專利名稱：一種甲型流感病毒抗原和乙型病毒流感抗原的聯(lián)檢試紙及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域，尤其涉及一種一種甲型流感病毒抗原和乙型病毒流感抗原的聯(lián)檢試紙及其制備方法。
背景技術：
流行性感冒，通常稱為“流感”，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，具有很強的傳染性，主要通過咳嗽和打噴嚏傳播，一般春季和冬季爆發(fā)。分為A型(甲型)流感病毒、B型(乙型)流感病毒和C型(丙型)流感病毒。甲型流感病毒具有極強的變異性，乙型病毒次之，而丙型病毒則非常穩(wěn)定，故甲型病毒和乙型病毒的檢測尤為重要。根據(jù)統(tǒng)計，全球每年的流感病例為6-12億，其中重癥流感為300-500萬例，死亡 25-50萬人，重癥流感的病死率可達8% -10%。目前美國每年流感導致的死亡人數(shù)超過車禍和艾滋病造成的死亡人數(shù)，在我國和發(fā)展中國家已成為嚴重危害人類健康的頭號大敵。 我國是流感的高發(fā)區(qū)，流感的流行或局部暴發(fā)基本上每年都有，每年有1億多人遭受流感的困擾，到醫(yī)院就醫(yī)者超過50萬人。現(xiàn)階段檢測流感病毒感染的方法主要包括病毒培養(yǎng)法、RT-PCR法以及膠體金免疫層析法。病毒培養(yǎng)是病毒檢測的金標準，但這種檢測方法周期很長，一般要3 7天的時間，靈敏度不高；RT-PCR能夠4-8小時內對樣本實現(xiàn)檢測，且靈敏度和特異性很高，但是并不適于在機場、口岸、火車站、醫(yī)院等人口密度大、人流量大、不易讓人群長時間聚集的公共場所；膠體金免疫層析法由于不需要輔助的設備，方便的儲運及操作簡便非常適合在基層場所使用，但現(xiàn)階段靈敏度不高，容易造成漏檢，尚不能夠區(qū)分病毒感染亞型。中國專利CN200910087632. 5公開了一種屬于病原體基因快速診斷領域的檢測甲型Hmi流感病毒的專用引物和包括該引物的檢測甲型Hmi流感病毒的試劑盒以及該引物所對應的靶序列。本發(fā)明的專用引物所對應的靶序列，該試劑盒利用基因反轉錄和等溫擴增技術原理，對甲型Hmi病毒核酸進行快速檢測，檢測結果可肉眼判定，也可利用電泳進行分析。但是該方法耗時長，費用大，不利于大面積推廣和民用化。中國專利CN20091008M75. 4公開了一種流感病毒rRT_PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法，包括甲型流感病毒特異性引物和探針、兩組新甲型Hmi流感病毒Hl特異性引物和探針、新甲型流感病毒特異性引物和探針等，4種共12條寡核苷酸引物和探針序列，同時公開了待檢樣本處理、rRT-PCR反應體系及反應條件、結果分析。該方法的不足也是由于費用昂貴、需要專業(yè)的儀器和操作人員需要經過專業(yè)培訓。故該方法也不適用于普及和民用化。同樣的，專利號為CN20081002M89. 7的專利公布了一種借助液相芯片檢測流感和H5m亞型禽流感病毒的方法、申請?zhí)枮镃N201110223913. 6的專利公布了甲型/乙型流感病毒核酸雙重熒光PCR檢測試劑盒、申請?zhí)枮镃N201010171355.9的專利公布了人甲、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多檢方法及試劑盒、申請?zhí)枮?01110149333. 7公布了雙重熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及應用，這些方法都存在費用高、需要專業(yè)儀器、檢測周期長的問題，不利于流感檢測在家庭、在基層及更廣泛人群中推廣使用。申請?zhí)枮镃N200710040792的發(fā)明專利多聯(lián)檢測試劑盒公開了一種多項聯(lián)檢的試劑盒，但是該試劑盒是有多條檢測條組成的，雖然可以同步聯(lián)檢，但是沒有達到最大降低一次性耗材消耗，不夠環(huán)保。申請?zhí)枮镃N200910040975公布了一種用于檢測甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒的核酸納米金生物傳感器，是通過玻璃纖維上涂有納米金標記寡核苷酸探針以及在硝酸纖維素膜上固定兩種寡核苷酸探針來檢測目標物。但是因為流感會有甲型和乙型之分，該發(fā)明就不能實現(xiàn)同時檢測的目的，而且，檢測時間基本需要在半個小時以上。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術中存在的流感病毒檢測費用昂貴、檢測周期長、 用納米金靈敏度稍低、以及不能同時檢測甲型和乙型流感病毒的缺陷，而提供一種新的甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術方案一種甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙，所述試紙由樣品墊、含有膠體金顆粒標記物的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構成，所述硝酸纖維素膜包括包被有甲型流感病毒抗體的檢測區(qū)、包被有乙型流感病毒抗體的檢測區(qū)和包被有羊抗兔抗體的控制區(qū)，所述膠體金顆粒標記物包括微信號放大系統(tǒng)和膠體金標記的兔IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為膠體金顆粒-親和素-生物素-甲或乙型流感病毒抗體。優(yōu)選地，所述膠體金顆粒-親和素-生物素-甲或乙型流感病毒抗體的用量為 42. 5-90 μ g/cm2 ；所述膠體金標記的兔IgG抗體的用量為25-45 μ g/cm2 ；所述檢測區(qū)中甲型流感病毒抗體用量為0. 144-0. 28 μ g/mm,乙型流感病毒抗體用量為0. 144-0. 28 μ g/mm ；所述羊抗兔抗體為羊抗兔IgG抗體，所述羊抗兔抗體的用量為0. 18-0. 44 μ g/mm。更優(yōu)選地，所述膠體金標記的兔IgG抗體的用量為30-36 μ g/cm2 ；所述膠體金顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體的用量為70-72 μ g/cm2 ；所述膠體金顆粒-親和素-生物素-乙型流感病毒抗體的用量為74-76 μ g/cm2 ；所述檢測區(qū)甲型流感病毒抗體用量為0. 21-0. 22 μ g/mm，所述檢測區(qū)乙型流感病毒抗體用量為0. 23-0. 24 μ g/mm ；所述羊抗兔抗體的用量為0. 30-0. 35 μ g/mm。本發(fā)明還提供了上述試紙的制備方法，包括以下步驟(1)按常規(guī)方法制備甲型流感病毒抗體、乙型流感病毒抗體以及膠體金標記的兔 IgG抗體；(2)制備微信號放大系統(tǒng)a、制備膠體金標記親和素將待標記親和素預先在0. 001 0. 01mol/L的NaCl溶液中透析過夜，離心，用PBS 調節(jié)膠體金液的pH為8 9，按Iml膠體金溶液中加入15 25 μ g親和素的量，標記親和素以形成膠體金標記親和素；b、按常規(guī)方法制備生物素化甲型流感病毒抗體和生物素化乙型流感病毒抗體；所
5述生物素與甲型流感病毒抗體的質量比為1 9，所述生物素與乙型流感病毒抗體的質量比為1 10 ； c、完成微信號放大系統(tǒng)按Iml膠體金標記親和素中加入100 μ 1生物素化甲/乙型流感病毒抗體的量，將膠體金標記親和素和生物素化甲/乙型流感病毒抗體混合，連接得到膠體金-親和素-生物素-甲/乙型流感病毒抗體，洗滌，即得微信號放大系統(tǒng)；(3)按稀釋參數(shù)20cm2/ml 40cm2/ml，將步驟⑵的膠體金-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體、以及膠體金-親和素-生物素-乙型流感病毒抗體噴灑到玻璃纖維膜上， 干燥12個小時以上，備用；(4)用包被緩沖液稀釋甲型流感病毒抗體，使其濃度為0. 9mg/ml 1. %ig/ml，按膜液量0. 16 μ 1/mm 0. 2 μ 1/mm,將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥12個小時以上，備用；用包被緩沖液稀釋乙型流感病毒抗體，使其濃度為0. 9mg/ml 1. %ig/ml，按膜液量0. 16 μ 1/mm 0. 2 μ 1/mm，將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥12個小時以上，備用；用包被緩沖液(0.01M pH7. 2PBS、5%蔗糖、甲醇、5%甘氨酸、0. 05% NaN3)稀釋羊抗兔抗體，使其濃度為1. Omg/ml 2. Omg/ml，按膜液量0. 18 μ 1/mm 0. 44 μ 1/mm,將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥12個小時以上，備用；(5)將樣品墊、步驟( 的玻璃纖維膜、步驟(4)的硝酸纖維素膜、吸水紙按序粘貼于底板上，即得。為了解決信號擴大不足和不能同時檢測兩種分型的問題，本發(fā)明基于固相免疫層析原理，采用功能性彩色微球技術(膠體金顆粒標記技術)、微信號放大技術(親和素-生物素體系和雙抗體夾心反應體系)及聯(lián)檢技術檢測人體分泌物中的流感病毒抗原。若樣品中含有甲型流感病毒抗原或者是乙型流感病毒抗原，經玻璃纖維膜上的微信號級聯(lián)系統(tǒng)將信號放大，使甲型/乙型流感病毒抗原與膠體金顆粒標記物結合，形成復合物，并擴散到硝酸纖維素膜上進一步層析，當遇到包被在硝酸纖維素膜上檢測區(qū)的Tl線或者T2線(分別為甲型或乙型流感病毒抗體包被線)處的配對抗體時，復合物則又和包被抗體結合，被捕獲在包被處，當被捕獲的復合物達到一定數(shù)量時，則形成肉眼可見的T線，說明樣品中含有甲型或乙型流感病毒抗體，若不出現(xiàn)，說明樣品為陰性或含量低于試紙的最低檢測限?？刂茀^(qū)(C線)作為試紙的質控標準，陽性和陰性樣品檢測時均會出現(xiàn)。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果(1)本發(fā)明在現(xiàn)有檢測試紙的基礎上，添加了生物素-親和素微信號級聯(lián)放大系統(tǒng)，因而，在檢測甲型/乙型流感病毒抗原的過程中，擴大了目標抗體的信號，增加檢測靈敏度，避免因信號太弱而出現(xiàn)假陰或者漏檢；同時，通過調整不同的制備工藝參數(shù)，實現(xiàn)在同一條試紙條上兩種分型的同時檢測。(2)本發(fā)明的試紙條具有操作安全(無放射物污染)、簡便(簡單操作一步完成)、 適合單人/份檢測(放免、酶免不適合單人/份或少量樣品檢測)和快速(15分鐘左右即可有結果)等優(yōu)點，可實現(xiàn)對甲型/乙型流感病毒抗原現(xiàn)場和家庭自檢；彌補現(xiàn)階段層析試劑盒靈敏度不高及不能實現(xiàn)分型的缺陷，將能夠最大限度地降低人群聚集感染的風險、在疫情現(xiàn)場減低疾病造成的危害；(3)本發(fā)明的試紙可以實現(xiàn)在一條紙條上同時檢測甲型、乙型兩種流感病毒，縮短了檢測周期，減少因為單一檢測某種分型而漏檢的現(xiàn)象，并節(jié)約了一次性耗材。


圖1為本發(fā)明的甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙的結構示意圖；圖2為利用本發(fā)明試紙條檢測甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的檢驗陽性結果圖示(有效結果)；圖3為利用本發(fā)明試紙條檢測甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的檢驗陰性結果圖示(無效結果)；附圖標記1.樣品墊；2.玻璃纖維膜；3.硝酸纖維素膜；4.吸水紙；5.底板；6.甲型流感病毒檢測區(qū)；7.乙型流感病毒檢測區(qū)；8.控制區(qū)。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明。實施例1本發(fā)明甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙如圖1所示，為本發(fā)明所述的一種甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙。包括樣品墊1、與所述樣品墊1 一端緊密相連的含有膠體金顆粒標記物的玻璃纖維膜 2、與所述玻璃纖維膜2另一端緊密相連的硝酸纖維素膜3、以及與所述纖維素膜3的另一端緊密相連的吸水紙4，所述樣品墊1、玻璃纖維膜2、硝酸纖維素膜3和吸水紙4均設置于底板5上，所述硝酸纖維素膜3包括包被有甲型流感病毒抗體的檢測區(qū)6、包被有乙型流感病毒抗體的檢測區(qū)7和包被有羊抗兔抗體的控制區(qū)8，所述膠體金顆粒標記物包括微信號放大系統(tǒng)和膠體金標記的兔IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為膠體金顆粒-親和素-生物素-流感病毒抗體，其中流感病毒抗體為甲型流感病毒抗體或乙型流感病毒抗體。該實施例的試紙，膠體金顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復合物在玻璃纖維膜2上的用量為71 μ g/cm2 ；膠體金顆粒-親和素-生物素-乙型流感病毒抗體復合物在玻璃纖維膜2上的用量為75 μ g/cm2 ；膠體金標記的兔IgG抗體在玻璃纖維膜2上的用量為35 μ g/cm2 ；甲型流感病毒抗體的原始濃度為3. 00mg/ml,乙型流感病毒抗體的原始濃度為3. 5mg/ml，包被到硝酸纖維膜3的檢測區(qū)6和檢測區(qū)7時的濃度分別為1. 2mg/ml和 1. 3mg/ml，包被用量分別為0. 216μ g/mm和0. 234 μ g/mm ；羊抗兔IgG抗體包被在控制區(qū)時的用量為0. 33 μ g/mm。實施例2實施例1的試紙的制備方法在本發(fā)明中采用膠體金顆粒標記。其中膠體金顆粒的顆粒直徑大小為納米級 (30 50nm)，膠體顆粒的吸附機理是利用它在堿性條件下帶負電荷的性質，與蛋白質分子的正電荷集團，靠靜電吸引而結合形成免疫診斷試劑。甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙的制備步驟如下1.制備甲/乙型流感病毒抗體利用常規(guī)方法用重組的甲/乙型流感抗原或滅活的流感抗原免疫小鼠，甲/乙型流感抗原免疫的小鼠與骨髓瘤細胞融合后，用ELISA方法鑒別，鑒別出來的雜交瘤在腹水中培養(yǎng)，篩選陽性克隆，分離純化甲/乙型流感病毒抗體。ELISA鑒定甲/乙型流感病毒抗體的活性和效價，純化備用，甲型流感病毒抗體的原始濃度為3. 00mg/ml,乙型流感病毒抗體的原始濃度為3. 5mg/ml。2、制備微信號放大系統(tǒng)a、制備膠體金標記親和素(美國Thermo公司中性親和素蛋白)將待標記親和素預先在0. 005mol/L pH7. O的NaCl溶液中4°C透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后 40C IOOOOOg離心lh，去除聚合物；以0. lmol/L PBS調節(jié)膠體金(按常規(guī)方法制備)液的 PH值至8 9，按Iml膠體金溶液中加入15 25 μ g親和素的量，標記親和素以形成膠體金標記親和素；b、制備生物素(美國Thermo公司EZ-Link NHS-Biotin)化甲/乙型流感病毒抗體先用6-氨基己糖與生物素連接制得長臂生物素，再使其與甲/乙型流感抗原結合，生物素與甲型流感病毒抗體的質量比為1 9，生物素與乙型流感病毒抗體的質量比為1 10。 然后在碳二亞胺的作用下將其與N-羥基丁二酰胺進行縮和，生成長臂生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl ami do hexanoate，BCNHS)，即為生物素化甲/乙型流感病毒抗體。通過透析除去游離生物素。C、完成微信號放大系統(tǒng)按Iml膠體金標記親和素溶液中加入100 μ 1生物素化甲 /乙型流感病毒抗體的量，將步驟a得到的膠體金標記親和素和步驟b得到的生物素化甲/ 乙型流感病毒抗體直接混合，連接得到膠體金-親和素-生物素-甲/乙型流感病毒抗體復合物，經過洗滌、離心處理后，即得微信號放大系統(tǒng)。3、膠體金標記的兔IgG抗體在pH6. 5 7.0范圍內，兔IgG與膠體金顆粒蛋白(最低用量為8. 0 μ g/ml)標記形成膠體金標記兔IgG抗體(蛋白探針)。4、將膠體金-親和素-生物素-甲/乙型流感病毒抗體、以及膠體金標記兔IgG 抗體噴灑到玻璃纖維膜2上，稀釋參數(shù)(稀釋參數(shù)是每ml溶液噴灑多少面積的工藝參數(shù)) 為25cm2/ml 35cm2/ml，膠體金顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體復合物的用量為71 μ g/cm2 ；膠體金顆粒-親和素-生物素-乙型流感病毒抗體復合物的用量為75 μ g/ cm2 ；膠體金標記的兔IgG抗體的用量為35 μ g/cm2 ；并在溫度20 40°C，濕度10% -30%, 將玻璃纖維膜2干燥12個小時以上，備用。5、用包被緩沖液(其包被緩沖液的配方是0. OlM pH7. 2PBS、5%蔗糖、甲醇、 5%甘氨酸、0. 05% NaN3)稀釋甲和乙型流感病毒抗體，使其濃度分別為1. 2mg/ml和1. 3mg/ ml，按包被用量分別為0. 216μ g/mm和0. 234 μ g/mm，將其分別細致均勻的噴到硝酸纖維素膜3上，其中硝酸纖維素膜3孔徑為5. 0 μ m 12. 0 μ m，置于20 40°C，濕度10 % 30%條件下烘干處理12個小時以上，備用；用包被緩沖液稀釋羊抗兔IgG抗體，使其濃度為 1. 5mg/ml，按包被用量為0. 33 μ g/mm，將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜3上，置于20 40°C，濕度10% 30%條件下烘干處理12個小時以上，封袋，備用；6、將樣品墊1、玻璃纖維膜2、硝酸纖維素膜3和吸水紙4依序粘貼于底板5上，即得所述聯(lián)檢試紙。所述甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙經過包裝可以直接使用，或者安裝到試劑盒里，配合小滴管，充當試劑卡使用。實施例3利用實施例1中的試紙檢測分泌液中甲/乙型流感病毒抗原的方法本實施例利用實施例1的試紙對分泌液樣本中的甲/乙型流感病毒抗原進行檢測。包括以下步驟(1)采集樣本使用無菌PP (聚丙烯)桿的聚酯海綿拭子采集樣本。鼻腔分泌物采集方法收集鼻腔分泌物時，將拭子插入鼻腔中分泌物最多處，輕輕轉動并向鼻腔內部推動拭子，直至鼻甲(離鼻孔約2. Ocm 2. 5cm)受阻處，貼鼻腔壁旋轉拭子三次，取出拭子；咽喉分泌物采集將拭子從口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上顎扁桃的發(fā)紅部位為中心，適度用力擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，應避免觸及舌部，取出拭子。(2)采集樣品后，在樣本提取管內垂直加入400μ 1(約10滴)樣本提取液，將采樣后的拭子插入樣本提取管中的溶液內，緊靠試管內壁旋轉約10次，使標本盡可能溶解在溶液中，沿提取管內壁擠壓拭子的棉簽頭，使液體盡可能留在管內，取出并棄去拭子。標本采集后盡快采用病毒采樣液或本試劑盒提供的樣本提取液進行處理。如不能立即處理，標本應立即置于干燥、消毒并嚴格密封的塑料管內儲存，2°C 8°C下可保存8小時，-70°c可長期保存。(3)沿鋁箔袋切口部位撕開，取出試條平放，吸取5μ 1樣本垂直滴加于試條箭頭膠所示的加樣區(qū)；由于毛細管作用，樣品將沿著試紙向玻璃纖維素膜2和硝酸纖維素膜3移動，待樣品完全通過玻璃纖維素膜2以及硝酸纖維素膜3，結果開始顯示；(4) 15分鐘后觀察顯示結果(30分鐘后顯示的結果無效)，判讀并記錄檢測結果 (圖2和圖3)，若硝酸纖維素膜3的檢測區(qū)6出現(xiàn)一條肉眼可見的深色線(Τ2線，即A區(qū))， 即表明樣品中含有大量甲型流感病毒抗原，即說明受檢驗者的肌體已經被甲型流感病毒感染(甲型流感病毒陽性，請同時參考圖2)；若檢測區(qū)7出現(xiàn)一條肉眼可見的深色線(Tl線， 即B區(qū))，即表明樣品中含有大量乙型流感病毒抗原，即說明受檢驗者的肌體已經被乙型流感病毒感染(乙型流感病毒陽性，請同時參考圖2)；若Tl線和Τ2線同時出現(xiàn)，即說明受檢驗者的肌體已經被甲型和乙型流感病毒的同時感染(Α區(qū)和B區(qū))；若硝酸纖維素膜3的檢測區(qū)6和檢測區(qū)7均未出現(xiàn)一條肉眼可見的深色線，即表明樣品中未含有大量的流感病毒抗原，說明受檢驗者未被病毒感染(陰性，請同時參考圖幻；當樣品通過硝酸纖維素膜3的檢測區(qū)6和檢測區(qū)7移動至控制區(qū)8時，無論樣品中有沒有甲/乙型流感病毒抗原，控制區(qū) 8都會有一條深色線(C線)；若控制區(qū)8無色線出現(xiàn)，說明試紙條已經過期或操作有誤(請參考圖3)；(5)測試結束后，將使用后的試紙、樣本提取管和口腔取樣器按生物醫(yī)療廢棄物進行處理。測定結果為了表示方便，在下列表格中A代表甲型流感病毒抗原，B代表乙型流感病毒抗原。1.實施例1中的試紙對人流感病毒不同亞型和不同株的甲型流感病毒和乙型流感病毒均有良好的反應性，研究結果見表1。表1對人甲型/乙型流感病毒抗原的檢測靈敏度結果
權利要求
1.一種甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙，所述試紙由樣品墊、含有膠體金顆粒標記物的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構成，其特征在于，所述膠體金顆粒標記物包括微信號放大系統(tǒng)和膠體金標記的兔IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為膠體金顆粒-親和素-生物素-甲型或乙型流感病毒抗體；所述硝酸纖維素膜包括包被有甲型流感病毒抗體的檢測區(qū)、包被有乙型流感病毒抗體的檢測區(qū)和包被有羊抗兔抗體的控制區(qū)。
2.根據(jù)權利要求1所述的甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙，其特征在于，所述膠體金顆粒-親和素-生物素-甲型或乙型流感病毒抗體的用量為42. 5-90 μ g/
3.根據(jù)權利要求1所述的甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙，其特征在于，所述膠體金標記的兔IgG抗體的用量為25-45 μ g/cm2。
4.根據(jù)權利要求1所述的甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙，其特征在于，所述檢測區(qū)甲型流感病毒抗體用量為0. 144-0. g/mm，所述檢測區(qū)乙型流感病毒抗體用量為 0. 144-0. 28 μ g/mm。
5.根據(jù)權利要求1所述的甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙，其特征在于，所述羊抗兔抗體為羊抗兔IgG抗體，所述羊抗兔抗體的用量為0. 18-0. 44 μ g/mm。
6.根據(jù)權利要求1-5任一項所述的甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙，其特征在于，所述膠體金顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體的用量為 70-72 μ g/cm2 ；所述膠體金顆粒-親和素-生物素-乙型流感病毒抗體的用量為74-76 μ g/ cm2 ；所述膠體金標記的兔IgG抗體的用量為30-36 μ g/cm2 ；所述檢測區(qū)甲型流感病毒抗體用量為0. 21-0. 22 μ g/mm，所述檢測區(qū)乙型流感病毒抗體用量為0. 23-0. 24 μ g/mm ；所述羊抗兔抗體的用量為0. 30-0. 35 μ g/mm。
7.一種制備權利要求1所述的甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)按常規(guī)方法制備甲型流感病毒抗體、乙型流感病毒抗體以及膠體金標記的兔IgG 抗體；(2)制備微信號放大系統(tǒng)a、制備膠體金標記親和素將待標記親和素預先在0. 001 0. 01mol/L的NaCl溶液中透析過夜，離心，用PBS調節(jié)膠體金液的pH為8 9，按Iml膠體金溶液中加入15 25 μ g親和素的量，標記親和素以形成膠體金標記親和素；b、按常規(guī)方法制備生物素化甲型流感病毒抗體和生物素化乙型流感病毒抗體；所述生物素與甲型流感病毒抗體的質量比為1 9，所述生物素與乙型流感病毒抗體的質量比為 1 10 ；C、完成微信號放大系統(tǒng)按Iml膠體金標記親和素中加入100μ 1生物素化甲/乙型流感病毒抗體的量，將膠體金標記親和素和生物素化甲/乙型流感病毒抗體混合，連接得到膠體金-親和素-生物素-甲/乙型流感病毒抗體，洗滌，即得微信號放大系統(tǒng)；(3)按稀釋參數(shù)20cm2/ml 40cm2/ml，將步驟O)的膠體金-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體、以及膠體金-親和素-生物素-乙型流感病毒抗體噴灑到玻璃纖維膜上，干燥后備用；(4)用包被緩沖液稀釋甲型流感病毒抗體，使其濃度為0.9mg/ml 1. %ig/ml，按膜液量0. 16 μ 1/mm 0. 2 μ 1/mm，將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥后備用；用包被緩沖液稀釋乙型流感病毒抗體，使其濃度為0. 9mg/ml 1. %ig/ml，按膜液量 0. 16 μ 1/mm 0. 2 μ 1/mm，將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥后備用；用包被緩沖液稀釋羊抗兔抗體，使其濃度為1. Omg/ml 2. Omg/ml，按膜液量0. 18 μ 1/ mm 0. 22μ 1/mm，將其細致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥后備用；(5)將樣品墊、步驟C3)的玻璃纖維膜、步驟(4)的硝酸纖維素膜、吸水紙按序粘貼于底板上，即得。
8.根據(jù)權利要求7所述的制備甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙的方法，其特征在于，所述步驟(1)中膠體金標記的兔IgG抗體的用量為25-45 μ g/cm2 ；所述步驟(3)中膠體金-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體的用量為42.5-90yg/cm2，膠體金-親和素-生物素-乙型流感病毒抗體的用量為42. 5-90 μ g/cm2 ；所述步驟中甲型流感病毒抗體的用量為0. 144-0. 28 μ g/mm ；乙型流感病毒抗體的用量為0. 144-0. 28 μ g/ mm ；所述羊抗兔抗體的用量為0. 18-0. 44 μ g/mm。
9.根據(jù)權利要求8所述的檢測甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的試紙條的方法，其特征在于，所述膠體金標記的兔IgG抗體的用量為30-36 μ g/cm2 ；所述膠體金顆粒-親和素-生物素-甲型流感病毒抗體的用量為70-72 μ g/cm2 ；所述膠體金顆粒-親和素-生物素-乙型流感病毒抗體的用量為74-76 μ g/cm2 ；所述檢測區(qū)甲型流感病毒抗體用量為0. 21-0. 22 μ g/mm，所述檢測區(qū)乙型流感病毒抗體用量為0. 23-0. 24 μ g/mm ；所述羊抗兔抗體的用量為0. 30-0. 35 μ g/mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的聯(lián)檢試紙及其制備方法，試紙包括樣品墊、含有膠體金顆粒標記物的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜以及吸水紙，所述硝酸纖維素膜包括包被有甲型流感病毒抗體的檢測區(qū)、包被有乙型流感病毒抗體的檢測區(qū)和包被有羊抗兔抗體的控制區(qū)，所述膠體金顆粒標記物包括微信號放大系統(tǒng)和膠體金標記的兔IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為膠體金顆粒-親和素-生物素-甲/乙型流感病毒抗體。本發(fā)明在雙抗體夾心檢測體系中添加了生物素-親和素微信號放大系統(tǒng)，擴大了目標抗體的信號，增加檢測靈敏度，避免因信號太弱而出現(xiàn)假陰或者漏檢，同時還可同時對甲型和乙型流感病毒抗原進行聯(lián)檢，節(jié)省檢測時間、樣本和成本。
文檔編號G01N33/569GK102445537SQ201110431548
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權日2011年12月20日
發(fā)明者張健, 王繼華, 郭詩靜 申請人:廣州萬孚生物技術有限公司