，特別是其中正在用相同設(shè)施和/或工藝設(shè)備生產(chǎn)多種抗體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在生產(chǎn)具有抗體同種型和輕鏈?zhǔn)褂玫娜魏谓M合的情況下用于監(jiān)測產(chǎn)物遺留和/或用于清潔驗(yàn)證的組合物和方法。
除了全長抗體外，特異性抗體片段通常用于研究、開發(fā)中，和作為治療劑。例如，但不是通過限制的方式，這樣的抗體片段可以包含全長抗體的整個抗原結(jié)合部分或其部分。在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)包含的結(jié)合片段實(shí)例包括(i)Fab片段，包含VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域的單價片段；(Ii)F(Bb1)2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)包含VH和CHl結(jié)構(gòu)域的Fd片段；(iv)包含抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域的Fv片段，(V)包含VH結(jié)構(gòu)域的dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544-546，其完整教導(dǎo)通過引用并入本文)；和(vi)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的2個結(jié)構(gòu)域VL和VH由分開的基因編碼，但是它們可以使用重組方法通過合成接頭進(jìn)行連接，所述合成接頭使它們能夠制備為單條蛋白鏈，其中VL和VH區(qū)配對以形成單價分子(稱為單鏈 Fv(scFv);參見例如，Bird 等人(1988) Science 242:423-426 ;和 Huston 等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883，其完整教導(dǎo)通過引用并入本文)。這樣的單鏈抗體也意欲包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。還包含其他形式的單鏈抗體，如雙抗體。雙體是二價、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單一多肽鏈上表達(dá)，但使用太短而不允許相同鏈上的2個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，并且產(chǎn)生2個抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見例如,Holliger, P.,等人(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448 ；Poljak,R.J.，等人(1994) Structure 2:1121-1123，其完整教導(dǎo)通過引用并入本文)。仍進(jìn)一步地，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是通過抗體或抗體部分與一種或多種其他蛋白或肽的共價或非共價結(jié)合形成的更大免疫粘附分子的部分。這樣的免疫粘附分子的實(shí)例包括使用鏈霉親和素核心區(qū)，以制備四聚scFv分子(Kipriyanov, S.Μ.,等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101),以及使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C末端多組氨酸標(biāo)簽，以制備二價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov, S.Μ.,等人(1994)Mol.1mmunol.31:1047-1058)?？梢允褂贸Ｒ?guī)技術(shù)如完整抗體的分別地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化從完整抗體制備抗體部分如Fab和F(ab’)2片段。此外，可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得抗體、抗體部分和免疫粘附分子。在一個方面，抗原結(jié)合部分是完整結(jié)構(gòu)域或完整結(jié)構(gòu)域?qū)?。·在某些?shí)施方案中，本發(fā)明包括用于檢測抗體片段和含有抗體片段的分子中的一個或多個或任何組合的組合物和方法，所述抗體片段和含有抗體片段非限制性地選自:Fab ;F(ab’)2 ；Fd ；Fv ；scFv ;一種或多種分離的⑶R ;雙抗體；和免疫粘附分子。5.4捕獲和檢測抗體的生產(chǎn)
如本節(jié)中使用的，術(shù)語“捕獲抗體”和“檢測抗體”是指完整抗體或其抗原結(jié)合片段。可以通過多種技術(shù)生成本發(fā)明的捕獲和檢測抗體，包括用目的抗原免疫動物和隨后的常規(guī)單克隆抗體方法，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。盡管體細(xì)胞雜交程序是優(yōu)選的，但是原則上可以采用用于生產(chǎn)單克隆抗體的其他技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌性轉(zhuǎn)化。用于制備雜交瘤的一種優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。雜交瘤生產(chǎn)是非常良好確立的程序。用于分離免疫的脾細(xì)胞用于融合的免疫方案和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。融合伴侶(例如，鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合方案也是已知的?？贵w優(yōu)選可以是人、嵌合或人源化抗體?？梢曰谌缟纤鲋苽涞姆侨藛慰寺】贵w序列制備本發(fā)明的嵌合或人源化抗體。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以得自目的非人雜交瘤，并且使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)工程改造為含有非鼠(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)連接(參見例如Cabilly等人的美國專利號4，816，567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠⑶R區(qū)插入人構(gòu)架內(nèi)(參見例如Winter的美國專利號5，225，539，和Queen等人的美國專利號 5，530，101 ;5，585，089 ;5，693，762 和 6，180，370)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及評價一組捕獲和/或檢測抗體或其抗原結(jié)合片段以鑒定對于正在生產(chǎn)的特定生物技術(shù)產(chǎn)物適當(dāng)?shù)牟东@和/或檢測抗體或其抗原結(jié)合片段。示例性但非限制性的組包括:抗人IgG (H+L)、抗人IgG F(ab’) 2、抗人IgG κ、抗人IgG λ和抗小鼠IgG (H+L)抗體。使用抗人IgG (H+L)捕獲和/或檢測整個(完全人/人源化抗體)產(chǎn)物分子；抗人IgG F(ab’)2、抗人IgG κ和抗人IgG λ將捕獲和/或檢測產(chǎn)物結(jié)合位點(diǎn)，如果這樣的結(jié)合位點(diǎn)是人或人源化的；并且抗小鼠IgG (H+L)將提供對于嵌合產(chǎn)物的特異性。在某些實(shí)施方案中，特別是在設(shè)備清潔后發(fā)生的那些實(shí)施方案中，當(dāng)殘留物產(chǎn)物可能被片段化、降解或以其他方式變性時，各種捕獲和/或檢測抗體的組合將確保檢測盡可能多的產(chǎn)物殘留物。6.實(shí)施例
6.1.ELISA檢測測定
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及免疫測定法，其中一種或多種捕獲抗體或其結(jié)合片段用于檢測與生物技術(shù)產(chǎn)物生產(chǎn)相關(guān)的殘留物。如表I中所示，評價與初始測定開發(fā)相關(guān)的5種商業(yè)上獲得的捕獲抗體。在該研究中還評價這些相同的五種與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗體(“Ab”)作為檢測抗體。表1.捕獲抗體
權(quán)利要求
1.用于檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的方法，其中將測試樣品與包含對于所述產(chǎn)物殘留物特異性的捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段的基質(zhì)接觸，并且抗體-抗原復(fù)合物的檢測指示生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通過監(jiān)測能夠結(jié)合所述抗體-抗原復(fù)合物的標(biāo)記的檢測抗體的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)所述抗體-抗原復(fù)合物的檢測。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的存在指示產(chǎn)物遺留。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物的量指示清潔過程的效率。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)物殘留物源自核酸產(chǎn)物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)物殘留物源自蛋白產(chǎn)物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述蛋白產(chǎn)物選自:酶；肽激素；多克隆抗體；人單克隆抗體；人源化單克隆抗體；嵌合單克隆抗體；單鏈抗體；Fab抗體片段；F(ab’)2抗體片段；Fd抗體片段；Fv抗體片段；分離的CDR ;雙抗體；和免疫粘附分子。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述捕獲抗體或其抗原結(jié)合部分選自:抗人IgG(H+L)、抗人IgG F(ab’)2、抗人IgG κ、抗人IgG λ、抗小鼠IgG (H+L)抗體；以及其組合。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)包含兩種或更多種具有不同結(jié)合特異性的捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在監(jiān)測產(chǎn)物遺留時檢測生物技術(shù)產(chǎn)物殘留物和/或用于在生物技術(shù)產(chǎn)物的制造中清潔驗(yàn)證的組合物和高度靈敏的方法。具體而言，本發(fā)明涉及免疫測定法，其中一種或多種捕獲抗體或其抗原結(jié)合片段用于檢測與生物技術(shù)產(chǎn)物生產(chǎn)相關(guān)的殘留物。
文檔編號G01N33/68GK103221823SQ201180054320
公開日2013年7月24日 申請日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者L.楊, N.拉馬蘇布拉曼延 申請人:Abbvie 公司