專利名稱：使用微米圖案化的成核位點(diǎn)控制肌動(dòng)蛋白絲的生長(zhǎng)和組織的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及裝置和方法，所述裝置和方法用于控制肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的組織并由此用于研究肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的組織，用于篩選能夠調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的組織的化合物或用于制造基于肌動(dòng)蛋白的組件，特別是使用肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)作為模板用于其他納米工程學(xué)過(guò)程。
背景技術(shù)：
肌動(dòng)蛋白絲構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要組分之一。肌動(dòng)蛋白絲是從肌動(dòng)蛋白單體自發(fā)自組裝到細(xì)胞中的聚合物。它們形成復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，為調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀提供機(jī)械支撐。以絲狀偽足或以應(yīng)力纖維組裝成束后，它們?cè)诩?xì)胞形態(tài)發(fā)生、粘附和運(yùn)動(dòng)期間發(fā)揮關(guān)鍵的作用。所述束的出現(xiàn)已與體內(nèi)的特異性肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)物廣泛相關(guān)聯(lián)。通過(guò)在本體溶液(bulksolution)中或使用仿生裝置進(jìn)行肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)集合體的生物化學(xué)重建，也突顯了這樣的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。然而，還沒有被查明幾何學(xué)邊界例如在細(xì)胞中所遇到的那些如何影響高度有序的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)形成這一問(wèn)題。肌動(dòng)蛋白單體可以從過(guò)濾后的細(xì)胞勻漿液分離和純化。在體外，這些單體能夠在成核蛋白和ATP (能量來(lái)源)的存在下聚合，形成新的肌動(dòng)蛋白絲(F-肌動(dòng)蛋白)。與細(xì)胞內(nèi)集合體相反，當(dāng)在體外形成時(shí)，肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)沒有特定結(jié)構(gòu)。已描述了幾種用于在體外重建肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的方法(Haraszti等，2009)。在第一種方法中，在溶液中從純化的單體執(zhí)行肌動(dòng)蛋白絲的體外聚合(例如US2004/0038323、US2006/0003399)。然而，這種類型的重建的缺點(diǎn)在于肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)且隨機(jī)的組織，特別是完全缺乏對(duì)引發(fā)區(qū)域的幾何形狀控制。在第二種方法中，使用分散在溶液中的包被有成核蛋白的珠子來(lái)執(zhí)行肌動(dòng)蛋白的聚合(Michelot等，2007)。然而，這種包被珠子的主要限制之一是它們?cè)谌芤褐械碾S機(jī)相對(duì)位置。在第三種方法中，在肌動(dòng)蛋白絲在溶液中聚合之后對(duì)肌動(dòng)蛋白絲的組織進(jìn)行控制。例如，可以將它們固定在支柱網(wǎng)絡(luò)上(S卩，肌動(dòng)蛋白絲將沿著支柱網(wǎng)絡(luò)排列成行)(Roos等，2003)。在29微米高支柱的頂部制造2微米寬金盤的陣列。這些點(diǎn)被用于接枝肌球蛋白并由此連接肌動(dòng)蛋白絲。然后使用包含肌動(dòng)蛋白單體的溶液延長(zhǎng)這些連接的肌動(dòng)蛋白絲。從所述點(diǎn)生長(zhǎng)出來(lái)的長(zhǎng)絲沒有定向，并且沒有在空間中自發(fā)組織網(wǎng)絡(luò)。但是添加一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白即細(xì)絲蛋白，可以迫使肌動(dòng)蛋白絲成束，并引起在點(diǎn)之間形成橋。這種組織只有在肌動(dòng)蛋白絲被錨定在微支柱的頂部上時(shí)才會(huì)發(fā)生，所述微支柱的長(zhǎng)度必須超過(guò)肌動(dòng)蛋白絲的長(zhǎng)度。在平坦表面上而不是在支柱的頂部上的同樣的點(diǎn)陣列，即使在細(xì)絲蛋白存在下也只促進(jìn)形成不清楚的網(wǎng)絡(luò)。也可以將它們送入放置有帶光阱的珠子的腔室中(Uhrig等，2009)。然而，在這兩種情況下，肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)不是自組裝的；它通過(guò)流體的流動(dòng)或捕獲珠子的位置從外部定向。最終結(jié)構(gòu)體系不依賴于肌動(dòng)蛋白絲集合體的生物學(xué)性質(zhì)和相互作用，因此這些方法不能用于測(cè)試這些性質(zhì)。此外，在從外部定向的肌動(dòng)蛋白絲束中，單個(gè)肌動(dòng)蛋白絲的極性不受控制。因此不能高度控制這些網(wǎng)絡(luò)的精確結(jié)構(gòu)體系。在第四種方法中，通過(guò)在表面上引入肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)和肌動(dòng)蛋白捕獲位點(diǎn)，在固體支持物上控制肌動(dòng)蛋白絲的組織(US20050106629)。使用這兩種錨定點(diǎn)，可以控制肌動(dòng)蛋白絲的組織。然而，結(jié)構(gòu)不是自組裝的，而是通過(guò)成核位點(diǎn)和捕獲位點(diǎn)的受控位置從外部安排的。具體來(lái)說(shuō)，將成核位點(diǎn)在支持物上排列成使得來(lái)自于一個(gè)成核位點(diǎn)的肌動(dòng)蛋白絲不與來(lái)自于另一個(gè)成核位點(diǎn)的肌動(dòng)蛋白絲相互作用。此外，從成核位點(diǎn)生長(zhǎng)出來(lái)的肌動(dòng)蛋白絲沒有定向，并且必須通過(guò)由磁阱或光阱所操縱的珠子從外部驅(qū)動(dòng)。這些方法中沒有一種允許提供具有可重復(fù)和受控的幾何形狀的有序肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的自組裝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人第一次證實(shí)了成核幾何形狀本身可能是肌動(dòng)蛋白絲體系結(jié)構(gòu)的首要決定因素。本發(fā)明人確定了指導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲組織的規(guī)律，第一規(guī)律是肌動(dòng)蛋白絲相對(duì)于成核位點(diǎn)放射狀生長(zhǎng)。他們開發(fā)出肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)的微米圖案，所述微米圖案允許制備有趣且可重復(fù)的肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。具體來(lái)說(shuō)，形狀、取向和成核區(qū)域之間的距離控制了肌動(dòng)蛋白絲的取向和長(zhǎng)度、肌動(dòng)蛋白絲-肌動(dòng)蛋白絲的相互作用和絲狀偽足樣束的形成(平行束)或應(yīng)力纖維樣束的形成(反平行束)。因此，本發(fā)明提供了一種裝置，其包含表面，在所述表面上配置有包含含有肌動(dòng)蛋白成核劑的線(例如至少一條線)的圖案、優(yōu)選為納米圖案或微米圖案，或包含至少兩個(gè)點(diǎn)的圖案，其中每個(gè)點(diǎn)包含肌動(dòng)蛋白成核劑，并且所述點(diǎn)處于允許來(lái)自于兩個(gè)相鄰點(diǎn)的聚合的肌動(dòng)蛋白絲發(fā)生相互作用的適合距離。優(yōu)選情況下，所述線具有15、20、25或30微米，優(yōu)選15或20微米的最小長(zhǎng)度。優(yōu)選情況下，所述點(diǎn)具有I至10 μ m、優(yōu)選2至7 μ m、更優(yōu)選約5μπι的直徑。優(yōu)選情況下，所述表面在其上配置有多個(gè)圖案，優(yōu)選為多個(gè)可尋址圖案。優(yōu)選情況下，所述肌動(dòng)蛋白成核劑選自WASP/SCAR家族的成員、其PWA片段及其VAC結(jié)構(gòu)域、ActaA、IscA及其C-末端區(qū)域。更優(yōu)選情況下,所述肌動(dòng)蛋白成核劑是pWA。任選地，所述PWA與一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)簽(例如GST標(biāo)簽和/或His標(biāo)簽)連接或融合。更具體來(lái)說(shuō)，所述PWA在其N端處與GST標(biāo)簽連接或融合，并在其C端處與His標(biāo)簽連接或融合。優(yōu)選情況下，所述圖案包含數(shù)個(gè)點(diǎn)或數(shù)條線，所述點(diǎn)或線處于允許來(lái)自于兩個(gè)相鄰點(diǎn)或兩條相鄰線的聚合的肌動(dòng)蛋白絲發(fā)生相互作用的適合距離。因此，所述圖案可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10條線或至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)點(diǎn)，具體來(lái)說(shuō)可以包括2、3、4、5、6、7、8、9或10條線或2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)點(diǎn)。優(yōu)選情況下，兩個(gè)相鄰線或兩個(gè)相鄰點(diǎn)(即兩條相鄰線的近端)之間的距離為1、2、5、10、15、20、25或30微米，優(yōu)選為
5、10、15或20微米，更優(yōu)選為約10微米。優(yōu)選情況下，所述圖案、優(yōu)選為納米圖案或微米圖案包含:-一個(gè)圓或數(shù)個(gè)圓，優(yōu)選為嵌套的圓；和/或-兩條以上的線；和/或-點(diǎn)的陣列。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述圖案、優(yōu)選為納米圖案或微米圖案包含2至5個(gè)圓，所述圓具有不同的直徑并且是同心或偏心的。優(yōu)選情況下，所述圓是嵌套的。換句話說(shuō)，較小的圓被包含在較大的圓內(nèi)。在第一可選優(yōu)選實(shí)施方案中，所述圖案、優(yōu)選為納米圖案或微米圖案包含兩條以上的線，特別是兩條以上的直線，所述線是平行的或相對(duì)于彼此形成小于或不超過(guò)25°的角度、優(yōu)選相對(duì)于彼此形成小于或不超過(guò)22°的角度、更優(yōu)選相對(duì)于彼此形成小于或不超過(guò)10°的角度。在第二可選優(yōu)選實(shí)施方案中，所述圖案、優(yōu)選為納米圖案或微米圖案包含兩條以上的線，特別是兩條以上的直線，所述線相對(duì)于彼此形成超過(guò)25、30、35、40或45°并小于110°的角度，優(yōu)選相對(duì)于彼此形成在45°和90°之間的角度。任選地，所述圖案包括兩條線，優(yōu)選為兩條直線。任選地，所述圖案包括數(shù)條線，所述線被排列成形成放射狀圖案。在第三可選優(yōu)選實(shí)施方案中，所述圖案、優(yōu)選為納米圖案或微米圖案包含兩條以上的線，特別是兩條以上的直線，所述線相對(duì)于彼此形成超過(guò)110°并小于150°、140°或130°，優(yōu)選在110°和120°之間的角度。任選地，所述圖案包括兩條線性肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)，優(yōu)選為兩條直線的肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)。任選地，所述圖案包括數(shù)條線性肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)，所述位點(diǎn)被排列成形成放射狀圖案。優(yōu)選情況下，所述表面是硅、應(yīng)變硅、多晶硅、多晶硅、二氧化硅、鍺、砷化鎵、玻璃、塑料、陶瓷或金屬。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表面是玻璃。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表面是平面的。本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其包含本文中所公開的裝置和肌動(dòng)蛋白聚合混合物，所述混合物包含足以引起肌動(dòng)蛋白聚合的組分。所述組分包含肌動(dòng)蛋白單體、ATP、Arp2/3復(fù)合體、肌動(dòng)蛋白絲和二價(jià)陽(yáng)離子。任選地，所述肌動(dòng)蛋白聚合混合物還可以包含肌動(dòng)蛋白抑制蛋白(prof i I in )。任選地,所述聚合混合物包含標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白單體，特別是用突光染料或蛋白標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白單體和/或結(jié)合有金屬原子、特別是金的肌動(dòng)蛋白單體。本發(fā)明還涉及用于制備或制造肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的方法，所述方法包括:a)提供本文中所公開的裝置；b)將所述圖案、優(yōu)選為所述納米圖案或微米圖案與包含肌動(dòng)蛋白單體、ATP、二價(jià)陽(yáng)離子、肌動(dòng)蛋白絲和Arp2/3復(fù)合體的聚合溶液或混合物相接觸，從而引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合；以及任選地c)移除所述聚合溶液或混合物。所述方法還可以包括從所述表面移除獲得的肌動(dòng)蛋白絲的步驟。所述方法還可以包括:所述肌動(dòng)蛋白絲的包被，特別是用傳導(dǎo)性物質(zhì)例如金包被；和/或所述肌動(dòng)蛋白絲的處理，特別是用肌動(dòng)蛋白交聯(lián)劑例如肌成束蛋白或α-輔肌動(dòng)蛋白處理。優(yōu)選情況下，所述聚合溶液或混合物含有足以引起臨界密度的肌動(dòng)蛋白絲聚合的量的Arp2/3復(fù)合體，特別是至少30nM的Arp2/3復(fù)合體。此外，本發(fā)明提供了用于研究肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的空間組織的方法，其中所述方法包括:a)提供本文中所公開的裝置；b)將所述圖案、優(yōu)選為所述納米圖案或微米圖案與包含肌動(dòng)蛋白單體、ATP、二價(jià)陽(yáng)離子、肌動(dòng)蛋白絲和Arp2/3復(fù)合體的聚合溶液或混合物相接觸，從而引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合；以及c)觀察所述肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)。優(yōu)選情況下，所述聚合溶液或混合物含有足以引起臨界密度的肌動(dòng)蛋白絲聚合的量的Arp2/3復(fù)合體，特別是至少30nM的Arp2/3復(fù)合體。本發(fā)明還涉及用于篩選能夠調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的測(cè)試分子的方法，其中所述方法包括:a)提供本文中所公開的裝置；b)將所述圖案、優(yōu)選為所述納米圖案或微米圖案與包含肌動(dòng)蛋白單體、ATP、二價(jià)陽(yáng)離子、肌動(dòng)蛋白絲和Arp2/3復(fù)合體的聚合溶液或混合物相接觸，從而引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合；以及c)觀察所述肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)；其中在所述肌動(dòng)蛋白聚合之前、期間和/或在所述肌動(dòng)蛋白聚合之后添加所述測(cè)試分子，并且其中確定所述測(cè)試分子對(duì)所述肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的影響。優(yōu)選情況下，所述聚合溶液或混合物含有足以弓I起臨界密度的肌動(dòng)蛋白絲聚合的量的Arp2/3復(fù)合體，特別是至少30nM的Arp2/3復(fù)合體。最后，本發(fā)明涉及用于研究分子馬達(dá)例如肌球蛋白的方法，所述方法包括:a)提供本文中所公開的裝置山)將所述圖案、優(yōu)選為所述納米圖案或微米圖案與包含肌動(dòng)蛋白單體、ATP、二價(jià)陽(yáng)離子、肌動(dòng)蛋白絲和Arp2/3復(fù)合體的聚合溶液或混合物相接觸，從而引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合；以及c)觀察聚合的肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)構(gòu)、相互作用和/或變形；其中在所述肌動(dòng)蛋白聚合之前、期間和/或在所述肌動(dòng)蛋白聚合之后添加所述分子馬達(dá)。優(yōu)選情況下，所述聚合溶液或混合物含有足以引起臨界密度的肌動(dòng)蛋白絲聚合的量的Arp2/3復(fù)合體，特別是至少30nM的Arp2/3復(fù)合體。任選地，也可以與所述分子馬達(dá)同時(shí)或順序添加測(cè)試分子，并觀察所述測(cè)試分子對(duì)聚合的肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)構(gòu)和變形的影響。任選地，所述方法還可以包括選擇能夠調(diào)節(jié)所述分子馬達(dá)的活性及其與肌動(dòng)蛋白絲的相互作用的測(cè)試分子。


圖1:肌動(dòng)蛋白成核和生長(zhǎng)的幾何形狀控制。圖la，表面微米圖案化方法。圖lb，在PWA包被的微米圖案上成核的肌動(dòng)蛋白絲以及在不存在pWA包被的情況下溶液中的自發(fā)肌動(dòng)蛋白絲聚合的落射熒光顯微術(shù)圖像。圖lc，肌動(dòng)蛋白絲在PWA包被的微米圖案上的成核和生長(zhǎng)。圖ld，將熒光圖像過(guò)濾，并根據(jù)肌動(dòng)蛋白絲沿著條的位置(X)人工測(cè)量肌動(dòng)蛋白絲與所述條微米圖案主軸之間的角度。比例尺表示10 μ m。圖2:肌動(dòng)蛋白絲數(shù)量和長(zhǎng)度的生物化學(xué)控制。圖2a，隱失波顯微術(shù)下肌動(dòng)蛋白-alexa568集合體沿著pWA包被的微米圖案的引發(fā)和伸延。圖2b，培養(yǎng)基中存在的單體肌動(dòng)蛋白濃度的變化。隨著肌動(dòng)蛋白濃度增加，從成核區(qū)延伸出來(lái)的肌動(dòng)蛋白絲變得更長(zhǎng)。圖2c，成核倍率隨Arp2/3復(fù)合體濃度的變化。隨著Arp2/3復(fù)合體濃度的增加，逸出成核區(qū)的肌動(dòng)蛋白絲變得更短。圖2d，對(duì)刺端加帽物即異二聚體加帽蛋白的響應(yīng)。隨著加帽蛋白濃度的增加，逸出成核區(qū)的肌動(dòng)蛋白絲變短。圖2e，肌動(dòng)蛋白單體-Ca-ATP而不是生理學(xué)相關(guān)形式肌動(dòng)蛋白單體-Mg-ATP的聚合。在肌動(dòng)蛋白組裝的標(biāo)準(zhǔn)條件下，鈣肌動(dòng)蛋白絲不受擾亂地生長(zhǎng)，形成微米圖案化的成核表面。圖2f，肌動(dòng)蛋白在0.25%甲基纖維素存在下的聚合。圖2g，肌動(dòng)蛋白在1%甲基纖維素存在下的聚合。在兩種情況下，肌動(dòng)蛋白絲保持其組裝成束的性質(zhì)。比例尺為20 μ m。圖3:肌動(dòng)蛋白絲的長(zhǎng)度控制它們穿越致密肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的能力。圖3a，在成核圓上形成的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的熒光顯微術(shù)圖像。圖3b，通過(guò)幾張圖像(第一列)的重疊和平均所計(jì)算得到的以及來(lái)自于肌動(dòng)蛋白絲生長(zhǎng)(第三和第四列)的數(shù)值模擬的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)密度圖。示出了成核區(qū)域。本發(fā)明人測(cè)定了沿著插入圖像中的內(nèi)圓和外圓(第二列，虛線的圓)線掃描的熒光比率。點(diǎn)對(duì)應(yīng)于實(shí)驗(yàn)密度圖的比率(第二列)；線是指其中肌動(dòng)蛋白絲能夠或不能穿越致密肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的數(shù)值模擬的比率(第三和第四列)。比例尺表示ΙΟμπι。圖4:成核區(qū)域的取向控制束的形成。圖4a，在120° V形成核區(qū)上成核的肌動(dòng)蛋白絲的成核、延長(zhǎng)和變形。圖4b，在四種不同角度的V形區(qū)上形成的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的熒光顯微術(shù)圖像。圖4c，每個(gè)角度30張圖像的平均熒光投影。圖4d，由在微米圖案上成核的肌動(dòng)蛋白絲的相互作用引起的束形成的示意圖。沿著在平均后的圖像上執(zhí)行的線掃描(虛線)的熒光強(qiáng)度分布；組c中的箭頭表示最大熒光。比例尺表示ΙΟμπι。圖5:肌動(dòng)蛋白絲的固有性質(zhì)和集體組裝調(diào)控平行束的形成。圖5a，隨時(shí)間推移在8分枝的放射狀陣列上獲得肌動(dòng)蛋白絲的成核和延長(zhǎng)。圖5b，在肌動(dòng)蛋白組裝的穩(wěn)態(tài)下三種尺寸的放射狀陣列的熒光圖像。圖5c，平均熒光投影。圖5d是圖5b的放大。圖5e，條的底部與轉(zhuǎn)變點(diǎn)位置之間的距離d，在三種放射狀陣列尺寸之間沒有變化。圖5f，模型假設(shè):肌動(dòng)蛋白絲的概率性行為取決于它們的局部環(huán)境。圖5g，左側(cè):來(lái)自于圖5e的三種不同放射狀陣列尺寸的組合實(shí)驗(yàn)測(cè)量值。右側(cè):根據(jù)概率Q(y)和沿著X軸的正常變化性計(jì)算得到的20000個(gè)轉(zhuǎn)變點(diǎn)的位置。中間:轉(zhuǎn)變點(diǎn)位置的實(shí)驗(yàn)測(cè)量值與模型函數(shù)Q(y)的比較。圖5h，左側(cè):大的放射狀陣列的每個(gè)扇形的平均熒光投影。右側(cè):構(gòu)成根據(jù)函數(shù)Q(y)產(chǎn)生的束的10000個(gè)平行肌動(dòng)蛋白絲的計(jì)算得到的熒光強(qiáng)度。中間:沿著實(shí)驗(yàn)平均圖像(點(diǎn))和從模型獲得的分析公式上的對(duì)分線的熒光強(qiáng)度的比較。比例尺表示ΙΟμπι。圖6:成束蛋白對(duì)幾何形狀誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的差異影響。圖6a添加α -輔肌動(dòng)蛋白或肌成束蛋白對(duì)圖案化表面上預(yù)先形成的絲狀結(jié)構(gòu)的影響。為了引入蛋白而不擾亂肌動(dòng)蛋白絲的組織，使用了特殊設(shè)置。不是產(chǎn)生流動(dòng)池，而是將肌動(dòng)蛋白聚合混合物直接滴加在微米圖案化的蓋玻片上，并放置在濕度箱中。然后可以將成束蛋白的液滴輕輕添加在其頂部。這種I μ Ma-輔肌動(dòng)蛋白的添加引起相鄰的肌動(dòng)蛋白絲在有序的結(jié)構(gòu)體系內(nèi)成束(放大的圖像)，而I μ M肌成束蛋白不引起變化。圖6b，圖像顯示了從一開始就添加a-輔肌動(dòng)蛋白的影響。在高濃度下失去了肌動(dòng)蛋白絲的標(biāo)準(zhǔn)組織。圖6c，a-輔肌動(dòng)蛋白使肌動(dòng)蛋白絲成束。在4°C下以13krpm轉(zhuǎn)速對(duì)4μ M肌動(dòng)蛋白執(zhí)行低速離心測(cè)定法,所述肌動(dòng)蛋白如所示在存在或不存在a -輔肌動(dòng)蛋白的條件下在20°C下組裝至穩(wěn)態(tài)I小時(shí)。未成束的肌動(dòng)蛋白絲被保留在上清液中(第I和2道)，而a -輔肌動(dòng)蛋白成束的肌動(dòng)蛋白絲被轉(zhuǎn)移至沉淀物(第3至12道)。在低速沉淀物中回收的肌動(dòng)蛋白絲的百分率隨a-輔肌動(dòng)蛋白濃度而變化，顯示出a-輔肌動(dòng)蛋白以20nM的表觀Kd與肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合。圖6d，圖像顯示了從一開始就添加肌成束蛋白(IOOnM)的影響。在該濃度下失去肌動(dòng)蛋白絲的標(biāo)準(zhǔn)組織。圖7:通過(guò)TIRF顯微術(shù)觀察到的平行和反平行肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)形成的實(shí)時(shí)獲取。從兩個(gè)成核條(虛線卵形區(qū))引發(fā)肌動(dòng)蛋白絲組裝。線突顯了從在成核區(qū)上引發(fā)的分枝肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)發(fā)出的肌動(dòng)蛋白絲的取向。小的倒置箭頭表示延長(zhǎng)中的刺端的位置。大的箭頭指出反平行(在200s處)或平行(在360s處)肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的形成。圖8:點(diǎn)陣列的肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)。從肌動(dòng)蛋白成核劑pWA的點(diǎn)陣列引發(fā)肌動(dòng)蛋白絲組裝。點(diǎn)的直徑為5微米，點(diǎn)相隔20微米。點(diǎn)陣列的使用產(chǎn)生特定且可重復(fù)的肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)。肌動(dòng)蛋白絲束是肌動(dòng)蛋白絲的反平行排列。圖9:研究分子馬達(dá)對(duì)基于成核劑的放射狀圖案的肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的影響。向形成45°角的8個(gè)條的放射狀圖案添加聚合混合物。肌動(dòng)蛋白絲在條的近端部分中形成預(yù)期的反平行束，并在遠(yuǎn)端部分中形成平行束。為了測(cè)試一種分子馬達(dá)肌球蛋白VI對(duì)預(yù)先形成的結(jié)構(gòu)的作用，在完成肌動(dòng)蛋白絲聚合后向混合物添加IOnM純化的雙頭肌球蛋白VI(DeLaCruz等,2001)。通過(guò)每分鐘獲取一張Alexa488標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲的圖像,在時(shí)間流逝視頻顯微術(shù)中監(jiān)測(cè)所述影響。圖像顯示出結(jié)構(gòu)底部部分的收縮，表明分子馬達(dá)使反平行的肌動(dòng)蛋白絲沿著彼此滑動(dòng)。然而，在幾分鐘后，收縮傳播到結(jié)構(gòu)的其余部分，在僅由平行束構(gòu)成的純放射狀結(jié)構(gòu)中引起所有肌動(dòng)蛋白絲的聚結(jié)。該實(shí)驗(yàn)突顯了肌球蛋白VI對(duì)肌動(dòng)蛋白絲的實(shí)際收縮效應(yīng)，及其產(chǎn)生能夠使結(jié)構(gòu)完全變形的強(qiáng)大力量的能力。發(fā)明詳述本發(fā)明人確定了指導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲空間自組織的規(guī)律，第一規(guī)律是肌動(dòng)蛋白絲相對(duì)于成核位點(diǎn)放射狀生長(zhǎng)，其中它們的刺端被定向在遠(yuǎn)端。他們開發(fā)了肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)的微米圖案，所述微米圖案允許制備有趣且可重復(fù)的肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。具體來(lái)說(shuō)，形狀、取向和成核區(qū)域之間的距離控制了肌動(dòng)蛋白絲的取向和長(zhǎng)度、肌動(dòng)蛋白絲-肌動(dòng)蛋白絲的相互作用和絲狀偽足樣束或應(yīng)力纖維樣束的形成。“自組織”在本文中意在指肌動(dòng)蛋白絲的固有物理化學(xué)性質(zhì)將促進(jìn)它們的相互作用和空間重排。肌動(dòng)蛋白絲將交叉或改變它們的原始取向，并以平行或反平行方式對(duì)齊。肌動(dòng)蛋白絲的這些取向過(guò)程不需要外部干預(yù)(包括實(shí)驗(yàn)人員、外部材料或肌動(dòng)蛋白捕獲位點(diǎn))。圖案允許肌動(dòng)蛋白絲的極化。對(duì)于所有肌動(dòng)蛋白絲來(lái)說(shuō)，刺端被定向在遠(yuǎn)端?！凹?dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)”、“肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)體系結(jié)構(gòu)”或“肌動(dòng)蛋白絲組織”在本文中意在指肌動(dòng)蛋白絲相對(duì)于彼此的空間定位，即肌動(dòng)蛋白絲在它們所形成的網(wǎng)絡(luò)中采取的幾何形狀。通過(guò)肌動(dòng)蛋白絲的相互作用，它們形成肌動(dòng)蛋白絲的束。具體來(lái)說(shuō)，取決于圖案，它提供了平行肌動(dòng)蛋白絲、反平行肌動(dòng)蛋白絲、平行肌動(dòng)蛋白絲的束、反平行肌動(dòng)蛋白絲的束等。“肌動(dòng)蛋白絲的平行相互作用”意在指所述肌動(dòng)蛋白絲表現(xiàn)出相同極性?！凹?dòng)蛋白絲的反平行相互作用”意在指所述肌動(dòng)蛋白絲表現(xiàn)出相反極性。此外，束的取向可以由圖案控制。因此，由于這些圖案提供了可重復(fù)且可預(yù)測(cè)的肌動(dòng)蛋白絲結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)，它們是非常有用的。本發(fā)明涉及適用于制備肌動(dòng)蛋白絲的表面以及使用它們的方法。取決于圖案形式，本文公開的表面可以形成非常薄的結(jié)構(gòu)(像單個(gè)肌動(dòng)蛋白絲一樣薄，約7-8nm)，或者當(dāng)圖案產(chǎn)生肌動(dòng)蛋白絲的束時(shí)，形成較大結(jié)構(gòu)(例如90-100nm)。另外，具有多個(gè)肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)構(gòu)可以被成形，以形成例如柱。因此，本發(fā)明提供了用于在微米和納米級(jí)上形成用于制造和其他目的的各種有序結(jié)構(gòu)的方法和組合物。本發(fā)明提供了一種裝置，其包含表面，在所述表面上配置有包含含有肌動(dòng)蛋白成核劑的線(例如至少一條線)的圖案、優(yōu)選為納米圖案或微米圖案，或包含至少兩個(gè)含有肌動(dòng)蛋白成核劑的點(diǎn)的圖案，所述點(diǎn)處于允許來(lái)自于兩個(gè)相鄰點(diǎn)的聚合的肌動(dòng)蛋白絲發(fā)生相互作用的適合距離。具體來(lái)說(shuō)，所述表面在其上配置有多個(gè)圖案，優(yōu)選為多個(gè)可尋址圖案。多個(gè)可尋址圖案意在指所述圖案在所述表面上具有不同的已知位置，所述位置被記錄并可以被接近。每個(gè)圖案位置的精確位置知識(shí)使這些“可尋址”圖案可用于高通量測(cè)定法。優(yōu)選情況下，圖案是納米圖案或微米圖案。更優(yōu)選情況下，圖案是微米圖案。優(yōu)選情況下，表面上的圖案是一致的?？蛇x地，表面也可以包含數(shù)個(gè)系列的不同圖案。優(yōu)選情況下，當(dāng)表面包含數(shù)個(gè)圖案時(shí)，所述圖案配置在其上的距離使得兩個(gè)圖案之間不存在肌動(dòng)蛋白絲相互作用。圖案
首先，圖案意在指納米或微米級(jí)的圖案。因此，術(shù)語(yǔ)圖案可以被納米圖案或微米圖案代替。更優(yōu)選情況下，圖案是微米圖案。重要的是指出，在本發(fā)明中，在表面上不需要肌動(dòng)蛋白捕獲位點(diǎn)。事實(shí)上，肌動(dòng)蛋白絲的組織和相互作用以及由此形成的結(jié)構(gòu)由肌動(dòng)蛋白成核劑的圖案的幾何形狀來(lái)控制。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表面不具有配置在其上的肌動(dòng)蛋白捕獲位點(diǎn)。具體來(lái)說(shuō)，肌動(dòng)蛋白捕獲位點(diǎn)意在指肌動(dòng)蛋白捕獲劑，所述肌動(dòng)蛋白捕獲劑選自肌球蛋白、N-乙基馬來(lái)酰亞胺-肌球蛋白、鬼筆環(huán)肽、α -輔肌動(dòng)蛋白和肌成束蛋白。在第一實(shí)施方案中，表面可以具有配置在其上的圖案，更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，所述圖案包含一條或數(shù)條包含肌動(dòng)蛋白成核劑的線或由肌動(dòng)蛋白成核劑制成的線。線可以是直線或曲線或其組合。線可以是開放或閉合的。開放或閉合的線可以形成任何幾何形式或圖形。當(dāng)然，某些幾何形式或圖形可能表現(xiàn)出與其他形式或圖形相比更有趣的特點(diǎn)(例如在肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)方面)。人們可以設(shè)想形成或包含圓、正方形、菱形、三角形、橢圓形及其組合的圖案。線具有15、20、25或30微米、優(yōu)選15或20微米的最小長(zhǎng)度。對(duì)于線來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)度至少為厚度的三倍。當(dāng)圖案包括數(shù)條線時(shí)，所述線被配置在適合的距離處以允許聚合的肌動(dòng)蛋白絲發(fā)生相互作用。線的厚度可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行調(diào)整，并且可以是例如0.05-100 μ m。厚度為50-100nm的線可以提供更精確的結(jié)構(gòu)。也可以設(shè)想具有大厚度的線。然而，適合的厚度可以為I至10 μ m、優(yōu)選2至7 μ m、更優(yōu)選約5 μ m。在特定實(shí)施方案中，線型圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，包括一個(gè)或數(shù)個(gè)圓。具有數(shù)個(gè)圓的圖案提供了向內(nèi)和向外生長(zhǎng)的肌動(dòng)蛋白絲之間的相互作用，從而在相鄰圓之間形成短且細(xì)的反平行束。成核區(qū)域之間的距離，在使用偏心圓時(shí)可以不同，或者在使用同心圓時(shí)保持不變。這種類型的示例性微米圖案被詳細(xì)描述在實(shí)施例部分中，并示出在圖3中。任選地，圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，由一個(gè)圓形成。可選地，圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，由數(shù)個(gè)圓形成(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)圓)。具體來(lái)說(shuō)，圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，由2、3或4個(gè)圓、優(yōu)選3個(gè)圓形成。優(yōu)選情況下，圓具有不同的直徑，并且較小的圓被包含在較大的圓內(nèi)。圓可以是同心的?？蛇x地，圓可以是偏心的。圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，也可以由同心圓和偏心圓的混合體形成。優(yōu)選情況下，同心圓或偏心圓被隔開5、10、15、20、25或30微米，優(yōu)選10、15或20微米，還更優(yōu)選約15微米。優(yōu)選情況下，圓或最小的圓具有15、20或25微米、優(yōu)選20微米的最小直徑。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，線型圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，含有兩條以上的線(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10條線)，特別是兩條以上的直線。線可以具有任何方便的長(zhǎng)度。具體來(lái)說(shuō)，線可以具有10-100微米、優(yōu)選20-50微米、更優(yōu)選20-30微米的長(zhǎng)度。線型圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，可以含有一條線。這種圖案允許獲得肌動(dòng)蛋白絲的平行網(wǎng)絡(luò)。這種類型的示例性微米圖案被詳細(xì)描述在實(shí)施例部分中，并示出在圖lb-d和2a-e中。兩條以上的線，特別是兩條以上的直線，可以是平行或幾乎平行的(即角度小于或不超過(guò)25°，優(yōu)選不超過(guò)10° )。本發(fā)明人已確定，這樣的線型圖案提供了被締合成短且細(xì)的反平行束的肌動(dòng)蛋白絲。這種類型的示例性微米圖案被詳細(xì)描述在實(shí)施例部分中，并示出在圖4b-d、5f中。具體來(lái)說(shuō)，兩條以上的線，特別是兩條以上的直線，可以相對(duì)于彼此形成10-25°的角度。在非常具體的實(shí)施方案中，兩條以上的線，特別是兩條以上的直線，相對(duì)于彼此形成約22°的角度。具體來(lái)說(shuō)，圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，包括兩條線、優(yōu)選為兩條直線。所述線被隔開5、10、15、20、25或30微米，優(yōu)選5、10、15或20微米，更優(yōu)選約10微米?？蛇x地，兩條以上的線，特別是兩條以上的直線，可以相對(duì)于彼此形成超過(guò)25、30、35、40或45°并小于110°的角度。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述角度相對(duì)于彼此在45°和90°之間。本發(fā)明人已經(jīng)確定，這樣的線型圖案提供了具有兩種不同組織類型的混合結(jié)構(gòu):在線的近端部分處，肌動(dòng)蛋白絲被締合成短且細(xì)的反平行束；在線的遠(yuǎn)端部分處，肌動(dòng)蛋白絲被締合成平行肌動(dòng)蛋白絲的束，特別是在相鄰線之間的對(duì)分線上。所述線在其近端部分中被隔開1、2、5、10、15、20、25或30微米，優(yōu)選5、10、15或20微米，更優(yōu)選約10微米。這種類型的示例性微米圖案被詳細(xì)描述在實(shí)施例部分中，并示出在圖4b-d、5、6和7中。具體來(lái)說(shuō)，圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，包括兩條線、優(yōu)選為兩條直線。圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，也可以包括數(shù)條線，所述線被排列成形成放射狀圖案。因此，這樣的放射狀圖案可以包含4-9條線、優(yōu)選4-8條線。優(yōu)選情況下，放射狀圖案中兩條相鄰線之間的角度是幾乎相同的(例如，4分枝的放射狀陣列具有90°的角度，5分枝的放射狀陣列具有72°的角度，6分枝的放射狀陣列具有60°的角度，7分枝的放射狀陣列具有51°的角度，8分枝的放射狀陣列具有45°的角度)?？蛇x地，放射狀圖案中兩條相鄰線之間的角度可以是不同的。任選地，它們可以不同但處于相同的角度范圍內(nèi)(即在25、30、35、40或45°和110°之間，優(yōu)選在45°和90°之間)。任選地，它們可以不同，以便包括不同種類的組織或結(jié)構(gòu)。因此，放射狀圖案可以包括角度在25、30、35、40或45°和110°之間、優(yōu)選在45°和90°之間的的線。此外，兩條以上的線，特別是兩條以上的直線，可以形成超過(guò)110°的角度。然而，角度優(yōu)選小于150°、140°或130°。本發(fā)明人已經(jīng)確定，這樣的線型圖案提供了平行肌動(dòng)蛋白絲的束，但不是在相鄰線之間的對(duì)分線上。這種類型的示例性微米圖案被詳細(xì)描述在實(shí)施例部分中，并示出在圖4中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述角度相對(duì)于彼此在110°和120°之間。具體來(lái)說(shuō)，圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，包括兩條線、優(yōu)選為兩條直線。圖案、更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，也可以包括數(shù)條線，所述線被排列成形成放射狀圖案。例如，這樣的放射狀圖案可以包含3條線。優(yōu)選情況下，放射狀圖案中兩條相鄰線之間的角度是幾乎相同的(例如120° )。所述線在其近端部分中被隔開1、2、5、10、15、20、25或30微米，優(yōu)選5、10、15或20微米，更優(yōu)選約10微米。任選地，本發(fā)明還涉及在兩條相鄰線之間具有不同角度的放射狀圖案，以便包含不同種類的組織或結(jié)構(gòu)。因此，放射狀圖案可以包括具有第一種類型的角度(即具有小于或不超過(guò)25°的角度)和/或第二種類型的角度(即具有在25、30、35、40或45°和110°之間，優(yōu)選在45°和90°之間的角度)和/或第三種類型的角度(即具有超過(guò)110°的角度)的線。在第二實(shí)施方案中，表面可以具有配置在其上的圖案，更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是納米或微米圖案，所述圖案包含至少兩個(gè)包含肌動(dòng)蛋白成核劑的點(diǎn)或由肌動(dòng)蛋白成核劑制成的點(diǎn)，所述點(diǎn)處于允許來(lái)自于兩個(gè)相鄰點(diǎn)的聚合的肌動(dòng)蛋白絲發(fā)生相互作用的適合距離。優(yōu)選情況下，點(diǎn)具有I至10 μ m、優(yōu)選2至7 μ m、更優(yōu)選約5 μ m的直徑。優(yōu)選情況下，圖案包含數(shù)個(gè)點(diǎn)，所述點(diǎn)處于允許來(lái)自于兩個(gè)相鄰點(diǎn)的聚合的肌動(dòng)蛋白絲發(fā)生相互作用的適合距離。因此，圖案可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)點(diǎn)，具體來(lái)說(shuō)可以包括2至1，000個(gè)點(diǎn)、10至100個(gè)點(diǎn)。優(yōu)選情況下，兩個(gè)相鄰點(diǎn)之間的距離為I至40微米，例如1、2、5、10、15、20、25或30微米，優(yōu)選為5、10、15或20微米，更優(yōu)選為約10微米。在優(yōu)選實(shí)施方案中，圖案是點(diǎn)的陣列。優(yōu)選情況下，點(diǎn)具有相同的直徑，并且陣列的幾何形狀是規(guī)則的。點(diǎn)的陣列的實(shí)例示出在圖8中。這類圖案提供了反平行束的網(wǎng)絡(luò)。肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的這種體系結(jié)構(gòu)在電子學(xué)領(lǐng)域中可能表現(xiàn)出特殊的興趣。本發(fā)明不限于這些特定圖案。取決于所關(guān)心的問(wèn)題，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)其他圖案。事實(shí)上，本發(fā)明人的貢獻(xiàn)不限于此，因?yàn)樗麄兊谝淮未_立了肌動(dòng)蛋白成核劑的形式和排列方式允許控制由肌動(dòng)蛋白聚合所形成的結(jié)構(gòu)，即具有受控的位置、長(zhǎng)度和取向的平行和反平行肌動(dòng)蛋白絲的束。表面表面可以是具有足夠面積用于在其上配置如本文所公開的肌動(dòng)蛋白成核劑的圖案、優(yōu)選多個(gè)線型圖案、更優(yōu)選多個(gè)可尋址圖案的任何固體支持物。在某些實(shí)施方案中，表面可以被認(rèn)為是平坦的或平面的，但也可以在彎曲或其他形狀的表面上使用本發(fā)明的裝置和方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，表面是平面的或基本上平面的。因此，在這種實(shí)施方案中，表面不是珠子，特別是直徑太小而不能提供足以在其上配置如本文所公開的肌動(dòng)蛋白成核劑的圖案的面積的珠子。適用于結(jié)合肌動(dòng)蛋白成核劑以形成圖案的任何表面均可用于本文所公開的裝置和方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，除了肌動(dòng)蛋白成核劑圖案之外，表面是惰性表面。適合的惰性表面的實(shí)例是用聚乙二醇衍生物覆蓋的表面。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道用于制備惰性表面的其他可選方案。例如，表面可以是非衍生化的硅烷，或者表面可以被免疫測(cè)定法中常用于減少非特異性結(jié)合的其他分子包被，例如脫脂奶、牛血清白蛋白和人血清白蛋白?？偟膩?lái)說(shuō)，表面可以是用于微米級(jí)或納米級(jí)應(yīng)用的任何表面。例如，表面可以是硅、應(yīng)變硅、多晶硅、多晶硅、二氧化硅、鍺、砷化鎵、玻璃、塑料、陶瓷或金屬。在優(yōu)選實(shí)施方案中，表面是玻璃。在優(yōu)選實(shí)施方案中，表面可以是便于共聚焦、光學(xué)和/或熒光顯微術(shù)、特別是落射熒光和全內(nèi)反射熒光(TIRF)顯微術(shù)的支持物，但是本發(fā)明也設(shè)想了不具有良好光學(xué)品質(zhì)(例如適用于電子顯微術(shù))的支持物。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，板是玻璃，并可能覆蓋有氧化的聚苯乙烯的薄層。例如，本發(fā)明的方便的板是蓋玻片或載玻片。它也可以是塑料載玻片、塑料皿或皮氏培養(yǎng)皿。本發(fā)明還涉及包含數(shù)個(gè)如上定義的表面或如上定義的表面與其他元件的組合的系統(tǒng)。因此，具有數(shù)個(gè)表面的系統(tǒng)形成3D結(jié)構(gòu)。表面被放置成使得從每個(gè)表面的肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)生長(zhǎng)的肌動(dòng)蛋白絲可以彼此相互作用。表面可以彼此平行，或者可以形成角度，例如孔的相鄰側(cè)面。用于制備裝置的方法本發(fā)明涉及用于制備本文所公開的表面的方法。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及使用分離的肌動(dòng)蛋白成核劑將表面圖案化以獲得如上公開的圖案的方法。方法至少包括使用肌動(dòng)蛋白成核劑制備配置在表面上的線型圖案、優(yōu)選多個(gè)線型圖案、更優(yōu)選多個(gè)可尋址圖案的步驟。對(duì)于微米和納米圖案化來(lái)說(shuō)，可以使用各種方法，例如微接觸印刷、光刻法、激光燒蝕、基于UV的微米圖案化方法(Azioune等,2009)、蘸水筆(Dip PenXGinger等,2004)、原子力顯微術(shù)(“AFM”)差減(Wadu-Mesthrige等,2001)和等離子體沉積。例如，對(duì)于微米級(jí)別的結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，通過(guò)接觸印刷將工作表面微米圖案化，可以通過(guò)將工作表面緊壓于包被有肌動(dòng)蛋白成核劑的微米圖案化的印模來(lái)實(shí)現(xiàn)。用于蛋白質(zhì)沉積的印模，典型地按照現(xiàn)在的標(biāo)準(zhǔn)慣例在聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)基材上使用光刻法來(lái)制造?？梢杂玫鞍踪|(zhì)直接對(duì)印?！吧夏?，所述蛋白質(zhì)將被被動(dòng)吸附于或者可以使用常用方法步驟共價(jià)結(jié)合于基材。具體來(lái)說(shuō)，理想情況下，將要用肌動(dòng)蛋白成核劑覆蓋的圖案不含賦予表面惰性的涂層。實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)有許多方式。例如，可以將成核劑施加到表面上，然后再施加賦予表面惰性的涂層?？蛇x地，可以用可移除材料覆蓋表面，然后將表面與賦予表面惰性的涂料接觸，并將所述材料移除，留下不含涂層和肌動(dòng)蛋白成核劑的位點(diǎn)。然而，優(yōu)選情況下，通過(guò)移除這些位點(diǎn)處的涂層，可以在肌動(dòng)蛋白成核劑的圖案處產(chǎn)生不含涂層材料的區(qū)域。涂層材料可以用激光燒掉，利用以接觸方式使用的AFM針刮掉或推掉，或者通過(guò)保護(hù)掩模用UV或等離子體處理來(lái)移除。方便的方案被詳細(xì)描述在實(shí)施例部分中并示出在圖1a中。可以將肌動(dòng)蛋白成核劑的多個(gè)圖案置于表面上。可以通過(guò)例如將肌動(dòng)蛋白成核劑的一系列圖案以所需陣列放置，來(lái)提供圖案(以及由此提供肌動(dòng)蛋白絲)的有序陣列。優(yōu)選情況下，表面上肌動(dòng)蛋白成核劑的圖案彼此隔開足夠遠(yuǎn)，使得來(lái)自于陣列的一個(gè)圖案的肌動(dòng)蛋白絲不會(huì)接觸來(lái)自于另一個(gè)圖案的肌動(dòng)蛋白絲。可以容易地確定將成對(duì)的肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)圖案隔開的距離。肌動(dòng)蛋白成核劑或成核促進(jìn)因子肌動(dòng)蛋白成 核劑是能夠在肌動(dòng)蛋白單體和ATP以及任選的其他元件的存在下引發(fā)肌動(dòng)蛋白聚合的蛋白質(zhì)或其片段。肌動(dòng)蛋白成核劑在本領(lǐng)域中往往被稱為“成核促進(jìn)因子”(NPF)。具體來(lái)說(shuō)，肌動(dòng)蛋白成核劑可以是例如ActA(誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白組裝的蛋白)、IscA、RickA, WASp (Wiskott-Aldrich 綜合征蛋白)、N-WASP, SCAR CcAR 的抑制因子)、VCA 結(jié)構(gòu)域(富脯蛋白同源域，絲切蛋白同源域，酸性區(qū))或WA區(qū)、pWA區(qū)。肌動(dòng)蛋白成核劑還包括能夠引發(fā)肌動(dòng)蛋白聚合的類似物(嵌合形式或突變體)及其片段。肌動(dòng)蛋白成核劑被公開在US2006/0003399和US2005/0106629中，其公開內(nèi)容在此引為參考。其他適合的肌動(dòng)蛋白成核劑也被公開在下面的參考文獻(xiàn)中=Pollard等，2000 ；Higgs和Pollard，2001。除了肌動(dòng)蛋白單體和ATP之外，肌動(dòng)蛋白成核劑可能還需要引發(fā)肌動(dòng)蛋白聚合所必需的其他元件，特別是Arp2/3復(fù)合體和肌動(dòng)蛋白絲。具體來(lái)說(shuō)，將肌動(dòng)蛋白成核劑包被在裝置的表面上，而將引發(fā)肌動(dòng)蛋白聚合所需的其他元件特別是肌動(dòng)蛋白單體、ATPJ^a蛋白絲和Arp2/3復(fù)合體提供在聚合溶液或混合物中。為引發(fā)肌動(dòng)蛋白聚合，肌動(dòng)蛋白成核劑還需要Arp (肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白)2/3復(fù)合體。肌動(dòng)蛋白成核劑通過(guò)改變Arp2/3復(fù)合體的構(gòu)象以模擬F-肌動(dòng)蛋白二聚體來(lái)起作用，從而引發(fā)肌動(dòng)蛋白聚合。因此，肌動(dòng)蛋白的聚合以Arp2/3依賴性方式來(lái)引發(fā)。對(duì)于提供在聚合溶液或混合物中的肌動(dòng)蛋白絲來(lái)說(shuō)，重要的是指出該肌動(dòng)蛋白絲不被延長(zhǎng)。事實(shí)上，形成了包括肌動(dòng)蛋白成核劑、Arp2/3和肌動(dòng)蛋白絲的三元復(fù)合體。該三元復(fù)合體然后能夠引發(fā)肌動(dòng)蛋白絲的聚合，新合成的肌動(dòng)蛋白絲生長(zhǎng)為三元復(fù)合體的肌動(dòng)蛋白絲的分枝。因此，從最初的肌動(dòng)蛋白絲開始，成核劑將促進(jìn)數(shù)百個(gè)肌動(dòng)蛋白絲的聚合，由此達(dá)到生長(zhǎng)的肌動(dòng)蛋白絲的高密度。此外，某些肌動(dòng)蛋白成核劑如ActA、IscA, RickA, WASp、N-WASP和SCAR可能需要其他調(diào)控蛋白或元件(也稱為上游調(diào)控因子)例如Cdc42、PIP2、Nck和Racl。這些要求在本領(lǐng)域中是公知的，并被詳細(xì)描述在例如US2006/003399以及Higgs和Pollard，2001中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，肌動(dòng)蛋白成核劑是pWA，即來(lái)自于WASP/Scar蛋白的C端結(jié)構(gòu)域。pWA包括WASP或SCAR的富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域、肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合性W結(jié)構(gòu)域和p21結(jié)合性A結(jié)構(gòu)域。具體來(lái)說(shuō)，pWA可以包含人類Scar蛋白的172-559位氨基酸(SEQ ID Nol)或由所述氨基酸構(gòu)成。有利情況下，肌動(dòng)蛋白成核劑也可以是VCA結(jié)構(gòu)域。事實(shí)上，使用pWA或VCA結(jié)構(gòu)域比其他肌動(dòng)蛋白成核劑更有利，這是因?yàn)樗恍枰嫌握{(diào)控因子。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，肌動(dòng)蛋白成核劑是PWA (具體來(lái)說(shuō)，如在Machesky等，1999中所詳細(xì)公開的)。肌動(dòng)蛋白成核劑可以包括一個(gè)或數(shù)個(gè)標(biāo)簽，所述標(biāo)簽優(yōu)選與氨基和/或羧基末端連接或融合。標(biāo)簽被用于增強(qiáng)表達(dá)、增加溶解性、協(xié)助純化和/或促進(jìn)在表面上的結(jié)合。可以使用各種標(biāo)簽，包括但不限于:1)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽，其可用于與谷胱甘肽-瓊脂糖結(jié)合；2)His6標(biāo)簽(或簡(jiǎn)稱HIS標(biāo)簽)，其可用于與固定化的金屬離子柱(例如鎳)結(jié)合；3)鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(CBP)標(biāo)簽，其與鈣調(diào)蛋白-瓊脂糖柱結(jié)合；4)表位標(biāo)簽(例如血細(xì)胞凝集素標(biāo)簽、myc標(biāo)簽或FLAG標(biāo)簽)，其可用于與對(duì)所述表位標(biāo)簽具有特異性結(jié)合親和性的抗體結(jié)合；以及5)麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)簽，其增加融合蛋白的溶解性。這些標(biāo)簽也可以被組合使用，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽與氨基端融合，一個(gè)或多個(gè)其他標(biāo)簽與羧基端融合。在特定實(shí)施方案中，肌動(dòng)蛋白成核劑是連接有兩個(gè)標(biāo)簽的PWA，所述兩個(gè)標(biāo)簽具體來(lái)說(shuō)是GST標(biāo)簽和His標(biāo)簽，更具體來(lái)說(shuō)GST標(biāo)簽連接在其N端處，His標(biāo)簽連接在其C端處。帶有兩個(gè)標(biāo)簽的PWA呈遞所述序列。聚合溶液或混合物聚合溶液或混合物包含足以弓丨起并維持肌動(dòng)蛋白聚合的成分。對(duì)聚合溶液或混合物的要求在本領(lǐng)域中是公知的。具體來(lái)說(shuō)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道聚合混合物組分的適合濃度。聚合溶液或混合物包括ATP、單體肌動(dòng)蛋白(G-肌動(dòng)蛋白)、二價(jià)陽(yáng)離子和Arp2/3復(fù)合體。優(yōu)選情況下，聚合溶液或混合物還包括肌動(dòng)蛋白絲。很久以來(lái)，用于制備純化的單體肌動(dòng)蛋白的方法在本領(lǐng)域中就已是公知的(MacLean-FIetcher&Po11ard, 1980 ；Spudich&ffatt, 1971 )。事實(shí)上，肌動(dòng)蛋白及其聚合已被研究了幾乎50年。此外,純化的單體肌動(dòng)蛋白也是可商購(gòu)的(例如Invitrogen:目錄號(hào)A12375)。優(yōu)選情況下，單體肌動(dòng)蛋白包括標(biāo)記的單體肌動(dòng)蛋白。事實(shí)上，優(yōu)選用熒光蛋白或染料標(biāo)記單體肌動(dòng)蛋白。熒光蛋白或染料的實(shí)例包括但不限于熒光染料例如Alexa Fluor染料(例如 Alexa350、Alexa430、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa568 和 Alexa594 染料)、花青素染料(例如Cy3和Cy5)、德克薩斯紅、acyiOlodan、芘等，以及熒光蛋白例如GFP、CFP、YFP、RFP和mCherry。優(yōu)選情況下使用熒光染料。某些熒光標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白單體是可商購(gòu)的(非窮舉地，例如Invitrogen:Alexa488結(jié)合物(目錄號(hào):A12373), Alexa568結(jié)合物(目錄號(hào):A12374),Alexa594結(jié)合物(目錄號(hào):A34050)和Alexa647結(jié)合物(目錄號(hào):A34051))。其他適合的熒光標(biāo)簽對(duì)于本領(lǐng)域的普通人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。優(yōu)選情況下，聚合溶液或混合物包含標(biāo)記和未標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白單體的混合物。在特定實(shí)施方案中，單體肌動(dòng)蛋白可以可選地或還包括與金屬原子、特別是與金結(jié)合的單體肌動(dòng)蛋白。用金標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白單體的制備被詳細(xì)描述在Pato I sky等，2004中。聚合溶液或混合物可以只包含用金屬原子、特別是用金標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白單體，或者可以包含未標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白單體與用金屬原子、特別是用金標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白單體的混合物?！癆rp2/3復(fù)合體”首先分離自卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba castellani),由7種多肽構(gòu)成:兩種肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白Arp2和Arp3,以及5種其他蛋白p40、p35、pl9、pl8和Pl4。人類的復(fù)合體由7個(gè)亞基構(gòu)成，所述亞基包括肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白Arp2和Arp3以及被稱為p41_Arc、p34_Arc、p21-Arc> p20_Arc和pl6_Arc的5種其他蛋白。所有7個(gè)亞基的預(yù)測(cè)的氨基酸序列已被確定。啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的Arp2/3復(fù)合體由6個(gè)亞基構(gòu)成。研究確定，復(fù)合體的成核和組織活性是可分開的。因此，對(duì)于本發(fā)明的方法所設(shè)想的成核活性來(lái)說(shuō)，可能不是所有的Arp2/3復(fù)合體亞基都是必需的。因此，當(dāng)在本文中使用時(shí)，對(duì)“Arp2/3復(fù)合體”的指稱是指全部6或7種組分的復(fù)合體，或者是指成核肌動(dòng)蛋白聚合所必需的這些復(fù)合體組分的集合物，除非上下文要求指稱全部6或7種蛋白的復(fù)合體。來(lái)自于任何來(lái)源的任何Arp2/3復(fù)合體都可方便地用于本文所公開的聚合混合物、方法和試劑盒。例如，專利申請(qǐng)US2006/0014266公開了用于純化Arp2/3復(fù)合體的方法(其公開內(nèi)容在此引為參考)。任何肌動(dòng)蛋白絲都是適合的。例如，適合的肌動(dòng)蛋白絲可以具有30_100nm的長(zhǎng)度。優(yōu)選情況下，聚合溶液或混合物還包括肌動(dòng)蛋白抑制蛋白。事實(shí)上，肌動(dòng)蛋白抑制蛋白允許阻止肌動(dòng)蛋白的自發(fā)聚合。當(dāng)肌動(dòng)蛋白成核劑是PWA時(shí)，在聚合混合物或溶液中存在肌動(dòng)蛋白抑制蛋白是非常適合的。在特定實(shí)施方案中，聚合混合物或溶液可以是細(xì)胞提取物(Theriot等，1992)或卵提取物(例如非洲爪蟾卵提取物)(Marchand等，1995)。試劑盒本發(fā)明涉及用于制備肌動(dòng)蛋白絲特別是具有確定組織的肌動(dòng)蛋白絲的試劑盒，或用于執(zhí)行測(cè)定法或篩選方法的試劑盒。本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其包含本文所公開的裝置以及用在所述裝置上的肌動(dòng)蛋白聚合溶液或混合物，特別是如上公開的聚合混合物，所述溶液或混合物包含足以在肌動(dòng)蛋白成核劑的存在下引起肌動(dòng)蛋白聚合的組分。試劑盒可以包含解釋如何使用試劑盒的說(shuō)明書。試劑盒還可以包含對(duì)肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)、肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或結(jié)構(gòu)具有明確影響的對(duì)照分子。這樣的分子可以是肌球蛋白、α-輔肌動(dòng)蛋白或肌成束蛋白。應(yīng)用和方法本文所公開的裝置可用于制備或制造肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)，特別是具有肌動(dòng)蛋白絲的可重復(fù)(即可預(yù)測(cè))結(jié)構(gòu)、組織和/或相互作用的肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)。因此，本發(fā)明涉及本文公開的裝置在制備或制造肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及用于制備或制造肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)、特別是二維或三維肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的方法。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供了用于制備或制造肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的方法，所述方法包括a)提供如本文所公開的裝置；b)將所述圖案、優(yōu)選為所述納米或微米圖案與聚合溶液或混合物相接觸，由此引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合，以及任選地c)移除聚合溶液或混合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括一種或幾種下面的實(shí)施方案:a)肌動(dòng)蛋白成核劑是PWA ;和/或b)表面是平面的；和/或c)聚合混合物包括肌動(dòng)蛋白單體、ATP、二價(jià)陽(yáng)離子、Arp2/3復(fù)合體,并且優(yōu)選為標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白單體,優(yōu)選為突光標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白單體或結(jié)合有金屬原子例如Au的肌動(dòng)蛋白單體。據(jù)認(rèn)為，由于致密網(wǎng)絡(luò)中肌動(dòng)蛋白絲-肌動(dòng)蛋白絲的排斥，肌動(dòng)蛋白絲以垂直于成核區(qū)域邊緣的形式從成核區(qū)域定向長(zhǎng)出。低密度的肌動(dòng)蛋白絲不會(huì)引起從成核區(qū)域定向長(zhǎng)出。當(dāng)肌動(dòng)蛋白絲被充分壓緊時(shí)，它們的空間排斥引起它們垂直于成核區(qū)域的邊緣排列。具體來(lái)說(shuō)，可以認(rèn)為肌動(dòng)蛋白絲的最小密度為10根肌動(dòng)蛋白絲/μπι2。優(yōu)選情況下，肌動(dòng)蛋白絲密度為至少20、30、40或50根肌動(dòng)蛋白絲/μπι2。當(dāng)成核區(qū)域被NPF (成核促進(jìn)因子)(在本文中也稱為肌動(dòng)蛋白成核劑)例如PWA完全包被時(shí)，肌動(dòng)蛋白絲密度僅僅依賴于聚合混合物或溶液中Arp2/3復(fù)合體的密度。事實(shí)上，成核是由pWA-Arp2/3-肌動(dòng)蛋白絲三聚體的形成引起的。肌動(dòng)蛋白單體以足以引起并維持肌動(dòng)蛋白聚合的適合濃度(例如，最低濃度為0.01mg/ml)下使用。然而,在允許肌動(dòng)蛋白絲聚合的條件下,肌動(dòng)蛋白單體優(yōu)選以大的過(guò)量使用。因此，三聚體的形成僅依賴于Arp2/3復(fù)合體的存在。IOnM的Arp2/3復(fù)合體濃度不足以引起臨界密度的肌動(dòng)蛋白絲在它們的生長(zhǎng)期間允許平行排列。Arp2/3復(fù)合體超過(guò)30nM時(shí)，肌動(dòng)蛋白絲足夠致密，允許垂直于成核區(qū)域邊緣以平行方式生長(zhǎng)。因此，與肌動(dòng)蛋白成核劑的圖案相接觸的聚合溶液或混合物含有至少30nM的Arp2/3復(fù)合體。所述方法還可以包括包被肌動(dòng)蛋白絲的步驟或?qū)λ鼈冞M(jìn)行處理的步驟。具體來(lái)說(shuō)，在肌動(dòng)蛋白聚合之后或在肌動(dòng)蛋白聚合期間，肌動(dòng)蛋白絲可以被進(jìn)一步處理或包被。任選地，在移除聚合溶液后進(jìn)行所述進(jìn)一步處理或包被。在第一實(shí)施方案中，用交聯(lián)肌動(dòng)蛋白絲的蛋白質(zhì)進(jìn)一步處理肌動(dòng)蛋白絲。事實(shí)上，這種附加處理可以增加由肌動(dòng)蛋白絲形成的結(jié)構(gòu)特別是肌動(dòng)蛋白束的強(qiáng)度。這允許制備更剛性的結(jié)構(gòu)。正如下面進(jìn)一步提到的，已知多種蛋白質(zhì)可在細(xì)胞中結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲、使肌動(dòng)蛋白絲成束或交聯(lián)肌動(dòng)蛋白絲。例如肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白質(zhì)可以是α-輔肌動(dòng)蛋白、肌成束蛋白、EF-1、Scruin、villin、dematin、fimbrin、血影蛋白、抗肌萎縮蛋白、ABP120或細(xì)絲蛋白(Lodish 等，《分子細(xì)胞生物學(xué)》(Molecular Cell Biology),ff.H.Freeman and Company,N.Y.，N.Y.(2000)，表18.1)。示例性的交聯(lián)蛋白質(zhì)是肌成束蛋白，其可用于將一個(gè)肌動(dòng)蛋白絲中的每個(gè)亞基與相鄰肌動(dòng)蛋白絲中的亞基相連(Matsudaira等，1994)。類似地,蛋白質(zhì)α-輔肌動(dòng)蛋白可用于連接肌動(dòng)蛋白絲。肌成束蛋白和α-輔肌動(dòng)蛋白兩者使肌動(dòng)蛋白絲平行排列并連接肌動(dòng)蛋白絲，但肌成束蛋白將它們連接得更緊密。使用肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白質(zhì)的附加處理，可以通過(guò)將肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)在包含連接蛋白質(zhì)的溶液中洗滌或浸泡來(lái)進(jìn)行。這可以在肌動(dòng)蛋白聚合完成后或在肌動(dòng)蛋白聚合過(guò)程期間進(jìn)行。已觀察到，用交聯(lián)蛋白質(zhì)例如肌成束蛋白或α-輔肌動(dòng)蛋白進(jìn)行處理，特別是在肌動(dòng)蛋白聚合過(guò)程期間，可以改變獲得的結(jié)構(gòu)或組織。例如，在肌動(dòng)蛋白聚合過(guò)程期間添加大量肌成束蛋白(例如IOOnM)或α -輔肌動(dòng)蛋白(例如500ηΜ)，可以防止形成平行束，這是由于平行肌動(dòng)蛋白絲的剛性對(duì)于肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)來(lái)說(shuō)太高(參見實(shí)驗(yàn)部分和圖6)。此外，獲得的效應(yīng)可以隨著交聯(lián)蛋白質(zhì)例如肌成束蛋白或α -輔肌動(dòng)蛋白的用量而變(參見實(shí)驗(yàn)部分和圖6a)。在第二實(shí)施方案中，用加帽蛋白進(jìn)一步處理肌動(dòng)蛋白絲。事實(shí)上，加帽蛋白可用于控制肌動(dòng)蛋白絲的長(zhǎng)度。加帽蛋白在本領(lǐng)域中是已知的，例如CAPZAl (F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白亞基α-l)或CAPZB。此外，使用加帽蛋白與絲切蛋白的組合可以產(chǎn)生動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，從而維持生長(zhǎng)的肌動(dòng)蛋白絲。在第三實(shí)施方案中，用物質(zhì)進(jìn)一步包被肌動(dòng)蛋白絲。具體來(lái)說(shuō)，可以用傳導(dǎo)性物質(zhì)包被肌動(dòng)蛋白絲。優(yōu)選情況下，傳導(dǎo)性物質(zhì)可以是金屬原子，更優(yōu)選為金?？蛇x地，物質(zhì)可以是碳納米管。在特定實(shí)施方案中，肌動(dòng)蛋白絲已包含與金結(jié)合的肌動(dòng)蛋白，并且用金包被允許增強(qiáng)金的沉積(例如參見Patolsky等，2004)。因此，本發(fā)明提供了用于制備基于肌動(dòng)蛋白的金屬絲、特別是金絲的方法。因此，本發(fā)明涉及用于制備可用于納米級(jí)電路的制造、特別是可用于納米生物技術(shù)領(lǐng)域的傳導(dǎo)性微米絲或納米絲的方法。此外，本發(fā)明提供了用于制備或制造肌動(dòng)蛋白絲、特別是具有確定組織的肌動(dòng)蛋白絲的方法，所述方法還包括從表面移除獲得的肌動(dòng)蛋白絲。任選地，在從表面移除后，也可以如上所述對(duì)肌動(dòng)蛋白絲進(jìn)行處理或包被。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用物質(zhì)將表面圖案化的方法。在這種方法中，表面上的肌動(dòng)蛋白絲在用物質(zhì)包被表面時(shí)被用作掩模。具體來(lái)說(shuō)，方法包括:a)提供其上具有本發(fā)明的納米或微米圖案的表面，b)將所述納米或微米圖案與聚合溶液相接觸，由此引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合，c)用物質(zhì)包被表面，以及d)從表面移除肌動(dòng)蛋白絲(例如通過(guò)肌動(dòng)蛋白絲的解聚)，由此留下被包被在表面上具有所需圖案的物質(zhì)。例如，表面的包被可以通過(guò)化學(xué)氣相沉積來(lái)進(jìn)行。物質(zhì)可以選自硅、多晶硅、二氧化硅、碳纖維、碳納米纖維、細(xì)絲、碳納米管、SiO2、硅-鍺、鎢、碳化硅、氮化硅、氮氧化硅、氮化鈦、金屬和各種高k電介質(zhì)?？蛇x地，可以通過(guò)旋涂法進(jìn)行包被，并且物質(zhì)可以是聚合物例如聚苯乙烯或極性更高的聚合物例如聚砜或聚醚酰亞胺。它也可用于制備光敏聚合物膜抗蝕劑。在可選的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用物質(zhì)蝕刻表面的方法。在這種方法中，表面上的肌動(dòng)蛋白絲在用物質(zhì)蝕刻表面時(shí)被用作掩模。具體來(lái)說(shuō)，方法包括:a)提供其上具有本發(fā)明的納米或微米圖案的表面，b)將所述納米或微米圖案與聚合溶液相接觸，由此引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合，c)蝕刻表面，以及d)從表面移除肌動(dòng)蛋白絲(例如通過(guò)肌動(dòng)蛋白絲的解聚)。事實(shí)上，肌動(dòng)蛋白絲起到掩模的作用以覆蓋表面，而沒有被肌動(dòng)蛋白絲覆蓋的表面被蝕刻。例如，在芯片制造中，典型地將薄金屬膜沉積在半導(dǎo)體例如硅上，將金屬以所需圖案遮蔽，并將未遮蔽的金屬蝕刻掉。本發(fā)明的方法允許用肌動(dòng)蛋白絲在金屬層上遮蔽所需圖案，然后蝕刻沒有被肌動(dòng)蛋白絲遮蔽的金屬。本發(fā)明的圖案、特別是納米或微米圖案，可用于研究肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或用于研究肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明涉及本文所公開的裝置用于研究肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或用于研究肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于研究肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或用于研究肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的方法，其中所述方法包括制備或制造如上公開的肌動(dòng)蛋白絲。具體來(lái)說(shuō)，方法包括:a)提供如本文所公開的裝置；b)將所述圖案、優(yōu)選為所述納米或微米圖案與聚合溶液或混合物相接觸，由此引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合；以及c)觀察肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)構(gòu)和/或相互作用。具體來(lái)說(shuō)，觀察步驟可以包括觀察肌動(dòng)蛋白絲的生長(zhǎng)及其組織?？梢栽谝粋€(gè)特定時(shí)刻、在連續(xù)的特定時(shí)刻或通過(guò)視頻來(lái)進(jìn)行觀察。肌動(dòng)蛋白絲的相互作用可以是平行或反平行的?？梢杂^察特定結(jié)構(gòu)的形成，例如肌動(dòng)蛋白絲束的形成。在肌動(dòng)蛋白絲聚合后，人們也可以研究肌動(dòng)蛋白的解聚。優(yōu)選情況下，可以通過(guò)熒光顯微術(shù)觀察肌動(dòng)蛋白絲及其組織。因此，可以在聚合步驟期間通過(guò)使用熒光標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白單體來(lái)標(biāo)記肌動(dòng)蛋白絲，或者可以在聚合后用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記肌動(dòng)蛋白絲。幾種熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽是可商購(gòu)的(例如，羅丹明-鬼筆環(huán)妝(Molecular Probes);德克薩斯紅-鬼筆環(huán)妝(Molecular Probes)等)。在步驟b)期間、在步驟b)與c)之間或在步驟c)期間，可以進(jìn)一步將微米圖案與其他分子或條件相接觸，特別是用于研究這些其他分子或條件對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合和/或肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)的影響。所公開的裝置也可用于評(píng)估或確定測(cè)試分子對(duì)肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響。因此，本發(fā)明涉及使用本文所公開的裝置用于評(píng)估或確定測(cè)試分子對(duì)肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于確定測(cè)試分子是否調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)的方法，其中方法包括制備或制造如上公開的肌動(dòng)蛋白絲，將肌動(dòng)蛋白絲與測(cè)試分子相接觸，以及確定測(cè)試分子對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合、肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)的影響。具體來(lái)說(shuō)，方法包括:a)提供本發(fā)明的納米或微米圖案，b)將所述微米圖案與聚合溶液相接觸，c)觀察肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)構(gòu)和/或相互作用，由此確定測(cè)試分子是否調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；其中在肌動(dòng)蛋白聚合之前、期間和/或在肌動(dòng)蛋白聚合之后添加測(cè)試分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在肌動(dòng)蛋白聚合期間添加測(cè)試分子，例如與聚合混合物或溶液同時(shí)添加測(cè)試分子。在可選的優(yōu)選實(shí)施方案中，在肌動(dòng)蛋白絲聚合之后，例如在移除聚合混合物或溶液后之添加測(cè)試分子。優(yōu)選情況下，將在測(cè)試分子存在下觀察到的肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)，與在測(cè)試分子不存在下觀察到的肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比較。本文公開的圖案的優(yōu)點(diǎn)在于使用本發(fā)明的裝置獲得的肌動(dòng)蛋白絲相互作用和肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是可重復(fù)的。因此，在測(cè)試分子存在和不存在下的肌動(dòng)蛋白聚合、肌動(dòng)蛋白絲相互作用和肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的比較是有可能并且準(zhǔn)確的。測(cè)試分子可以具有各種來(lái)源、性質(zhì)和組成。它可以是任何有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)，例如脂質(zhì)、肽、多肽、核酸、小分子、藥物等，它是分離的或與其他物質(zhì)形成混合物。例如，測(cè)試化合物可以是抗體、反義寡核苷酸或RNAi。所述分子例如可以是產(chǎn)物組合文庫(kù)的全部或一部分。調(diào)節(jié)意在指測(cè)試分子可以抑制或激活肌動(dòng)蛋白聚合。可選地，測(cè)試分子也可以擾亂肌動(dòng)蛋白絲組織，特別是肌動(dòng)蛋白絲相互作用和肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)。在實(shí)驗(yàn)部分中，使用如上公開的裝置測(cè)試了某些分子對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合的影響以及對(duì)聚合的肌動(dòng)蛋白絲的影響(參見圖6，其中研究了 α-輔肌動(dòng)蛋白和肌成束蛋白的影響)?？梢杂^察到，本發(fā)明的圖案通過(guò)提供可重復(fù)且可預(yù)測(cè)的肌動(dòng)蛋白絲組織，允許觀察測(cè)試分子對(duì)肌動(dòng)蛋白絲組織的影響。具體來(lái)說(shuō)，所述影響可以在肌動(dòng)蛋白聚合期間進(jìn)行觀察，但是也可以在肌動(dòng)蛋白絲聚合并由選定的圖案組織后進(jìn)行觀察。用于評(píng)估或確定測(cè)試分子對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合和/或肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)的影響的方法，表現(xiàn)出幾種用途。在第一特定實(shí)施方案中，這種方法可用于根據(jù)所尋求的效果篩選分子并鑒定能夠或不能調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合、肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)的測(cè)試分子。當(dāng)所述分子對(duì)肌動(dòng)蛋白的聚合表現(xiàn)出抑制劑活性時(shí)，本文公開的篩選方法允許鑒定可用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移、血栓形成或骨質(zhì)疏松癥或用于抑制血管發(fā)生的分子；以及當(dāng)所述分子對(duì)肌動(dòng)蛋白的聚合表現(xiàn)出激活劑活性時(shí)，鑒定可用于改善傷口愈合或用于促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的分子。在第二實(shí)施方案中，這種方法可用于評(píng)估分子的毒性，特別是分子的肌動(dòng)蛋白毒性。這種毒性可以通過(guò)分子抑制肌動(dòng)蛋白聚合或肌動(dòng)蛋白解聚或阻止正常肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)形成的能力來(lái)評(píng)估。所公開的裝置也可用于評(píng)估或確定特定細(xì)胞提取物對(duì)肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響。因此，本發(fā)明涉及本文公開的裝置用于評(píng)估或確定確定特定細(xì)胞提取物對(duì)肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于確定特定細(xì)胞提取物是否調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)的方法，其中所述方法包括使用特定細(xì)胞提取物制備或制造如上公開的肌動(dòng)蛋白絲，并通過(guò)與參比細(xì)胞提取物進(jìn)行比較來(lái)確定所述特定細(xì)胞提取物對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合、肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)的影響。具體來(lái)說(shuō)，所述方法包括:a)提供本發(fā)明的納米或微米圖案，b)將所述微米圖案與特定細(xì)胞提取物相接觸，c)通過(guò)與參比細(xì)胞提取物進(jìn)行比較來(lái)觀察肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)構(gòu)和/或相互作用，由此確定特定細(xì)胞提取物是否調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲相互作用和/或肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。本文所公開的圖案的優(yōu)點(diǎn)在于使用本發(fā)明的裝置獲得的肌動(dòng)蛋白絲相互作用和肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是可重復(fù)的。因此，比較在特定細(xì)胞提取物存在下的肌動(dòng)蛋白聚合、肌動(dòng)蛋白絲相互作用和肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并與參比細(xì)胞提取物進(jìn)行比較，是有可能并且準(zhǔn)確的。具體來(lái)說(shuō)，參比細(xì)胞提取物由健康細(xì)胞提供，并且特定細(xì)胞提取物由具有缺陷特別是與肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)的缺陷的細(xì)胞提供。本發(fā)明也便于研究分子馬達(dá)例如肌球蛋白。分子馬達(dá)可以被添加在聚合混合物中，或者可以被添加在具有已經(jīng)聚合的肌動(dòng)蛋白絲的表面上。在分子馬達(dá)作用下，肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)被彎曲或扭曲。通過(guò)研究肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的變形，通過(guò)確定區(qū)域變形的次序，以及通過(guò)測(cè)量變形速度和取向，人們可以研究分子馬達(dá)如何與肌動(dòng)蛋白絲相互作用。此外，本發(fā)明還提供了用于鑒定能夠調(diào)節(jié)分子馬達(dá)活性或分子馬達(dá)與肌動(dòng)蛋白絲之間的相互作用的分子的方法。不使用本文所公開的裝置，分子馬達(dá)的體外研究是非常困難或者是不可能的，并且這種研究一般僅限于其中結(jié)構(gòu)是不可預(yù)測(cè)且復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)背景。在細(xì)胞內(nèi)背景中，除了復(fù)雜的結(jié)構(gòu)之外，還存在大量與肌動(dòng)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。因此，在這種復(fù)合體中，不能對(duì)肌動(dòng)蛋白絲的明顯可鑒定且可測(cè)量的變形進(jìn)行觀察和定量。類似地，通過(guò)在凝膠或其他肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)中研究分子馬達(dá)，不可能或難以比較分子馬達(dá)相互作用之前和之后的結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)榧?dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是隨機(jī)的，因此全都不同并且不可比較。本發(fā)明的裝置允許克服這些缺點(diǎn)并方便地研究分子馬達(dá)。定義本發(fā)明中所使用的蛋白質(zhì)的來(lái)源沒有影響?？梢允褂萌魏蝸?lái)源的蛋白質(zhì)，具體來(lái)說(shuō)，各種來(lái)源的蛋白質(zhì)可以被一起使用。
當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“約”是指+/_10%、優(yōu)選+/_5%。當(dāng)然，當(dāng)該術(shù)語(yǔ)與數(shù)值相連時(shí)，該術(shù)語(yǔ)可以被去除，并且在本文中總是設(shè)想了該精確的數(shù)值。本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將被公開在下面的實(shí)驗(yàn)部分中，所述實(shí)驗(yàn)部分應(yīng)該被視為示例性的，并且不限制本申請(qǐng)的范圍。
實(shí)施例肌動(dòng)蛋白絲構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要組分之一。特定的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)例如分枝的網(wǎng)絡(luò)或平行的肌動(dòng)蛋白絲束，驅(qū)動(dòng)明確的細(xì)胞功能。在本體溶液中或使用仿生裝置從純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)集合體的生物化學(xué)重建，已成為避開細(xì)胞復(fù)雜性和解譯控制肌動(dòng)蛋白組裝的分子機(jī)制的強(qiáng)有力工具。這些方法突顯了肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白如何在動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)中影響肌動(dòng)蛋白絲的生長(zhǎng)和相互作用。然而，幾何學(xué)邊界例如在細(xì)胞中所遇到的那種如何影響高度有序的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)形成這一問(wèn)題仍然在很大程度上未被研究。在這里，本發(fā)明人證實(shí)了成核幾何形狀本身可能是肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)體系結(jié)構(gòu)的首要決定因素。他們開發(fā)出一種微米圖案化方法，所述方法允許對(duì)用于體外測(cè)定法的肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)進(jìn)行空間控制。具體來(lái)說(shuō)，他們?cè)谂c細(xì)胞尺寸對(duì)應(yīng)的尺度上調(diào)節(jié)成核位點(diǎn)的定位。形狀、取向和成核區(qū)域之間的距離控制了肌動(dòng)蛋白絲的取向和長(zhǎng)度、肌動(dòng)蛋白絲-肌動(dòng)蛋白絲的相互作用和絲狀偽足樣束的形成。肌動(dòng)蛋白絲生長(zhǎng)和相互作用的建模證實(shí)了，基本的機(jī)械和概率法則控制更高級(jí)結(jié)構(gòu)的肌動(dòng)蛋白組裝。作為第一步，為了在體外精確調(diào)控肌動(dòng)蛋白成核位點(diǎn)的位置，本發(fā)明人使用了最近開發(fā)的基于UV的微米圖案化方法(Azioune等，2009)來(lái)為成核促進(jìn)因子(NPF) pWA的定位產(chǎn)生模板(圖la)。pWA (SEQ ID Nol)包含來(lái)自于WASP/Scar蛋白的C端結(jié)構(gòu)域，所述WASP/Scar蛋白是在Arp2/3復(fù)合體和肌動(dòng)蛋白單體存在下在預(yù)先存在的肌動(dòng)蛋白絲上引發(fā)肌動(dòng)蛋白聚合的普遍存在的蛋白質(zhì)家族(Blanchoin等,2000 ；Machesky等，1999 ；Mul I ins等，1998 )。將少量由純化的蛋白肌動(dòng)蛋白聚合的最小組合(2 μ M肌動(dòng)蛋白單體(7%，用Alexa-568標(biāo)記)、6μΜ肌動(dòng)蛋白抑制蛋白和30nM Arp2/3復(fù)合體)制成的溶液置于PffA包被的微米圖案化的載玻片與玻璃支持物之間。官能化的微米圖案在其表面上特異性引發(fā)肌動(dòng)蛋白絲成核，并促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的2D生長(zhǎng)(圖lb)。作為對(duì)照，本發(fā)明人證實(shí)了，在不存在pWA包被的情況下，條形微米圖案不能募集任何在溶液中自發(fā)組裝的肌動(dòng)蛋白絲(圖lb)。這證實(shí)了官能化的微米圖案在其表面上特異性引發(fā)肌動(dòng)蛋白絲成核。肌動(dòng)蛋白絲成核和生長(zhǎng)的實(shí)時(shí)可視化突顯了網(wǎng)絡(luò)形成的自催化過(guò)程(圖2)。這些網(wǎng)絡(luò)由從pWA包被的區(qū)域生長(zhǎng)的肌動(dòng)蛋白絲產(chǎn)生，其中它們快速生長(zhǎng)的刺端向外取向(圖lc)。與肌動(dòng)蛋白絲在玻璃桿上的生長(zhǎng)一致，隨著成核波傳播，在微米圖案上形成了致密且互連的網(wǎng)絡(luò)(圖2)。總體來(lái)看，除了在接近于條末端的狹窄區(qū)域中之外，從這個(gè)致密網(wǎng)絡(luò)發(fā)出的肌動(dòng)蛋白絲一般自我組織到微米圖案的邊緣(圖lc-d)。盡管致密組織成平行網(wǎng)絡(luò)，但通過(guò)添加交聯(lián)因子，可以將這些肌動(dòng)蛋白絲進(jìn)一步聚集成更大的束，因此本發(fā)明人將其稱為肌動(dòng)蛋白絲而不是束。本發(fā)明人將不受隨后添加交聯(lián)劑影響的結(jié)構(gòu)稱為束(參見圖6)。他們證實(shí)了肌動(dòng)蛋白絲在微米圖案上的生長(zhǎng)對(duì)已知的生物化學(xué)參數(shù)敏感:肌動(dòng)蛋白絲長(zhǎng)度隨著G-肌動(dòng)蛋白的濃度而增加，隨著Arp2/3或加帽蛋白的濃度增加而減小，并被α -輔肌動(dòng)蛋白或肌成束蛋白成束(圖2)。
本發(fā)明人利用了肌動(dòng)蛋白生長(zhǎng)的幾何形狀控制來(lái)研究彼此相向生長(zhǎng)的兩組肌動(dòng)蛋白絲之間的相互作用。因此，他們分析了肌動(dòng)蛋白從單個(gè)、同心或偏心圓的生長(zhǎng)。20至30微米長(zhǎng)的肌動(dòng)蛋白絲成放射狀向內(nèi)和向外生長(zhǎng)(圖3a)。令人吃驚的是，由隔開15微米的三個(gè)同心圓產(chǎn)生的網(wǎng)絡(luò)不簡(jiǎn)單地疊加，并且平行束的向心排列方式消失。相反，向內(nèi)和向外生長(zhǎng)的肌動(dòng)蛋白絲之間的相互作用，在相鄰圓之間形成短且細(xì)的的反平行束。有趣的是，肌動(dòng)蛋白絲的延長(zhǎng)似乎被在相鄰圓上形成的致密肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)阻斷。為了證實(shí)這一點(diǎn)，本發(fā)明人通過(guò)將在相同的微米圖案上分別獲取的幾張圖進(jìn)行平均，對(duì)肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)局部密度進(jìn)行了定量(圖3b)。此外，為了理解肌動(dòng)蛋白絲生長(zhǎng)如何能夠產(chǎn)生這些肌動(dòng)蛋白密度分布情況，他們執(zhí)行了數(shù)值模擬，其中將肌動(dòng)蛋白絲沿著圓以恒定的線密度成核。肌動(dòng)蛋白絲一般從圓生長(zhǎng)出來(lái)，它們的長(zhǎng)度由生物化學(xué)條件決定。然后允許肌動(dòng)蛋白絲穿越或不穿越相鄰的成核區(qū)域，并從模擬的肌動(dòng)蛋白絲的局部密度推導(dǎo)出理論密度圖(圖3b)。數(shù)值模擬顯示，在同心圓上，肌動(dòng)蛋白絲不穿越位于其路徑上的致密網(wǎng)絡(luò)區(qū)域。相反，當(dāng)分開的成核區(qū)域之間的距離被縮短時(shí)，正如在偏心圓的情形中，內(nèi)圓中的密度不再各向同性。數(shù)值模擬證實(shí)，其他肌動(dòng)蛋白絲進(jìn)入這個(gè)最內(nèi)部的區(qū)域，從而在局部增加了熒光強(qiáng)度(圖3b)。這證實(shí)了短的并因此硬挺的肌動(dòng)蛋白絲可以生長(zhǎng)通過(guò)致密的網(wǎng)絡(luò)，而較長(zhǎng)且更柔性的肌動(dòng)蛋白絲變得纏結(jié)在一起，并被相鄰的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)阻斷。因此，除了生物化學(xué)信號(hào)之外，物理限制也調(diào)控肌動(dòng)蛋白絲的長(zhǎng)度。為了進(jìn)一步探索幾何參數(shù)對(duì)肌動(dòng)蛋白絲的相互作用及其得到的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用，本發(fā)明人迫使肌動(dòng)蛋白絲之間以各種角度接觸。當(dāng)從兩個(gè)短條成核時(shí)，肌動(dòng)蛋白絲首先垂直于所述條生長(zhǎng)，然后相互作用并拉鏈?zhǔn)缴L(zhǎng)，以形成絲狀偽足樣平行束(圖4a、圖7)，這令人聯(lián)想起在體內(nèi)出現(xiàn)的情形。這種相互作用迫使肌動(dòng)蛋白絲彎曲，因此束的形成依賴于肌動(dòng)蛋白絲改變其生長(zhǎng)方向的能力。我們通過(guò)改變兩個(gè)短條之間的角度測(cè)試了這個(gè)參數(shù)(圖4b)，并對(duì)平行束的形成進(jìn)行定量(圖4c)。對(duì)于接近于22°的成核條角度來(lái)說(shuō)，肌動(dòng)蛋白絲締合成短且細(xì)的反平行束。只有在大于22°至45°之間的臨界角時(shí)才開始形成平行束，并且平均圖像分析證實(shí)存在促進(jìn)大量肌動(dòng)蛋白絲聚結(jié)成平行束的最適角度(圖4d)。由于本發(fā)明人證實(shí)了肌動(dòng)蛋白絲的長(zhǎng)度和剛性調(diào)節(jié)它們與肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的相互作用，因此他們調(diào)查了在兩個(gè)成核區(qū)域之間的給定角度下，距離的變化是否影響束的形成。為此目的，他們?cè)O(shè)計(jì)了 8分枝的放射狀陣列，其中放射線從原點(diǎn)開始里外移動(dòng)。正如所預(yù)期的，肌動(dòng)蛋白絲從每個(gè)放射線向外生長(zhǎng)，并在相鄰放射線之間的對(duì)分線上形成平行的束(圖5a、b和圖7)。當(dāng)放射線足夠遠(yuǎn)時(shí)，短的平行束沿著對(duì)分線精確地形成并維持它們的取向。隨著放射線之間的距離減小，束變得更長(zhǎng)、錯(cuò)位且彎曲(圖5b、c)。在所有情形中，在放射線的近端部分中反平行束的組裝與其遠(yuǎn)端部分中平行束的組裝之間的轉(zhuǎn)變，在相當(dāng)可變的位置處發(fā)生(圖5d、e)。因此，在所測(cè)試的范圍內(nèi)，成核位點(diǎn)之間的距離對(duì)于最終結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生不是關(guān)鍵的。從反平行束轉(zhuǎn)變成平行束的位置，可以作為肌動(dòng)蛋白絲的固有性質(zhì)和集體組裝的結(jié)果進(jìn)行建模(圖5f)。如果肌動(dòng)蛋白絲在網(wǎng)絡(luò)的近端部分中專一地組裝成反平行束，則彼此接觸的肌動(dòng)蛋白絲組裝成平行束的概率為P。這種固有概率P只取決于肌動(dòng)蛋白絲的取向，并因此取決于它們沿著放射線的位置(圖1d)。如果肌動(dòng)蛋白絲在近端網(wǎng)絡(luò)中形成平行束，則相遇的肌動(dòng)蛋白絲被迫彎曲并促成這種平行束。因此形成平行束的概率Q由下式給出:
Q(y+1) = p(y) (1-Q(y))+Q(y) (I)其解為0(,> =卜111,—/柳
“.(2)其中y是表征沿著對(duì)分軸的位置的離散變量。從概率函數(shù)Q獲得的轉(zhuǎn)變位置與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精確匹配(圖5g)。由于轉(zhuǎn)變點(diǎn)產(chǎn)生由所有遠(yuǎn)端肌動(dòng)蛋白絲構(gòu)成的平行束，因此本發(fā)明人計(jì)算了與每個(gè)轉(zhuǎn)變點(diǎn)相關(guān)的束的大小和熒光強(qiáng)度。模型準(zhǔn)確解釋了由肌動(dòng)蛋白絲組裝成束造成的熒光增加和由束中各種不同的肌動(dòng)蛋白絲長(zhǎng)度造成的熒光降低兩者(圖5h)。在兩種不同的肌動(dòng)蛋白交聯(lián)劑存在下，這些幾何形狀介導(dǎo)的束也以濃度依賴性方式出現(xiàn)(圖6)。這證實(shí)了束的出現(xiàn)受到肌動(dòng)蛋白絲機(jī)械性質(zhì)的嚴(yán)密控制。由本發(fā)明人執(zhí)行的絲狀偽足樣束的重建依賴于前體結(jié)構(gòu)的自發(fā)形成，所述前體結(jié)構(gòu)由從致密肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)發(fā)出的肌動(dòng)蛋白絲的崩潰和進(jìn)一步的聚結(jié)所形成，并且相鄰的延長(zhǎng)的肌動(dòng)蛋白絲將系統(tǒng)性地會(huì)聚于所述前體結(jié)構(gòu)。有趣的是，由前體、例如與體內(nèi)觀察到的外張絲狀偽足根(splayed filopodial root)對(duì)應(yīng)的Λ -前體所引發(fā)的肌動(dòng)蛋白絲的這種伸延性聚結(jié)，解釋了細(xì)胞中平行束從周圍的致密網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)。此外，這種伸延性過(guò)程解釋了束中短肌動(dòng)蛋白絲的存在，這與板狀偽足的前緣處存在高的刺端加帽活性相一致。本發(fā)明的創(chuàng)新性方法證實(shí)了，獨(dú)立于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的混合物，成核幾何形狀在決定肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)體系中發(fā)揮關(guān)鍵作用。相鄰成核區(qū)的相應(yīng)定位導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白絲纏結(jié)成網(wǎng)絡(luò)并控制它們的長(zhǎng)度。肌動(dòng)蛋白絲的取向決定了它們與鄰近肌動(dòng)蛋白絲相互作用并形成束的能力。從根本上說(shuō)，基本的機(jī)械和概率法則控制著反平行和絲狀偽足樣平行肌動(dòng)蛋白絲對(duì)確定的幾何邊界條件做出響應(yīng)的空間排列方式。擴(kuò)展到活細(xì)胞，本工作強(qiáng)調(diào)了成核區(qū)的空間和時(shí)間組織的重要性，所述空間和時(shí)間組織產(chǎn)生特定的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)體系，并因此控制力產(chǎn)生的位置。盡管已知肌動(dòng)蛋白生長(zhǎng)的時(shí)空調(diào)控影響細(xì)胞形狀，但本工作以定量方式揭示出細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍的相互物理邊界控制了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)體系O材料和方法蛋白質(zhì)表達(dá)和純化:肌動(dòng)蛋白純化自兔骨骼肌丙酮粉末(MacLean-Fletcher&Pollard, 1980 ；Spudich&ffatt, 1971)。按照 Isambert 等(1995)的方法用Alexa-488在賴氨酸上標(biāo)記肌動(dòng)蛋白。Arp2/3復(fù)合體按照Egile等(1999)的方法純化自牛腦提取物。GST-pWA、按照以前描述的方法(Almo等，1994 ;Falck等，2004 ；Machesky等，1999)來(lái)表達(dá)和純化人肌動(dòng)蛋白抑制蛋白和小鼠加帽蛋白。微米圖案化:將玻璃蓋玻片用氧等離子體氧化(10s，30W，HarrickPlasma, Ithaca, NY),并與 0.lmg/ml 聚賴氛酸-L_g-聚乙二 醇(PLL-PEG) (JenKemTechnology, TX)在IOmM pH7.4的HEPES中溫育lh。使用自制真空支架將聚乙二醇化的蓋玻片置于鉻合成石英光掩模(Toppan Photomasks, Corbeil, France)上。光掩模的鉻層含有3μπι寬的透明微米圖案。然后將掩模覆蓋的蓋玻片暴露于深紫外光(l〈200nm，UVOCleaner, Jelight Company, Irvine, CA) 5min,并用 0.5 μ M 的成核促進(jìn)因子 pWA 溶液包被15min。肌動(dòng)蛋白聚合:將蛋白質(zhì)混合物在新鮮制備的滅光緩沖液中稀釋以引起肌動(dòng)蛋白聚合，所述緩沖液含有IOmM咪唑-HCl (pH7.8)、50mM KClUmM MgCl2、IOOmM 二硫蘇糖醇、3mg/ml葡萄糖、20 μ g/ml過(guò)氧化氫酶、100mg/ml葡萄糖氧化酶和0.5%甲基纖維素。在含有2μΜ肌動(dòng)蛋白單體(7%，用Alexa568或Alexa488標(biāo)記)和6μΜ肌動(dòng)蛋白抑制蛋白以及30nM Arp2/3復(fù)合體的溶液中引起肌動(dòng)蛋白聚合。圖像獲取:使用裝備有40x干物鏡(UPLFLN, NA=0.75)、XY馬達(dá)驅(qū)動(dòng)載物臺(tái)(Marzhauser, Germany)和 CoolSnap HQ2 相機(jī)(Roper Scientific, GmbH, Germany)的立式BX6101ympus顯微鏡獲取圖像。顯微鏡和裝置由MetaMorph (Molecular Devices,downington, PA)驅(qū)動(dòng)。圖像處理:使用相同的光強(qiáng)度和曝光時(shí)間獲取所有圖像。然而，在進(jìn)行重疊和平均之前，調(diào)整圖像的灰度以具有相同的最小和最大灰度值。使用來(lái)自于Image J軟件的“非銳化掩模”(unsharp mask)和“高斯模糊”(Gaussian blur)濾鏡對(duì)顯示的圖像進(jìn)行過(guò)濾，以從背景中突顯肌動(dòng)蛋白絲。全內(nèi)反射熒光顯微術(shù):在裝備有50mW488nm激光器和QuantEM512SC -定量EMCCD相機(jī)(Roper Scientific)的Nikon TE2000E倒置顯微鏡上執(zhí)行全內(nèi)反射熒光的獲取。參考文獻(xiàn) Almo 等，1994，J Mol Biol236,950-952。Azioune 等，2009，LabChip9,1640-1642。Blanchoin 等，2000, Nature4O4,1007-1011oDeLaCruz 等，2001，JBiol Chem，276，32373-32381。Egile 等，1999，J Cell Bioll46，1319-1332。Falck 等，2004，EMBO J23，3010-3019。Ginger 等，2004, Angew Chem Int Ed Engl, 43, 30-45。Haraszti 等，2009, ChemphyschemlO, 2777-86。Higgs HN, Pollard TD.2001, Annu Rev Biochem.70:649-76。Isambert 等，1995，J Biol Chem270，11437-11444。MacLean-Fletcher&Pollard, 1980, Cell20, 329-341。Machesky 等，1999，Proc NatlAcad SciUSA96，3739-3744。Marchand 等，1995，J Cell Biol.130，331-43。Matsudaira 等，1994, Semin Cell Biol.5,165-74。Michelot 等，2007, Current Bio logy 17,825-833 Mullins 等，1998，Proc Natl Acad Sci USA95，6181-6186。Patolsky 等，2004, Nature Materials3,692-695。Pollard 等，2000, Annu Rev Biophys Biomol Struct.;29, 545-76。Roos 等，2003, ChemPhysChem, 4,872-877。Spudich&ffatt,1971,J Biol Chem246，4866-4871。Theriot 等，1992, Nature.357, 257-60。Uhrig 等，2009，Lab On A Chip，9，661-668。Wadu-Mesthrige 等，2001, Biophys J80,1891-9。
權(quán)利要求
1.裝置，其包含表面，在所述表面上配置有包括含有肌動(dòng)蛋白成核劑的線的圖案或包含至少兩個(gè)點(diǎn)的圖案，其中每個(gè)點(diǎn)包含肌動(dòng)蛋白成核劑，并且所述點(diǎn)處于適合允許來(lái)自于兩個(gè)相鄰點(diǎn)的聚合的肌動(dòng)蛋白絲發(fā)生相互作用的距離，并且其中所述肌動(dòng)蛋白成核劑選自WASP/SCAR家族的成員、其PWA片段及其VAC結(jié)構(gòu)域、ActaA、IscA及其C-末端區(qū)域，所述肌動(dòng)蛋白成核劑優(yōu)選為PWA。
2.權(quán)利要求1的裝置，其中所述表面在其上配置有多個(gè)圖案，優(yōu)選為多個(gè)可尋址圖案。
3.權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的裝置，其中所述圖案包含數(shù)個(gè)點(diǎn)或數(shù)條線，所述點(diǎn)或線處于適合允許來(lái)自于兩個(gè)相鄰點(diǎn)或兩條相鄰線的聚合的肌動(dòng)蛋白絲發(fā)生相互作用的距離，所述距離優(yōu)選為1、2、5、10、15、20、25或30微米。
4.權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的裝置，其中所述圖案包含: -一個(gè)圓或數(shù)個(gè)嵌套的圓；和/或 -兩條以上的線；和/或 -點(diǎn)的陣列。
5.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的裝置，其中所述圖案包含2至5個(gè)圓，所述圓具有不同的直徑，所述圓是同心圓或偏心圓，并且較小的圓被包含在較大的圓內(nèi)。
6.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的裝置，其中所述圖案包含兩條以上的線，優(yōu)選為直線，所述線相對(duì)于彼此形成: -小于或不超過(guò)25°的角； -超過(guò)25°并小于110°的角；或 -超過(guò)110°并小于150°的角。
7.權(quán)利要求1至4和6任一項(xiàng)的裝置，其中所述圖案包括數(shù)條線，所述線被排列成形成放射狀圖案。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的裝置，其中所述表面是平面的。
9.試劑盒，其包含權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的裝置以及肌動(dòng)蛋白聚合溶液或混合物，所述溶液或混合物包含足以引起肌動(dòng)蛋白聚合的組分，特別是肌動(dòng)蛋白單體、ATP、二價(jià)陽(yáng)離子、肌動(dòng)蛋白絲和Arp2/3復(fù)合體以及任選的肌動(dòng)蛋白抑制蛋白。
10.用于制備或制造肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的方法，所述方法包括:a)提供權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的裝置山)將所述圖案、優(yōu)選為所述納米圖案或微米圖案與包含肌動(dòng)蛋白單體、ATP、二價(jià)陽(yáng)離子、肌動(dòng)蛋白絲和Arp2/3復(fù)合體的聚合溶液或混合物相接觸，從而引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合；以及任選地c)從所述表面移除所述聚合溶液或混合物和/或移除獲得的肌動(dòng)蛋白絲。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述方法包括: -所述肌動(dòng)蛋白絲的包被，特別是用傳導(dǎo)性物質(zhì)例如金包被；和/或 -所述肌動(dòng)蛋白絲的處理，特別是用肌動(dòng)蛋白交聯(lián)劑例如肌成束蛋白或α-輔肌動(dòng)蛋白處理。
12.用于研究肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的空間組織的方法，其中所述方法包括:a)提供權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的裝置；b)將所述圖案、優(yōu)選為所述納米圖案或微米圖案與包含肌動(dòng)蛋白單體、ATP、二價(jià)陽(yáng)離子、肌動(dòng)蛋白絲和Arp2/3復(fù)合體的聚合溶液或混合物相接觸，從而引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合；以及c)觀察所述肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)。
13.用于篩選能夠調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的測(cè)試分子的方法，其中所述方法包括:a)提供權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的裝置；b)將所述圖案、優(yōu)選為所述納米圖案或微米圖案與包含肌動(dòng)蛋白單體、ATP、二價(jià)陽(yáng)離子、肌動(dòng)蛋白絲和Arp2/3復(fù)合體的聚合溶液或混合物相接觸，從而引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合；以及c)觀察所述肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)；其中在肌動(dòng)蛋白聚合之前、期間和/或在肌動(dòng)蛋白聚合之后添加所述測(cè)試分子，并且其中確定所述測(cè)試分子對(duì)所述肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的影響。
14.用于研究分子馬達(dá)例如肌球蛋白的方法，所述方法包括:a)提供權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的裝置山)將所述圖案、優(yōu)選為所述納米圖案或微米圖案與包含肌動(dòng)蛋白單體、ATP、二價(jià)陽(yáng)離子、肌動(dòng)蛋白絲和Arp2/3復(fù)合體的聚合溶液或混合物相接觸，從而引起肌動(dòng)蛋白絲的聚合；以及c)觀察聚合的肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)構(gòu)、相互作用和/或變形；其中在肌動(dòng)蛋白聚合之前、期間和/或在肌動(dòng)蛋白聚合之后添加所述分子馬達(dá)。
15.權(quán)利要求10-14的方法，其中所述聚合溶液或混合物含有至少30nM的Arp2/3復(fù)合體。`
全文摘要
本發(fā)明涉及用微米圖案化的成核位點(diǎn)控制肌動(dòng)蛋白絲的生長(zhǎng)和組織的裝置和方法，它們?cè)谘芯考?dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)形成、篩選藥物或制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103201631SQ201180039957
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2011年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者瑪紐爾·特里, 勞倫特·布蘭可因, 拉賈·帕特爾斯基 申請(qǐng)人:原子能及替代能源委員會(huì), 法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心, 格勒諾布爾第一大學(xué)