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一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙及制備方法

文檔序號:6015196閱讀:581來源:國知局
專利名稱:一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及免疫診斷試劑領(lǐng)域,具體為一種在可同時檢測TORCH感染五項指標的一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙及制備方法。
背景技術(shù)
我國是一個出生缺陷高發(fā)國家,每年約有20-30萬肉眼可見的先天畸形兒出生, 加上出生后數(shù)月和數(shù)年才顯現(xiàn)出來的缺陷,每年先天缺陷兒童總數(shù)高達80-120萬,約占每年總出生人數(shù)的4% -6%,大約每30秒就會誕生一個缺陷兒。1940年,澳大利亞風(fēng)疹流行,次年新生兒白內(nèi)障明顯增多。經(jīng)調(diào)查,患兒母親于孕期都有感染風(fēng)疹的歷史。首次發(fā)現(xiàn)新生兒畸形與母親孕期感染風(fēng)疹有關(guān)。1964年,美國風(fēng)疹流行,次年出生了數(shù)萬名畸形兒。證明了孕期感染風(fēng)疹可引起新生兒畸形。TORCH—詞于1971年由Nahmias首次提出,系指能引起胎兒感染造成先天畸形或發(fā)育異常的幾種病原體的聯(lián)稱。T指弓形蟲(Toxplasma gomdii Tox) ;R指風(fēng)疹病毒 (Rubella virus RV) ;C指巨細胞病毒(Cytomegao virus CMV) ;H指單純皰疹病毒(Herpes Simplex virus HSV) ;0指其它(Others),如梅毒螺旋體等。TORCH感染如果在婦女妊娠期發(fā)生,常可并發(fā)先天性或圍產(chǎn)期新生兒感染,導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎、死胎、早產(chǎn)或發(fā)育不全等。在免疫系統(tǒng)正常個體中,原發(fā)感染后,多數(shù)呈隱形感染,無臨床癥狀(鼠弓形體、 巨細胞),或是病程緩慢溫和或不典型(風(fēng)疹、單皰)。且一旦發(fā)生感染后,特異性IgG抗體將終生存在于體內(nèi)。在我國人群中,感染率極高。據(jù)資料統(tǒng)計,除弓形體(約5%-20%)和 HSV-2(約20% -40% )外,其他TORCH病原體的IgG抗體在正常人群中的陽性率可達80% 甚至90%以上,可以說感染普遍存在。當孕婦處于潛伏感染期或復(fù)發(fā)時,幾乎對胎兒沒有影響,而妊娠早期的原發(fā)感染雖然對孕婦自身影響不大,但卻可以垂直感染胎兒,或在分娩時感染新生兒,給胎兒或新生兒帶來危害。TORCH感染在圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)中稱之為“TORCH綜合癥”, 已經(jīng)受到全世界醫(yī)學(xué)界尤其是婦產(chǎn)科和兒科醫(yī)生的高度重視。歐美發(fā)達國家早在七十年代就將風(fēng)疹、弓形體、巨細胞病毒等檢測列為孕期篩查項目。TORCH開始檢測的時間在孕前或是孕早期,對于易感孕婦,持續(xù)的監(jiān)測也有必要。我國為人口大國,實行一對夫婦生一個孩子,優(yōu)生優(yōu)育工作非常重要。根據(jù)《中國婦女發(fā)展綱要》(2001-2010)和《中國兒童發(fā)展綱要Q001-2010)》要求,國家衛(wèi)生部于2002 年7月出臺了《中國提高出生人口素質(zhì)、減少出生缺陷和殘疾行動計劃(2002-2010)》,國家人口和計劃生育委員會于2006年12月頒布了《全國“十一五”人口和計劃生育事業(yè)發(fā)展規(guī)劃》,其中都從法律角度明確提出了加強產(chǎn)前篩選及診斷。我國農(nóng)村人口基數(shù)龐大,達7. 37億,近年來,農(nóng)村人口出生缺陷發(fā)生率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。孕婦感染TORCH導(dǎo)致新生兒缺陷是出生缺陷率上升的一個重要原因,傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法需要專業(yè)技術(shù)人員和在實驗室里操作才能進行,農(nóng)村醫(yī)療基礎(chǔ)設(shè)施差,缺乏專業(yè)技術(shù)人員,不利于孕婦感染TORCH的篩查(事實上每一位孕婦在懷孕準備期到分娩期,都應(yīng)當接受1-3次孕婦感染TORCH的篩查,懷孕初的三個月胚胎處于器官形成期,此時受病毒感染,可破壞細胞或抑制細胞的分裂和增值。器官形成期以后感染病毒,可破壞組織和器官結(jié)構(gòu),并可形成持續(xù)感染,出生后繼續(xù)排毒,能引起相應(yīng)的病變),導(dǎo)致出生缺陷的發(fā)生,不僅給農(nóng)村家庭和社會帶來沉重負擔,而且影響到未來勞動力的素質(zhì),已經(jīng)成為制約社會主義新農(nóng)村建設(shè)、全面建設(shè)小康社會的重要因素。城鎮(zhèn)地區(qū)雖有實驗室和專業(yè)技術(shù)人員,但目前臨床上檢測TORCH-IgM抗體常用的是ELISA法,其操作程序比較復(fù)雜,檢測時間較長,不適應(yīng)孕婦感染的快速診斷和懷孕人群的篩查,不能滿足臨床快速檢測的需求,市場上已出現(xiàn)了膠體金快速檢測TORCH-IgM抗體, 但只能檢測一個結(jié)果,不利于孕婦早期感染TORCH的快速篩查。人們也發(fā)展了能同時進行多種疾病的檢測的膠體金免疫層析技術(shù),如在層析膜上同時包被固定兩種以上檢測項目抗原,包被線長度相同,并間隔一定距離平行向后排列,固化的層析膜裝配成試紙條。但當用此試紙條檢測含有兩種以上病原體抗體血清標本時,膠體金標記抗體結(jié)合物與第一條檢測線形成復(fù)合物后,剩余的膠體金標記抗體結(jié)合物再與下一個檢測線反應(yīng)時,由于濃度下降檢測靈敏度會降低,當它流到第三條檢測線反應(yīng)時,由于濃度更低,反應(yīng)檢測靈敏度會更低,標本就會出現(xiàn)假陰性情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對以上所述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足,提供一種操作簡便,簡易快速,觀察結(jié)果直觀,無需儀器設(shè)備,并能夠做到一次加樣即可檢測是否有五種病原微生物急性感染的一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙。本發(fā)明的另一目的是提供所述一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的制備方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙,包括底板、吸收墊、層析膜、用于抗體標記的金標墊和樣品墊;所述層析膜一端連接金標墊的一端、金標墊的另一端與樣品墊連接,所述層析膜的另一端連接吸收墊,所述吸收墊、層析膜、金標墊和樣品墊設(shè)置在所述底板上,所述金標墊上吸附羊抗人 IgM(羊抗人免疫球蛋白M)標記的膠體金結(jié)合物顆粒;所述層析膜上包被TORCH五種抗原的檢測線和兔抗羊IgG(兔抗羊免疫球蛋白)抗體的對照線,所述層析膜設(shè)有檢測線區(qū)和對照線區(qū),所述檢測線區(qū)和對照線區(qū)分別獨立的設(shè)有五個條狀帶;所述吸收墊上有與所述層析膜上的檢測線相對應(yīng)的標識區(qū)。優(yōu)選的,所述層析膜兩端分別與金標墊和吸收墊連接,所述金標墊和吸收墊分別安裝在所述層析膜兩側(cè)邊緣的上部,所述金標墊另一側(cè)邊緣上部設(shè)置有樣品墊;所述層析膜、金標墊、吸收墊以及樣品墊安裝在底板上;所述層析膜中對照線和檢測線的部分被切割為各獨立的條帶,每一條帶分別包括一個包被抗原的檢測線T和包被抗體的對照線C。所述層析膜為硝酸纖維素膜,層析膜上設(shè)有檢測線和對照線,檢測線包被弓形體、 風(fēng)疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型和單純皰疹病毒II型抗原五種抗原,對照線包被兔抗羊IgG抗體。所述層析膜的包被方法是用劃膜儀將工作濃度的抗原和抗體以一定的噴液量和噴液速度包被在硝酸纖維素膜上,室溫晾干。所述金標墊可以玻璃纖維膜,所述玻璃纖維膜上用膠體金標記羊抗人IgM抗體。
一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的制備方法,包括如下步驟(1)獲得TORCH抗原、羊抗人IgM抗體及兔抗羊IgG抗體;(2)膠體金溶液及膠體金-抗體結(jié)合物的制備;(3)樣品墊與金標墊的處理;(4)層析膜對照線C、檢測線T的噴劃;(5)五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的成品組裝;本發(fā)明所涉及的TORCH抗原(弓形體、風(fēng)疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型、 單純皰疹病毒II型抗原)可通過商業(yè)化途徑購買弓形體抗原(貨號A5202)可由上海西唐生物科技有限公司供貨;風(fēng)疹病毒(貨號RV021)、巨細胞病毒抗原(貨號A5202)可由北京萬域美瀾科技有限公司供貨;單純皰疹病毒I型(貨號N0503944)、單純皰疹病毒II 型抗原(貨號N0503942)可由上海希美生物科技有限公司供貨。抗體(羊抗人IgM抗體及兔抗羊IgG抗體)可以通過實驗室自制,也可通過商業(yè)化途徑購買??贵w(羊抗人IgM抗體及兔抗羊IgG抗體)的制備方法是用生理鹽水稀釋免疫原(人IgM和羊IgG),與弗氏佐劑進行1 1混合,形成乳劑,將乳劑免疫注射動物, 共進行四次免疫;然后收集、分離得到含有羊抗人IgM抗體和兔抗羊IgG抗體的血清;將抗體血清加入到親和層析柱中,放置于4°C孵育過夜后,洗脫抗體,即得到純化的抗體。羊抗人IgM抗體(貨號P2589g-h)可從上海麥莎生物科技有限公司購買,兔抗羊IgG抗體(貨號A20)可從北京法特捷生物技術(shù)發(fā)展中心購買。所述底板為塑料材質(zhì)底板,可以購于東莞市納林塑膠化工有限公司。作為層析膜材質(zhì)的硝酸纖維素膜可以購于北京賽馳生物科技有限公司。所述金標墊是用玻璃纖維膜制成的,所述玻璃纖維膜可以購于上海金標生物科技有限公司。所述樣品墊可以購于上海金標生物科技有限公司。所述吸收墊可以購于上海金標生物科技有限公司。所述步驟( 膠體金溶液及膠體金-抗體結(jié)合物的制備步驟如下(1)膠體金溶液的制備方法采用檸檬酸三鈉還原法取硅化過的三角瓶,加入 4000mL去離子及40mL 1 %質(zhì)量百分比濃度的氯金酸,微波爐加熱沸騰;迅速加入47mL的
質(zhì)量百分比濃度的檸檬酸三鈉,此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液很快變成灰色, 續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色,最后變成穩(wěn)定的酒紅色后,繼續(xù)煮沸15min,冷卻后用去離子水補足體積至 4000mLo(2)羊抗人IgM標記膠體金顆粒的膠體金-抗體結(jié)合物制備方法每4000ml膠體金溶液,按照25 μ g/ml的比例需要提供羊抗人IgM IOOmg (即每IOOOml需要羊抗人IgM的重量為25mg),將膠體金溶液和羊抗人IgM溶液分別以0. lmol/L K2CO3調(diào)pH至9. 0,電磁攪拌羊抗人IgM溶液,在羊抗人IgM溶液加入膠體金溶液,繼續(xù)攪拌lOmin,加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。(3)采用超速離心法純化根據(jù)膠體金顆粒的大小,標記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。用BSA(牛血清白蛋白)做穩(wěn)定劑的膠體金-羊抗人IgM結(jié)合顆??上?000g,4°C離心5分鐘去除沉淀(20nm 40nm膠體金顆粒);余下上清再以HOOOg離心力,4°C離心Ih (沉淀為20nm 40nm膠體金標抗體結(jié)合物),棄上清,復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸為原體積的1/10,4°C保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50%甘油可貯存于-20°C
保存一年以上。所述步驟( 中樣品墊與金標墊分別用各自的處理緩沖液進行浸泡處理。將樣品墊浸入含質(zhì)量百分比濃度BSA和0. 05%質(zhì)量百分比濃度Tween20的PBS溶液中浸泡15 分鐘,取出真空凍干。將金標墊浸入含10%蔗糖、0. 05質(zhì)量百分比濃度%Tween20和0.01% 質(zhì)量百分比濃度疊氮鈉的PBS溶液中浸泡15分鐘,取出室溫晾干。所述步驟(4)層析膜中對照線C和檢測線T噴劃方法是將弓形體、風(fēng)疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型和單純皰疹病毒II型五種包被抗原(檢測線)、兔抗羊多克隆抗體(對照線)分別稀釋至 1. 5mg/ml、l. Omg/ml, 1. 5mg/ml, lmg/ml, lmg/ml 及 2mg/ml。分別加入劃膜儀(型號:HM3030)的1、2、3、4、5和6號杯;調(diào)試劃膜儀,噴液量設(shè)定為1. 4μ 1/ cm,其中1、2、3、4、5號杯在同一水平線上放置,6號杯在距上述杯上方5mm處放置,6號杯的導(dǎo)軌速度是其它杯的5倍。包被后的硝酸纖維素膜過夜晾干。按每IOOOml封閉液浸泡5 張(折20板)膜計,將包被好的膜浸入封閉2小時;將膜取出浙干,過夜晾干,即制得硝酸纖維反應(yīng)膜。羊抗人IgM抗體與膠體金結(jié)合的pH值為8. 2,濃度為為25 μ g/mL。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的檢測原理如下在層析膜上均有對照線C(Control)和檢測線T(Test),對照線C包被有兔抗羊IgG抗體,檢測線T上包被弓形體、風(fēng)疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型和單純皰疹病毒II型五種抗原;試紙的層析膜兩端分別與樣品墊、金標墊和吸收墊連接,層析膜中間部分包括對照線和檢測線的部分被切割為5各獨立的條帶,每一條帶分別包括一個包被抗原的檢測線和對照線。測定血清TORCH-IgM抗體時先將受試者血清滴在樣品墊上,通過虹吸現(xiàn)象血清就會向吸水墊一端滲透,當血清經(jīng)過玻璃纖維膜時其中的 TORCH-IgM抗體就會與羊抗人IgM標記的膠體金結(jié)合物顆粒反應(yīng),形成抗原抗體復(fù)合物,使得受試者的抗體間接地標上了膠體金顆粒,并進一步向吸水墊一端流動,經(jīng)過檢測區(qū)時,抗原抗體復(fù)合物就會被包被其上的TORCH抗原捕捉而形成一條紅色線(陽性線),血清繼續(xù)向前流動,未與TORCH抗原反應(yīng)的膠體金結(jié)合物顆粒則會與控制區(qū)該膠體金標記抗抗體(羊抗人IgM)的二抗(兔抗羊IgG抗體)反應(yīng)也形成一條紅色線(對照線),結(jié)果可報告陽性。如受試者抗體陰性,當血清進過玻璃纖維膜時雖然血清中其它IgM抗體會與羊抗人IgM 標記的膠體金結(jié)合物顆粒形成抗原抗體復(fù)合物,但經(jīng)過檢測區(qū)時,不會被包被其上的TORCH 抗原捕捉,就不會出現(xiàn)紅色線(陽性線),血清繼續(xù)向前流動,形成的膠體金復(fù)合物顆粒會與控制區(qū)該膠體金標記抗抗體(羊抗人IgM)的二抗(兔抗羊IgG抗體)反應(yīng)也形成一條紅色線(對照線),因此陰性血清僅有一條對照線。本發(fā)明所述的試紙中間部分共有5個條帶,條帶之間彼此獨立,不會受到相互干擾。受試者血清中有某一種或幾種TORCH-IgM抗體,相應(yīng)的包被此TORCH抗原的那個條帶的檢測線就會形成紅色線,可以通過一次血清加樣即可檢測孕婦是否有TORCH五種病原的急性感染;檢測時不需其它任何儀器設(shè)備,用肉眼即可觀察結(jié)果,用戶容易接受,特別適合基層衛(wèi)生所,尤其是農(nóng)村衛(wèi)生所開展孕婦TORCH-IgM篩查工作,具有很好的應(yīng)用價值;可以有效的預(yù)防孕婦TORCH感染會引起先天性或圍產(chǎn)期新生兒感染,從而導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎、死胎、 早產(chǎn)或發(fā)育不全等的發(fā)生。


圖1為本發(fā)明一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的結(jié)構(gòu)示意圖;圖2為羊抗人IgM抗體與膠體金結(jié)合的最佳pH值確定曲線圖;圖3為羊抗人IgM抗體與膠體金結(jié)合的最佳濃度確定曲線圖;圖4為單項膠體金免疫層析試紙條結(jié)果判斷的模擬圖
具體實施例方式以下具體結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的說明。一板五聯(lián)TORCH-I gM抗體膠體金快速檢測試紙,如圖1所示,包括底板5、吸收墊 4、層析膜3、用于抗體標記的金標墊2和樣品墊1 ;金標墊2為玻璃纖維膜上吸附羊抗人IgM 標記的膠體金結(jié)合物顆粒;層析膜3上包被TORCH五種抗原檢測線T和兔抗羊IgG抗體對照線C,所述層析膜3的一端連接金標墊2的一端、金標墊2的另一端連接樣品墊1,所述層析膜3的另一端連接吸收墊4。所述吸收墊4、層析膜3、金標墊2和樣品墊1設(shè)置在所述底板5上,所述層析膜3中設(shè)有檢測線區(qū)和對照線區(qū),所述檢測線區(qū)和對照線區(qū)分別設(shè)有獨立分開的五個條狀帶,所述吸收墊4上設(shè)有與層析膜3上的具體檢測線相對應(yīng)的標識區(qū)。所述底板5為塑料板。所述層析膜3為硝酸纖維素膜,所述硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線T和對照線C,所述檢測線T包被弓形體、風(fēng)疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型和單純皰疹病毒II型抗原五種抗原,對照線C包被兔抗羊IgG抗體。所述金標墊為上吸附羊抗人IgM(羊抗人免疫球蛋白M)標記的膠體金結(jié)合物顆粒;所述層析膜3上的TORCH-IgM及兔抗羊IgG 抗體的包被方法是用劃膜儀將工作濃度的抗原和抗體以一定的噴液量和噴液速度包被在硝酸纖維素膜上,室溫晾干。所述樣品墊1可以為無紡布、玻璃纖維膜;所述吸收墊4可以為吸水紙。優(yōu)選的結(jié)構(gòu)如下層析膜3兩端分別與金標墊2和吸收墊4連接,所述金標墊2和吸收墊4分別安裝在所述層析膜2兩側(cè)邊緣的上部,所述金標墊2另一側(cè)邊緣上部設(shè)置有樣品墊1。所述層析膜3、金標墊2、吸收墊4以及樣品墊1安裝在底板5上。所述層析膜3 中間部分包括對照線和檢測線的部分被切割為5個獨立的條帶,每一個條帶分別包括一個包被抗原的檢測線T和對照線C。測定血清TORCH-IgM抗體時先將受試者血清滴在樣品墊1上,通過虹吸現(xiàn)象血清就會向吸水墊一端滲透,當血清經(jīng)過金標墊2的玻璃纖維膜時其中的TORCH-IgM抗體就會與羊抗人IgM標記的膠體金結(jié)合物顆粒反應(yīng),形成抗原抗體復(fù)合物,使得受試者的抗體間接地標上了膠體金顆粒,并進一步向吸水墊的層析膜3 —端流動,經(jīng)過檢測區(qū)時,抗原抗體復(fù)合物就會被包被其上的TORCH抗原捕捉而形成一條紅色線(陽性線),血清繼續(xù)向前流動,未與TORCH抗原反應(yīng)的膠體金結(jié)合物顆粒則會與控制區(qū)該膠體金標記抗抗體(羊抗人 IgM)的二抗(兔抗羊IgG抗體)反應(yīng)也形成一條紅色線(對照線),結(jié)果可報告陽性。如受試者抗體陰性,當血清進過玻璃纖維膜時雖然血清中其它I gM抗體會與羊抗人IgM標記的膠體金結(jié)合物顆粒形成抗原抗體復(fù)合物,但經(jīng)過檢測區(qū)時,不會被包被其上的TORCH抗原捕捉,就不會出現(xiàn)紅色線(陽性線),血清繼續(xù)向前流動,形成的膠體金復(fù)合物顆粒會與控制區(qū)該膠體金標記抗抗體(羊抗人IgM)的二抗(兔抗羊IgG抗體)反應(yīng)也形成一條紅色線(對照線),因此陰性血清僅有一條對照線。層析膜3中的5個條帶之間彼此獨立,不會受到相互干擾。受試者血清中有某一種或幾種TORCH-IgM抗體,相應(yīng)的包被此TORCH抗原的那個條帶的檢測線就會形成紅色線,可以通過一次血清加樣即可檢測孕婦是否有TORCH 五種病原的急性感染。實施例1膠體金標記抗體制備1.羊抗人IgM抗體與膠體金結(jié)合的最適pH值確定標記體系的pH值、離子濃度以及膠體金與蛋白的比例均影響膠體金對蛋白質(zhì)的吸附。一般認為膠體金粒子表面為一層AuCl2,因此,粒子表面帶有負電荷,這種負電荷粒子之間相互排斥,形成穩(wěn)定懸浮的膠體金溶液。金顆粒表面可以包被一層生物大分子(如蛋白)來穩(wěn)定和保護這些粒子,以免受外來電解質(zhì)的影響而相互凝聚在一起。膠體金粒子對蛋白的吸附作用取決于PH值,這是因蛋白的凈電荷取決于溶液的pH值,在pH = pi時為中性。由于在pH = pI時蛋白溶解度最小,因此這時它水化程度最小,最容易吸附到疏水的金粒子表面。但在實際的膠體金探針制備中,一般膠體金調(diào)整為PH = ΡΙ+0. 5,這樣蛋白帶正電,有利于結(jié)合更穩(wěn)定。本實驗用0. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值分別調(diào)至6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、 8. 5、9. 0和9. 5,依次加入羊抗人IgM和10% NaCl溶液參見下表(羊抗人IgM抗體與膠體金結(jié)合的最低PH值確定),結(jié)果顯示pH值為8. 0的一管仍保持紅色,確定最低pH值為8. 0。 重新再將膠體金溶液的PH值分別調(diào)至7. 4,7. 6,7. 8,8. 0,8. 2,8. 4和8. 6,分別加入抗體與 NaCl溶液,通過觀察顏色變化確定最適結(jié)合pH值為8. 2。根據(jù)膠體金顆粒的大小,在500 560nm之間測定OD值。以pH值為橫坐標,以O(shè)D值為縱坐標繪制曲線,曲線最先與橫軸相接近點處的PH值為8. 2,即最適結(jié)合pH值為8. 2,見下表及圖3所示。羊抗人IgM抗體與膠體金結(jié)合的最低pH值確定
權(quán)利要求
1.一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙,其特征在于,包括底板、吸收墊、層析膜、用于抗體標記的金標墊和樣品墊;所述層析膜一端連接金標墊的一端、金標墊的另一端與樣品墊連接,所述層析膜的另一端連接吸收墊,所述吸收墊、層析膜、金標墊和樣品墊設(shè)置在所述底板上,所述金標墊上吸附羊抗人IgM標記的膠體金結(jié)合物顆粒;所述層析膜上包被TORCH五種抗原的檢測線和兔抗羊IgG抗體的對照線,所述層析膜設(shè)有檢測線區(qū)和對照線區(qū),所述檢測線區(qū)和對照線區(qū)分別獨立的設(shè)有五個條狀帶;所述吸收墊上有與所述層析膜上的檢測線相對應(yīng)的標識區(qū)。2.如權(quán)利要求1所述的一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙,其特征在于,所述層析膜兩端分別與金標墊和吸收墊連接,所述金標墊和吸收墊分別安裝在所述層析膜兩側(cè)邊緣的上部,所述金標墊另一側(cè)邊緣上部設(shè)置有樣品墊;所述層析膜、金標墊、吸收墊以及樣品墊安裝在底板上;所述層析膜中對照線和檢測線的部分被切割為各獨立的條帶,每一條帶分別包括一個包被抗原的檢測線T和包被抗體的對照線C。
2.如權(quán)利要求1或者2所述的一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙,其特征在于,所述層析膜為硝酸纖維素膜,層析膜上設(shè)有檢測線和對照線,檢測線包被弓形體、風(fēng)疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型和單純皰疹病毒II型抗原五種抗原,對照線包被兔抗羊IgG抗體。
3.—板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的制備方法,其特征在于,包括如下步驟(1)獲得TORCH抗原、羊抗人IgM抗體及兔抗羊IgG抗體;(2)膠體金溶液及膠體金-抗體結(jié)合物的制備;(3)樣品墊與金標墊的處理;(4)層析膜對照線C、檢測線T的噴劃;(5)五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的成品組裝。
4.如權(quán)利要求3所述的一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的制備方法,其特征在于,所述步驟(2)膠體金溶液及膠體金-抗體結(jié)合物的制備步驟如下(1)膠體金溶液的制備方法采用檸檬酸三鈉還原法取硅化過的三角瓶,加入4000mL 去離子及40mL 質(zhì)量百分比濃度氯金酸,微波爐加熱沸騰;加入47mL的質(zhì)量百分比濃度檸檬酸三鈉,此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液很快變成灰色,續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色,最后變成穩(wěn)定的酒紅色后,繼續(xù)煮沸15min,冷卻后用去離子水補足體積至4000mL ;(2)羊抗人IgM標記膠體金顆粒的膠體金-抗體結(jié)合物制備方法每4000ml膠體金溶液,按照25 μ g/ml的比例需要提供羊抗人IgM IOOmg,將膠體金溶液和羊抗人IgM溶液分別以0. lmol/L K2CO3調(diào)pH至9. 0,電磁攪拌羊抗人IgM溶液,在羊抗人IgM溶液加入膠體金溶液,繼續(xù)攪拌IOmin ;(3)采用超速離心法純化用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金-羊抗人IgM結(jié)合顆粒先4000g, 4°C離心5分鐘去除沉淀;余下上清再以14000g的離心力,4°C離心lh,棄上清,復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸為原體積的1/10,4°C保存。
5.如權(quán)利要求3所述的一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的制備方法,其特征在于,所述步驟O)中樣品墊與金標墊分別用各自的處理緩沖液進行浸泡處理,將樣品墊浸入含質(zhì)量百分比濃度BSA和0. 05% Tween20的PBS溶液中浸泡15分鐘,取出真空凍干;將金標墊墊浸入含10%蔗糖、0. 05% Tween20和0. 01 %質(zhì)量百分比濃度疊氮鈉的 PBS溶液中浸泡15分鐘,取出室溫晾干。
6.如權(quán)利要求3所述的一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的制備方法,其特征在于,所述步驟(4)層析膜中對照線C和檢測線T噴劃方法是將弓形體、風(fēng)疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I型和單純皰疹病毒II型五種包被抗原、兔抗羊I gG抗體分別稀釋至 1. 5mg/ml、l. Omg/ml, 1. 5mg/ml,lmg/ml,lmg/ml 及 2mg/ml ;分別加入劃膜儀的 1、2、3、 4、5和6號杯;調(diào)試劃膜儀,噴液量設(shè)定為1.4μ 1/cm,其中1、2、3、4、5號杯在同一水平線上放置,6號杯在距上述杯上方5mm處放置,6號杯的導(dǎo)軌速度是其它杯的5倍;包被后的硝酸纖維素膜過夜晾干。
7.如權(quán)利要求4所述的一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的制備方法,其特征在于,羊抗人IgM抗體與膠體金結(jié)合的pH值為8. 2,濃度為25 μ g/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開一種一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙,層析膜一端連接金標墊、金標墊的另一端與樣品墊連接,所述層析膜的另一端連接吸收墊,所述吸收墊、層析膜、金標墊和樣品墊設(shè)置在所述底板上,所述金標墊為上吸附羊抗人IgM標記的膠體金結(jié)合物顆粒;所述層析膜上包被TORCH五種抗原的檢測線和兔抗羊IgG抗體的對照線,所述吸收墊上有與所述層析膜上的檢測線相對應(yīng)的標識區(qū)。本發(fā)明另外公開了一種一板五聯(lián)TORCH-IgM抗體膠體金快速檢測試紙的制備方法。本發(fā)明可以通過一次血清加樣即可檢測孕婦是否有TORCH五種病原的急性感染;用肉眼即可觀察結(jié)果,用戶容易接受,特別適合基層衛(wèi)生所,可以有效的預(yù)防孕婦TORCH感染會引起先天性或圍產(chǎn)期新生兒感染,從而導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎、死胎、早產(chǎn)或發(fā)育不全等的發(fā)生。
文檔編號G01N33/531GK102323410SQ20111022054
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月3日
發(fā)明者胡勇 申請人:廣州精達醫(yī)學(xué)科技有限公司
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