專利名稱：辣蓼藥材的hplc特征指紋圖譜研究技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及高效液相色譜(HPLC)儀器、中藥等領域中應用的一種質量控制過程， 尤其是應用于辣蓼藥材HPLC特征指紋圖譜。
背景技術：
辣蓼為蓼科植物水辣蓼/ ^ ^/ 腫hydropiper L.或旱辣蓼尺flaccidum Meisn .的干燥全草[1]。其味辛酸、性溫，歸脾、大腸經，有導滯化濕；辣蓼是中國的一種資源十分豐富傳統(tǒng)中草藥，于北半球溫帶或亞熱帶地區(qū)都有分布，在中國大部分地區(qū)都有生長。我國古代的許多醫(yī)書中都對辣寥的功用作了描述《本草綱目》“辣蓼，辛，溫，”《別錄》“蓼葉， 歸舌，除大小腸邪氣，利中益志?！薄短票静荨贰爸鞅簧邆?，搗敷之；絞汁服，治蛇毒人腹心悶； 水煮浸腳持之，消腳氣腫?！薄侗静菔斑z》“蓼葉，主痃癖，每日取60g煮服之；由霍亂轉筋，多取煮湯及熱搏腳；葉搗敷狐刺痣；亦主小兒頭瘡?！薄稁X南采藥錄》:“敷跌打，洗痣疥，止癢消腫?！睆幕瘜W成分角度而言，辣蓼主要含槲皮素、蘆丁、山奈酚、金絲桃苷、兒茶素和表兒茶素等黃酮成分；還有酚酸(沒食子酸、綠原酸、咖啡酸和阿魏酸)等成分。主要用于痢疾、腸胃炎、腹瀉、腳氣、疥癬、風濕關節(jié)痛、跌打腫痛、功能性子宮出血；外用治毒蛇咬傷、皮膚濕疹等癥狀[2]。國外近年來的研究表明，辣蓼具有抗微生物、殺蟲、抗氧化、抗腫瘤等多種生物功效，由于地域與氣候條件的不同，其化學成分也有差異，現(xiàn)有技術中，尚沒有針對辣蓼藥材 HPLC特征指紋圖譜的研究方法。參考文獻羅杰，陸霞.HPLC法測定水辣蓼中蘆丁的含量[J].中草藥，3503085486.李安仁.中國植物志(第25卷第一分冊)[M].北京科學出版社，1998:1-118·。
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種針對辣蓼藥材HPLC特征指紋圖譜技術； 為了解決上述技術問題，本發(fā)明中采用了如下的技術方案，即采用辣蓼藥材HPLC特征指紋圖譜的具體方法(1)收集藥材包括Si、S2共2批為重慶地區(qū)收集，S3、S4、S5和S6共4 批為海南地區(qū)收集，S7、S8共2批為廣西地區(qū)收集，S9、SlO和Sll共3批分別來源于成都、廣東和江西各1批，共計11批辣蓼藥材，粉碎加工炮制成飲片(圖1)，減壓低溫干燥，備用。(2)辣蓼中主含2類主要活性物質黃酮成分(如槲皮素、蘆丁、山奈酚、金絲桃苷、兒茶素和表兒茶素等)和酚酸類成分(沒食子酸、綠原酸、咖啡酸和阿魏酸)；由于其活性物質的極性也有差別，最大吸收波長的不同，對極性差別采用不同溶劑進行提取，對最大吸收波長的不同，采用日本島津HPLC-2010AHT高效液相色譜儀(包括自動進樣器，四元梯度泵，在線脫氣機，Lcbsolution化學工作站)，建立2個特征吸收波長對應2類有效物質的指紋圖譜，并對指紋圖譜建立后進行精密度、重復性和穩(wěn)定性分析，同時結合量化數(shù)據(jù)相對保留時間和相對峰面積，及化學計量學中相似度分析方法，最終建立辣蓼的色譜指紋圖譜，以實現(xiàn)指紋圖譜的全面和整體評價。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
圖1辣蓼藥材飲片
圖2參照物HPLC圖譜
圖3辣蓼藥材對照指紋圖譜(注-J號峰為參照物成分蘆丁) 圖4 11批不同產地辣蓼指紋圖譜匹配5 11批辣蓼藥材非共有峰面積之和占總峰面積的百分比。
具體實施例方式本發(fā)明控制辣蓼藥材質量方法一、實驗材料與儀器
1、藥材
收集為重慶、海南、廣西、成都、廣東和江西辣蓼藥材，經楊憲高工鑒定為蓼科植物水辣 MPolygonum hydropiper L.或旱辣蓼/7. flaccidum Meisn.的干燥全草。2、儀器和試劑
日本島津HPLC-2010AHT高效液相色譜儀(包括自動進樣器，四元梯度泵，在線脫氣機，Lcbsolution化學工作站)。瑞士 METTLER AE240分析天平；KQ-250E超聲清洗儀(上海綠宇生物科技有限公司)。蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100080-200707)。 沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110831-200803)。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。二、方法及結果
1、供試品的制備，其特征在于
取收集并加工后的辣蓼樣品粉末適量，分別精密稱取辣蓼約2. Og,精密加入80%甲醇 50ml，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，分別用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，用0. 45 μ m濾膜濾過，合并濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；
2、參照物的制備，其特征在于
分別精密稱取沒食子酸和蘆丁對照品適量，加80%甲醇制成每IOOml含食子酸4. 21mg、 蘆丁 5. 16mg的參照物溶液；
3、色譜條件的建立，其特征在于
色譜柱，Waters ODS C18(250 mmX4. 6 mm, 5 μ m)；流動相以0. 4%的磷酸緩沖鹽為A， 乙腈為B，梯度洗脫，洗脫程序為0-8min，B的濃度(ν/ν)保持為9% ；8-20min,B的濃度變化 9%-14% ；20-40min, B 的濃度變化 14%-20% ；40_50min，B 的濃度變化為 20%_45% ；50_65min， B的濃度變化為45%-80% ；65-88min, B的濃度保持為80% ；流速為0. 9ml/min ；柱溫30°C ； 進樣量10 μ 1 ；檢測波長:0-25min和55_88min范圍內，設為273nm, 25_55min范圍內，檢測波長設為360nm。指紋圖譜方法學考察精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗測定結果辣蓼的共有峰為15個(圖3)，各共有峰相對保留時間結果表明共有色譜峰的相對保留時間相對標準偏差(RSD)均不大于5. 0%， 共有峰相對峰面積均小于3. 0%;試驗表明儀器精密度、重復良好，供試品溶液在48h內基本穩(wěn)定。5、指紋圖譜的構建 5. 1參照色譜峰的選擇
通過色譜圖比較，在共有峰確定的基礎上(見5. 2描述)，按峰面積由大到小統(tǒng)計各樣品色譜圖中強信號峰，根據(jù)各藥材的成分情況，隨機選擇一個出峰時間較居中的成分作為參照峰(s)，辣蓼藥材中含有沒食子酸成分(圖2)和蘆丁成分(圖2中和圖3中的7號峰)，而蘆丁既是常用藥材定量控制成分，出峰也居中，適合作為參照峰，本發(fā)明將蘆丁峰定為參照峰(S)。5. 2共有色譜峰確定
根據(jù)11批次各供試品HPLC圖譜，采用軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A 版》(國家藥典委員會)，通過色譜峰采用多點校正方法行色譜峰的自動匹配，以辣蓼藥材第1批作為參照圖，以平均數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法，設定的時間窗寬度參數(shù)為 0. 50mino辣蓼藥材的對照色譜圖和11批藥材指紋圖譜匹配圖分別見圖3和圖4。通過峰匹配，11批辣蓼藥材共有峰為15個(圖3)；
5. 3相對保留時間(tK)和相對峰面積(Ak)的確定
以選定的蘆丁成分在各批次藥材指紋圖譜的保留時間和峰面積為1，各指紋峰保留時間與同一圖譜中參照物的保留時間相比，比值為各指紋峰的相對保留時間，同理，各共有峰的峰面積與同一圖譜中參照物的峰面積相比，比值為各共有峰的相對峰面積。11批辣蓼藥材的相對保留時間和相對峰面積見表1和表2。5. 4非共有峰占占總峰面積的百分比
通過對11辣蓼藥材供試品測定，統(tǒng)計各批非共有峰占相應圖譜總峰面積的百分比， 結果表明11辣蓼藥材的指紋圖譜中，非共有峰面積之和占總峰面積的百分比(圖5)為 5. 88-8. 22%，符合“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求”規(guī)定小于10%的檢測要求。從而也間接說明，原藥材的質量變化由產地等因素影響，因此，通過對指紋圖譜的研究，原藥材的質量得到控制，并符合要求，由它們制成的中藥的質量得也才能保持穩(wěn)定性和一致性。5. 5相似度分析
選取色譜圖中的共有峰，由“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004年A版”中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理軟件輔助自動進行峰匹配，采用相關系數(shù)法(見圖3)進行相似度計算， 結果見表3，辣蓼藥材相似度大于0. 95，表明各批次藥材之間具有較好的一致性，本方法可用于綜合評價辣蓼藥材的整體質量分析
表1 11批辣蓼藥材的相對保留時間(tK)結果
權利要求
1.一種辣蓼藥材HPLC特征指紋圖譜建立方法，包括如下步驟a.供試品的制備取收集并加工后的辣蓼樣品粉末適量，分別精密稱取辣蓼約2.0g， 精密加入80%甲醇50ml，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，分別用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，用0. 45 μ m濾膜濾過，合并濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；b.參照物的制備分別精密稱取沒食子酸和蘆丁對照品適量，加80%甲醇制成每IOOml 含食子酸4. 21mg、蘆丁 5. 16mg的參照物溶液；c.色譜條件的建立色譜柱，litersODS C18(250 mmX4. 6 mm, 5 μ m ；流動相，以0. 4% 的磷酸緩沖鹽為A，乙腈為B，梯度洗脫，洗脫程序為0-8min，B的濃度(ν/ν)保持為9% ； 8-20min, B的濃度變化9%-14% ；20-40min, B的濃度變化14%-20% ；40-50min, B的濃度變化為20%-45% ；50-65min, B的濃度變化為45%_80% ；65_88min，B的濃度保持為80% ；流速為 0. 9ml/min ；柱溫:30°C ；流速，0. 9mL/min ；進樣量 10 μ 1 ；檢測波長:0_25min 和 55_88min 范圍內，設為273nm，25_55min范圍內，檢測波長設為360nm。
2.如權利要求1所述辣蓼藥材的檢測方法，其特征在于步驟c所述流動相是0.4%的磷酸-乙腈。
3.如權利要求1所述辣蓼藥材的檢測方法，其特征在于步驟c所述檢測波長0-25min 和55-88min范圍內，設為273nm，25_55min范圍內，檢測波長設為360nm。
全文摘要
本發(fā)明提供了辣蓼高效液色譜(HPLC)特征指紋圖譜建立方法，包括11批不同產地的辣蓼藥材收集、供試品的制備、參照物的制備、色譜條件的建立、指紋圖譜的構建等過程，通過建立辣蓼藥材高效液相色譜(HPLC-UV)指紋圖譜技術，達到對辣蓼藥材質量進行穩(wěn)定、可控的目的。
文檔編號G01N30/88GK102279240SQ201110185409
公開日2011年12月14日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權日2011年7月4日
發(fā)明者何興國, 劉瑋琦, 張雪, 楊憲, 楊水平, 王伯初 申請人:楊憲