專利名稱:雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫分析(ELISA)技術(shù)領(lǐng)域,具體的說是一種雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù):
酶聯(lián)免疫分析法(又稱酵素免疫分析法,Enzyme-Iinkedimmunoassay,簡稱ELISA)是利用抗原抗體之間專一性鍵結(jié)之特性,對檢體進(jìn)行檢測,主要以夾心法 (sandwich)、間接法(indirect)、以及競爭法(Competitive)三種為主。雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的ELISA方法,適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價(jià)抗原的定量檢測,而不能用于小分子半抗原的檢測。其基本工作原理是 利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合,形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對于待測抗原是過量的,因此復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比(在方法可檢測范圍內(nèi))。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(0D值),即可確定待測抗原含量。若固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個不同的抗原決定簇結(jié)合,則屬于雙位點(diǎn)夾心法。雙抗體夾心法主要有三種,傳統(tǒng)的雙多抗夾心法(A法)所需檢測抗體和固相載體包被抗體都是多抗,制備簡單,在一定范圍內(nèi)檢測靈敏度高,信號顯示強(qiáng),很難避免鉤狀效應(yīng),其主要問題在于固相載體上的抗體和檢測抗體都為針對完整抗原所有抗原結(jié)合位點(diǎn)多克隆抗體,抗原濃度比較低的時(shí)候,固相支持物上的抗體幾乎跟抗原上所有位點(diǎn)結(jié)合,結(jié)合力強(qiáng),空余位點(diǎn)少,檢測抗體與抗原位點(diǎn)少,結(jié)合力弱,只要固相支持物上的抗體未與抗原結(jié)合飽和,抗原量與最后信號顯示部呈線性關(guān)系;隨著抗原量的增加,固相支持物上的抗體與抗原結(jié)合飽和,空余位點(diǎn)越來越多,檢測抗體與抗原的空余位點(diǎn)結(jié)合,信號顯示與實(shí)際抗原增長呈幾何倍數(shù)增長,同樣不呈線性關(guān)系;隨著抗原量的增加,固相載體上的抗體與每個抗原的結(jié)合位點(diǎn)很少,結(jié)合力很弱,而過量的檢測抗體與其結(jié)合位點(diǎn)增多,結(jié)合力增強(qiáng), 因?yàn)榭乖贵w結(jié)合本來就是一個動態(tài)可逆的反應(yīng)過程(抗原+抗體#抗原·抗體),一旦從固相載體上抗體與抗原解離下來的時(shí)候,位點(diǎn)立即被檢測抗體結(jié)合,形成抗原抗體復(fù)合物沉淀,在洗滌過程中被洗掉,隨著抗原量的增加,而信號反而降低,就是所謂的鉤狀效應(yīng)。此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同,如按常法測讀,所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量,因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí),反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此采用傳統(tǒng)雙多抗夾心法(A法)不適用于測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg、AFP和尿液HCG等)。用高親和力的單克隆抗體對(C法即檢測抗體和固相載體包被抗體都用單克隆抗體,)生產(chǎn)此類試劑盒可削弱鉤狀效應(yīng),由于固相載體上的抗體和檢測抗體結(jié)合的不是相同的位點(diǎn),所以不形成競爭關(guān)系,一般情況下不會形成鉤狀效應(yīng),但是單克隆抗體制備周期長,成本高,特別是高親和力的配對抗體更是不容易得到,同時(shí),由于固相載體上抗體和檢測抗體都是單位點(diǎn)與抗原結(jié)合,所以結(jié)合力弱,信號顯示值低,敏感性差,穩(wěn)定性也不好。針對上述問題,國外很多公司以單抗作包被抗體制備固相載體,以多抗作檢測抗體(B法),由于抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)競爭效應(yīng)不強(qiáng),不會產(chǎn)生鉤狀效用,檢測信號強(qiáng)度介于A 法和C法之間,穩(wěn)定性也介于A法和C法之間,但是該法需要生產(chǎn)至少一個單抗,生產(chǎn)周期長,成本高;但相對于C法而言,由于B法只需要生產(chǎn)一個單抗,并且不需要配對篩選,其成本和技術(shù)難度都相對較低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)問題,提供一種制備方法簡單、成本低、周期短的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒的生產(chǎn)方法。本發(fā)明還提供一種由上述方法生產(chǎn)得到的檢測靈敏度高、誤差小、無標(biāo)準(zhǔn)曲線的鉤狀效應(yīng)的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒。一種雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒的生產(chǎn)方法,包括以下步驟(1)抗原拆分將含有兩個以上抗原表位的完整抗原拆分成兩個部分,每個部分為至少包含一個完整的有效抗原表位完全抗原;(2)動物免疫及其檢測將上述兩個完全抗原分別進(jìn)行動物免疫,并采用酶聯(lián)免疫吸附分析法檢測動物免疫效果,分別得到兩份相應(yīng)的ELISA效價(jià)不低于1 100,000的動物免疫血清;(3)親和層析提取將上述兩份動物免疫血清分別通過完整抗原親和層析方法提取出兩份針對各自完全抗原的抗體;(4)制備檢測抗體和固相載體將其中一份抗體經(jīng)過生物素標(biāo)記用于制備檢測抗體,另一份抗體用于制備固相載體。(5)按照雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析法要求以完整抗原為標(biāo)準(zhǔn)品組裝試劑盒。所述步驟(1)中完整抗原拆分的方法為對于蛋白質(zhì)抗原可以通過多肽合成、分段重組表達(dá)或蛋白酶切方法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)抗原的拆分;對于化合物大分子抗原可以通過化學(xué)合成或化學(xué)分解實(shí)現(xiàn)化合物大分子抗原拆分。所述步驟(1)中拆分后的兩部分中任一部分分子量小于20kd時(shí),則通過添加載體制備成完全抗原后再進(jìn)入步驟O),所述的添加載體是指將拆分抗原附著或者藕聯(lián)在載體上制備成可以用于動物免疫產(chǎn)生較好免疫效果的完全抗原,實(shí)現(xiàn)方法包括化學(xué)藕聯(lián),物理吸附,或者是重組表達(dá)時(shí)直接與載體融合表達(dá)。所述步驟O)中酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)方法為以未拆分的完整抗原作為包被抗原制備固相載體,免疫血清稀釋后與包被有完整抗原的固相載體共同反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后洗滌,加抗被免疫動物的酶標(biāo)抗體,底物顯色,終止后讀取吸光值判斷抗體效價(jià)。本發(fā)明雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒由上述生產(chǎn)方法制得。本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照選擇的具體抗原合理確定完整抗原拆分成兩部分的方法, 可以使用但不限于下述方法對于蛋白質(zhì)抗原可以通過多肽合成、分段重組表達(dá)或蛋白酶切方法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)抗原的拆分;對于化合物大分子抗原可以通過化學(xué)合成或化學(xué)分解實(shí)現(xiàn)化合物大分子抗原拆分。其詳細(xì)步驟為現(xiàn)有技術(shù),不作贅述。所述動物免疫方法也可參照
4現(xiàn)有的動物免疫方法進(jìn)行。所述雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒內(nèi)除了包括有上述固相載體、標(biāo)準(zhǔn)品、經(jīng)過生物素標(biāo)記的檢測抗體外,根據(jù)需要還配有例如稀釋液、洗滌液、鏈霉親和素酶標(biāo)記復(fù)合物、顯色液,顯色終止液等劑試盒檢測需要的各種輔助試劑。本發(fā)明通過將含有兩個以上抗原表位的抗原(如蛋白質(zhì),多肽或其他的大分子物質(zhì))拆分并制備成兩部分(要求每一部分至少包含一個完整的表位,而又不含有另外一部分的活性表位)完全抗原,再分別進(jìn)行動物免疫,利用完整抗原檢測是否產(chǎn)生抗體并監(jiān)測抗體效價(jià),當(dāng)抗體效價(jià)滿足實(shí)驗(yàn)要求時(shí)取血,通過親和層析提取動物血清中的特異性抗體, 分別用于固相載體包被和生物素標(biāo)記的檢測抗體。由于拆分后得到的兩部分完全抗原各自至少包含一個完整的表位,而又不含有另外一部分的活性表位,因而由本發(fā)明方法得到的用作固相載體包被的特異性抗體是針對其中一個拆分抗原的多抗,用作檢測抗體的特異性抗體是針對另一拆分抗原的多抗,進(jìn)而以完整抗原為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行夾心酶聯(lián)免疫分析時(shí), 這兩部分的特異性抗體能夠分別針對各自對應(yīng)的抗原表位,由于檢測抗體不與固相載體上的抗體競爭表位,因此抗原的量與最后信號顯示的結(jié)果呈很好的線性關(guān)系,不會因?yàn)榭乖^量反而造成信號減低的現(xiàn)象,檢測時(shí)也不會出現(xiàn)鉤狀效應(yīng),同時(shí),由于多抗的結(jié)合力比較強(qiáng),所以不同抗原濃度的信號值拉得開距離,擴(kuò)大了檢測范圍,大大提高了檢測的靈敏度。本發(fā)明方法生產(chǎn)的試劑盒比傳統(tǒng)雙多抗夾心法(A法)線性好,無標(biāo)準(zhǔn)曲線的鉤狀效應(yīng)。與單抗作包被抗體、多抗作檢測抗體的夾心法(B法)相比,敏感性更高。與雙單抗的夾心法(C法)相比制備更簡單,生產(chǎn)周期更短(比C法生產(chǎn)周期短2個月)、試劑盒更穩(wěn)定(穩(wěn)定性周期可以提高半年到一年以上)、成本更低廉(多抗的生產(chǎn)成本只有單抗的 1/3)、檢測范圍廣(以人原癌基因B-myb蛋白試劑盒為例,C法檢測范圍0. 32-lOng/mL,而本法制備的試劑盒的檢測范圍可達(dá)0. 15-12ng/mL,)。表1幾種雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒的比較
權(quán)利要求
1.一種雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒的生產(chǎn)方法,包括以下步驟(1)抗原拆分將含有兩個以上抗原表位的完整抗原拆分成兩個部分,每個部分為至少包含一個完整的有效抗原表位的完全抗原;(2)動物免疫及其檢測將上述兩個完全抗原分別進(jìn)行動物免疫,并采用酶聯(lián)免疫分析法檢測動物免疫效果,分別得到兩份相應(yīng)的ELISA效價(jià)不低于1 100,000的動物免疫血清;(3)親和層析提取將上述兩份動物免疫血清分別通過完整抗原親和層析方法提取出兩份針對各自完全抗原的抗體;(4)制備檢測抗體和固相載體將其中一份抗體經(jīng)過生物素標(biāo)記用于制備檢測抗體, 另一份抗體用于制備固相載體。(5)按照雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析法要求以完整抗原為標(biāo)準(zhǔn)品組裝試劑盒。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法,其特征在于,所述步驟(1)中完整抗原拆分的方法為對于蛋白質(zhì)抗原可以通過多肽合成、分段重組表達(dá)或蛋白酶切方法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)抗原的拆分;對于化合物大分子抗原可以通過化學(xué)合成或化學(xué)分解實(shí)現(xiàn)化合物大分子抗原拆分。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)方法,其特征在于,所述步驟(1)中拆分后的兩部分中任一部分分子量小于20kDa時(shí),則通過添加載體制備成完全抗原后再進(jìn)入步驟(2)。
4.如權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)方法,其特征在于,所述步驟O)中酶聯(lián)免疫分析法為以未拆分的完整抗原作為包被抗原制備固相載體,免疫血清稀釋后與包被有完整抗原的固相載體共同反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后洗滌,加抗被免疫動物的酶標(biāo)抗體,底物顯色,終止后讀取吸光值判斷抗體效價(jià)。
5.一種雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒,其特征在于,由權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)生產(chǎn)方法制得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒及其生產(chǎn)方法,解決了現(xiàn)有雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒制作復(fù)雜、周期長、成本高、難以避免鉤狀效應(yīng)、檢測范圍小、穩(wěn)定性差的問題。技術(shù)方案包括抗原拆分、動物免疫及其檢測、親和層析提取、制備檢測抗體和固相載體及試劑盒組裝等步驟。本發(fā)明方法制備方法簡單、成本低、周期短,本發(fā)明方法生產(chǎn)的試劑盒檢測靈敏度高、誤差小、檢測范圍廣、無標(biāo)準(zhǔn)曲線的鉤狀效應(yīng)。
文檔編號G01N33/535GK102175848SQ201110002499
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者李學(xué)斌 申請人:武漢伊艾博科技有限公司