專利名稱：高通量的rsv蛋白含量的定量檢測法及其檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒滴度的定量檢測法，特別是涉及一種用于藥物篩選及生物樣品檢驗(yàn)的RSV(Respiratory Syncytial Virus,呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量檢測法及其高通量檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(RSV)是在嬰兒時期和兒童早期導(dǎo)致支氣管炎和肺炎的主要原因。該病毒通常會引起再感染。再感染一般發(fā)生在成年人中。在老人和缺乏免疫力的病人當(dāng)中，可能導(dǎo)致下呼吸道的嚴(yán)重疾病。通常病情會持續(xù)兩到三周.在嬰兒和有高風(fēng)險病情的兒童中，RSV(呼吸道合胞病毒)感染可能會危及患者的生命。病毒性支氣管炎是一個嚴(yán)重的傳染病，據(jù)估計每年引起100萬人死亡，其中大多數(shù)病例是由RSV(呼吸道合胞病毒)引起的。出生后第一年，高達(dá)70% 80%比例的嬰兒將感染RSV (呼吸道合胞病毒)。目前尚無有效的疫苗或小分子藥物用來防治RSV(呼吸道合胞病毒)感染。因此，用快速、高效的方法來篩選獲得抗RSV(呼吸道合胞病毒)的有效藥物是研發(fā)新藥的有效手段。在抗病毒藥物篩選方法中，目前主要使用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)法。其檢測方法有四甲基偶氮唑鹽(以下簡稱MTT)法，或者使用Cell Counting Kit_8 (CCK-8試劑盒)進(jìn)行檢測。其中，MTT法的檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。而CCK-8試劑盒是基于WST-8 [2-(2-甲氧基-4-硝苯基)`-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽的檢測試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚溶解在培養(yǎng)基中。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系，即生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。但這些CPE法靈敏度低，通量亦不適于大量化合物的篩選。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的ELISA法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測抗原，后者用于測定特異性抗體。ELISA是一種敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)方法，由于其試劑穩(wěn)定、易保存、操作簡便、結(jié)果判斷較客觀等因素，具有適宜于大規(guī)模篩查試驗(yàn)、又可以用于少量標(biāo)本的檢測、既可以做定性試驗(yàn)也可以做定量分析等優(yōu)點(diǎn)，因此，具有廣泛的使用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于高通量藥物篩選及生物樣品檢驗(yàn)的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量檢測法及其檢測試劑盒。本發(fā)明改變了目前篩選抗病毒藥物的方法，提高了篩選通量，縮短了篩選周期(可以縮短60%以上的時間)，同時該方法也用于臨床或非臨床樣品的定量檢測。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的用于高通量藥物篩選及生物樣品檢驗(yàn)的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量檢測法，包括步驟A、對于非臨床樣品，其檢測步驟，包括H印2細(xì)胞的培養(yǎng)階段、RSV (呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量檢測階段步驟；B、對于臨床或臨床前樣品，其檢測步驟，包括RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量檢測階段步驟。所述非臨床樣品包括化合物；臨床樣品包括患者的鼻咽拭子或鼻咽洗液；臨床前樣品包括動物模型組織提取物等。所述A中的H印2細(xì)胞的培養(yǎng)階段，步驟包括①將Ifep2細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)；其中，培養(yǎng)條件為37°C、5% CO2、培養(yǎng)16-24小時；②待檢測樣品(非臨床樣品，如化合物)加入上述接種有細(xì)胞的培養(yǎng)板中；③加入RSV (呼吸道合胞病毒)至上述培養(yǎng)板中；④培養(yǎng)板經(jīng)培養(yǎng)96-120小時后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測。所述細(xì)胞培養(yǎng)板是384孔培養(yǎng)板，接種的細(xì)胞密度控制在每孔1800-3000個細(xì)胞，體積為20-50 μ I ； 所述培養(yǎng)階段③中，加入RSV (呼吸道合胞病毒)的量為50-150倍TCID5tl (Tissueculture infective dose,半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)病毒稀釋液,體積為10_40ul。所述A、B中的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA檢測階段，步驟包括①在384孔酶標(biāo)板內(nèi)加入羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗體，經(jīng)孵育、洗滌后，加入封閉試劑作用，然后洗滌；②在384孔酶標(biāo)板內(nèi)加入待測樣品(包括細(xì)胞培養(yǎng)上清，臨床或臨床前樣品)經(jīng)孵育、洗滌后，加入生物素結(jié)合羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗體，經(jīng)孵育、洗滌；③在384孔酶標(biāo)板內(nèi)加入抗生物素過氧化蛋白酶，經(jīng)孵育、洗滌后，加入TMB(3，3' ,5,5' -Tetramethylbenzidine,四甲基聯(lián)苯胺)顯色液作用后，再加入TMB終止液；④在450nm波長處測量酶標(biāo)板的吸光值。所述ELISA檢測階段中，所涉及的所有洗滌是使用PBS-Tween 20 (PBST)洗滌3次以上。所述ELISA檢測階段的步驟①中，羊抗RSV多克隆抗體加入量為羊抗RSV多克隆抗體(ViroStat-0601)的I 480-1 2000倍的稀釋液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的條件為37°C孵育1-3小時；封閉試劑為O. 5% -2%的BSA(牛血清白蛋白)，加入量為每孔100-120μ 1，4°C過夜或者37°C孵育2-4小時。所述ELISA檢測階段的步驟②中，待測樣品的加入量為10-50 μ I (樣品或樣品稀釋液)，待測樣品孵育的條件為25°C過夜或者37°C孵育1-3小時；生物素結(jié)合羊抗RSV多克隆抗體的加入量為生物素結(jié)合羊抗RSV多克隆抗體(ViroStat-0607)的I 2000-1 10000倍的稀釋液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的條件為37°C孵育1-3小時。
所述ELISA檢測階段的步驟③中，抗生物素過氧化蛋白酶的加入量為抗生物素過氧化蛋白酶(Sigma-E2886)的I 1000-1 4000倍的稀釋液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的條件為37°C孵育20-40分鐘；TMB顯色液(Sigma_T0440)的加入量為每孔30-60 μ 1，常溫作用2-15分鐘；ΤΜΒ終止液(TMB底物終止液，Sigma_S5814)加入量為每孔30-60 μ I。另外，本發(fā)明還公開了一種RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量檢測試劑盒，可應(yīng)用于藥物篩選及生物樣品檢驗(yàn)。該定量檢測試劑盒包括=RSV蛋白含量的ELISA檢測試劑，還可包括384孔酶標(biāo)板。其中，RSV蛋白含量的ELISA檢測試劑包括羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗體、生物素結(jié)合羊抗RSV (呼吸道合胞病毒)多克隆抗體、抗生物素過氧化蛋白酶、封閉試齊U、洗滌液、TMB顯色液、TMB終止液。所述定量檢測試劑盒，還包括H印2細(xì)胞、RSV (呼吸道合胞病毒)。所述定量檢測試劑盒的檢測步驟按照如上所述的步驟進(jìn)行。本發(fā)明通過運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附檢測原理，發(fā)現(xiàn)了一種呼吸道合胞病毒專一性的定量檢測法，此法可用于高通量的抗呼吸道合胞病毒藥物篩選以及臨床或非臨床樣品的定量檢測，其具有的有益效果如下(I)區(qū)別于現(xiàn)有的ELISA應(yīng)用范圍和目前的篩選技術(shù)(MTT或者CCK8試劑盒)，本發(fā)明采用ELISA法，利用384孔板進(jìn)行抗RSV (呼吸道合胞病毒)病毒化合物篩選；(2)采用ELISA法篩選藥物，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單快速、實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定、重復(fù)性高以及易于自動化操作等特點(diǎn)，而且可以在一天之內(nèi)檢測數(shù)千份樣品；(3)通過采用384孔板進(jìn)行ELISA篩選，可以大大提高實(shí)驗(yàn)的通量，而且其檢測精準(zhǔn)度、靈敏度較傳統(tǒng)的96孔板高(如圖1所示)，實(shí)驗(yàn)周期可以完成上萬個化合物篩選的工作量，時間縮短了 60%以上 ；原先使用96孔板，即最多只可檢測96個樣本，使用384孔板，則一次可以檢測384個樣本，同樣使用384孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，會使得實(shí)驗(yàn)成本也降低了不少，因此，本發(fā)明在節(jié)省時間的同時，節(jié)省了大量試劑，節(jié)約了成本；(4)本發(fā)明不僅適用于篩選化合物，還適用于臨床標(biāo)本檢測或者動物樣品的檢測，而且所有的操作均可使用儀器完成，降低了人為因素和耗材使用。


圖1是在相同條件下，使用384孔板和96孔板進(jìn)行RSV的ELISA檢測的結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)是RSV病毒含量滴度，單位為pfu/ml，縱坐標(biāo)為OD值。如對于同樣的樣品，在384孔板中測得的OD值(多次平均值)為1. 77，在96孔板中測得的值則為1. 55，讀數(shù)高出了 14%，因此，384孔板中的ELISA檢測靈敏度高于96孔板。圖2是實(shí)施例1的ELISA檢測結(jié)果圖。下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1非臨床樣品RSV (呼吸道合胞病毒)定量、高通量ELISA法檢測一、細(xì)胞培養(yǎng)階段(I)將H印2細(xì)胞(ATCC-CC123)以3000個細(xì)胞，體積為30 μ I接種入384孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Greiner-781080，美國)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37°C、5% CO2)中培養(yǎng)16小時；(2)稀釋非臨床樣品(即化合物1，來源于客戶)，根據(jù)終濃度50 μ Μ、10 μ Μ、2 μ M、O. 4 μ Μ，分別從母液(IOmM)中取300nL、60nL、12. 5nL、2. 5nL，加入至接種有細(xì)胞的384孔培
養(yǎng)板；(3)稀釋RSV (呼吸道合胞病毒)(ATCC-VR26)，加入的量為100倍TCID5tl病毒稀釋液，體積為30 μ I ;(4)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)上述384孔培養(yǎng)板96小時后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測。二、ELISA篩選化合物(I)在384孔酶標(biāo)板(Thermo-Nunc-464718)內(nèi)加入羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗體(ViroStat-0601，l 1000倍稀釋，每孔加入50 μ I)，37°C孵育1. 5小時;(2)使用 PBS-Tween 20 (PBST) [PBS (Thermo-Hyclone-SH30264. 01)，含有 O.1 %Tween20 (sigma_P2287)(體積百分比)洗漆3次；(3)在384孔酶標(biāo)板內(nèi)加入封閉試劑——1% (體積百分比)的BSA，加入量為每孔 120μ 1，4°C過夜；(4)使用 PB S-Tween 20 洗滌 3 次；(5)在384孔酶標(biāo)板內(nèi)加入上述細(xì)胞培養(yǎng)上清稀釋液50 μ I (樣品稀釋10倍液)，待測樣品孵育的條件為37°C孵育2小時；(6)使用 PBS-Tween 20 洗滌 3 次；(7)在384孔酶標(biāo)板內(nèi)加入生物素結(jié)合羊抗RSV(呼吸道合胞病毒)多克隆抗體(ViroStat-0607,1 6000倍稀釋，每孔加入50 μ I)，孵育的條件為37°C孵育2小時；(8)使用 PBS-Tween 20 洗滌 3 次；(9)在384孔酶標(biāo)板內(nèi)加入抗生物素過氧化蛋白酶(Sigma_E2886，l 2000倍稀釋，每孔加入50 μ I)，37°C孵育30分鐘；(10)使用 PBS-Tween 20 (PBST)洗滌 3 次；(11)在384孔酶標(biāo)板內(nèi)加入TMB (Sigma_T0440，每孔加入50 μ I)顯色液，常溫作用3分鐘后，再加入TMB終止液(Sigma-S5814,每孔加入50 μ I)；(12)利用酶標(biāo)儀(Molecular Device_340PC384)，在 0D450nm 處測量 384 孔酶標(biāo)板的吸光值。以上步驟中同時設(shè)置有相應(yīng)的對照，測量結(jié)果見下表1:表I
權(quán)利要求
1.一種用于高通量藥物篩選及生物樣品檢驗(yàn)的呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的定量檢測法，包括步驟 A、對于非臨床樣品，其檢測步驟，包括Ifep2細(xì)胞的培養(yǎng)階段、呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量檢測階段步驟； B、對于臨床或臨床前樣品，其檢測步驟，包括呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA高通量檢測階段步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的定量檢測法，其特征在于所述非臨床樣品包括化合物； 臨床樣品包括患者的鼻咽拭子或鼻咽洗液； 臨床前樣品包括動物模型組織提取物。
3.如權(quán)利要求1所述的定量檢測法，其特征在于所述A中的H印2細(xì)胞的培養(yǎng)階段，步驟包括 ①將H印2細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)；其中，培養(yǎng)條件為37°C、5%CO2、培養(yǎng)16-24小時； ②將非臨床樣品加入上述接種有細(xì)胞的培養(yǎng)板中； ③加入呼吸道合胞病毒RSV至上述培養(yǎng)板中； ④培養(yǎng)板經(jīng)培養(yǎng)96-120小時后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測。
4.如權(quán)利要求3所述的定量檢測法，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)板是384孔培養(yǎng)板，接種的細(xì)胞密度控制在每孔1800-3000個細(xì)胞，體積為20-50 μ I ； 所述培養(yǎng)階段③中，加入呼吸道合胞病毒RSV的量為50-150倍TCID5tl病毒稀釋液，體積為 10_40 u I ο
5.如權(quán)利要求1所述的定量檢測法，其特征在于所述Α、B中的呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA檢測階段，步驟包括 ①在384孔酶標(biāo)板內(nèi)加入羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體，經(jīng)孵育、洗滌后，加入封閉試劑作用，然后洗滌； ②在384孔酶標(biāo)板內(nèi)加入待測樣品經(jīng)孵育、洗滌后，加入生物素結(jié)合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體，經(jīng)孵育、洗滌； ③在384孔酶標(biāo)板內(nèi)加入抗生物素過氧化蛋白酶，經(jīng)孵育、洗滌后，加入TMB顯色液作用后，再加入TMB終止液； ④在450nm波長處測量酶標(biāo)板的吸光值。
6.如權(quán)利要求5所述的定量檢測法，其特征在于所述ELISA檢測階段中，所涉及的所有洗滌是使用PBS-Tween 20洗滌3次以上； 所述ELISA檢測階段的步驟①中，羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體加入量為羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體的1: 480-1 2000倍的稀釋液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的條件為37°C孵育1-3小時； 封閉試劑為0.5% -2%的BSA，加入的量為每孔100-120μ 1，4°C過夜或者37°C孵育2-4小時。
7.如權(quán)利要求5所述的定量檢測法，其特征在于所述ELISA檢測階段的步驟②中，待測樣品包括細(xì)胞培養(yǎng)上清，臨床或臨床前樣品； 待測樣品的加入量為10-50 μ 1，待測樣品孵育的條件為25°C過夜或者37°C孵育1_3小時； 生物素結(jié)合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體的加入量為生物素結(jié)合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體的1: 2000-1 10000倍的稀釋液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的條件為37°C孵育1-3小時。
8.如權(quán)利要求5所述的定量檢測法，其特征在于所述ELISA檢測階段的步驟③中，抗生物素過氧化蛋白酶的加入量為抗生物素過氧化蛋白酶的1: 1000-1 4000倍的稀釋液，每孔加入30-70 μ 1，孵育的條件為37°C孵育20-40分鐘； TMB的加入量為每孔30-60 μ 1，常溫作用2-15分鐘； TMB終止液的加入量為每孔30-60 μ I。
9.如權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于高通量藥物篩選及生物樣品檢驗(yàn)的定量檢測試劑盒，其特征在于所述定量檢測試劑盒包括呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA檢測試劑。
10.如權(quán)利要求9所述的定量檢測試劑盒，其特征在于所述定量檢測試劑盒，還包括H印2細(xì)胞、呼吸道合胞病毒RSV、384孔酶標(biāo)板； 所述呼吸道合胞病毒RSV蛋白含量的ELISA檢測試劑包括羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體、生物素結(jié)合羊抗呼吸道合胞病毒RSV多克隆抗體、抗生物素過氧化蛋白酶、封閉試劑、洗滌液、TMB顯色液、TMB終止液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高通量的RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的定量檢測法及其檢測試劑盒，其定量檢測法包括步驟A、對于非臨床樣品，其檢測步驟，包括Hep2細(xì)胞的培養(yǎng)階段、RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量檢測階段步驟；B、對于臨床或臨床前樣品，其檢測步驟，包括RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA高通量檢測階段步驟；所述定量檢測試劑盒包括RSV(呼吸道合胞病毒)蛋白含量的ELISA檢測試劑。本發(fā)明改變了目前篩選抗病毒藥物的方法，提高了篩選通量，縮短了篩選周期，可以節(jié)約60％以上的時間。同時也用于大量臨床或非臨床樣品中RSV的高通量定量檢測。
文檔編號G01N33/569GK103048450SQ20111031051
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者彭祥翔, 李少華, 陸恒 申請人:上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司, 蘇州藥明康德新藥開發(fā)有限公司