專利名稱：一種測(cè)定促甲狀腺激素的長(zhǎng)光程酶聯(lián)免疫分析法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種測(cè)定促甲狀腺激素 (ThyroidStimulating Hormone, TSH)的長(zhǎng)光程酶聯(lián)免疫分析法和試劑盒。
背景技術(shù)：
TSH是垂體前葉分泌的、促進(jìn)甲狀腺生長(zhǎng)和機(jī)能的堿性糖蛋白激素。含211個(gè)氨基酸。糖類約占整個(gè)分子的15%，整個(gè)分子由兩條肽鏈-α鏈和β鏈組成，分子量為25000 ^OOOD。TSH分子α亞基的氨基酸序列與其它的糖蛋白激素如促黃體素(LH)、促卵泡素 (FSH)和人絨毛膜促性腺素(HCG)的α亞基基本相同。β亞基為TSH所特有的，決定TSH 的特異性。血清中除有生物活性的整分子TSH外，還有無生物活性的α及β亞基。TSH全面促進(jìn)甲狀腺的機(jī)能，同時(shí)受下丘腦分泌的促甲狀腺激素釋放激素(TRH)的促進(jìn)性影響， Τ3、Τ4反饋性的抑制性影響，它們相互作用，組成下丘腦-垂體-甲狀腺軸，血清中TSH的準(zhǔn)確測(cè)定，是判斷甲狀腺和下丘腦-垂體-甲狀腺軸的功能是否正常的首選指標(biāo)之一，我國(guó)食品藥品監(jiān)督局已批準(zhǔn)多種TSH檢測(cè)藥盒或試劑盒用于臨床診斷。TSH檢測(cè)的難度主要是臨床診斷要求很高的靈敏度。人血清中TSH含量低，正常值約在0. 4 4. 0mIU/L(57 712ng/L)范圍，甲亢患者一般低于正常范圍，相當(dāng)部分的患者TSH小于0. (MmIU/L，毒性彌漫性甲狀腺腫甚至小于0. 01mIU/L。高靈敏的TSH檢測(cè)方法能顯著地?cái)U(kuò)大其在臨床診斷中的作用(Carole A. S pencer，Michael Takeuchi,Margarita Kazarosyan Currentstatus and performance goals for serum thyrotropin (TSH) assays. Clinical chemistry 42:1(1996) 140—145)。臨床診斷中檢測(cè)TSH的方法主要是非競(jìng)爭(zhēng)性的雙位點(diǎn)夾心免疫分析法(IMA)，此方法測(cè)量信號(hào)的大小與待檢物含量呈正比關(guān)系。根據(jù)標(biāo)記物的不同，可分為免疫放射分析、 酶聯(lián)免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫分析和全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析等。目前全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析法被認(rèn)為具有靈敏度優(yōu)勢(shì)(0. 01 0. 02mIU/L)，成為市場(chǎng)中的主流，但其儀器和試劑價(jià)格昂貴。酶聯(lián)免疫分析具有試劑盒制造技術(shù)較成熟、制造成本較低、無放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，但測(cè)量?jī)x器酶標(biāo)儀采用傳統(tǒng)的分光光度法，測(cè)量靈敏度低，直接影響了 TSH測(cè)定的靈敏度。分光光度法測(cè)量吸光度遵從朗伯-比爾定律:Α = ε be (Α為吸光度，ε為摩爾消光系數(shù)，b為測(cè)量光程，c為檢測(cè)物的濃度)。由上式可知，當(dāng)檢測(cè)物濃度一定時(shí)，吸光度與測(cè)量光程成正比，所以可以通過增大有效光程的途徑提高測(cè)量靈敏度。近年出現(xiàn)了用石英材料制作的長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池，長(zhǎng)可達(dá)2米，被測(cè)液流過樣品池，光信號(hào)通過光纖傳導(dǎo)到光纖光譜儀測(cè)定。長(zhǎng)光程技術(shù)應(yīng)用于食品質(zhì)量檢測(cè)、化學(xué)濃度分析、水質(zhì)檢測(cè)等領(lǐng)域，靈敏度較常規(guī)方法提高了數(shù)十倍(馬劍，張敏，袁東星.反液相流動(dòng)注射-長(zhǎng)光程多波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定飲水中超痕量亞硝酸鹽.分析化學(xué)37 :2(2009年)p3i;3)。將長(zhǎng)光程光纖光譜技術(shù)引入到酶聯(lián)免疫分析中，作為測(cè)量信號(hào)的手段，能顯著提高試劑盒的靈敏度。如采用1米的長(zhǎng)光程樣品池和吸收光程0. 01米的微孔板相比，根據(jù)朗伯-比爾定律測(cè)量靈敏度將提高100倍以上。長(zhǎng)光程技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)相結(jié)合的測(cè)定TSH的長(zhǎng)光程酶聯(lián)免疫分析法和試劑盒，具有靈敏度高、測(cè)定范圍適當(dāng)、試劑盒制造成本低的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題為了克服現(xiàn)有酶聯(lián)免疫分析法靈敏度不足的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種長(zhǎng)光程光纖光譜酶聯(lián)免疫分析法，基于此方法提供一種測(cè)定TSH的長(zhǎng)光程光纖光譜酶聯(lián)免疫分析法，并提供一種實(shí)施上述方法的TSH長(zhǎng)光程光纖光譜酶聯(lián)免疫分析試劑盒，用于滿足檢測(cè)人血清樣品的要求。( 二 )技術(shù)方案本發(fā)明為一種長(zhǎng)光程光纖光譜酶聯(lián)免疫分析法，是將現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫分析測(cè)量信號(hào)的方法一分光光度法改變成采用長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池和光纖光譜儀測(cè)量的方法。所述長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池為熔石英管，長(zhǎng)度不小于0. 5米，通過SMA接頭和傳輸光信號(hào)的光纖耦合； 光纖光譜儀光源為氘-鹵燈或氘-鹵鎢燈或鹵鎢燈，測(cè)量波長(zhǎng)范圍是400 900nm。測(cè)量時(shí)，將反應(yīng)終產(chǎn)物稀釋液注入長(zhǎng)光程樣品池，入射光也通過光纖傳導(dǎo)同時(shí)打入樣品池，經(jīng)過樣品吸收后，信號(hào)光再通過光纖傳導(dǎo)給光纖光譜儀，測(cè)量吸收光譜和吸光度。本發(fā)明將長(zhǎng)光程技術(shù)、光纖光譜技術(shù)和酶免疫分析技術(shù)相結(jié)合，建立長(zhǎng)光程光纖光譜酶聯(lián)免疫分析法，提高免疫分析的靈敏度。本發(fā)明技術(shù)原理為根據(jù)朗伯-比爾定律:Α = ε be (Α為吸光度，ε為摩爾消光系數(shù)，b為測(cè)量光程， c為檢測(cè)物的濃度)，當(dāng)檢測(cè)物濃度一定時(shí)，吸光度與測(cè)量光程成正比?，F(xiàn)有的酶聯(lián)免疫分析采用的微孔板，最大吸收光程不足0. 01米，改用長(zhǎng)度0. 5米以上的長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池，測(cè)量光程增加了 50倍以上，測(cè)量靈敏度將提高50倍以上。測(cè)量靈敏度提高將使免疫分析的靈敏度提高，特別是對(duì)于測(cè)量信號(hào)的大小與待檢物含量呈正比關(guān)系的非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析模式(皿)。本發(fā)明分析法包括以下步驟(1)樣品和酶標(biāo)記物及固相捕捉劑溫育；(2)固液相分離使酶標(biāo)記物結(jié)合部分和游離部分分離；(3)向酶標(biāo)記物結(jié)合部分加入低本底底物液，發(fā)生酶催化顯色反應(yīng)；(4)把反應(yīng)終產(chǎn)物稀釋，并注入長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池，用光纖光譜儀測(cè)量吸光度；(5)數(shù)據(jù)處理，根據(jù)測(cè)定的吸光度值檢測(cè)待檢物的濃度?；谏鲜龇椒ū景l(fā)明提供一種測(cè)定促甲狀腺激素(TSH)的長(zhǎng)光程光纖光譜酶聯(lián)免疫分析法。采用長(zhǎng)光程樣品池提高靈敏度的同時(shí)也成倍數(shù)地放大了被測(cè)物的本底，為解決這一問題，本發(fā)明優(yōu)選低本底底物液的組分、濃度配比和緩沖體系，獲得了具有足夠顯色能力、吸收本底低、性能穩(wěn)定的低本底底物液。采用終產(chǎn)物稀釋后測(cè)量，也可降低本底，雖然稀釋使靈敏度有所損失，但稀釋倍數(shù)遠(yuǎn)小于測(cè)量光程增加倍數(shù)，因而仍然能提高靈敏度。本發(fā)明采用終產(chǎn)物稀釋5 17倍后測(cè)量。本發(fā)明采用特制塑料試管制備抗體包被管，取代了酶免疫分析中常用的微孔板。 特制的試管增大了比表面積，可增加包被抗體量，進(jìn)而提高免疫分析性能。并且試管可容納反應(yīng)物多，當(dāng)樣品中TSH含量較高，吸光度超出儀器測(cè)量范圍時(shí)，可將剩余的反應(yīng)終產(chǎn)物稀釋，再進(jìn)行測(cè)量，可擴(kuò)大TSH測(cè)定范圍?？傊瑢㈤L(zhǎng)光程技術(shù)、酶免疫分析技術(shù)和包被管技術(shù)相結(jié)合，建立測(cè)定促甲狀腺激素(TSH)的長(zhǎng)光程光纖光譜酶聯(lián)免疫分析法，通過優(yōu)選的低本底底物液、特制的包被管替代微孔板、測(cè)量前稀釋以及分析條件的優(yōu)化，最終使本發(fā)明較常規(guī)的酶免疫分析法靈敏度提高，且測(cè)定范圍適當(dāng)。測(cè)定原理為TSH抗體吸附在塑料試管內(nèi)壁上成為抗體包被管，辣根過氧化物酶連接TSH單克隆抗體成為酶標(biāo)記物，待測(cè)樣品和酶標(biāo)記抗體同時(shí)加入抗體包被管中溫育，管內(nèi)壁上的抗體和TSH及酶標(biāo)記抗體反應(yīng)結(jié)合，在管內(nèi)壁上生成抗體-TSH-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，棄去管中溶液并洗滌，使酶標(biāo)記物結(jié)合部分和游離部分分離，管內(nèi)壁上結(jié)合的酶與TSH量呈正比關(guān)系。加入底物，酶催化底物顯色，將終產(chǎn)物稀釋后注入長(zhǎng)光程樣品池，入射光也通過光纖傳導(dǎo)同時(shí)打入樣品池，經(jīng)過樣品吸收后，信號(hào)光再通過光纖傳導(dǎo)給光纖光譜儀，測(cè)量450nm吸光度值。吸光度值與TSH含量呈正比關(guān)系。采用系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品可以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，從曲線上查得待測(cè)物的TSH濃度。測(cè)定包括以下步驟(1)將人血清樣品或標(biāo)準(zhǔn)品和辣根過氧化物酶標(biāo)記的TSH抗體加入TSH包被管中
溫育；(2)洗滌抗體包被管；(3)加入低本底底物液溫育；(4)加入終止液；(5)稀釋反應(yīng)終產(chǎn)物；(6)把反應(yīng)終產(chǎn)物稀釋液注入長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池，用光纖光譜儀測(cè)量吸光度；(7)數(shù)據(jù)處理；優(yōu)選地，其中TSH抗體包被管是識(shí)別TSH整分子的單克隆抗體或多克隆抗體包被在試管內(nèi)壁上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的是識(shí)別TSHii亞基的單克隆抗體；或者抗體包被管上是識(shí)別TSHii亞基的單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的是識(shí)別TSH整分子的單克隆抗體或多克隆抗體。TSH單克隆抗體為鼠抗人TSH抗體，TSH多克隆抗體為以人源性TSH為免疫原對(duì)綿羊或兔進(jìn)行免疫得到的。其中試管為聚苯乙烯或聚丙烯材料，特制為管內(nèi)底部為凸起的六角星形。優(yōu)選地，其中低本底底物液本底低，適合長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池測(cè)定。低本底底物液由 A、B液組成；A液過氧化氫或過氧化脲的濃度是0. 015 0. 12g/L ；B液的四甲基聯(lián)苯胺的濃度是0. 02 0. 2g/L、鹽酸濃度為0. 和甲醇濃度為5%。優(yōu)選地，其中終產(chǎn)物稀釋液為0. 05 1. OM的硫酸溶液。其中所述長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池為不小于0. 5米的熔石英管，通過SMA接頭和傳輸光信號(hào)的光纖耦合；光纖光譜儀測(cè)量波長(zhǎng)范圍是400 900nm，光源為氘-鹵燈或氘_鹵鎢燈或鹵鎢燈；數(shù)據(jù)經(jīng)過軟件處理后直接在計(jì)算機(jī)上顯示出450nm時(shí)的吸光度。其中所述數(shù)據(jù)處理是用TSH濃度的對(duì)數(shù)值做橫坐標(biāo)，吸光度值的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出TSH含量。也可以用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件完成數(shù)據(jù)處理。為方便起見，可以以試劑盒的形式提供本發(fā)明的測(cè)定方法，此類試劑盒是一種包裝組合物，其包括的基本組分有(1)抗體包被管；(2)酶標(biāo)記物；(3) TSH系列標(biāo)準(zhǔn)品；(4)濃縮洗滌液；(5)低本底底物液；(6)終止液；(7)終產(chǎn)物稀釋液。其中所述抗體包被管是識(shí)別TSH整分子或β亞基的多克隆或單克隆抗體，包被在特制的六角星形的聚苯乙烯管內(nèi)壁上，抗體包被濃度是02 2. Omg/L。其中所述酶標(biāo)記物采用的是識(shí)別TSH的β亞基或整分子的單克隆抗體或多克隆抗體，使用的酶是辣根過氧化物酶，標(biāo)記方法是過碘酸鈉法。其中所述TSH系列標(biāo)準(zhǔn)品為小牛血清或含牛血清白蛋白緩沖液中加入TSH純品及 0. 0. 3%的柳硫汞配而制成，濃度為0,0. 05,0. 3,4. O、10. O和20. OmIU/L。其中所述濃縮洗滌液為含有0. 3% 0. 8%Tween20和0. 0.3%柳硫汞的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。其中所述低本底底物液由A、B液組成，A液由0. 15M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液加入過氧化氫或過氧化脲配制而成，B液由0. 15M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液加入四甲基聯(lián)苯胺及穩(wěn)定劑配制而成。A液的過氧化物的濃度是0. 015 0. 12g/L ；B液的四甲基聯(lián)苯胺濃度是 0. 02 0. 2g/L、鹽酸的濃度是0. 1%、甲醇的濃度是5%。其中所述終止液和終產(chǎn)物稀釋液為硫酸溶液，濃度分別為1 2M和0. 05 1. OM0其中所述試劑盒的制備方法為(1)抗體包被管的制備用0. 01 0. 05M, pH 7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液稀釋TSH抗體至0. 2 ang/L， 以200μ L/管加入六角星形聚苯乙烯管中，4°C下過夜；棄去上清，用含 3%牛血清白蛋白的0. 01 0. 05M，pH 7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液37°C下封閉2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后棄去封閉液，凍干機(jī)干燥，4°C保存，以備使用；(2) TSH系列標(biāo)準(zhǔn)品的制備采用含有0. 0. 3%的柳硫汞，經(jīng)56°C下滅活0. 5 2. O小時(shí)的小牛血清或含 5%牛血清白蛋白的磷酸緩沖液將TSH純品配制成濃度為O 20mIU/L的一系列標(biāo)準(zhǔn)品，分裝，4°C或-20°C保存，以備使用；(3)酶標(biāo)記物的制備將辣根過氧化物酶的羥基用過碘酸鈉氧化為醛基，在堿性條件下與TSH抗體的氨基結(jié)合為酰胺化合物，透析后即得到TSH酶標(biāo)抗體酶標(biāo)記物，在標(biāo)記好的溶液中，等體積加入丙三醇，-20°C保存，以備使用；(4)濃縮洗滌液的配制0. IM 0. 3M，pH7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液或iTris-HCl緩沖液加入0. 3% 0. 8% 的Tween20和0. 0. 3%柳硫汞的配制而成；(5)低本底底物液的配制低本底底物液由A液、B液組成，A液由0. 15M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液加入0.015 0. 12g/L的過氧化氫或過氧化脲配制而成；B液由0. 15M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液加入0. 02 0.2g/L四甲基聯(lián)苯胺、0.1%的鹽酸、5%甲醇配制而成，使用時(shí)體積比1 1混合；(6)終止液的配制終止液由800ml蒸餾水加入50 IOOml 96% 98%的濃硫酸配制而成；(7)終產(chǎn)物稀釋液的配制終產(chǎn)物稀釋液由750ml蒸餾水加入19 750ml 2M硫酸配制而成；(8)將上述所制備的各組分組裝成試劑盒。(三)有益效果本發(fā)明提供了一種測(cè)定促甲狀腺激素(TSH)的長(zhǎng)光程光纖光譜酶聯(lián)免疫分析法， 并提供配套試劑盒，其中測(cè)量采用長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池、匹配光纖光譜儀進(jìn)行，通過加大測(cè)量光程并配合與其相適應(yīng)的低本底底物液、采用特制的包被管以及方法學(xué)優(yōu)化，使TSH檢測(cè)的靈敏度達(dá)到最小檢測(cè)限0. 015mIU/L，和使用同樣抗體的、優(yōu)化了的常規(guī)酶聯(lián)免疫分析法比較靈敏度提高了 4倍(參見下表1)，TSH標(biāo)準(zhǔn)品的最低濃度為0. 05mIU/L。免疫反應(yīng)在特制的抗體包被管中進(jìn)行，包被管底部為凸起的六角星形，比表面積大，吸附抗體多，有利于免疫反應(yīng)。同時(shí)反應(yīng)體積靈活，配合適當(dāng)?shù)南♂尣襟E，使標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍達(dá)到0. 05 20mIU/L。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)較高的分析靈敏度，較寬的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，使TSH檢測(cè)性能有較大改善，明顯優(yōu)于常規(guī)的酶免疫分析，可以滿足臨床檢測(cè)的需要。同時(shí)保持了低的制造成本，有利于普及應(yīng)用。表1本發(fā)明與部分現(xiàn)有TSH酶聯(lián)免疫分析(ELISA)靈敏度比較*
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定促甲狀腺激素(TSH)的長(zhǎng)光程酶聯(lián)免疫分析法，其特征在于，采用長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池(LPC)和光纖光譜儀測(cè)量酶聯(lián)免疫分析反應(yīng)終產(chǎn)物的吸光度，它包括以下步驟(1)樣品和酶標(biāo)記物及固相捕捉劑溫育；(2)固液相分離使酶標(biāo)記物結(jié)合部分和游離部分分離；(3)向酶標(biāo)記物結(jié)合部分加入低本底底物液，發(fā)生酶催化顯色反應(yīng)；(4)把反應(yīng)終產(chǎn)物稀釋，并注入長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池，用光纖光譜儀測(cè)量吸光度；(5)數(shù)據(jù)處理，根據(jù)測(cè)定的吸光度值檢測(cè)待檢物的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫分析法，其特征在于，長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池為熔石英管，長(zhǎng)度不小于0. 5米，通過SMA接頭和傳輸光信號(hào)的光纖耦合，用來檢測(cè)低濃度樣品的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫分析法，其特征在于，光纖光譜儀的光源為氘-鹵燈或氘-鹵鎢燈或鹵鎢燈，測(cè)量波長(zhǎng)范圍是400 900nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫分析法，其特征在于，固相捕捉劑為固定在試管內(nèi)壁上的抗體，試管為聚苯乙烯或聚丙烯管，管內(nèi)底部為凸起的六角星形；抗體為下列之一(1)酶標(biāo)記的是可與TSH的β亞基結(jié)合的單克隆抗體，固相捕捉劑是可與TSH整分子結(jié)合的單克隆抗體或多克隆抗體；或(2)酶標(biāo)記的是可與TSH整分子結(jié)合的單克隆抗體或多克隆抗體，固相捕捉劑是可與 TSH的β亞基結(jié)合的單克隆抗體；其中TSH單克隆抗體是小鼠單克隆抗體，多克隆抗體是以人TSH免疫綿羊或兔得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫分析法，其特征在于，低本底底物液由含過氧化氫或過氧化脲的A液和含四甲基聯(lián)苯胺、鹽酸及甲醇的B液組成，其中過氧化氫或過氧化脲的濃度是0. 015 0. 12g/L，四甲基聯(lián)苯胺的濃度是0. 02 0. 2g/L，鹽酸濃度為0. 1 %，甲醇濃度為5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述免疫分析法，其特征在于，測(cè)量前反應(yīng)終產(chǎn)物用0.05 1. OM 的硫酸溶液稀釋5-17倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述免疫分析法，其特征在于，其中樣品是人血清、血漿或全血；酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶與抗體的化學(xué)連接物；數(shù)據(jù)處理是根據(jù)450nm的吸光度值用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量樣品中TSH濃度。
8.一種實(shí)施權(quán)利要求1 7所述免疫分析法之一的測(cè)定TSH的長(zhǎng)光程光纖光譜酶聯(lián)免疫分析試劑盒，其特征在于，它包括以下基本組分(1)抗體包被管；(2)酶標(biāo)記物；(3)TSH系列標(biāo)準(zhǔn)品；(4)濃縮洗滌液；(5)低本底底物液；(6)終止液；(7)終產(chǎn)物稀釋液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，抗體包被管為內(nèi)壁上吸附有TSH抗體的聚苯乙烯或聚丙烯試管，管內(nèi)底部為凸起的六角星形；抗體為下列之一(1)酶標(biāo)記的是可與TSH的β亞基結(jié)合的單克隆抗體，包被抗體是可與TSH整分子結(jié)合的單克隆抗體或多克隆抗體；或(2)酶標(biāo)記的是可與TSH整分子結(jié)合的單克隆抗體或多克隆抗體，包被抗體是可與TSH 的β亞基結(jié)合的單克隆抗體；其中TSH單克隆抗體是小鼠單克隆抗體，多克隆抗體是以人TSH免疫綿羊或兔得到的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶和TSH抗體的化學(xué)連接物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于，低本底底物液由A、B液組成，A液由檸檬酸-磷酸鹽緩沖液加過氧化氫或過氧化脲配制而成，過氧化物的濃度是0. 015 0. 12g/L;B液由檸檬酸-磷酸鹽緩沖液加入四甲基聯(lián)苯胺、鹽酸及甲醇配制而成，其中四甲基聯(lián)苯胺的濃度是0. 02 0. 2g/L，鹽酸的濃度是0. 1 %，甲醇的濃度是5%。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，終產(chǎn)物稀釋液是0.05 1. OM的硫酸溶液。
13.一種適用權(quán)利要求8 12之一所述試劑盒的制備方法，其特征在于，包括下述步驟(1)包被管的制備用0. 01 0. 05M pH 7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液稀釋TSH抗體至0. 2 lyg/mL，200 500 μ 1每管加至底部六角星形聚苯乙烯管，4°C溫育過夜，洗滌包被管，用含0. 2% 牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液封閉，凍干機(jī)干燥，4°C貯存；O) TSH系列標(biāo)準(zhǔn)品的制備采用含有0. 1 % 0. 3 %柳硫汞的小牛血清或含有1 % 5 %牛血清白蛋白的磷酸緩沖液將促甲狀腺激素純品配制成系列濃度，分裝，-20°C貯存；(3)酶標(biāo)記物的制備將辣根過氧化物酶的羥基用過碘酸鈉氧化為醛基，在堿性條件下與促甲狀腺激素抗體的氨基結(jié)合為酰胺化合物，透析后即得到酶標(biāo)記物，等體積加入丙三醇，-20°C保存；(4)濃縮洗滌液的制備濃縮洗滌液由0. 1 0. 3M pH7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液加入 Tween20及穩(wěn)定劑配制而成；(5)低本底底物液的制備低本底底物液由A、B液組成，A液由0. 15M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液加入0.015 0. 12g/ L過氧化氫或過氧化脲配制而成；B液由0. 15M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液加入0. 02 0. 2g/L 四甲基聯(lián)苯胺、鹽酸及醇類配制而成；(6)終止液的制備終止液由800ml蒸餾水加入50 IOOml 96 98%的濃硫酸配制而成；(7)終產(chǎn)物稀釋液的制備終產(chǎn)物稀釋液由750ml蒸餾水加入19 750ml 2M硫酸配制而成；(8)將各組分組裝成試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測(cè)定促甲狀腺激素的長(zhǎng)光程酶聯(lián)免疫分析法，還提供了該方法的試劑盒。測(cè)定步驟包括免疫反應(yīng)、分離、顯色、測(cè)量和數(shù)據(jù)處理。采用長(zhǎng)光程流動(dòng)樣品池和光纖光譜儀進(jìn)行測(cè)量，通過增加測(cè)量光程、采用低本底底物液、以及各組分制備和方法學(xué)優(yōu)化使檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.015mIU/L，和使用同樣抗體的、優(yōu)化的常規(guī)酶聯(lián)免疫分析法比較，靈敏度提高了4倍。測(cè)定線性范圍為0.05～20mIU/L。免疫反應(yīng)在包被管中進(jìn)行，反應(yīng)模式為雙抗體夾心一步法。試劑盒包括抗體包被管、系列校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記物、濃縮洗滌液、低本底底物液、終止液及終產(chǎn)物稀釋液。本方法靈敏度高，測(cè)定范圍適當(dāng)，可以滿足臨床檢測(cè)的需要。同時(shí)試劑盒制造成本低，有利于普及應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102192888SQ201110106810
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者官國(guó)英, 潘玉婷, 燕強(qiáng)奮 申請(qǐng)人:原子高科股份有限公司