專利名稱：對(duì)給定靶標(biāo)具有親和力的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2(Lcn2，hNGAL)的突變蛋白的制作方法
對(duì)給定靶標(biāo)具有親和力的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 (Lcn2,hNGAL)的突變蛋白

本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生突變蛋白的新文庫(kù)和源自人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 (Lcn2, hNGAL)的新突變蛋白以及相關(guān)蛋白，所述蛋白以可檢測(cè)的親和力結(jié)合給定靶標(biāo)。本發(fā)明還涉及編碼這樣的突變蛋白的相應(yīng)的核酸分子以及用于產(chǎn)生所述核酸分子的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于生產(chǎn)這樣的突變蛋白的方法。此外，本發(fā)明涉及包含這樣的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的藥物組合物以及所述突變蛋白的多種用途。根據(jù)本發(fā)明的Lcn2突變蛋白顯示出在數(shù)個(gè)疾病領(lǐng)域作為治療和/或診斷試劑的潛力。例如，它們可以用于結(jié)合天然生物分子的致病形式(例如阿爾茨海默氏病中的P淀粉樣肽)并使其耗盡。在另一個(gè)實(shí)施例中，它們可以用于將各種標(biāo)記或毒素特異靶向至疾病相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)記物，例如與腫瘤新生血管相關(guān)的纖連蛋白額外結(jié)構(gòu)域B。由于可以根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生的Lcn2突變蛋白的特殊益處，各種其它應(yīng)用或?qū)嵤├彩强梢缘摹?
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病(AD)是老年人群中最為常見的癡呆形式。與AD相關(guān)的淀粉樣前體蛋白的缺陷性進(jìn)程產(chǎn)生具有潛在神經(jīng)毒性的包含40-42個(gè)殘基的0淀粉樣肽(A3)。
之后聚集成低聚物和長(zhǎng)纖維，這在該疾病的過程中具有關(guān)鍵作用，從而聚集形成老年斑塊(Haass 和 Selkoe (2007) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8，101-112)。盡管 AD 越來越重要，但對(duì)于預(yù)防、治療或減緩所述癡呆的有效療法的需求仍未得到滿足。當(dāng)前的抗淀粉樣方法的目標(biāo)為(i)預(yù)防AP形成，(ii)阻斷其聚集，(iii)降低腦中可溶AP的水平，以及(iv)分解存在的淀粉樣斑塊。迄今為止，包括主動(dòng)和被動(dòng)免疫AD患者的免疫療法在此領(lǐng)域最有希望(Dodel等人(2003) Lancet Neurology 2，215-220;Lichtlen和 Mohajeri (2007) J. Neurochem. 104, 859-874 ;Brody和 Holtzmann (2008)Annu. Rev. Neurosci. 31, 175-193)。然而，由于6%的患者發(fā)生了腦膜腦炎，因此停止了主動(dòng)免疫AD患者的近期臨床試驗(yàn)。由于這些Fe介導(dǎo)的免疫功能的潛在不良反應(yīng)，非Ig結(jié)合試劑例如Anticalin,提供了替代方案。與0淀粉樣蛋白具有特異性的親和體分子的識(shí)別是示出基因工程的非Ig結(jié)合蛋白的潛力的一個(gè)實(shí)例(Gr5nwall等人(2007)J. Biotechnol. 128，162-183 ；Hoyer 等人(2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105，5099-5104)。然而，親和體的細(xì)菌來源可能在人患者中造成免疫原性的問題。纖連蛋白(FN)在細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化中起重要作用。FN為大的模塊化的二聚體糖蛋白，其包含1、11和III型的多個(gè)結(jié)構(gòu)域。FN的可選剪切變體，例如其額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B,在FNni7和FNm8結(jié)構(gòu)域之間摻入)表現(xiàn)為組織特異的和發(fā)育階段依賴的行為(Zardi 等人(1987) EMBO J 6，2337-2342)。ED-B不存在于正常成人組織中，但在傷口愈合和腫瘤的血管形成期間例外。因此，含有ED-B的纖連蛋白在吸引新血管形成和經(jīng)歷異常血管生成的多種不同腫瘤類型中大量表達(dá)。盡管ED-B在血管生成中的實(shí)際生物學(xué)功能尚不清楚，其在FN中的加入起到腫瘤發(fā)生的良好標(biāo)記物的作用。通常，區(qū)分惡性組織和健康器官是有利的治療策略，原因在于，使藥物直接選擇性靶向到腫瘤組織使得藥物局部濃度提高。為了特異性檢測(cè)和靶向ED-B，使用噬菌體展示抗體技術(shù)提供了重組抗體片段。分離的抗體片段中的一種為L(zhǎng)19單鏈Fv (Carnemolla等人(1996) Int. J. Cancer 68,397-405 ;Ebbinghaus 等人(2004) Curr. Pharm. Des. 10，1537-1549)。目前通過 L19組合有效的細(xì)胞毒性藥劑來解決ED-B顯示了癌癥治療和診斷的前景(Schliemann和Neri(2007) Biochim. Biophys. Acta 1776, 175-192 ；Kaspar 等人(2006) Int. J. Cancer118， 1331-1339)。然而，L19 scFv片段易于寡聚化。由于在治療阿爾茨海默氏病和腫瘤的診斷或治療中存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供可以用于治療和腫瘤的診斷或治療中的替代方法和化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，源自脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的蛋白的特定突變蛋白由于其穩(wěn)定性更好并且尺寸更小，因此是具有吸引力的化合物。本發(fā)明人鑒定了特定組的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白，其在特定位點(diǎn)具有突變，顯示具有例如與ED-B的高親和力和特異性。這種Lcn2突變蛋白以高靈敏性特異性地識(shí)別人細(xì)胞上的含ED-B的纖連蛋白，因而顯示了作為用于診斷和治療腫瘤疾病的治療試劑的前景。本發(fā)明人還得以鑒定了與AP肽具有高親和力和特異性的特定Lcn2突變蛋白。這種Lcn2突變蛋白還可以抑制AP聚集，并因而顯示了在進(jìn)一步改進(jìn)和修飾后可以作為治療AD的治療試劑的前景。此外，本發(fā)明還描述了基于人Lcn2支架的新隨機(jī)文庫(kù)，所述文庫(kù)允許有效產(chǎn)生通常與給定靶標(biāo)具有高親和力和特異性的突變蛋白，例如本發(fā)明的突變蛋白。這種文庫(kù)或其部分的實(shí)例示于圖I和2。在一個(gè)方面，至少在編碼hLcn2線性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 134 中任一個(gè)的 1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)核苷酸三聯(lián)體處，通過此位置處以核苷酸三聯(lián)體
組實(shí)現(xiàn)的替換，進(jìn)行隨機(jī)突變。核苷酸三聯(lián)體組可以是指、但不限于(a)少于由核苷酸NNN編碼的64個(gè)可能的三聯(lián)體(如果N = A、T、G、C，則表示4x4x4=64個(gè)可能的三聯(lián)體)，(b)少于由核苷酸NNK或NNS編碼的32個(gè)可能的三聯(lián)體，(c)少于編碼全部20個(gè)天然蛋白氨基酸的必需三聯(lián)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在突變期間，編碼半胱氨酸的核苷酸三聯(lián)體不用于替換。這意味著突變不帶來在原始未經(jīng)突變的序列中不包含的攜帶新半胱氨酸的突變蛋白。因而，在這一方面規(guī)定了那些核苷酸三聯(lián)體將被引入到如本段落所規(guī)定的待突變位置(同樣參見實(shí)施例I和圖2)。因而，在第一方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生源自人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 (Lcn2 ;也稱為人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白即hNGAL或稱為siderocalin)的突變蛋白的方法。以此方法獲得的突變蛋白能夠以可檢測(cè)的親和力結(jié)合非天然靶標(biāo)。該方法包括使編碼人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 (Lcn2，hNGAL)的核酸分子發(fā)生突變，所述突變發(fā)生在對(duì)應(yīng)于人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2線性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置中的至少一個(gè)處，從而得到一種或
多種突變蛋白核酸分子。根據(jù)上文，術(shù)語“人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2”或“人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(hNGAL) ”包括來自其它物種的已被鑒定或尚未分離的結(jié)構(gòu)同源物，所述結(jié)構(gòu)同源物具有大于約60%的氨基酸序列同源性或序列同一性。優(yōu)選的是，上文描述的這些人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白在對(duì)應(yīng)于hNGAL線性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136 和 138 的序列位置中的任一個(gè)處包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)突變的氨基酸殘基。本文使用的術(shù)語“同源性”以其通常的含義在本文中使用，并且包括相同氨基酸以及認(rèn)為是在兩個(gè)互相比較的蛋白質(zhì)線性氨基酸序列等價(jià)位置處的保守替換的氨基酸(例如天冬氨酸殘基交換谷氨酸殘基)。本發(fā)明所用的術(shù)語“序列同一性”或“同一性”表示本發(fā)明多肽序列與有關(guān)序列同源性比對(duì)之后，形成配 對(duì)的相同殘基相對(duì)于這兩個(gè)序列中較長(zhǎng)一個(gè)的殘基數(shù)量的百分比。本文中，使用程序BLASTP，blastp 2. 2. 5 版(2002 年 11 月 16 日;參見 Altschul,S. F.等人(1997) Nucl. Acids Res. 25，3389-3402)測(cè)定序列同源性或序列同一性百分比。同源性百分比基于包括前肽序列的完整多肽序列比對(duì)(matrix: BLOSUM 62; gapcosts: 11. I; cutoff value set to 10_3),在配對(duì)比較中使用人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2作為參考。其計(jì)算為，以BLASTP程序輸出的結(jié)果表示的“陽(yáng)性”(同源氨基酸)除以該程序選擇用于比對(duì)的氨基酸總數(shù)的百分比。在這方面應(yīng)注意，所選擇的氨基酸的總數(shù)可以與人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的長(zhǎng)度不同。在不同于人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的蛋白用于本發(fā)明的情況下，針對(duì)人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2給出的突變序列位置的定義可以在公開的序列比對(duì)或比對(duì)方法的幫助下指定給該其它脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，所述公開的序列比對(duì)或比對(duì)方法是技術(shù)人員可獲得的。可以例如如WO99/16873 (參見本文圖3)中所述，使用例如公開的比對(duì)(例如Redl，B. (2000) Biochim.Biophys. Acta 1482，241-248的圖I中的比對(duì))進(jìn)行序列比對(duì)。如果可獲得脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的三維結(jié)構(gòu)，則可以將結(jié)構(gòu)疊加用確定要進(jìn)行本發(fā)明的突變的那些序列位置。結(jié)構(gòu)分析的其它方法，例如多維核磁共振波譜法也可用于此目的。人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的同源物也可以是人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的突變蛋白本身，其中在不同于本發(fā)明中選擇的位置的位置處引入氨基酸替換。例如，這種突變蛋白可以是這樣的蛋白相比于人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的野生型序列，蛋白中的P桶的溶劑暴露表面處的位置被突變，以便提高蛋白的溶解性或穩(wěn)定性。通常，術(shù)語“人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2”包括與人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的序列同源性或序列同一性大于60%、70%、80%、85%、90%或95%的所有蛋白。優(yōu)選的是，上文描述的這些人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白在對(duì)應(yīng)于hNGAL線性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、
51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136 和 138 的序列位置中的任一個(gè)處包含 1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)突變的氨基酸殘基。因而，在另一方面，本發(fā)明提供了一種源自人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的突變蛋白(S卩，人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白或突變的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，優(yōu)選突變的成熟hNGAL，其中所述成熟hNGAL具有SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)P80188，更優(yōu)選所述成熟hNGAL具有SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列)。此突變蛋白在對(duì)應(yīng)于人Lcn2線性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置中的任一個(gè)處包含至少一個(gè)或兩個(gè)突變的氨基酸殘基，并且其中該突變蛋白以可檢測(cè)的親和力結(jié)合給定非天然靶標(biāo)。本文使用的“突變蛋白”、“突變的”的實(shí)體(蛋白或核酸)或“突變體”是指，相比于天然存在的(野生型)核酸或蛋白“參照”支架，分別為一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸的交換、缺失或插入。優(yōu)選地，分別交換、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的數(shù)量為1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或更多，例如 25、30、35、40、45 或 50。本文使用的術(shù)語“人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白”或“hNGAL”或“脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2”或“Lcn2”是指具有SWISS-PR0T數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)P80188的成熟hNGAL (本文示例為 SEQ ID NO: 44)。 在此上下文中，應(yīng)注意本發(fā)明基于下述令人吃驚的發(fā)現(xiàn)使人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2、大鼠a 2微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m)和小鼠24p3/uter0calin (24p3)在這些上文提及的3個(gè)序列位置中的一個(gè)或多個(gè)處進(jìn)行突變，提供了具有結(jié)合預(yù)定靶標(biāo)的足夠親和力的突變蛋白，所述預(yù)定靶標(biāo)可以包括、但不限于肽、蛋白、蛋白的片段或結(jié)構(gòu)域和小有機(jī)分子。給定靶標(biāo)可以是任何期望的非天然靶標(biāo)/配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“非天然配體”是指在生理?xiàng)l件下不結(jié)合天然的成熟hNGAL的化合物。本文針對(duì)非天然靶標(biāo)使用的術(shù)語“有機(jī)分子”或“小有機(jī)分子”是指這樣的有機(jī)分子其包含至少兩個(gè)碳原子，但是優(yōu)選不大于7或12個(gè)可旋轉(zhuǎn)碳鍵，分子量范圍為100至2000道爾頓，優(yōu)選100至1000道爾頓，并且任選地包含一個(gè)或兩個(gè)金屬原子。本文針對(duì)非天然靶標(biāo)使用的術(shù)語“肽”是指具有2至45個(gè)氨基酸的二肽或寡肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該肽具有2-40、2-35、2-30、2-25、2-20、2-15或2_10個(gè)氨基酸殘基。該肽可以是天然存在的肽或合成肽，并且除了 20個(gè)天然存在的L-氨基酸之外，還可以包括D-氨基酸、非天然存在的氨基酸和氨基酸類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該肽為P淀粉樣肽(A3或八0)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，P淀粉樣肽為A￠40肽或A￠42肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該小有機(jī)分子為顯示具有免疫半抗原的特征的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，非天然靶標(biāo)是蛋白，且是纖連蛋白或其結(jié)構(gòu)域，例如EB-結(jié)構(gòu)域或EB-結(jié)構(gòu)域的片段。本發(fā)明的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白可以包含位于突變的氨基酸序列位置之外的野生型(天然)氨基酸序列。在其它方面，本文公開的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白還可以含有進(jìn)行突變的序列位置之外的氨基酸突變，只要這些突變不干擾突變蛋白的結(jié)合活性和折疊即可。使用已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook, J.等人(1989) Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY)可以非常容易地在DNA水平上實(shí)現(xiàn)此類突變。氨基酸序列的可能改變?yōu)椴迦牖蛉笔б约鞍被崽鎿Q。此類替換可以是保守的，即氨基酸殘基被化學(xué)上相似的氨基酸殘基替代。保守替換的實(shí)例為以下組成員的替代1)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和賴氨酸；5)異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可以在氨基酸序列中引入非保守改變。此外，除了替代單一的氨基酸殘基，還可以插入或缺失人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2—級(jí)結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)的氨基酸，只要這些缺失或插入產(chǎn)生穩(wěn)定的折疊/功能突變蛋白即可?？偟膩碚f，氨基酸序列的這種修飾包括單一氨基酸位置的定點(diǎn)突變，以便通過摻入特定限制性酶的切割位點(diǎn)而簡(jiǎn)化突變的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白基因或其部分的亞克隆。此外，可摻入這些突變以進(jìn)一步提高脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白與給定靶標(biāo)的親和力。并且，可以引入突變，以便調(diào)節(jié)突變蛋白的某些特征，例如以改善折疊穩(wěn)定性、血清穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)抗性或水溶解性，或者如果必要的話以降低聚集傾向。例如，天然存在的半胱氨酸殘基可以突變成其它氨基酸，以防止二硫鍵的形成。然而，還可以有意地將其它氨基酸序列位置突變成半胱氨酸，以便引入新的反應(yīng)性基團(tuán)，例如用于綴合至其它化合物，例如聚乙二醇(PEG)、羥乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白質(zhì)或者用于形成非天然的二硫鍵。將半胱氨酸殘基引入人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白的氨基酸序列的這種突變的示例性可能包括，在對(duì)應(yīng)于hNGAL野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的序列位置中的至少一個(gè)處引入半胱氨酸(Cys)殘基。產(chǎn)生的位于氨基酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143,146和/或158中的任一個(gè)一側(cè)的硫醇部分可以用于對(duì)突變蛋白進(jìn)行PEG化或HES化，例如以便提高相應(yīng)的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白的血清半衰期。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變蛋白包含在對(duì)應(yīng)于人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2線性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置中至少2個(gè)或全部3個(gè)處突變的氨基酸殘基。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該突變蛋白在對(duì)應(yīng)于hNGAL線性多肽序列的序列位置 33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136 和 138的序列位置中的任一個(gè)處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)突變的氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該突變蛋白在hNGAL線性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136 和 138 中的任一個(gè)處包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17個(gè)突變的氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該突變蛋白在人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2線性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136 和 138 中的任一個(gè)處包含18、19或20個(gè)突變的氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該突變蛋白在上文列出的序列位置中的至少任意
10、14、15、20、22、24、26、28、29、30、31、32、33、35或全部45個(gè)處包含突變的氨基酸殘基。本發(fā)明的結(jié)合P淀粉樣肽(例如A ￠40肽或A ￠42肽)的突變蛋白可以相對(duì)示例于圖17的成熟人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2野生型氨基酸序列(Lcn2)包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11或12個(gè)氨基酸替代，所述氨基酸替代包括、但不限于Leu36 — Val或Cys ;Ala40 —Tyr 或 Lys 或 Val ;Ile41 — Thr 或 Ser 或 Leu ;Gln49 — Leu 或 Trp ;Leu70 — Gly ；Arg72—Gly 或 Asp ;Lys73 — Leu 或 Thr 或 Asp ;Asp77 — Asn 或 His 或 Leu ;Trp79 — Lys ；Asn96 — lie 或 Arg ;Tyrl00 — Gln 或 Arg 或 Glu ;Leul03 — Met 或 Arg 或 Gly ;Tyrl06—Tyr 或 Ala 或 Trp ;Lysl25 — Thr 或 Val 或 Glu ;Serl27 — Gly 或 Gln 或 Ala ;Tyrl32—Met或Ser或Thr ;以及Lysl34 — Asn。已發(fā)現(xiàn),這種突變蛋白可以減少體外或體內(nèi)A 3聚集。優(yōu)選的是，本文描述的突變蛋白結(jié)合AP且抑制AP聚集,所述AP優(yōu)選A ￠40,更優(yōu)選在實(shí)施例11所指定的測(cè)定條件下(優(yōu)選地包括突變蛋白AP40的比率為1:10)。本發(fā)明還涉及如上文描述的突變蛋白，當(dāng)與突變蛋白US7比較時(shí)，其具有可比較的生物學(xué)功能?！翱杀容^的生物學(xué)功能”表示，這些突變蛋白能夠結(jié)合和抑制AP， 優(yōu)選AP 40，其中就US7的聚集抑制活性的差異不大于約40%、30%、20%、15%、10%、5%、2，5%、2%或1%，例如在等同于實(shí)施例11中所列出的那些條件或與其相同的條件下(優(yōu)選地，包括突變蛋白AP 40的比率為1:10)。本發(fā)明還涉及本文描述的突變蛋白，其用于治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾茨海默氏病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合P淀粉樣肽(例如A ￠40肽或A ￠42肽)的突變蛋白包含下述氨基酸替代Leu36 — Val ；Ala40 — Tyr ；Ile41 — Thr ；Gln49 — Leu ；Leu70 — Gly ；Lys73 — Leu ；Asp77 — Asn ；Trp79 — Lys ；Asn96 — lie ；Tyrl00 —Gln ；Leul03 — Met ；Lysl25 — Thr ；Serl27 — Gly ；Tyrl32 — Met;以及 Lysl34 —Asn。包含這種氨基酸替代的突變蛋白的實(shí)例為示例于圖17的S1-A4 (SEQ ID NO: 39)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合P淀粉樣肽(例如AP 40肽或AP 42肽)的 突變蛋白包含下述氨基酸替代Leu36 — Val ；Ala40 — Lys ；Ile41 — Ser ；Gln49 —Trp ；Leu70 一 Gly ；Arg72 一 Gly ；Lys73 一 Thr ；Asp77 一 His ；Trp79 一 Lys ；Asn96—Arg ；Tyrl00 — Arg ；Leul03 — Arg ；Tyrl06 — Ala ；Lysl25 — Val ；Serl27 — Gln；Tyrl32 — Ser;以及Lysl34 — Asn。包含這種氨基酸替代的突變蛋白的實(shí)例為示例于圖17 的 US-7 (SEQ ID NO: 41)。本發(fā)明還預(yù)見了突變的成熟hNGAL脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(如保藏于SWISS-PR0T數(shù)據(jù)庫(kù)，登記號(hào)為P80188，優(yōu)選具有SEQ ID NO: 40中所示的氨基酸序列)，其在對(duì)應(yīng)于野生型hNGAL線性多肽序列的位置 36、40、41、49、70、72、73、77、79、96、100、103、106、125、127、132、134的位置處包含一個(gè)或多個(gè)如本文描述的突變氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合P淀粉樣肽(例如AP 40肽或AP 42肽)的突變蛋白包含下述氨基酸替代Leu36 — Cys ；Ala40 — Val ；Ile41 — Leu ；Gln49 —Leu ；Leu70 一 Gly ；Arg72 一 Asp ；Lys73 一 Asp ；Asp77 一 Leu ；Trp79 一 Lys ；Asn96—Arg ；Tyrl00 — Glu ；Leul03 — Gly ；Tyrl06 — Trp ；Lysl25 — Glu ；Serl27 — Ala ；Tyrl32 — Thr;以及Lysl34 — Asn。包含這種氨基酸替代的突變蛋白的實(shí)例為示例于圖17 的 Hl-Gl (SEQ ID NO: 43)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合P淀粉樣肽(例如AP 40肽或AP 42肽)的突變蛋白包含下述氨基酸替代Leu36 — Ala ；Ala40 — Val ；Ile41 — Leu ；Gln49 —Leu ；Leu70 一 Gly ；Arg72 一 Asp ；Lys73 一 Asp ；Asp77 一 Leu ；Trp79 一 Lys ；Asn96—Arg ；Tyrl00 — Glu ；Leul03 — Gly ；Tyrl06 — Trp ；Lysl25 — Glu ；Serl27 — Ala ；Tyr 132 — Thr;以及Lysl34 — Asn。包含這種氨基酸替代的突變蛋白的實(shí)例為示例為SEQID NO: 50 的 HlGA。優(yōu)選的是，本文上文描述的突變蛋白結(jié)合AP且抑制AP聚集，所述AP優(yōu)選AMO，更優(yōu)選在實(shí)施例23所指定的測(cè)定條件下(優(yōu)選地，AMO =HlGA的比率為10:2)。本發(fā)明還涉及如上文描述的突變蛋白，當(dāng)與突變蛋白HlGA比較時(shí)，其具有可比較的生物學(xué)功能?！翱杀容^的生物學(xué)功能”表示，這些突變蛋白能夠結(jié)合和抑制A3， 優(yōu)選AM0，其中就HlGA的聚集抑制活性的差異不大于約40%、30%、20%、15%、10%、5%、2，5%、2%或1%，例如在等同于實(shí)施例23中所列出的那些條件或與其相同的條件下(優(yōu)選地，AP 40 =HlGA的比率為10:2)。本發(fā)明還涉及本文描述的突變蛋白，其用于治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾茨海默氏病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合P淀粉樣肽(例如AP 40肽或AP 42肽)的突變蛋白包含下述氨基酸替代Leu36 — Val ；Ala40 — Val ；Ile41 — Leu ；Gln49 —Leu ；Leu70 一 Gly ；Arg72 一 Asp ；Lys73 一 Asp ；Asp77 一 Leu ；Trp79 一 Lys ；Asn96—Arg ；Tyrl00 — Glu ；Leul03 — Gly ；Tyrl06 — Trp ；Lysl25 — Glu ；Serl27 — Ala ；Tyrl32 — Thr;以及Lysl34 — Asn。包含這種氨基酸替代的突變蛋白的實(shí)例為示例為SEQID NO: 52 的 HlGV0優(yōu)選的是，本文上文描述的突變蛋白在實(shí)施例21所指定的測(cè)定條件下結(jié)合A3 40。本發(fā)明還涉及如上文描述的突變蛋白，當(dāng)與突變蛋白HlGV比較時(shí)，其具有可比較的生物學(xué)功能?！翱杀容^的生物學(xué)功能”表示，這些突變蛋白能夠結(jié)合和抑制AP， 優(yōu)選A 3 40，其中就HlGV的聚集抑制活性的差異不大于約40%、30%、20%、15%、10%、5%、2，5%、2%或 1%，例如在等同于實(shí)施例21中所列出的那些條件或與其相同的條件下。本發(fā)明還涉及本文描述的突變蛋白，其用于治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾茨海默氏病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合額外結(jié)構(gòu)域B或其片段的突變蛋白包含下述氨基酸替代Leu36 — Lys ；Ala40 — His ；Ile41 — Asp ；Gln49 — Arg ；Tyr52 —Gln ；Ser68 一 Asn ；Leu70 一 Arg ；Arg72 一 Val ；Lys73 一 His ；Asp77 一 Asn ；Trp79一 Arg ；Arg81 一 Trp ；Tyrl00 一 Trp ；Tyrl06 一 Trp ；Lysl25 一 Arg ；Serl27 一 Tyr ；Tyrl32 — Leu ；Lysl34 — Glu以及Sei*146 — Asn。包含這種氨基酸替代的突變蛋白的實(shí)例為示例于圖17的N7A (SEQ ID NO: 20)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合額外結(jié)構(gòu)域B或其片段的突變蛋白包含下述氨基酸替代Leu36 — Arg ；Ala40 — Met ；Ile41 — Arg ；Gln49 — Ala ；Tyr52 —Val ；Ser68 — Lys ；Leu70 — Met ；Arg72 — Gln ；Lys73 — Arg ；Asp77 — Lys ；Trp79—Met ；Arg81 — Asn ；Asn96 — Ala ；Tyrl00 — Pro ；Leul03 — Pro ；Tyrl06 — Thr ；Lysl25 — His ；Serl27 — Phe;以及Lysl34 — His。包含這種氨基酸替代的突變蛋白的實(shí)例為示例于圖17的N9B (SEQ ID NO: 24)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合額外結(jié)構(gòu)域B或其片段的突變蛋白包含下述氨基酸替代Leu36 — Ala ；Ala40 — Thr ；Ile41 — Trp ；Gln49 — Tyr ；Tyr52 —Gln ；Ser68 — Asn ；Arg72 — Met ；Lys73 — Ser ；Asp77 — Arg ；Trp79 — Met ；Arg81一 His ；Asn96 一 Ser ；Tyrl00 一 Trp ；Tyrl06 一 Trp ；Lysl25 一 Arg ；Serl27 一 Tyr ；Tyrl32 — Phe;以及Lysl34 — Gly0包含這種氨基酸替代的突變蛋白的實(shí)例為示例于圖17 的 NlOD (SEQ ID NO: 26)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合額外結(jié)構(gòu)域B或其片段的突變蛋白包含下述氨基酸替代Leu36 — Glu ；Ala40 — Ser ；Ile41 — Leu ；Gln49 — Arg ；Leu70 — Arg ；Lys73 一 Ser ；Asp77 一 His ；Trp79 一 Leu ；Asn96 一 Leu ；Tyrl00 一 Lys ；Leul03 一His ；Tyrl06 — Phe ；Lysl25 — Thr ；Serl27 — Ala;以及 Lysl34 — Phe。包含這種氨基酸替代的突變蛋白的實(shí)例為示例于圖17的N7E (SEQ ID NO: 22)。參考圖17描述的上述突變蛋白可以包括其它氨基酸替代。該突變蛋白可以進(jìn)一步包括下述氨基酸替代所述氨基酸替代可以包括、但不限于Gln28 — His或Cys87 —Ser。其它可能的氨基酸替代包括、但不限于Tyr52 — Gln或Val ;Ser68 — Lys或Asn ;或 Arg81 — Trp 或 Asn 或 His0本發(fā)明的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白能夠以可檢測(cè)的親和力、即以至少200 nM的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合期望的非天然靶標(biāo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該突變蛋白以I剛或更低、100剛或更低、I剛或更低、500 nM、200 nM或更低、100 nM或更低、50 nM或更低、10 nM或更低、或者I nM或更低的KD結(jié)合給定非天然靶標(biāo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白以對(duì)于給定靶標(biāo)的至少100、20、1 nM或甚至更低的解離常數(shù)結(jié)合期望的靶標(biāo)?？梢酝ㄟ^多種方法測(cè)量突變蛋白與期望靶標(biāo)的結(jié)合親和力，所述方法例如熒光滴定法、競(jìng)爭(zhēng)ELISA或表面等離子共振(BIAcore)。 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，與靶標(biāo)形成復(fù)合體取決于多種因素，例如結(jié)合 配偶體的濃度、競(jìng)爭(zhēng)劑的存在、緩沖體系的離子強(qiáng)度等。選擇和富集通常在允許分離脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的條件下進(jìn)行，所述脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白在與期望靶標(biāo)復(fù)合時(shí)具有如上文所述的解離常數(shù)。然而，可以在多種嚴(yán)格程度下進(jìn)行洗滌和洗脫步驟。例如，可以在這樣 的條件下進(jìn)行選擇所述條件有利于與靶標(biāo)顯示緩慢解離(或換言之，低Ktjff速率)的突變蛋白與靶標(biāo)形成復(fù)合體。或者，可以在這樣的條件下進(jìn)行選擇所述條件有利于快速(或換言之，高Km速率)形成突變蛋白與靶標(biāo)的復(fù)合體。本發(fā)明的突變蛋白通常作為單體蛋白存在。然而，本發(fā)明的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白還可能能夠自發(fā)地二聚化或寡聚化。盡管對(duì)一些應(yīng)用而言可能優(yōu)選使用形成穩(wěn)定單體的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(例如由于更快的擴(kuò)散和更好的組織透過性)，但在其它情況下使用形成穩(wěn)定的同型二聚體或多聚體的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可能是有利的，因?yàn)檫@種多聚體可以提供對(duì)給定靶標(biāo)(進(jìn)一步)提高的親和力和/或親合力。此外，寡聚體形式的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可具有更慢的解離速率或延長(zhǎng)的血清半衰期。還應(yīng)注意，各個(gè)突變蛋白及其配體之間的復(fù)合物形成受多種因素影響，例如各自的結(jié)合配偶體的濃度、競(jìng)爭(zhēng)劑的存在、PH和使用的緩沖體系的離子強(qiáng)度以及用于測(cè)定解離常數(shù)Kd的實(shí)驗(yàn)方法(例如例如熒光滴定法、競(jìng)爭(zhēng)ELISA或表面等離子共振等)或甚至用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)算法。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員也十分清楚，該Kd值(各個(gè)突變蛋白與其配體形成的復(fù)合體的解離常數(shù))可在一定實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)變化，這取決于用于測(cè)定特定脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白對(duì)給定配體的親和力的方法和實(shí)驗(yàn)設(shè)置。這意味著，取決于例如是通過表面等離振子共振(Biacore)還是通過競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定Kd值，所測(cè)得的Kd值可能稍有變化或者是可接受的范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的突變蛋白在N或C端連接親和標(biāo)簽，例如五組氨酸標(biāo)簽、六組氨酸標(biāo)簽或Strep-標(biāo)簽' 因而，本申請(qǐng)包括帶有這種標(biāo)簽的所有明確和大致描述的突變蛋白。本發(fā)明結(jié)合特征脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白片段使用的術(shù)語“片段”涉及源自全長(zhǎng)成熟Lcn2的蛋白或肽，其在N端和/或C端截短，即缺少至少一個(gè)N端和/或C端氨基酸。這種片段包括成熟Lcn2 —級(jí)序列的優(yōu)選至少10個(gè)、更優(yōu)選20個(gè)、最優(yōu)選30個(gè)或更多的連續(xù)氨基酸，并且通?？稍诔墒霯cn2的免疫測(cè)定中檢測(cè)到。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包括在其免疫原性方面發(fā)生了改變的上述突變蛋白。細(xì)胞毒性T細(xì)胞識(shí)別與I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子結(jié)合的抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞表面上的肽抗原。肽與MHC分子結(jié)合的能力是等位基因特異性的，并與其免疫原性相關(guān)。為了降低給定蛋白質(zhì)的免疫原性，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)中哪些肽具有與給定MHC分子結(jié)合的能力十分有價(jià)值。先前已經(jīng)描述了利用計(jì)算機(jī)線程法(computational threadingapproach)鑒定潛在T細(xì)胞表位來預(yù)測(cè)給定肽序列與I類MHC分子的結(jié)合的方法(Altuvia等人(1995) J. Mol. Biol. 249: 244-250)。這樣的方法還可以用于鑒定本發(fā)明突變蛋白中的潛在T細(xì)胞表位，并用于根據(jù)其預(yù)期用途而基于其預(yù)測(cè)免疫原性選擇特定的突變蛋白。它還可以對(duì)預(yù)測(cè)含有T細(xì)胞表位的肽區(qū)域進(jìn)行額外的突變，以減少或消除這些T細(xì)胞表位，因而使免疫原性最小化。從遺傳改造的抗體中除去兩性表位已有描述(Mateo等人(2000) Hybridoma 19 (6) :463-471),并可 以適用于本發(fā)明的突變蛋白。這樣獲得的突變蛋白可以具有最小化的免疫原性，這在其治療和診斷應(yīng)用中是期望的，如下文所述。對(duì)于一些應(yīng)用，使用綴合形式的本發(fā)明的突變蛋白也是有用的。相應(yīng)地，本發(fā)明還涉及與這樣的化合物綴合的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白所述化合物包括、但不限于有機(jī)分子、酶標(biāo)記、有色標(biāo)記、細(xì)胞抑制劑、毒素、可以被光活化且適用于光動(dòng)力治療的標(biāo)記、熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、生色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、金屬?gòu)?fù)合物、金屬例如膠體金、半抗原、洋地黃毒苷、生物素、化療金屬等等。突變蛋白還可以綴合至有機(jī)藥物分子?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)偶聯(lián)方法進(jìn)行綴合。通常，可以以任何合適的化學(xué)物質(zhì)或酶來標(biāo)記Lcn2突變蛋白，所述化學(xué)物質(zhì)或酶在化學(xué)、物理、光學(xué)或酶促反應(yīng)中直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)的化合物或信號(hào)。物理反應(yīng)并且同時(shí)是光學(xué)反應(yīng)/標(biāo)記物的實(shí)例是在照射后發(fā)出熒光。堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或
半乳糖苷酶是催化形成生色反應(yīng)產(chǎn)物的酶標(biāo)記(也是光學(xué)標(biāo)記)的實(shí)例。通常，常用于抗體的所有標(biāo)記(除了僅用于免疫球蛋白Fe部分的糖部分的那些標(biāo)記以外)也均可用于與本發(fā)明突變蛋白綴合。本發(fā)明的突變蛋白還可以綴合任何合適的治療活性劑，例如用于將這樣的活性劑靶向遞送至給定細(xì)胞、組織或器官或者用于選擇性靶向細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)而不影響周圍的正常細(xì)胞。這些治療活性劑的實(shí)例包括放射性核素、毒素、小有機(jī)分子和治療肽(例如作為細(xì)胞表面受體激動(dòng)劑/拮抗劑的肽或者競(jìng)爭(zhēng)給定細(xì)胞靶標(biāo)上蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的肽)。合適的毒素的實(shí)例包括、但不限于百日咳毒素、白喉毒素、蓖麻毒素、肥皂草素、綠膿桿菌外毒素、加里剎毒素或其衍生物、紫杉烷、類美坦素、tubulysin或dolastatin類似物。該 dolastatin 類似物可以是 auristatin E、單甲基 auristatin E、auristatin PYE 和auristatin PHE。細(xì)胞抑制劑的實(shí)例包括、但不限于順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、5-氟尿嘧啶、泰索帝(多西他賽)、紫杉醇、蒽環(huán)霉素(多柔比星)、甲氨蝶呤、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞賓、達(dá)卡巴嗪、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、阿霉素、喜樹堿、Combretatastin A_4相關(guān)化合物、磺胺、n惡唑啉、苯并[b]噻吩合成螺縮酮批喃、單四氫呋喃化合物、curacin和curacin衍生物、甲氧基雌二醇衍生物和甲酰四氫葉酸。本發(fā)明的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白還可綴合治療活性核酸，如反義核酸分子、小干擾RNA、小RNA或核酶。這種綴合物可通過本領(lǐng)域熟知的方法產(chǎn)生。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變蛋白還可以與靶向特定機(jī)體部位的靶向部分偶聯(lián)，以便將本發(fā)明突變蛋白遞送至體內(nèi)期望的部位或區(qū)域?？蔀槔硐氲倪@種修飾的一個(gè)實(shí)例是穿過血腦屏障。為了穿過血腦屏障，本發(fā)明的突變蛋白可以與有利于主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過該屏障的部分偶聯(lián)(參見 Gaillard PJ 等人(2005). International Congress Series.1277，185-198 或 Gaillard PJ 等人(2005) Expert Opin Drug Deliv. 2(2)，299-309)。這樣的化合物例如以商品名2B_Trans (BBB technologies BV, Leiden, NL)購(gòu)得。本發(fā)明的突變蛋白可以偶聯(lián)的其它示例性靶向分子包括與期望的靶標(biāo)分子具有親和力的抗體、抗體片段或脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。靶向部分的靶標(biāo)分子可以例如為細(xì)胞表面抗原。細(xì)胞表面抗原可以對(duì)于細(xì)胞或組織類型(例如癌癥細(xì)胞)特異性的。這種細(xì)胞表面蛋白的示例性實(shí)例為HER-2或蛋白多糖例如NEU-2。如上文所述，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可以與延長(zhǎng)該突變蛋白的血清半衰期的化合物綴合(在這方面也參見PCT公開WO 2006/56464，其中參考對(duì)CTLA-4具有結(jié)合親和力的人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的突變蛋白描述了這種綴合策略)。延長(zhǎng)血清半衰期的化合物可以是聚亞烷基二醇分子，例如聚乙二醇(PEG)或其活化衍生物；輕乙基淀粉；脂肪酸分子，例如棕櫚酸(Vajo & Duckworth 2000, Pharmacol. Rev. 52，1-9)、免疫球蛋白的Fe部分、免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合肽或白蛋白結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等等。白蛋白結(jié)合蛋白可以是細(xì)菌白蛋白結(jié)合蛋白、抗體、抗體片段，包括結(jié)構(gòu)域抗體(參見例如美國(guó)專利6，696, 245)或者對(duì)白蛋白具有結(jié)合未和力的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。相應(yīng)地，用于延長(zhǎng)本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白半衰期的合適的綴合化合物包括白蛋白(Osborn等人(2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548)或者白蛋白結(jié)合蛋白，例如細(xì)菌白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如鏈球菌G蛋白中的一種(K5nig，T.和Skerra，A. (1998) J.Immunol. Methods 218，73-83)?？梢杂米骶Y合配偶體的白蛋白結(jié)合肽的其他實(shí)例例如具有 Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys 共有序列的那些，其中 Xaa1 是 Asp、Asn、Ser> Thr 或 Trp ；Xaa2 是 Asn、Gin、His、lie、Leu 或 Lys ；Xaa3 是 Ala、Asp、Phe、Trp 或 Tyr ；Xaa4 是 Asp、Gly、Leu、Phe、Ser 或 Thr，如美國(guó)專利申請(qǐng) 2003/0069395 或 Dennis 等人(Dennis 等人(2002)J. Biol. Chem. 277、35035_35043)所述。在其他實(shí)施方案中，白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段可以用作本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的化合物，以延長(zhǎng)該突變蛋白的血清半衰期。術(shù)語“白蛋白”包括所有哺乳動(dòng)物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。白蛋白或其片段可以如美國(guó)專利5，728，553或歐洲專利申請(qǐng)EP 0 330 451和EP 0 361 991所述重組產(chǎn)生。用作蛋白穩(wěn)定劑的重組人白蛋白(Recombumin )例如可從Novozymes Delta Ltd. (Nottingham,UK)得到。如果所述白蛋白結(jié)合蛋白是抗體片段，則它可以是結(jié)構(gòu)域抗體。結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)被改造為允許精確控制生理特性和體內(nèi)半衰期，以產(chǎn)生最佳的安全性和效力產(chǎn)品特性。結(jié)構(gòu)域抗體例如可從Domantis Ltd. (Cambridge, UK and MA, USA)商購(gòu)得到。如果使用轉(zhuǎn)鐵蛋白作為延長(zhǎng)本發(fā)明突變蛋白的血清半衰期的部分，該突變蛋白可以基因操作方式融合至非糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白的N端或C端，或者這兩個(gè)末端。非糖基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白具有14-17天的半衰期，轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白將相似地具有延長(zhǎng)的半衰期。轉(zhuǎn)鐵蛋白載體還提供高生物利用率、生物分布和循環(huán)穩(wěn)定性。該技術(shù)可從BioRexis (BioRexisPharmaceutical Corporation, PA, USA)商購(gòu)獲得。用作蛋白穩(wěn)定劑的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(DeltaFerrin )也可從 Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK)商購(gòu)獲得。如果使用免疫球蛋白的Fe部分來延長(zhǎng)本發(fā)明突變蛋白的血清半衰期，則可以使用可從 Syntonix Pharmaceuticals, Inc (MA, USA)商購(gòu)獲得的 SynFusion 技術(shù)。使用該Fe融合技術(shù)允許產(chǎn)生作用更長(zhǎng)的生物藥物，并可以例如由與抗體的Fe區(qū)連接的兩個(gè)拷貝的突變蛋白組成，以改進(jìn)藥代動(dòng)力學(xué)、溶解度和產(chǎn)生效率。延長(zhǎng)本發(fā)明突變蛋白的半衰期的另一個(gè)替代方案是將本發(fā)明突變蛋白的N端或C端融合到富含甘氨酸的長(zhǎng)的非結(jié)構(gòu)化的柔性序列(例如具有約20至80個(gè)連續(xù)甘氨酸殘基的聚甘氨酸)。公開于例如W02007/038619的這種方法也稱為“rPEG”( 重組PEG)。如果將聚亞烷基二醇用作延長(zhǎng)突變蛋白的半衰期的化合物，則該聚亞烷基二醇可以是被取代的或未取代的。其還可以是活化的聚亞烷基衍生物。合適的化合物的實(shí)例為聚乙二醇(PEG)分子，如WO 99/64016、美國(guó)專利6，177，074或美國(guó)專利6，403，564中關(guān)于干擾素所描述的，或者如針對(duì)其它蛋白質(zhì)所描述的，所述其它蛋白質(zhì)例如PEG修飾的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脫氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶(參見例如Fuertges等人(1990)The Clinical Efficacy of Poly (Ethylene Glycol)-Modified Proteins J. Control.Release 11，139-148)。這樣的聚合物(優(yōu)選聚乙二醇)的分子量可以為約300至約70. 000道爾頓的范圍,包括例如分子量為約10. 000、約20. 000、約30. 000或約40. 000道爾頓的聚乙二醇。此外，例如如美國(guó)專利6，500, 930或6，620, 413中所述，可將碳水化合物的寡聚物和多聚體(如淀粉或羥乙基淀粉(HES))綴合至本發(fā)明的突變蛋白，以用于延長(zhǎng)血清半衰期的目的。在另一實(shí)施方案中，為了提供用于將上文化合物中的一種綴合至本發(fā)明突變蛋白的合適的氨基酸側(cè)鏈，可以通過突變引入人工氨基酸。通常，這種人工氨基酸設(shè)計(jì)成更具反應(yīng)性，因而有利于綴合至期望部分。這種可以經(jīng)由人工tRNA引入的人工氨基酸的一個(gè)實(shí)例是對(duì)乙?；奖彼?。對(duì)于本文公開的突變蛋白的若干應(yīng)用而言，以融合蛋白的形式使用它們可能是有利的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變蛋白在其N端和/或其C端融合至蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或肽(如信號(hào)序列和/或親和標(biāo)簽)。對(duì)于藥物應(yīng)用而言，本發(fā)明的突變蛋白可以融合至延長(zhǎng)該突變蛋白體內(nèi)血清半衰期的融合配偶體(也參見PCT公開WO 2006/56464，其中參考對(duì)CTLA-4具有結(jié)合親和力的人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的突變蛋白描述了合適的融合配偶體)。類似于上文所述的綴合化合物，融合配偶體可以是免疫球蛋白的Fe部分、免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域、白蛋白、白蛋白結(jié)合肽或白蛋白結(jié)合蛋白等等。再次，白蛋白結(jié)合蛋白可以是細(xì)菌白蛋白結(jié)合蛋白或者對(duì)白蛋白具有結(jié)合活性的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。相應(yīng)地，用于延長(zhǎng)本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的半衰期的合適的融合配偶體包括白蛋白(Osborn, B. L.等人(2002)同上 J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548)或白蛋白結(jié)合蛋白，例如細(xì)菌白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如鏈球菌G蛋白中的一種(K5nig, T.和Skerra,
A.(1998)同上 J. Immunol. Methods 218，73-83)。Dennis 等人，同上(2002)或美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0069395中描述的具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的白蛋白結(jié)合肽也可以用作融合配偶體，其中Xaa1是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp -,Iaa2是Asn、Gin、His、lie、Leu 或 Lys ；Xaa3 是 Ala、Asp、Phe、Trp 或 Tyr ；Xaa4 是 Asp、Gly、Leu、Phe、Ser 或 Thr。還可以使用白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段作為本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的融合配偶體。術(shù)語“白蛋白”包括所有的哺乳動(dòng)物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。重組產(chǎn)生白蛋白或其片段是本領(lǐng)域熟知的，并例如描述于美國(guó)專利5，728，553、歐洲專利申請(qǐng) EP O 330 451 或 EP 0 361 991。融合配偶體可以賦予本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白新的特征，例如酶活性或?qū)ζ渌肿拥慕Y(jié)合親和力。合適的融合蛋白的實(shí)例為堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、G蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、A蛋白、抗體片段、寡聚化結(jié)構(gòu)域、具有相同或不同結(jié)合特異性的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白(導(dǎo)致形成“雙運(yùn)載蛋白”，參見Schlehuber, S.和Skerra, A. (2001), Duocalins, engineered ligand-binding proteins with dualspecificity derived from the lipocalin fold. Biol. Chem. 382, 1335-1342)或毒素。特別地，可以將本發(fā)明的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白與獨(dú)立的酶活性位點(diǎn)融合，使得 得到的融合蛋白的兩個(gè)“組分” 一起作用于給定治療靶標(biāo)。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域附著至致病靶標(biāo)，從而允許酶結(jié)構(gòu)域消除該靶標(biāo)的生物學(xué)功能。親和標(biāo)簽例如Strep-tag 或 Strep-tag II (Schmidt, T. G. M.等人(1996) J.Mol. Biol. 255，753_766)、myc-標(biāo)簽、FLAG-標(biāo)簽、His6_標(biāo)簽或HA-標(biāo)簽，或者例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)也允許對(duì)重組蛋白容易地進(jìn)行檢測(cè)和/或純化，是優(yōu)選融合配偶體的其它實(shí)例。最后，具有生色或熒光特性的蛋白質(zhì)如綠色熒光蛋白(GFP)或黃色熒光蛋白(YFP)也是用于本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的合適的融合配偶體。本文使用的術(shù)語“融合蛋白”還包括含有信號(hào)序列的根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。多肽N端的信號(hào)序列將該多肽引導(dǎo)至特定的細(xì)胞區(qū)室，例如大腸桿菌的外周胞質(zhì)或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。大量的信號(hào)序列是本領(lǐng)域已知的。用于將多肽分泌進(jìn)入大腸桿菌外周胞質(zhì)的優(yōu)選信號(hào)序列是OmpA-信號(hào)序列。本發(fā)明還涉及包含編碼本文所述突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子(DNA和RNA)。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性允許某些密碼子替換成指定相同氨基酸的其它密碼子，因此本發(fā)明不限于編碼本發(fā)明突變蛋白的特定核酸分子，而是包括包含編碼功能性突變蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。因此，本發(fā)明還包括編碼根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白的核酸序列，其包括至少在Lcn2線性多肽序列的氨基酸序列位置96、100和106中任一個(gè)的一個(gè)密碼子處的突變。如本文公開的本發(fā)明還包括編碼Lcn2突變蛋白的核酸分子，其包含在實(shí)驗(yàn)突變所指出序列位置之外的其它突變。這種突變經(jīng)常是可以容忍的，或甚至可以證明是有利的，例如如果它們有助于提高該突變蛋白的折疊效率、血清穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性或配體結(jié)合親和力的話。本申請(qǐng)中公開的核酸分子可以“可操作地連接”至調(diào)節(jié)序列，從而能夠表達(dá)該核酸分子。如果核酸分子(如DNA)包含含有關(guān)于轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)的信息的序列元件，并且這種序列“可操作地連接”至編碼多肽的核苷酸序列，則稱其“能夠表達(dá)核酸分子”或能“允許表達(dá)核苷酸序列”?？刹僮鞯倪B接是這樣的連接其中調(diào)節(jié)序列元件與待表達(dá)序列以使得基因能夠表達(dá)的方式相連。基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)區(qū)的確切性質(zhì)在物種之間可能不同，但通常，這些區(qū)域包含啟動(dòng)子，其在原核生物中包含啟動(dòng)子本身(即指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始的DNA元件)以及在轉(zhuǎn)錄成RNA時(shí)將發(fā)出翻譯起始信號(hào)的DNA元件。這種啟動(dòng)子區(qū)通常包括參與轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5’非編碼序列(如-35/-10盒)，以及原核生物中的Shine-Dalgarno元件或真核生物中的TATA盒、CAAT序列和5’加帽元件。這些區(qū)域還可以包括增強(qiáng)子或阻抑基因元件以及用于將天然多肽靶向至宿主細(xì)胞特定區(qū)室的翻譯的信號(hào)和前導(dǎo)序列。此外，3’非編碼序列可以含有參與轉(zhuǎn)錄終止、多腺苷酸化等的調(diào)節(jié)元件。然而，如果這些終止序列在特定宿主細(xì)胞中的功能不令人滿意，則可以將它們替換成在該細(xì)胞中有功能的信號(hào)。因此，本發(fā)明的核酸分子可以包含調(diào)節(jié)序列，優(yōu)選啟動(dòng)子序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含啟動(dòng)子序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。合適的原核啟動(dòng)子為例如tet啟動(dòng)子、lacUV5啟動(dòng)子或17啟動(dòng)子。可用于在真核細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的實(shí)例為SV40啟動(dòng)子或CMV啟動(dòng)子。 本發(fā)明的核酸分子還可以是載體或其他類型克隆運(yùn)載體(如質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、桿狀病毒、粘?；蛉斯と旧w)的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子包含在質(zhì)粒中。質(zhì)粒載體指編碼融合至目的cDNA的溫和噬菌體(如M13或fl)基因間區(qū)域或其功能部分的載體。用這樣的噬菌粒和合適的輔助噬菌體(如M13K07、VCS-M13或R408)超感染細(xì)菌宿主細(xì)胞后，產(chǎn)生完整的噬菌體顆粒，從而使得可以將編碼的異源cDNA物理偶聯(lián)至在噬菌體表面上展示的其相應(yīng)多肽(綜述于例如 Kay, B. K.等人(1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A LaboratoryManual,第一版,Academic Press, New York NY ；Lowman, H. B. (1997) Annu. Rev.Biophys. Biomol. Struct. 26, 401 - 424,或Rodi, D. J 和Makowski, L. (1999) Curr.Opin. Biotechnol. 10, 87 - 93)。除了上文描述的調(diào)節(jié)序列和編碼本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的核酸序列以外，這種克隆載體可以包括源自與用于表達(dá)的宿主細(xì)胞相容的物種的復(fù)制和控制序列，以及賦予轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞可選擇表型的選擇標(biāo)記物。大量合適的克隆載體是本領(lǐng)域已知的，并可商購(gòu)得到。編碼本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的DNA分子，特別是含有這種脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的編碼序列的克隆載體，可以轉(zhuǎn)化進(jìn)能夠表達(dá)該基因的宿主細(xì)胞中?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook, J.等人(1989)，同上)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因此，本發(fā)明還涉及含有本文公開的核酸分子的宿主細(xì)胞。在適于表達(dá)編碼本發(fā)明融合蛋白的核苷酸序列的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌(E. coli)或枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),或者是真核細(xì)胞,例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) > SF9或High5昆蟲細(xì)胞、永生化哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(例如HeLa細(xì)胞或CHO細(xì)胞)或原代哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的突變蛋白的方法，其中通過遺傳工程方法，從編碼該突變蛋白的核酸開始產(chǎn)生該突變蛋白、該突變蛋白的片段或該突變蛋白與另一個(gè)多肽的融合蛋白。該方法可以在體內(nèi)進(jìn)行，突變蛋白可以在例如細(xì)菌或真核宿主生物體中產(chǎn)生，然后從該宿主生物體或其培養(yǎng)物中分離。還可以在體外產(chǎn)生蛋白質(zhì)，例如使用體外翻譯系統(tǒng)。在體內(nèi)產(chǎn)生突變蛋白時(shí)，通過重組DNA技術(shù)(上文已概述)將編碼本發(fā)明突變蛋白的核酸引入合適的細(xì)菌或真核宿主生物體中。為此，首先使用成熟的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook,J.等人(1989)，同上)用克隆載體轉(zhuǎn)化該宿主細(xì)胞，所述克隆載體包含編碼本發(fā)明突變蛋白的核酸分子。然后在允許表達(dá)該異源DNA并因而允許合成相應(yīng)多肽的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。之后，從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收該多肽。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生本發(fā)明的突變蛋白的方法，該方法包括(a)使編碼人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的核酸分子發(fā)生突變，所述突變發(fā)生在編碼對(duì)應(yīng)于Lcn2線性多肽序列的序列位置96、100和106的任何序列位置中的至少一個(gè)的核苷酸三聯(lián)體處，從而得到一種或多種突變蛋白核酸分子。 該方法可以進(jìn)一步包括(b)在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)在(a)中獲得的一種或多種突變蛋白核酸分子，以及(C)通過選擇和/或分離富集對(duì)給定靶標(biāo)具有可檢測(cè)的結(jié)合親和力的一種或多種突變蛋白。本文使用的術(shù)語“突變”表示，選擇該實(shí)驗(yàn)條件，使得Lcn2 (hNGAL ；Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)目錄P80188)給定序列位置處的天然存在的氨基酸可以被替換為在相應(yīng)天然多肽序列的此特定位置處不存在的至少一個(gè)氨基酸。術(shù)語“突變”還包括通過缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行的序列區(qū)段長(zhǎng)度的(其它)修飾。因而，下述情況在本發(fā)明的范圍內(nèi)例如，所選序列位置處的一個(gè)氨基酸被替代為3個(gè)隨機(jī)突變的區(qū)段，從而相比于野生型蛋白的相應(yīng)區(qū)段的長(zhǎng)度插入兩個(gè)氨基酸殘基。這種插入或缺失可以彼此獨(dú)立地弓I入到可以進(jìn)行本發(fā)明的突變的肽區(qū)段中的任一個(gè)。在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，若干突變的插入可以引入到所選脂質(zhì)運(yùn)載蛋白支架的環(huán)AB中(參見國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2005/019256，其通過引用以其全文并入本文)。術(shù)語“隨機(jī)突變”表示，在某些序列位置處不存在預(yù)先確定的單個(gè)氨基酸(突變)，但是在突變期間，至少兩個(gè)氨基酸可以以一定可能性被摻入于預(yù)定序列位置處。將人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的編碼序列用作進(jìn)行本發(fā)明中選擇的肽區(qū)段的突變的起點(diǎn)。為了進(jìn)行所述氨基酸位置的突變，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇各種已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行定點(diǎn)突變(Sambrook，J.等人(1989)，上文)。通常使用的技術(shù)為使用合成的寡核苷酸的混合物，通過PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))引入突變，所述合成的寡核苷酸具有期望序列位置處的簡(jiǎn)并堿基組成。例如，使用密碼子NNK或NNS (其中N =腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶；K =嘌呤或胸腺嘧啶；S =腺嘌呤或胞嘧啶)允許在突變期間摻入全部20個(gè)氨基酸以及琥珀終止密碼子，而密碼子VVS將可以摻入的氨基酸的數(shù)量限制于12個(gè)，這是因?yàn)槠渑懦税被酑ys、lie、Leu、Met、Phe、Trp> Tyr> Val被摻入多肽序列的所選擇的位置；例如，使用密碼子匪S (其中M =腺嘌呤或胞嘧啶)，將所選擇的序列位置處可能的氨基酸的數(shù)量限制于11個(gè)，這是因?yàn)槠渑懦税被酇rg、Cys、Gly、lie、Leu、Met、Phe、Trp、Val被摻入所選擇的序列位置處。在這方面應(yīng)注意，其它氨基酸(除了規(guī)則的20個(gè)天然存在的氨基酸，例如硒半胱氨酸或吡咯賴氨酸)的密碼子可以摻入到突變蛋白的核酸中。還可以的是，如 Wang, L.，等人(2001) Science 292，498-500 或 Wang, L.，和 Schultz, P. G.(2002) Chem. Comm. I, 1_11描述的，使用通常被識(shí)別為終止密碼子的“人工”密碼子，例如UAG，以插入其它不常見的氨基酸，例如鄰甲基-L-酪氨酸或?qū)Π被奖彼帷Ｊ褂脡A基對(duì)特異性降低的核苷酸構(gòu)件，例如肌苷、8-氧-2’脫氧鳥苷或6(2-脫氧-B-D-呋喃核糖苷)_3，4- 二氫-8H-嘧啶并-I, 2-噁嗪~7~酮(Zaccolo等人(1996) J.
Mol. Biol. 255，589-603)，是用于將突變引入到所選序列區(qū)段的其它選擇。其它可能是所謂的三聯(lián)體突變。此方法使用不同核苷酸三聯(lián)體的混合物，其中每一個(gè)均編碼一個(gè)氨基酸，以摻入到編碼序列中(Virnekjis B, Ge L, Pliickthun A,Schneider KC, Wellnhofer G, Moroney SE. 1994 Trinucleotide phosphoramidites:ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for randommutagenesis. Nucleic Acids Res 22, 5600-5607)。一種用于在相應(yīng)多肽的所選擇的區(qū)域中引入突變的可行策略基于使用四種寡核苷酸，其中每一個(gè)均部分源自要突變的相應(yīng)的序列區(qū)段中的一個(gè)。當(dāng)合成這些寡核苷酸時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用核酸構(gòu)件的混合物，以合成那些對(duì)應(yīng)于要突變的氨基酸位置的核苷酸三聯(lián)體，以使得編碼全部天然氨基酸的密碼子隨機(jī)出現(xiàn)，這樣最后得以產(chǎn)生脂質(zhì)運(yùn)載蛋白肽文庫(kù)。例如，第一個(gè)寡核苷酸在其序列中——除了突變位置——對(duì)應(yīng)于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白多肽最N端位置處要突變的肽區(qū)段的編碼鏈。相應(yīng)地，第二個(gè)寡核苷酸對(duì)應(yīng)于該多肽序列后的第二個(gè)序列區(qū)段的非編碼鏈。第三個(gè)寡核苷酸依次對(duì)應(yīng)于相應(yīng)的第三個(gè)序列區(qū)段的編碼鏈。最后，第四個(gè)寡核苷酸對(duì)應(yīng)于第四個(gè)序列區(qū)段的非編碼鏈?？梢杂孟鄳?yīng)的第一個(gè)和第二個(gè)寡核苷酸進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，如果需要，可以單獨(dú)用相應(yīng)的第三個(gè)和第四個(gè)寡核苷酸進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?？梢酝ㄟ^多種已知方法將這兩個(gè)反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物組合成包含從第一個(gè)至第四個(gè)序列區(qū)段的序列的單個(gè)核酸，其中已在選定的位置處引入突變。為此，可以使用側(cè)翼寡核苷酸以及一種或多種中介體核酸分子(其貢獻(xiàn)第二個(gè)與第三個(gè)序列區(qū)段之間的序列)將兩種產(chǎn)物例如進(jìn)行新的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在選擇寡核苷酸序列中用于突變的數(shù)目和排列時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其需要有多種備選方案?？梢酝ㄟ^連接將上文限定的核酸分子與缺少的編碼脂質(zhì)運(yùn)載蛋白多肽的核酸的5’及3’序列和/或載體連接在一起，并可以克隆到已知的宿主生物體中。多種已建立的方法可用于連接和克隆(Sambrook，J.等人(1989)，同上)。例如，可以將也存在于克隆載體中的限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列改造到所述合成寡核苷酸的序列中。因而，在擴(kuò)增各PCR產(chǎn)物和酶切割之后，所得的片段可以容易地使用相應(yīng)的識(shí)別序列進(jìn)行克隆。也可以經(jīng)由已知方法將編碼選擇用于突變的蛋白質(zhì)的基因內(nèi)更長(zhǎng)的序列區(qū)段進(jìn)行隨機(jī)突變，例如通過在提高錯(cuò)誤率的條件下使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、通過化學(xué)突變或通過使用細(xì)菌增變菌株。這些方法還可以用于進(jìn)一步優(yōu)化脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的靶標(biāo)親和力或特異性。實(shí)驗(yàn)突變區(qū)段以外可能發(fā)生的突變通常是接受的，或者甚至可以證明是有利的，例如如果它們有助于改善脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的折疊效率或折疊穩(wěn)定性的話。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述方法包括使編碼人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2蛋白的核酸分子發(fā)生突變，所述突變至少發(fā)生在編碼人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的上文所述的序列位置中的任一個(gè)的2或3個(gè)核苷酸三聯(lián)體處。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使核酸分子發(fā)生突變，所述突變發(fā)生在編碼對(duì)應(yīng)于hNGAL線性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、
52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138的任何序列位置中的至少一個(gè)核苷酸三聯(lián)體處。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括使核酸分子發(fā)生突變，所述突變發(fā)生在編碼對(duì)應(yīng)于人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2線性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136 和 138 的序列位置中的至少任意 2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個(gè)的核苷酸三聯(lián)體處。根據(jù)本發(fā)明的方法，從編碼hNGAL的核酸開始獲得了突變蛋白。這種核酸進(jìn)行突變并且通過重組DNA技術(shù)被引入到合適的細(xì)菌或真核宿主生物體中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知 的任何合適的技術(shù)獲得人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的核酸文庫(kù)以用于產(chǎn)生具有類似抗體的特性的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，即與給定靶標(biāo)具有親和力的突變蛋白。這種組合方法的實(shí)例更詳細(xì)地描述于例如國(guó)際專利申請(qǐng) WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029471、WO 03/029462、W003/029463, WO 2005/019254、WO 2005/019255、WO 2005/019256 或 WO 2006/56464。這些專利申請(qǐng)中每一件的內(nèi)容都通過引用以其全文并入本文。在進(jìn)行了突變的核酸序列在適合的宿主中表達(dá)之后，可以從獲得的文庫(kù)中選擇結(jié)合給定靶標(biāo)的克隆，所述克隆攜帶該多種各脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的遺傳信息?？梢岳檬熘夹g(shù)來選擇這些克隆，例如噬菌體展示(綜述于 Kay，B. K.等人(1996)上文；Lowman，H. B. (1997)上文或 Rodi，D. J ，和Makowski, L. (1999)上文)、菌落篩選(綜述于 Pini, A.等人(2002) Comb. Chem. HighThroughput Screen. 5, 503-510)、核糖體展不(綜述于 Amstutz, P.等人(2001) Curr.Opin. Biotechnol. 12, 400-405)或如 Wilson, D. S.等人(2001) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 98，3750-3755 中報(bào)道的 mRNA 展示或具體描述于 WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO2005/019256 或 WO 2006/56464 中的方法。根據(jù)本公開內(nèi)容，在上述方法的另一實(shí)施方案中，步驟(C)還包括(i)提供選自以下的化合物作為給定靶標(biāo)/配體例如游離或綴合形式的顯示免疫半抗原特征的化合物、肽、蛋白質(zhì)或其他大分子例如多糖、核酸分子(例如DNA或RNA)或完整的病毒顆?；蝾惒《?，(ii)將多種突變蛋白與所述靶標(biāo)/配體接觸，以便允許在所述配體與對(duì)所述靶標(biāo)/配體具有結(jié)合親和力的突變蛋白之間形成復(fù)合體，以及(iii)去除無結(jié)合親和力或無實(shí)質(zhì)結(jié)合親和力的突變蛋白。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，該靶標(biāo)/配體為非天然靶標(biāo)，其包括、但不限于肽、蛋白、蛋白的片段或結(jié)構(gòu)域、或小有機(jī)分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，小有機(jī)分子為顯示免疫半抗原的特征的化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肽為P淀粉樣肽，例如A￠40肽或A￠42肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，給天然靶標(biāo)為纖連蛋白或其結(jié)構(gòu)域，例如EB-結(jié)構(gòu)域或EB-結(jié)構(gòu)域的片段。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(C)中的選擇在競(jìng)爭(zhēng)性條件下進(jìn)行。本文使用的“競(jìng)爭(zhēng)性條件”表示，突變蛋白的選擇包括至少一個(gè)其中將突變蛋白與人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 (靶標(biāo))的給定非天然配體在其他配體存在下進(jìn)行接觸的步驟，該其他配體與突變蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶標(biāo)。這種其他配體可以是靶標(biāo)的生理配體、過量的靶標(biāo)本身或者靶標(biāo)的任何其他生理配體，其至少結(jié)合與本發(fā)明突變蛋白所識(shí)別表位重疊的表位，因而干擾該突變蛋白的靶標(biāo)結(jié)合。或者，該其他配體通過別構(gòu)效應(yīng)將與突變蛋白的結(jié)合位點(diǎn)不同的表位與靶標(biāo)絡(luò)合而競(jìng)爭(zhēng)與突變蛋白的結(jié)合。給出了使用溫和M13噬菌體進(jìn)行的噬菌體展示技術(shù)的實(shí)施方案(綜述于Kay，
B.K.等人(1996)，同上；Lowman, H. B. (1997)同上或者 Rodi, D. J.和 Makowski,L. (1999)，同上)作為可以在本發(fā)明中使用的選擇方法的實(shí)例。可以用于選擇本發(fā)明突變蛋白的曬菌體展示技術(shù)的另一個(gè)實(shí)施方案是如Broders等人(Broders等人(2003)“Hyperphage. Improving antibody presentation in phage display. ” Methods Mol .Biol. 205:295-302)所述的超級(jí)噬菌體(hyperphage)技術(shù)。其他溫和噬菌體(例如fI)或溶菌性噬菌體(例如T7)也可以使用。就示例性選擇方法而言，產(chǎn)生了 M13噬菌粒，其允許將突變的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白核酸序列表達(dá)為在N端與信號(hào)序列(優(yōu)選OmpA信號(hào)序列)融合并在C端與噬菌體M13衣殼蛋白pill或其能摻入噬菌體衣殼的片段融合的融合蛋白。優(yōu)選使用包含野生型序列的氨基酸217至406的噬菌體衣殼蛋白的C端片段ApIII來產(chǎn)生融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，特別優(yōu)選的是其中位置201處的半胱氨酸殘基丟失或被另一個(gè)氨基酸替換的PlII C端片段。相應(yīng)地，本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案包括將編碼多種人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白并由3’末端突變所得的核酸分子與編碼M13家族絲狀噬菌體衣殼蛋白pill或該衣殼蛋白片段的基因可操作地融合，以便選擇至少一種與給定配體結(jié)合的突變蛋白。該融合蛋白可以包含額外的組分，例如允許固定、檢測(cè)和/或純化該融合蛋白或其部分的親和標(biāo)簽。此外，可以將終止密碼子設(shè)置于編碼脂質(zhì)運(yùn)載蛋白或其突變蛋白的序列區(qū)與噬菌體衣殼基因或其片段之間，其中該終止密碼子(優(yōu)選為琥珀型終止密碼子)在適當(dāng)?shù)囊种凭曛羞M(jìn)行翻譯期間至少部分地翻譯成氨基酸。例如，本文描述的質(zhì)粒載體PTLPC27 (現(xiàn)在也稱為pTlc27)，可以用于制備編碼人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白的噬菌粒文庫(kù)。使用兩個(gè)BstXI限制性位點(diǎn)將本發(fā)明編碼hNGAL突變蛋白的核酸分子插入載體中。連接之后，用所得的核酸混合物轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株，例如大腸桿菌XLl-Blue，以獲得大量獨(dú)立的克隆。如果需要，可以產(chǎn)生用于制備超級(jí)噬菌粒文庫(kù)的相應(yīng)載體。接著，使用適當(dāng)?shù)腗13輔助噬菌體或超級(jí)噬菌體，將所得的文庫(kù)在液體培養(yǎng)物中進(jìn)行超感染，以便產(chǎn)生功能性噬菌粒。重組噬菌粒在其表面上以帶有衣殼蛋白PlII或其片段的融合蛋白的形式展示脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，而該融合蛋白的N端信號(hào)序列通常被切掉。另一方面，它還帶有由輔助噬菌體提供的天然衣殼蛋白PlII的一個(gè)或多個(gè)拷貝，因而能感染接受者，所述接受者一般是帶有F或F’質(zhì)粒的細(xì)菌菌株。在超級(jí)噬菌體展示的情況下，超級(jí)噬菌粒在其表面上以帶有感染性衣殼蛋白PlII而不是天然衣殼蛋白的融合蛋白的形式展示脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。在用輔助噬菌體或超級(jí)噬菌體感染期間或感染之后，可以誘導(dǎo)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白與衣殼蛋白PlII之間的融合蛋白的基因表達(dá)，例如通過加入無水四環(huán)素來誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)條件選擇成使得所獲得的噬菌粒的大部分在其表面上展示至少一個(gè)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。在超級(jí)噬菌體展示的情況下，誘導(dǎo)條件產(chǎn)生帶有3至5個(gè)融合蛋白的超級(jí)嗤囷粒群，所述融合蛋白由脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白和衣殼蛋白pill組成。已知多種方法用于分離噬菌粒，例如用聚乙二醇進(jìn)行沉淀。通常在6-8小時(shí)的孵育時(shí)間段后進(jìn)行分離。然后通過與期望的靶標(biāo)一起孵育來對(duì)所分離的噬菌粒進(jìn)行選擇，其中該靶標(biāo)以允許將那些噬菌粒至少暫時(shí)固定的形式存在，所述噬菌粒在其衣殼中帶有具有期望的結(jié)合活性的突變蛋白作為融合蛋白。在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)可以例如與載體蛋白(如血清白蛋白)綴合，并經(jīng)由該載體蛋白與蛋白質(zhì)結(jié)合表面(例如聚苯乙烯)結(jié)合。適用于ELISA技術(shù)的微量滴定板或所謂的“免疫棒”可以優(yōu)選地用于這樣的靶標(biāo)固定。或者，可以使用靶標(biāo)與其他結(jié)合基團(tuán)(例如生物素)的綴合物。接著可將靶標(biāo)固定在選擇性結(jié)合該基團(tuán)的表面上，例如包被有鏈霉親和素、中性親和素(neutravidin)或親和素的微量滴定板或順磁性顆粒。如果靶標(biāo)與免疫球蛋白的Fe部分融合，那么也可以固定在表面上，例如包被有A蛋白或G蛋白的微量滴定板或順磁性顆粒?？梢匀鏓LISA方法中已知的那樣，用封閉溶液飽和表面上存在的非特異性噬菌粒 結(jié)合位點(diǎn)。然后通常在生理緩沖液存在下使噬菌粒與固定在表面上的靶標(biāo)接觸。通過多次洗滌除去未結(jié)合的噬菌粒。然后洗脫表面上剩余的噬菌粒顆粒。對(duì)于洗脫而言，若干方法都是可行的。例如，可以通過加入蛋白酶或者在酸、堿、洗滌劑或離液鹽存在下或在適度變性的條件下洗脫噬菌粒。優(yōu)選方法是使用PH 2. 2的緩沖液洗脫，其中接著中和洗脫液。或者，可以加入游離靶標(biāo)的溶液以便與固定的靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合噬菌粒，或者可以通過與特異性結(jié)合目的靶標(biāo)的免疫球蛋白或天然配體蛋白競(jìng)爭(zhēng)來洗脫靶標(biāo)特異性噬菌粒。其后，用洗脫的噬菌粒感染大腸桿菌細(xì)胞。或者，可以從洗脫的噬菌粒中提取核酸并用于序列分析、擴(kuò)增或以其他方式轉(zhuǎn)化細(xì)胞。從以此方式獲得的大腸桿菌克隆開始，根據(jù)上文所述的方法通過用M13輔助噬菌體或超級(jí)噬菌體進(jìn)行超感染而再次產(chǎn)生新鮮的噬菌?；虺?jí)噬菌粒，并且將以此方式擴(kuò)增的噬菌粒再次以固定的靶標(biāo)進(jìn)行選擇。經(jīng)常需要多個(gè)選擇循環(huán)才能以足夠富集的形式獲得帶有本發(fā)明突變蛋白的噬菌粒。優(yōu)選地，將選擇循環(huán)數(shù)選擇成使得在后續(xù)的功能分析中至少0. I %所研究的克隆產(chǎn)生與給定靶標(biāo)具有可檢測(cè)親和力的突變蛋白。根據(jù)所使用文庫(kù)的大小(即復(fù)雜性)，通常需要2至8個(gè)循環(huán)來達(dá)到這一目的。對(duì)于選定突變蛋白的功能分析，用從選擇循環(huán)獲得的噬菌粒感染大腸桿菌菌株，并且分離相應(yīng)的雙鏈質(zhì)粒DNA。從該質(zhì)粒DNA開始或者同樣從提取自該噬菌粒的單鏈DNA開始，可以通過本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定本發(fā)明選定突變蛋白的核酸序列，并且可由此推斷氨基酸序列。可以在另一個(gè)表達(dá)載體中亞克隆完整hNGAL突變蛋白的突變區(qū)或序列，然后在合適的宿主生物體中表達(dá)。例如，可以使用載體PTLPC26 (現(xiàn)在也稱為pTlc26)在大腸桿菌菌株(例如大腸桿菌TGl)中表達(dá)?？梢酝ㄟ^多種生物化學(xué)方法純化由此產(chǎn)生的hNGAL突變蛋白。所產(chǎn)生的hNGAL突變蛋白(例如用pTlc26產(chǎn)生)在其C端帶有親和肽Str印-標(biāo)簽II (Schmidt等人，同上)，因此優(yōu)選地可以通過鏈霉親和素親和層析進(jìn)行純化。還可以通過其他方法進(jìn)行選擇。許多相應(yīng)的實(shí)施方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者已在文獻(xiàn)中描述。此外，可以使用方法的組合。例如，可以使通過“噬菌體展示”選擇或至少富集的克隆再進(jìn)行“菌落篩選”。該方法具有以下優(yōu)勢(shì)就產(chǎn)生對(duì)靶標(biāo)具有可檢測(cè)的結(jié)合親和力的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白這方面，可以直接分離各個(gè)克隆。
除了使用大腸桿菌在“噬菌體展示”技術(shù)或“菌落篩選”方法中作為宿主生物體以夕卜，其它細(xì)菌菌株、酵母或者昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞也可以用于此目的。除了從上文所述的隨機(jī)文庫(kù)中選擇人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白以外，還可以使用進(jìn)化方法(包括限制性突變)，以使已對(duì)靶標(biāo)具有一定結(jié)合活性的突變蛋白在對(duì)靶標(biāo)的親和力或特異性方面進(jìn)行優(yōu)化。一旦以及選擇了與給定靶標(biāo)具有親和力的突變蛋白，還可以對(duì)使這種突變蛋白進(jìn)行另一突變，以便隨后選擇具有甚至更高親和力的變體，或者選擇具有改進(jìn)的特性(例如更聞的熱穩(wěn)定性；提聞的血清穩(wěn)定性；熱力學(xué)穩(wěn)定性；提聞的溶解度；改進(jìn)的單體行為；對(duì)熱變性、化學(xué)變性、蛋白水解或去污劑等提高的抗性等)的變體。這一其它突變(在目的為更高親和力的情況下可認(rèn)為是體外“親和力成熟”)可以通過基于推理性設(shè)計(jì)的位點(diǎn)特異性突變或隨機(jī)突變來實(shí)現(xiàn)。獲得更高親和力或改進(jìn)的特性的另一種可行方法是使用易錯(cuò)PCR，該易錯(cuò)PCR導(dǎo)致在脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的選定序列位置范圍中產(chǎn)生點(diǎn)突變。易錯(cuò)PCR可以根據(jù)任何已知的方案來進(jìn)行，例如Zaccolo等人(1996) J. Mol. Biol. 255，589-603所述的方案。適用于這種目的的其它隨機(jī)突變方法包括如Murakami, H等人(2002) Nat.Biotechnol. 20, 76-81描述的隨機(jī)插入/缺失(RID)突變或者如Bittker，J. A等人 (2002) Nat. Biotechnol. 20，1024-1029描述的非同源隨機(jī)重組(NRR)。如果需要，還可以根據(jù) WO 00/75308 或 Schlehuber, S 等人 J. Mol. Biol. 297，1105-1120 中描述的方法進(jìn)行親和力成熟，其中獲得了對(duì)洋地黃毒苷具有高親和力的后膽色素結(jié)合蛋白的突變蛋白。用于改進(jìn)親和力的其它方法為進(jìn)行位置飽和突變。在此方法中，產(chǎn)生“小”核酸文庫(kù)，其中僅在四個(gè)環(huán)區(qū)段中任一個(gè)內(nèi)的單個(gè)位置處引入氨基酸交換/突變。然后使這些文庫(kù)直接進(jìn)行選擇步驟(親和力篩選)，而無需其它淘選輪次。此方法允許對(duì)促成對(duì)期望靶標(biāo)改進(jìn)的結(jié)合的殘基進(jìn)行鑒定，并且允許鑒定對(duì)于結(jié)合來說重要的“熱點(diǎn)”。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述用于修飾突變蛋白的方法進(jìn)一步包括在對(duì)應(yīng)于人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的任何序列位置中的至少一個(gè)處引入Cys殘基，以及經(jīng)由在對(duì)應(yīng)于hNGAL野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的任何序列位置中的至少一個(gè)處引入的Cys殘基的硫醇基團(tuán)偶聯(lián)能夠改變所述突變蛋白的血清半衰期的部分。該能夠改變所述突變蛋白的血清半衰期的部分可以選自聚亞烷基二醇分子和羥乙基淀粉。在另一方面，本發(fā)明涉及對(duì)人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的給定非天然配體具有可檢測(cè)的結(jié)合親和力的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白，其能夠通過本發(fā)明上文詳述的方法獲得或者通過本發(fā)明上文詳述的方法獲得。在本發(fā)明的一些人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白中，去除了 Cys 76與Cys 175之間的天然存在的二硫鍵。相應(yīng)地，這種突變蛋白(或不包括分子內(nèi)二硫鍵的任何其它人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白)可以在具有還原性氧化還原環(huán)境的細(xì)胞隔室中產(chǎn)生，例如，在革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中。在本發(fā)明脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白包括分子內(nèi)二硫鍵的情況下，可以優(yōu)選的是，使用適合的信號(hào)序列將新生多肽引導(dǎo)至具有氧化性氧化還原環(huán)境的細(xì)胞隔室。這種氧化性環(huán)境可以由革蘭氏陰性細(xì)菌(例如大腸桿菌)的外周胞質(zhì)、在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞外環(huán)境中或在真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中提供，并且這種氧化性環(huán)境通常有利于形成結(jié)構(gòu)性二硫鍵。
然而，還可以在宿主細(xì)胞(優(yōu)選大腸桿菌)的胞液中產(chǎn)生本發(fā)明的突變蛋白。在這種情況下，該多肽可以以可溶和折疊狀態(tài)直接獲得，也可以以包涵體的形式回收，然后體外復(fù)性。其它選擇為使用具有氧化性細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的特定宿主菌株，其可以因而允許在胞液中形成二硫鍵(Venturi 等人(2002) J. Mol. Biol. 315，1-8.)。然而，本發(fā)明的突變蛋白可以不必定為僅通過利用基因工程生產(chǎn)。而是，還可以通過化學(xué)合成或通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯獲得脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，所述化學(xué)合成例如Merrifield固相多肽合成。例如可行的是，使用分子建模鑒定有希望的突變，然后體外合成希望的(設(shè)計(jì)的)多肽，然后研究對(duì)于給定靶標(biāo)的結(jié)合活性。用于固相和/或液相合成蛋白的方法是本領(lǐng)域熟知的(例如綜述于Lloyd-Williams等人(1997) Chemical Approachesto the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC Press, Boca Raton, Fields, GB,and Colowick (1997) Solid-Phase Peptide Synthesis. Academic Press, San Diego或Bruckdorfer 等人(2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的成熟方法通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯產(chǎn)生。 本發(fā)明還涉及藥物組合物，該藥物組合物包含至少一種權(quán)利要求中所指的本發(fā)明突變蛋白或其融合蛋白或綴合物以及任選的藥學(xué)上可接受的賦形劑。根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白可以經(jīng)由對(duì)蛋白質(zhì)藥物而言有治療效果的任何腸胃外或非腸胃外(腸內(nèi))途徑給藥。腸胃外施用法包括，例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)的注射和輸注技術(shù)，例如注射液、輸注液或酊劑以及氣霧劑裝置和吸入(例如氣霧劑混合物)、噴霧劑或粉劑的形式。非腸胃外遞送模式為例如經(jīng)口(例如丸劑、片劑、膠囊劑、溶液劑或混懸劑的形式)或直腸(例如栓劑的形式)。根據(jù)需要，本發(fā)明的突變蛋白可以在含有常規(guī)無毒藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體、添加劑和運(yùn)載體的制劑中全身或局部給藥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物腸胃外施用至哺乳動(dòng)物，特別是人。相應(yīng)的給藥方法包括、但不限于例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)的注射及輸注技術(shù)，例如注射液、輸注液或酊劑以及氣霧劑裝置和吸入(例如氣霧劑混合物的形式)、噴霧劑或粉劑的形式。靜脈內(nèi)和皮下輸注和/或注射的組合對(duì)于血清半衰期相對(duì)短的化合物而言可能是最方便的。所述藥物組合物可以是水溶液、水包油乳劑或油包水乳劑。就這一點(diǎn)而言,應(yīng)該注意，如Meidan 和 Michniak (2004) Am. J. Ther. 11(4)，312-316所述的經(jīng)皮遞送技術(shù)(例如離子電滲、超聲促滲或微針增強(qiáng)遞送)也可以用于經(jīng)皮遞送本文所述的突變蛋白。非腸胃外遞送模式為例如經(jīng)口(例如丸劑、片劑、膠囊劑、溶液劑或混懸劑的形式)或直腸施用(例如栓劑的形式)。本發(fā)明的突變蛋白可在含有多種常規(guī)無毒藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體、添加劑和運(yùn)載體的制劑中全身或局部給藥。所施用的突變蛋白劑量可以在寬范圍內(nèi)變化，以實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防效果或治療響應(yīng)。例如，這將取決于該化合物對(duì)選定配體的親和力以及該突變蛋白與該配體的復(fù)合體在體內(nèi)的半衰期。此外，最佳劑量將取決于該突變蛋白或其融合蛋白或其綴合物的生物分布、給藥模式、所治疾病/病癥的嚴(yán)重程度以及患者的醫(yī)學(xué)狀況。例如，當(dāng)在膏劑中用于局部施用時(shí)，可以使用高濃度的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白。然而，如果需要，也可以在持續(xù)釋放制劑中給予該突變蛋白，例如脂質(zhì)體分散體或基于水凝膠的聚合物微球體，如PolyActive 或 OctoDEX (參見 Bos 等人，Business Briefing: Pharmatech 2003: 1-6)。
相應(yīng)地，可以使用藥學(xué)上可接受的成分以及已建立的制備法將本發(fā)明的突變蛋白配制成組合物(Gennaro, A. L.和 Gennaro, A. R. (2000) Remington: The Science andPractice of Pharmacy,第二十版，Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia,PA)。為了制備藥物組合物，可以使用藥學(xué)上惰性的無機(jī)或有機(jī)賦形劑。為了制備例如丸劑、粉劑、明膠膠囊劑或栓劑，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其鹽、脂肪、蠟、固體或液體多元醇、天然和硬化的油。用于產(chǎn)生溶液劑、懸浮劑、乳劑、氣霧劑混合物或粉劑(在使用前將粉劑重建成溶液劑或氣霧劑混合物)的合適的賦形劑包括水、醇、甘油、多元醇及其合適的混合物以及植物油。所述藥物組合物還可以含有添加劑，例如填料、粘合劑、濕潤(rùn)劑、助流劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、乳化劑，以及其它溶劑或增溶劑或用于實(shí)現(xiàn)貯存效應(yīng)的試劑。后者使得融合蛋白可以摻入緩慢或持續(xù)釋放或靶向遞送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體和微囊劑)?？赏ㄟ^多種方法對(duì)制劑進(jìn)行滅菌，包括通過截留細(xì)菌的濾器過濾，或通過以無菌固體組合物的形式摻入消毒劑，所述消毒劑可以在臨用前溶于或分散于無菌水或其他無菌介質(zhì)中。 本發(fā)明的突變蛋白或其融合蛋白或綴合物可以用于多種應(yīng)用中。通常，這種突變蛋白可以用于所有使用抗體的應(yīng)用，除了特異地依賴于Fe部分的糖基化的那些以外。因此，在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白用于結(jié)合和/或檢測(cè)人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的給定非天然配體。這樣的用途可以包括以下步驟在合適的條件下使該突變蛋白接觸疑似含有給定配體的樣品，由此允許在該突變蛋白與該給定配體之間形成復(fù)合物，以及通過合適的信號(hào)檢測(cè)復(fù)合的突變蛋白?？蓹z測(cè)信號(hào)可以通過如上文所述的標(biāo)記產(chǎn)生，或通過由于結(jié)合(即復(fù)合物形成)本身而導(dǎo)致的物理特性的變化而產(chǎn)生。一個(gè)實(shí)例是等離子體表面共振，其數(shù)值在結(jié)合配偶體結(jié)合時(shí)發(fā)生改變，所述配偶體中的一者固定在表面上，例如金箔上。本文公開的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白還可以用于分離人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的給定非天然配體。這樣的用途可以包括以下步驟在合適的條件下使該突變蛋白接觸推測(cè)含有所述配體的樣品，由此允許在該突變蛋白與該給定配體之間形成復(fù)合物，以及從樣品中分離突變蛋白/配體復(fù)合物。在突變蛋白用于檢測(cè)給定非天然配體以及分離給定配體的兩個(gè)用途中，突變蛋白和/或靶標(biāo)均可以固定在合適的固相上。本發(fā)明的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白還可以用于使化合物以預(yù)先選擇的部位為靶向。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2的突變蛋白用于使有藥學(xué)活性的化合物以生物體或組織中預(yù)先選擇的部位為靶向，包含a)將突變蛋白與所述化合物綴合，以及b)將突變蛋白/化合物復(fù)合物遞送至該預(yù)先選擇的部位。就這樣的目的而言，使突變蛋白與目的化合物接觸，以便允許形成復(fù)合物。然后將包含該突變蛋白和目的化合物的復(fù)合物遞送至預(yù)先選擇的部位。這可以例如通過使突變蛋白與靶向部分偶聯(lián)而實(shí)現(xiàn)，所述靶向部分例如抗體、抗體片段、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白或?qū)υ撨x擇的靶標(biāo)具有結(jié)合親和力的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白片段。該用途特別適用于、但不限于將藥物(選擇性地)遞送至生物體中的預(yù)先選擇的部位，例如旨在用該藥物進(jìn)行治療的受到感染的機(jī)體部分、組織或器官。除了在突變蛋白與目的化合物之間形成復(fù)合物以外，突變蛋白還可以與給定化合物反應(yīng)，以得到突變蛋白與化合物的綴合物。與上述復(fù)合物相似，這樣的綴合物可以適用于將化合物遞送至預(yù)先選擇的靶部位。這樣的突變蛋白與化合物的綴合物還可包括將突變蛋白和化合物彼此共價(jià)連接的接頭。任選地，這樣的接頭在血流中穩(wěn)定，但在細(xì)胞環(huán)境中可被切割。因而，本文公開的突變蛋白及其衍生物可以用于與抗體或其片段相似的多個(gè)領(lǐng)域。除了與支持物結(jié)合以允許固定或分離給定突變蛋白的靶標(biāo)或該靶標(biāo)的綴合物或融合蛋白這種用途以外，該突變蛋白還可以用于以酶、抗體、放射性物質(zhì)或任何其他具有生物化學(xué)活性或確定的結(jié)合特征的基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。這樣，它們各自的靶標(biāo)或其綴合物或融合蛋白可以被檢測(cè)或者與它們接觸。例如，本發(fā)明的突變蛋白可以用于通過已建立的分析法(如ELISA或蛋白質(zhì)印跡)或通過顯微術(shù)或免疫傳感器來檢測(cè)化學(xué)結(jié)構(gòu)。這里，檢測(cè)信號(hào)可以通過使用合適的突變蛋白綴合物或融合蛋白直接產(chǎn)生，或者通過經(jīng)由抗體對(duì)結(jié)合的突變蛋白進(jìn)行免疫化學(xué)檢測(cè)而間接產(chǎn)生。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中還存在本發(fā)明突變蛋白的眾多可能的應(yīng)用。除了在診斷和藥物遞送中的用途以外，可以產(chǎn)生結(jié)合例如組織或腫瘤特異性細(xì)胞表面分子的本發(fā)明突變多肽。這樣 的突變蛋白例如可以以綴合形式或作為融合蛋白用于“腫瘤成像”或直接用于癌癥治療。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2突變蛋白用于與給定非天然配體或靶標(biāo)形成復(fù)合物的用途。在另一方面，本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白在制備藥物組合物中的用途。因而獲得的藥物組合物可以適于治療退行性障礙，例如阿爾茲海默氏病。所述藥物組合物還可以用于治療癌癥、治療纖維化或治療炎癥。所述藥物組合物可以用于單獨(dú)治療或組合治療。在另一方面，本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白的診斷或分析試劑盒。本發(fā)明的另一方面涉及治療患有神經(jīng)退行性疾病、癌癥、纖維化或炎癥的受試者的方法，該方法包括有此需要的受試者施用本發(fā)明的各突變蛋白或包含本發(fā)明的突變蛋白的藥物組合物。需要這種治療的受試者可以哺乳動(dòng)物，例如人、狗、小鼠、大鼠、豬、猿(例如獼猴)，以上僅為幾個(gè)示例性實(shí)例。在另一方面，本發(fā)明涉及用于受試者的體內(nèi)成像的方法，該方法包括所述受試者施用本發(fā)明的突變蛋白或包含本發(fā)明的突變蛋白的藥物組合物。受試者可以如上文進(jìn)行限定。


通過下述非限制性實(shí)例和附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明，其中圖I示出了用于同時(shí)隨機(jī)突變成熟Lcn2氨基酸序列中的20個(gè)氨基酸位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 134 (下劃線標(biāo)出且編號(hào)的)的PCR組裝策略。這20個(gè)位置分成四個(gè)序列組。為了隨機(jī)化各組中的氨基酸，合成了寡脫氧核苷酸(SEQ ID NO: U SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4)，其中在突變的密碼子處利用核苷酸的NNK混合物。N表示全部四個(gè)堿基A、C、G和T的混合物，而K表示僅兩個(gè)堿基G和T的混合物，因此這樣的三聯(lián)體編碼全部20種天然氨基酸以及琥珀型終止密碼子TAG,其在大腸桿菌supE-菌株XLl-blue (Bullock等人，BioTechniques 5(1987), 376-378)或 TGl (Sambrook 等人，Molecular Cloning. A Laboratory Manual(1989), Cold Spring Harbor Press)中翻譯成谷氨酰胺,所述菌株用于卩遼菌粒產(chǎn)生和基因表達(dá)。還在組裝反應(yīng)中使用四個(gè)其它的寡脫氧核苷酸(SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQID NO: 7,SEQ ID NO: 8)，其具有對(duì)應(yīng)于非編碼鏈(在DNA雙鏈序列下方以3’-5’方向?qū)懗?且填充上述寡脫氧核苷酸之間的間隙的固定核苷酸序列。額外添加的兩個(gè)較短且?guī)в猩锼鼗鶊F(tuán)的側(cè)翼寡脫氧核苷酸(SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10)用作所組裝的整個(gè)合成基因片段的PCR擴(kuò)增引物。兩個(gè)側(cè)翼引物各自包括BstXI限制性位點(diǎn)(CCANNNNNNTGG)，從而經(jīng)酶消化產(chǎn)生相互不相容的突出。這種限制性位點(diǎn)的特殊排列使得合成的基因能夠進(jìn)行特別有效的連接和克隆。對(duì)初始Lcn2序列將氨基酸Gln28替換成His是必需的，從而引入第一BstXI位點(diǎn)，而第二個(gè)天然存在于Lcn2的cDNA中。此外，未配對(duì)殘基Cy s87在基因組裝期間被替代為Ser。在一次罐式PCR (pot PCR)之后，將得到的基因片段插入到提供Lcn2結(jié)構(gòu)基因的丟失部分的載體中。該圖示還描述了兩個(gè)短引物(SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO:46)，分別在由該兩個(gè)BstXI限制性位點(diǎn)側(cè)翼的盒的上游和下游，已用于雙鏈DNA測(cè)序。圖2示出了合成的Lcn2基因文庫(kù)的核苷酸序列(僅示出了如圖I中由該兩個(gè)BstXI限制性位點(diǎn)側(cè)翼的中心盒)。此基因片段由Sloning BioTechnology GmbH制備。與圖I中描述的DNA文庫(kù)相比，存在兩個(gè)不同。第一，只要可行，就對(duì)非突變的氨基酸位置進(jìn)行了用于大腸桿菌表達(dá)的密碼子優(yōu)化。第二，在20個(gè)隨機(jī)化位置處采用了各自編碼不同氨基酸(除了 Cys)的 19 個(gè)不同三聯(lián)體(GAC、ITC、CTG、CAC、AAT、AGC、ACC、GCA、ATG、CCT、GIT、TGG、GAG、CAA、ATC、GGA、CGT、GCA、TAC)的混合物，其與圖I中所描述的那些相同。此處氨基酸的編號(hào)對(duì)應(yīng)于Sloning BioTechnology GmbH采用的內(nèi)部方案，由此Gly no. I為直接位于第一個(gè)氨基酸密碼子。圖3示出了在大腸桿菌中表達(dá)后，重組AP融合蛋白Trx-AP 28 (A)和MBP-A340(B)的SEC洗脫曲線。通過SDS-PAGE分析評(píng)估合成的A ￠40和重組AP融合蛋白二者的純度(C)。兩種融合蛋白均在大腸桿菌JM83的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。在用弗氏壓碎器破壞細(xì)胞之后，經(jīng)由His6-標(biāo)簽親和色譜、然后進(jìn)一步施用于Superdex 75 HR 10/30柱子(在Trx-A 3 28的情況下)或施用于Superdex 200 HR 10/30柱子(在MBP-A P 40的情況下)純化蛋白。在尺寸排阻色譜中兩種蛋白均主要以單體洗脫，并且在純化后為基本上勻質(zhì)的。AP 40獲得Keck Foundation,用HFIP處理,在SpeedVac中蒸發(fā),最后溶解于蒸懼水中。15%凝膠示出了 HFIP處理后的A P 40以及MAC純化和SEC之后的Trx-A ^ 28和MBP-A ^ 40樣品。M表示分子量標(biāo)記物，其相應(yīng)的譜帶大小以kDa為單位示于凝膠的左側(cè)。圖4示出了 Lcn2突變蛋白Hl-GU S1-A4和US7 (A)的SEC洗脫曲線的疊加和經(jīng)由15% SDS-PAGE (B)進(jìn)行的純化蛋白分析結(jié)果。3個(gè)Lcn2突變蛋白Hl-Gl、S1-A4和US7在大腸桿菌JM83或TG1-F_的外周胞質(zhì)中表達(dá)(如本文所示)，并且經(jīng)由Str印-標(biāo)簽II親和色譜純化。全部3個(gè)突變蛋白從Superdex 75 HR 10/30柱子上主要以單體蛋白洗脫，保留體積為10至11 ml。取決于具體突變蛋白的表達(dá)產(chǎn)量，峰值強(qiáng)度相異。(B)示出了重組野生型Lcn2 (泳道1、5)和突變蛋白US7 (泳道2、6)、H1_G1 (泳道3、7)和Str印-標(biāo)簽II親和純化和SEC之后的Sl-A4(泳道4、8)的15% SDS-PAGE分析結(jié)果。泳道1_4示出用2-巰基乙醇還原的Lcn2突變蛋白，泳道5-8示出在非還原條件下的蛋白。M表示分子量標(biāo)記物，其相應(yīng)的譜帶大小以kDa為單位示于凝膠的左側(cè)。圖5示出了 Lcn2突變蛋白Hl-Gl、S1-A4和US7在捕獲ELISA中與不同生物素化的八0祀標(biāo)的結(jié)合活性。將10 V- g/ml的StrepMAB-Immo固定在微量滴定板上,然后用于經(jīng)由Str印-標(biāo)簽II捕獲I iiM Lcn2突變蛋白。在圖A至C中，示出了 Lcn2突變蛋白S1-A4和US7與(A)生物素化的A P 40、⑶生物素化的Trx-A ^ 28和(C)生物素化的MBP-A ^ 40的結(jié)合。通過用ExtrAvidin/AP孵育和之后用pNPP進(jìn)行的顯色反應(yīng)檢測(cè)結(jié)合。將卵白蛋白(Ova)、硫氧還蛋白(Trx)和麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)用作陰性對(duì)照。此外，測(cè)試了野生型(wt)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的結(jié)合。將數(shù)據(jù)擬合成單價(jià)結(jié)合模型。圖D示出了以Lcn2 Hl-Gl以及生物素化的A P 40和Trx-A ^ 28作為靶標(biāo)進(jìn)行的相同ELISA程序。針對(duì)A P 40測(cè)定的Kd值為對(duì)于S1-A4為2. 7 nM,對(duì)于US7為6. 8 nM,對(duì)于H1-G1為16. 2 nM ;針對(duì)Trx-A P 28測(cè)定的相應(yīng)的值為1. 9 nM，2. 4 nM, 24. 3 nM。與MBP-A @ 40的結(jié)合示出的Kd值為對(duì)于S1-A4為 4. 7 nM，對(duì)于 US7 % 11. 4 nM。相應(yīng)地，針對(duì) A 3 16-27 的 Kd 值為 2. 6 nM 和 2. I nM。

圖6示出了 Lcn2突變蛋白S1-A4和US7在直接ELISA中的結(jié)合活性。將^\@靶標(biāo)Trx-AP 28和MBP-AP 40以及對(duì)照蛋白麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)以2 PM在PBS中固定過夜。經(jīng)由它們的Strep-標(biāo)簽II使用鏈霉親和素/AP然后用pNPP進(jìn)行顯色反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)合的Lcn2突變蛋白。作為對(duì)照，測(cè)試了野生型(wt)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的結(jié)合。將數(shù)據(jù)擬合成單價(jià)結(jié)合模型。針對(duì)Trx-A P 28測(cè)定的Kd值為對(duì)于S1-A4為16. 2 nM,對(duì)于US7為9. 6 nM ；針對(duì)MBP-A P 40的相應(yīng)的值為149 nM和49. 7 nM。圖7示出了 Lcn2突變蛋白S1_A4(A)和US7 (B)在競(jìng)爭(zhēng)ELISA中的結(jié)合活性。將StrepMAB-Immo以10 y g/ml固定在微量滴定板上,然后用于經(jīng)由Strep-標(biāo)簽II捕獲IU M Lcn2突變蛋白。為進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，將作為示蹤物的恒定濃度的生物素化的Trx-A ^ 28與不同濃度的未標(biāo)記的Trx-AP 28混合。之后,經(jīng)由用ExtrAvidin/AP孵育然后通過用pNPP進(jìn)行顯色反應(yīng)檢測(cè)結(jié)合的生物素化的Trx-AP 28。使用sigmoidal方程將數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。針對(duì)S1-A4的Kd值為21.7 nM,針對(duì)US7的值為76. 9 nM。圖8示出了在Biacore儀器上以10 U 1/min的流量測(cè)量的Lcn2突變蛋白S1-A4(A)和US7 (B)的動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)分析結(jié)果。經(jīng)由胺化學(xué)將MBP-A￠40融合蛋白偶聯(lián)在CMD 2001芯片(RU = 1455)上，每一種經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白都以不同濃度的系列應(yīng)用。在每種情況下，測(cè)得的信號(hào)示為灰色線條，而曲線擬合示為黑色線條。兩種突變蛋白的1^和kf速率顯著不同(km(Sl-A4) = 0.48 IO5M-1S' kon(US7) = 2. 02 IO5 M_1s_1, koff(Sl-A4)=8. 36-10^5 s^,koff(US7) = 25. 2 IO^5 s-1)。然而，總體 Kd 值相當(dāng)類似，其中 S1-A4 為 I. 74nM, US7 為 I. 25 nM。圖9示出了在thioflavin T聚集分析中測(cè)試的Lcn2突變蛋白S1-A4和US7的功能活性。用10 PM的US7、S1-A4、野生型(wt)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白或用PBS在37 ° C下不振搖孵育100 ii M AP 40。在所示時(shí)間點(diǎn)，將20 u I的各樣品與180 yl的5 u M thioflavinT混合，然后用450 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和482 nm的發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量熒光。在1:10 (US7:A 40)的比率下，Lcn2突變蛋白US7顯示出聚集的強(qiáng)抑制。在此比率下，S1-A4無法顯著抑制聚集，但是在1:2 (S1-A4:AP40)的比率下施加了明確抑制(未示出)。野生型Lcn2未對(duì)A3聚集顯示出抑制性作用。
圖10示出了重組ED-B (泳道I)、FN7B8 (泳道2)和FN789 (泳道3)在離子交換色譜之后的SDS-PAGE分析結(jié)果(用考馬斯亮藍(lán)染色之后的)。全部樣品都用2-巰基乙醇還原。M :分子量標(biāo)記物(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)。圖11示出了 Lcn2突變蛋白s N7A (泳道1)、N7E (泳道2)、N9B (泳道3)和NlOD(泳道4 )在Strep-標(biāo)簽11親和純化之后的SDS-PAGE分析結(jié)果(用考馬斯亮藍(lán)染色之后的)。全部樣品都用2-巰基乙醇還原。M :分子量標(biāo)記物(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)。圖12示出了在ELISA中的結(jié)合活性。用經(jīng)純化的蛋白FN7B8和FN789包被微量滴定板，用系列稀釋的所選Lcn2突變蛋白孵育，然后用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物和PNPP底物檢測(cè)。重組Lcn2突變蛋白N7A、N9B和NlOD在此分析中顯示對(duì)FN789的可忽略信號(hào)，這缺乏ED-B并用作陰性對(duì)照。圖13示出了在Biacore儀器上測(cè)量的Lcn2突變蛋白N9B的動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)分析結(jié)果。經(jīng)由胺化學(xué)將FN7B8偶聯(lián)到CMD 200 m傳感器芯片(ARU = 500)上，經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白以不同濃度應(yīng)用。在每種情況下，測(cè)得的信號(hào)示為灰色線條，而曲線擬合示為黑色線條。 從該組曲線測(cè)得的動(dòng)力學(xué)常數(shù)列于表2 (實(shí)施例17)。圖14示出了在Biacore儀器上測(cè)量的Lcn2突變蛋白N7E的動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)分析結(jié)果。經(jīng)由胺化學(xué)將FN7B8偶聯(lián)到CMD 200 m傳感器芯片(ARU = 500)上，經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白以不同濃度應(yīng)用。在每種情況下，測(cè)得的信號(hào)示為灰色線條，而曲線擬合示為黑色線條。從該組曲線測(cè)得的動(dòng)力學(xué)常數(shù)列于表2 (實(shí)施例17)。圖15示出了在Biacore儀器上測(cè)量的Lcn2突變蛋白N7A的動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)分析結(jié)果。經(jīng)由胺化學(xué)將FN7B8偶聯(lián)到CMD 200 m傳感器芯片(ARU = 500)上，經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白以不同濃度應(yīng)用。在每種情況下，測(cè)得的信號(hào)示為灰色線條，而曲線擬合示為黑色線條。從該組曲線測(cè)得的動(dòng)力學(xué)常數(shù)列于表2 (實(shí)施例17)。圖16示出了在Biacore儀器上測(cè)量的Lcn2突變蛋白NlOD的動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)分析結(jié)果。經(jīng)由胺化學(xué)將FN7B8偶聯(lián)到CMD 200 m傳感器芯片(ARU = 500)上，經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白以不同濃度應(yīng)用。在每種情況下，測(cè)得的信號(hào)示為灰色線條，而曲線擬合示為黑色線條。從該組曲線測(cè)得的動(dòng)力學(xué)常數(shù)列于表2 (實(shí)施例17)。圖 17示出了命名為 S1-A4 (SEQ ID NO: 39)、US_7 (SEQ ID NO: 41) ,Hl-Gl (SEQID NO: 43)、N7A (SEQ ID NO: 20)、N7E (SEQ ID NO: 22)、N9B (SEQ ID NO: 24)和 NlOD(SEQ ID NO: 26)的人Lcn2突變蛋白與Lcn2的序列比對(duì)結(jié)果。序列下方最后一行指示脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征(Sch5nfeld 等人(2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA106,8198-8203)。圖18示出了 Lcn2突變蛋白HlGA和HlGV (A)的SEC洗脫曲線的疊加和經(jīng)由15%SDS-PAGE (B)進(jìn)行的純化蛋白分析結(jié)果。2個(gè)Lcn2突變蛋白HlGA和HlGV (A)在大腸桿菌JM83的外周胞質(zhì)中表達(dá)，并且經(jīng)由Str印-標(biāo)簽II親和色譜純化。2個(gè)突變蛋白從Superdex75 HR 10/30柱子上主要以單體蛋白洗脫，保留體積為10至11 ml。取決于突變蛋白的表達(dá)產(chǎn)量，峰值強(qiáng)度相異。(B)示出了重組Lcn2突變蛋白Hl-Gl、H1GA和HlGV在Strep-標(biāo)簽II親和純化和SEC之后的15% SDS-PAGE分析結(jié)果。全部3個(gè)Lcn2突變蛋白在使用2-巰基乙醇的還原條件下示出。M表示分子量標(biāo)記物。圖19示出了 Lcn2突變蛋白H1GA、HlGV和Hl-Gl在捕獲ELISA中與生物素化的A3靶標(biāo)A￠40⑷和Trx-A￠28 (B)的結(jié)合活性。將10 y g/ml的Str印MAB-Immo固定在微量滴定板上，然后用于經(jīng)由Strep-標(biāo)簽II捕獲I PM Lcn2突變蛋白。然后通過用ExtrAvidin/AP孵育和之后用pNPP進(jìn)行的顯色反應(yīng)檢測(cè)生物素化的靶標(biāo)(以系列稀釋應(yīng)用)的結(jié)合。將生物素化的卵白蛋白(Ova)和硫氧還蛋白(Trx)用作陰性對(duì)照，該陰性對(duì)照不顯示結(jié)合Lcn2突變蛋白(未示出)。將數(shù)據(jù)擬合成單價(jià)結(jié)合模型。針對(duì)A340測(cè)定的Kd值為對(duì)于 HlGA 為 4. 2 nM,對(duì)于 HlGV 為 4. 9 nM,對(duì)于 H1-G1 為 21. 5 nM ;針對(duì) Trx-A 3 28測(cè)定的相應(yīng)的值分別為3. 8 nM、4. 2 nM和24. 4 nM。圖20示出了在Biacore儀器上以20 yl/min的流量測(cè)量的Lcn2突變蛋白HlGA(A)和HlGV (B)的動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)分析結(jié)果。經(jīng)由胺化學(xué)將MBP-AP 40融合蛋白偶聯(lián)在CMD2001芯片(RU = 1455)上，每一種經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白都以不同濃度的系列應(yīng)用。在每種情況下，測(cè)得的信號(hào)示為灰色線條，而曲線擬合示為黑色線條。兩種突變蛋白的km和 koff 速率顯著不同kon (HlGA) = 5. 77 104 M_ls_l，kon (HlGV) = 6. 84104 M-ls-l，koff (HlGA) = 2.75 10-5 s-1, koff (HlGV) = 7. 26 10-5 s_l?？傮w Kd 值為:對(duì)于 HlGA為 0. 476 nM，對(duì)于 HlGV 為 I. 06 nM。圖21示出了在固定有AP 40的Biacore儀器上測(cè)量的Lcn2突變蛋白HlGA的動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)分析結(jié)果，其中對(duì)于以高濃度測(cè)量的軌跡使用延長(zhǎng)的解離時(shí)間。經(jīng)由胺化學(xué)將靶標(biāo)肽A P 40偶聯(lián)到Biacore CM5芯片(A RU =325)上，經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白HlGA以30Ul/min的流量應(yīng)用。為了準(zhǔn)確測(cè)定低koff速率，以測(cè)試的最高濃度進(jìn)行解離7200 S。使用系列稀釋的Lcn2突變蛋白HlGA測(cè)定kon速率，其中連接和解離時(shí)間均為300 S。測(cè)得的 HlGA 的動(dòng)力學(xué)值如下kon = 1.25 * 105 M-ls-l,koff = I. 18 *10-5 s-1, KD = 0.095nM。圖22 (A)示出了在thioflavin T聚集分析中測(cè)試的Lcn2突變蛋白HlGA的功能活性。在不存在或存在不同摩爾比率的Lcn2突變蛋白HlGA的情況下，在0.5 x PBS中于37 ° C下并攪拌,孵育500 的I mg/ml單體AP。一式三份地制備聚集反應(yīng)。為了進(jìn)行熒光測(cè)量，以周期性間隔取得的20 W樣品各自與終濃度為0.5 X PBS中50剛的180W ThT混合，然后以450 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和482 nm的發(fā)射波長(zhǎng)分析。在等摩爾比率下，Lcn2突變蛋白HlGA顯示出聚集的強(qiáng)抑制。在此比率下，S1-A4無法顯著抑制聚集，但是在1:2(S1-A4: A^ 40)的比率下施加了明確抑制(未示出)。野生型Lcn2未對(duì)AP聚集顯示出抑制性作用。在10:2 (A^ 40:H1GA)的非等摩爾(subequimolar)比率下,聚集仍得到了顯著減弱。(B)相比之下，作為陰性對(duì)照的等摩爾量BSA或Lcn2均對(duì)AP40的聚集無抑制性作用。圖23總結(jié)了在不同ELISA程序中以及在表面等離子體共振測(cè)量中針對(duì)Lcn2突變蛋白HlGA和HlGV測(cè)定的KD值。圖 24示出了 Lcn2 突變蛋白 S1-A4 (SEQ ID NO: 39)、US7 (SEQ ID NO: 41) ,Hl-Gl(SEQ ID NO: 43),HlGA (SEQ ID NO: 50),HlGV (SEQ ID NO: 52)、N7A (SEQ ID NO: 20)、N7E (SEQ ID NO: 22)、N9B (SEQ ID NO: 24)和 NlOD (SEQ ID NO: 26)與 Lcn2 (SEQ IDNO: 44)的序列比對(duì)結(jié)果。圖25 示出了突變蛋白 HlGA (SEQ ID NO: 50)和 HlGV (SEQ ID NO: 52)與它們的前體Hl-Gl (SEQ ID NO: 43)和野生型Lcn2 (SEQ ID NO: 44)的相互序列比對(duì)結(jié)果。
圖26示出了 Lcn2變體N7E在ELISA中對(duì)FN7B8的特異結(jié)合活性。用FN7B8、FN789、BSA或卵白蛋白包被微量滴定板,用系列稀釋的N7E孵育,然后用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物和PNPP底物檢測(cè)。Lcn2變體N7E在此分析中顯示了對(duì)FN789、BSA和卵白蛋白的可忽略信號(hào)。圖27示出了示出了在Biacore儀器上測(cè)量的Lcn2變體N7A (A)、N7E (B)、N9B(C)和NlOD (D)的動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)分析結(jié)果。經(jīng)由胺化學(xué)將單個(gè)纖連蛋白結(jié)構(gòu)域ED-B偶聯(lián)在CMD 200 m傳感器芯片(ARU =180)上，經(jīng)純化的Lcn2變體都以不同濃度應(yīng)用。測(cè)得的信號(hào)示為與曲線擬合一起的軌跡。由這些感應(yīng)譜的測(cè)定的動(dòng)力學(xué)常數(shù)列于表3 (實(shí)施例24)。圖28 示出了 Lcn2 變體 N7A (A)、NlOD (B)、N9B (C)和 N7E (D)的分析性尺寸排阻色譜。將經(jīng)親和純化的蛋白施加到用TBS平衡的Superdex S75 10/30柱子。箭頭指示了柱子的排斥體積￠.7 ml)。分析性凝膠過濾得到該四種Lcn2變體中每一種的主峰蛋白的表觀分子量為N7A 為 21. 0 kDa, NlOD 為 21. 3 kDa, N9B 為 21. 7 kDa, N7E 為 21. 7 kDa,從而指示了僅單體物質(zhì)不存在。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :構(gòu)律突奪體Lcn2噬菌體展示t 庫(kù)在克隆的cDNA基礎(chǔ)上產(chǎn)生了 Lcn2變體的組合文庫(kù)(Breustedt等人(2006)Biochim. Biophys. Acta 1764, 161-173),所述文庫(kù)攜帶了氨基酸替換 Cys87Ser 以去除單個(gè)未配對(duì)的硫醇側(cè)鏈(Goetz等人(2000) Biochemistry 39, 1935-1941)以及Gln28His以引入第二個(gè)BstXI限制性位點(diǎn)?；旧细鶕?jù)已公開的策略(Beste等人(1999) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 96，1898-1903; Skerra (2001) J. Biotechnol. 74，257-275)，進(jìn)行了此區(qū)域的突變和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)組裝，此時(shí)使用采用如示例于圖I的寡脫氧核苷酸(SEQ ID NO: 1-10)的一罐式擴(kuò)增反應(yīng)。設(shè)計(jì)寡脫氧核苷酸，使得具有SEQ ID NO:1-4的引物對(duì)應(yīng)于編碼鏈并且分別在氨基酸位置36、40、41、49、52或68、70、72、73、77、79、81或96、100、103、106或125、127、132、134處攜帶簡(jiǎn)并密碼子，而具有SEQ ID NO: 5-8的引物對(duì)應(yīng)于非編碼鏈并且不攜帶簡(jiǎn)并密碼子或反密碼子。過量使用具有SEQ ID NO: 9和SEQID NO: 10的兩個(gè)側(cè)翼引物，并且用于擴(kuò)增組裝的隨機(jī)化基因片段。如所述，使用Go-TaqHot Start DNA 聚合酶(Promega, Mannheim, Germany)進(jìn)行全部 PCR 步驟(Schlehuber 等人(2000) J. Mol. Biol. 297，1105-1120)。HPLC級(jí)的不攜帶簡(jiǎn)并密碼子的寡脫氧核苷酸購(gòu)自Metabion (Munich, Germany)。脫鹽的含NNK的寡脫氧核苷酸購(gòu)自同一個(gè)供應(yīng)商并且通過尿素PAGE進(jìn)一步純化。用BstXI(Promega, Mannheim, Germany)切割所得的DNA文庫(kù),然后在卩遼菌粒載體phNGAL102 (SEQID NO: 11)上克隆，所述噬菌粒載體phNGAL102基于通用表達(dá)載體pASKlll (Vogt和Skerra (2001) J. Mol. Recognit. 14 (I), 79-86)并編碼由 OmpA 信號(hào)肽、經(jīng)修飾的成熟Lcn2、隨后的琥珀密碼子以及絲狀噬菌體M13的基因III外殼蛋白C端片段組成的融合蛋白，即類似于之前針對(duì)后膽色素結(jié)合蛋白進(jìn)行描述的(Beste等人，上文；Skerra，上文)。在用8，4 ii g經(jīng)消化的PCR產(chǎn)物和94 經(jīng)消化的質(zhì)粒DNA的連接混合物電穿孔大腸桿菌XLl-Blue (Bullock 等人(1987) Biotechniques 5，376-378)之后，獲得了 I x IO10 個(gè)轉(zhuǎn)化子。
或者，從Sloning BioTechnology GmbH (Puchheim, Germany)獲得了描述于圖 2的克隆的合成Lcn2隨機(jī)文庫(kù)。使用適合的引物(SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10)經(jīng)由PCR在20個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增由兩個(gè)BstXI限制性位點(diǎn)側(cè)翼的中心基因盒，然后在phNGAL108 (SEQID NO: 12)上亞克隆，從而產(chǎn)生復(fù)雜度對(duì)應(yīng)于1，7 X 101°個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化子的文庫(kù)。基于通用表達(dá)載體 PASK75 (Skerra (1994) Gene 151，131-135)的 phNGAL108 編碼由 OmpA 信號(hào)肽、經(jīng)修飾的成熟LCn2、Strep-標(biāo)簽、之后的琥珀型密碼子以及絲狀噬菌體M13的全長(zhǎng)基因III 外殼蛋白(Vogt 和 Skerra (2004) ChemBioChem 5, 191-199)組成的融合蛋白。對(duì)兩個(gè)Lcn2文庫(kù)相同地進(jìn)行文庫(kù)產(chǎn)生中的后續(xù)步驟。將100 ml的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無菌Erlenmeyer燒瓶，然后在37 ° C下、以160rpm在2YT培養(yǎng)基(無抗生素選擇壓力)中孵育一個(gè)小時(shí)，其中所述培養(yǎng)物含有用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述質(zhì)粒載體分別基于phNGAL102或phNGAL108，從而編碼作為噬菌體pill融合蛋白的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白的文庫(kù)。在用VCS-M13輔助噬菌體感染之前，將培養(yǎng)物在2YT培養(yǎng)基中稀釋到0D550為0，1，其中加入了相應(yīng)的抗生素并在相同條件下進(jìn)一步生長(zhǎng)直到達(dá)到0D550為0，6。在用VCS-M13輔助噬菌體(Agilent Technologies, La Jolla, USA)以大約為10的感染復(fù)數(shù)感染之后， 再在37 ° C下以100 rpm搖動(dòng)培養(yǎng)物30分鐘。然后將培養(yǎng)箱溫度降低至26 ° C，并將搖床速度再次升高至160 rpm, 10分鐘后加入卡那霉素(70 Mg/ml,之后經(jīng)由加入25 Mg/1(在每升培養(yǎng)物中加入125 m的在二甲基甲酰胺DMF中的200吒/ml母液)的無水四環(huán)素(ACROS Organics, Geel, Belgium)誘導(dǎo)基因表達(dá)。在26 ° C下以160 rpm再繼續(xù)孵育12-15個(gè)小時(shí)。通過離心(30 min, 18000 g, 4 ° C)沉淀來自整個(gè)培養(yǎng)物的細(xì)胞。無菌過濾(0.45 Mm)含有噬菌粒的上清液，與1/4體積的20 % w/v PEG 8000、15 % w/v NaCr混合，然后在冰上孵育至少2個(gè)小時(shí)。在離心(30 min，18000 g，4 ° C)之后，將來自I升培養(yǎng)物的沉淀的噬菌粒溶解于30 ml的冷BBS/E (200 mM硼酸鈉，160 mM NaCl, I mM EDTA pH8. 0)中，所述 BBS/E 含有 50 mM 苯甲脈(Sigma)和 Pefabloc I M-g/ml (Roth, Karlsruhe,Germany)。將溶液在冰上孵育I個(gè)小時(shí)。在離心(10 min, 43000 g，4 ° C)未溶解的組分之后，將每個(gè)上清液轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)管。加入1/4體積的20 % w/v PEG 8000、15 % w/v NaCl和在冰上孵育60分鐘使得再次沉淀噬菌粒，然后將噬菌粒等分并在-80° C下冷凍以進(jìn)行保存。為了進(jìn)行第一個(gè)選擇循環(huán)，解凍噬菌粒并離心(30 min，34000 g, 4 ° C)，去除上清液，然后溶解沉淀的噬菌粒并合并在含有50 mM苯甲脒的總計(jì)400 W的PBS中。在冰上孵育30 min之后，離心(5min, 18500 g, 4° C)該溶液，以便去除參與的聚集體并將上清液直接用于噬菌體展示選擇。實(shí)施例2 :制備不同形式的A P靶標(biāo)購(gòu)買了對(duì)應(yīng)于成熟P -淀粉樣序列(Dodel等人(2003) Lancet Neurology 2,215-220)的氨基酸I至40的AP 40肽(SEQ ID NO: 29)，該AP 40肽為合成的凍干的肽，具有經(jīng)由賴氨酸間隔物連接的C端生物素基團(tuán)(Peptide Speciality Laboratory,Heidelberg, Germany)或?yàn)槲礃?biāo)記形式(W. M. Keck Laboratory, New Haven, USA)。通過在室溫下將多達(dá)5 mg的肽在0. 5 mL的1，I, I, 3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP; Sigma-Aldrich,Steinheim, Germany)溶解至少0. 5小時(shí),獲得了均一單體A04O。之后,在SpeedVac濃縮儀中蒸發(fā)掉HFIP，并將AP 40溶解于合適體積的蒸餾水中，隨后在冷水中超聲(Bandelin，Sonorex, RK100, Germany) 15 分鐘。用 0. 22 Mm 過濾器(Spin-X 離心管過濾器;Corning,USA)過濾后,通過在280 nm下使用計(jì)算的消光系數(shù)1490 M4CnT1 (Gasteiger等人(2003)ExPASy the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.Nucleic Acids Res. 31, 3784-3788，http://www. expasy. ch/tools/protparam. html)進(jìn)行吸光度測(cè)量，測(cè)定蛋白濃度。還從Peptide Speciality Laboratory購(gòu)買了較短形式的0 -淀粉樣肽，例如N-端的肽 AP 1-11 (SEQ ID NO: 30)和中間的肽 AP 16-27 (SEQ ID NO: 31)。將這些較短形式的肽直接溶解于選擇的緩沖液中，未進(jìn)行預(yù)先的HFIP處理。除了合成的肽，構(gòu)建了編碼不同的重組AP融合蛋白的兩個(gè)載體以進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)首先，根據(jù) Hortschansky 等人((2005) Protein Sci. 14，1753-1759)構(gòu)建了具有麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP，pMBP-His, SEQ ID NO: 32)的融合蛋白，從而得到pASK75-MBP_A3 40(SEQ ID NO: 33)。第二，根據(jù) Moretto 等人((2007) J. Biol. Chem. 282，11436-11445)構(gòu)建了 pASK75-TrxAP 28H6 (SEQ ID NO: 34)，在 pASK75_TrxAP 28H6 中，將成熟淀粉樣肽 的氨基酸I至28插入到硫氧還蛋白(Trx，pASK75-TrxH6, SEQ ID NO: 35)的活性位點(diǎn)環(huán)中。順序克隆在麥芽糖結(jié)合蛋白基因框架內(nèi)攜帶延長(zhǎng)的N端的人AP 40，產(chǎn)生了新的質(zhì)粒 pASK75-MBP-A P 40，這是載體 pASK75 的衍生物(Skerra (1994) Gene 151，131-135)。此載體編碼這樣的融合蛋白在麥芽糖結(jié)合蛋白之后為His6標(biāo)簽(以便于蛋白純化)、煙草蝕刻病毒(TEV)識(shí)別位點(diǎn)(以用于切割該融合蛋白)以及人AP40的序列。所述載體處于四環(huán)素啟動(dòng)子/操縱子或系統(tǒng)的緊密控制下，并且允許在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中以高產(chǎn)率表達(dá)融合蛋白。經(jīng)由硫氧還蛋白的活性環(huán)中的獨(dú)特的CpoI位點(diǎn)(核苷酸位置99-105，對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基34和35)，將編碼成熟淀粉樣肽的(AP28)氨基酸I至28的序列插入到硫氧還蛋白環(huán)位點(diǎn)中，從而產(chǎn)生載體pASK75-Trx-A ^ 28H6。在大腸桿菌JM83(Yanisch-Perron 等人(1985) Gene 33，103-119)中于 37。C下表達(dá)兩個(gè)A ^融合蛋白Trx-A ^ 28和MBP-A ^ 40以及未融合的對(duì)照蛋白Trx和MBP。通過加入溶解于無水二甲基甲酰胺(DMF; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)中的200Ug/1無水四環(huán)素(aTc; Acros, Geel, Belgium)、然后繼續(xù)攪拌孵育3小時(shí)，以0. 5的光密度OD55tl誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。通過在4 ° C下以4200 g離心20分鐘收集細(xì)胞。將來自2 L培養(yǎng)物的細(xì)胞重懸于 20 ml 裂解緩沖液(100 mM Tris/HCl pH 8. 0, 50 mM NaCl, I mM EDTA)中，然后通過使所得的懸浮液3次通過弗氏壓碎器而勻質(zhì)化。如果離心(34500 g，4 ° C，20 min)去除不溶物，用 0. 45 U m 過濾器(Filtropur S 0.45; Sarstedt, Nuembrecht,Germany)過濾上清液并經(jīng)由每種蛋白的His6標(biāo)簽進(jìn)行親和純化。在固定化金屬親和色譜(IMAC)之后，經(jīng)由尺寸排阻色譜(SEC)進(jìn)一步純化該融合蛋白。通過在280 nm下使用下述計(jì)算的消光系數(shù)進(jìn)行吸光度測(cè)量，測(cè)定蛋白濃度對(duì)于MBP (SEQ ID NO: 32)為66350 M^cnT1，對(duì)于MBP-A3 40 (SEQ ID NO: 33)為69330 M-1CnT1,對(duì)于 Trx-AP 28 (SEQ ID NO: 34)為 15470 M^cnT1，對(duì)于 Trx (SEQ ID NO: 35)為 13980M-1CnT1 (Gasteiger 等人，上文)。
為了進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)，將兩種AP融合蛋白Trx-AP 28和MBP-AP 40以及用作對(duì)照蛋白的卵白蛋白(Ova; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)、Trx 和 MBP,用生物素或洋地黃毒苷(DIG)以2:1的摩爾比率(標(biāo)記試劑靶蛋白)進(jìn)行標(biāo)記。為此，將溶解于無水二甲基甲酰胺(DMF;Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)或二甲基亞諷(DMSO; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)中的 D-生物素-e-氨基己酸-N-輕基琥拍酰亞胺酯(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)或洋地黃毒苷-3-0-甲基羰基-e-氨基己酸-N-輕基琥拍酰亞胺酯(Roche Diagnostics, Mannheim,Germany)以 PBS (4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7.4)中蛋白的 2 倍摩爾比率加入。將混合物在室溫下旋轉(zhuǎn)I小時(shí)。然后，加入I M Tris/HCl pH 8. 0至終濃度為10 mM，并且孵育10分鐘，從而浸透剩下的活性NHS酯基團(tuán)，之后經(jīng)由在Superdex 75 HR10/30 柱子(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)上進(jìn)行 SEC純化標(biāo)記的蛋白。為了被用作噬菌體展示選擇中的靶標(biāo)，首先用洋地黃毒苷標(biāo)記Trx-A 281小時(shí)，然后——為了
封閉任何未配對(duì)的Cys殘基-加入50倍的過量碘乙酰胺(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)，然后孵育I小時(shí)。之后，用I M Tris/HCl pH 8. 0處理經(jīng)修飾的蛋白并如上進(jìn)行純化。實(shí)施例3 :通過噬菌體展示選擇對(duì)Ag 40肽具有親和力的Lcn2突變蛋白對(duì)于每個(gè)淘選循環(huán)，用PBS/T (含有0.1 % (v/v) Tween 20 [聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯；AppliChem, Darmstadt, Germany]的PBS)中的2 % (w/v) BSA封閉PBS (4mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7. 4)中的約 IO12 個(gè)重組噬菌粒 I 小時(shí)。用PBS/T分別洗滌50 ii L和25 u L的多份鏈霉親和素包被的磁珠懸浮液(Dynabeads M-280Streptavidin; Dynal Biotech, Invitrogen, Karlsruhe, Germany 和 StreptavidinMagnetic Particles; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany),然后用 PBS/T 中的 2 %(w/v) BSA封閉I小時(shí)。將25 UL經(jīng)封閉的珠子用于預(yù)吸附經(jīng)封閉的噬菌粒以去除對(duì)該柱子特異的噬菌粒，將50 UL之后用于個(gè)選擇循環(huán)。用25 UL經(jīng)洗滌且封閉的鏈霉親和素包被的磁珠孵育經(jīng)封閉的噬菌粒。然后用單管磁場(chǎng)(Promega, Mannheim, Germany)向下拉動(dòng)珠子2分鐘,用來自實(shí)施例2的100 nM生物素化的A P 40，以400 ML的總體積，將含有未結(jié)合至珠子的噬菌粒的上清液孵育1-2小時(shí)。用50 UL經(jīng)封閉的珠子孵育噬菌粒和肽靶標(biāo)的混合物0.5小時(shí)，之后用單管磁場(chǎng)向下拉動(dòng)2分鐘。丟棄含有未結(jié)合的噬菌粒的上清液。用400 uL PBS/T洗滌結(jié)合至磁珠的靶標(biāo)/噬菌粒復(fù)合物10次，然后在旋轉(zhuǎn)下用350 u L 0. I M甘氨酸/HC1，pH 2. 2洗脫結(jié)合的噬菌粒10分鐘，然后立即用55 ii L 0.5 M Tris堿中和?；蛘撸谟肞BS中的400 uL 4M尿素的變性條件下進(jìn)行洗脫30分鐘，然后用I mL PBS稀釋。對(duì)于選擇循環(huán)I和2應(yīng)用用酸或尿素的變性條件下的洗脫，而對(duì)于循環(huán)3和4，通過將400 UL 100剛非生物素化的A3 40加入到結(jié)合的噬菌粒并旋轉(zhuǎn)I小時(shí)，而在競(jìng)爭(zhēng)條件下進(jìn)行洗脫。總的來說，進(jìn)行4個(gè)選擇循環(huán)。為了擴(kuò)增洗脫的噬菌粒，在37 ° C下感染指數(shù)生長(zhǎng)的大腸桿菌XL-I Blue 30分鐘。通過將指數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌XL-I Blue直接加入到珠子中，洗脫剩余的珠子結(jié)合的噬菌粒。在4 ° C下離心之后，將細(xì)菌沉淀重懸在合適體積的2x YT培養(yǎng)基(16 g/L BactoTryptone, 10 g/L Bacto Yeast Extract, 5 g/L NaCI, pH 7. 5)中，涂布到 LB-Cam板(10g/L Bacto Tryptone, 5 g/L Bacto Yeast Extract, 5 g/L NaCl, 15 g/L Bacto Agar,35 mg/L氯胺苯醇，pH 7.5)上，然后在32 ° C下孵育14-16小時(shí)。之后，從板上刮下細(xì)胞并用于獲得和擴(kuò)增重組噬菌粒。在第四個(gè)淘選步驟之后，通過篩選ELISA (實(shí)施例5)進(jìn)行富集的噬菌粒集合的篩選。實(shí)施例4 :通過噬菌體展示選擇對(duì)Trx-Ag 28融合蛋白具有親和力的Lcn2突變蛋直對(duì)于每個(gè)淘選循環(huán)，首先用PBS/T (含有0.1 % (v/v) Tween 20的PBS)中的2% (w/v) BSA 封閉 PBS (4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7.4)中的約 IO12個(gè)重組噬菌粒I小時(shí)。來自進(jìn)行的選擇循環(huán)3，將PBS/T中的2 % (w/v)脫脂奶(Sucofin，TSI, Zeven, Germany)用作封閉試劑。用PBS/T洗滌50 y L和25 U L的抗DIG-IgG包被的磁珠懸浮液(Europa Bioproducts Ltd, Cambridge, UK),然后分別用PBS/T或脫脂奶中的2 % (w/v) BSA封閉I小時(shí)。 用洗滌且經(jīng)封閉的25 ii L抗DIG-IgG包被的磁珠孵育經(jīng)封閉的噬菌粒30分鐘。然后用單管磁場(chǎng)(Promega, Mannheim, Germany)向下拉動(dòng)珠子2分鐘,用來自實(shí)施例2的15 y M未標(biāo)記的Trx將含有未結(jié)合至珠子的噬菌粒的上清液孵育30分鐘，以去除對(duì)Trx特異的噬菌粒。之后加入洋地黃毒苷化和羧甲基化的Trx-AP 28至終濃度為100 nM，以400U L的總體積孵育混合物1-2個(gè)小時(shí)。然后用從50 ML份排出的經(jīng)封閉的珠子孵育噬菌粒、Trx和Trx-AP 28的混合物0. 5小時(shí)。接著用單管磁場(chǎng)向下拉動(dòng)珠子2分鐘。丟棄含有未結(jié)合的噬菌粒的上清液。用500 uL PBS/T洗滌具有結(jié)合的噬菌粒的磁珠10次。之后，在PBS中的400 UL 4 M尿素在旋轉(zhuǎn)下洗脫結(jié)合的噬菌粒30分鐘，之后用I mL PBS稀釋?？偟膩碚f，進(jìn)行6個(gè)選擇循環(huán)。為了擴(kuò)增洗脫的噬菌粒，在37 ° C下感染指數(shù)生長(zhǎng)的大腸桿菌XL-I Blue 30分鐘。通過將指數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌XL-I Blue直接加入到珠子中，洗脫剩余的珠子結(jié)合的噬菌粒。在4 ° C下離心之后，將細(xì)菌沉淀重懸在合適體積的2x YT培養(yǎng)基(16 g/L BactoTryptone, 10 g/L Bacto Yeast Extract, 5 g/L NaCI, pH 7. 5)中，涂布到 LB-Cam板(10g/L Bacto Tryptone, 5 g/L Bacto Yeast Extract, 5 g/L NaCl, 15 g/L Bacto Agar,35 mg/L氯胺苯醇，pH 7.5)上，然后在32 ° C下孵育14-16小時(shí)。之后，從板上刮下細(xì)胞并用于獲得和擴(kuò)增重組噬菌粒。在第六個(gè)淘選步驟之后，通過過濾器夾心的菌落篩選分析(filter-sandwichcolony screening synthsis)(實(shí)施例6)進(jìn)行富集的卩遼菌粒集合的篩選。實(shí)施例5 :經(jīng)由篩詵ELISA鑒定對(duì)A P特異的Lcn2突變蛋白在如實(shí)施例3所述用AP 40進(jìn)行4個(gè)循環(huán)的噬菌粒選擇之后，將富集的Lcn2突變蛋白集合在phNGAL98 (SEQ ID NO: 27)上進(jìn)行亞克隆，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌supE菌株TGl-F-(大腸桿菌 K12 TGl (Kim 等人(2009) J. Am. Chem. Soc. 131，3565-3576 的衍生物))，然后進(jìn)行篩選ELISA。為此目的，將來自富集的集合的單個(gè)菌落在96孔板(圓底帶蓋的MultipleWellPlate 96 ；Sarstedt, Nuembrecht, Germany)中、在 100 M-L TB-Amp 培養(yǎng)基(12 g/L BactoTryptone, 24 g/L Bacto 酵母提取物，55 mM 甘油，17 mM KH2PO4, 72 mM K2HPO4, 100mg/L氨芐西林)中于37 ° C下生長(zhǎng)過夜。用過夜培養(yǎng)物接種具有100 ML TB-Amp培養(yǎng)基的新的培養(yǎng)板，然后在22 ° C或37 ° C下生長(zhǎng)到指數(shù)期。用溶解于無水二甲基甲酰胺(DMF;Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)的 20 M-L 0. 2 Mg/mL 無水四環(huán)素(aTc; Acros,Geel, Belgium)在20 ° C下誘導(dǎo)Lcn2突變蛋白的外周胞質(zhì)表達(dá)13-17個(gè)小時(shí)。用包含Img/mL溶菌酶的40 ML BBSC800 mM硼酸鈉，640 mM NaCl, 8 mM EDTA, pH 8.0)，通過在4。C 下孵育 I 小時(shí)和以 750 rpm (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg, Germany)攪拌，釋放外周胞質(zhì)蛋白。在用 PBS/T (4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH7. 4，具有 0.05 % (v/v) Tween 20)中的 40 ML 10 % (w/v) BSA 于 4 ° C 和 750 rpm 下封閉I小時(shí)之后，在4 ° C和3000 g下離心培養(yǎng)板10分鐘。將上清液用于ELISA。為了選擇性地捕獲攜帶C端Strep-標(biāo)簽II (Schmidt和Skerra (2007)Nat. Protoc. 2，1528-1535)的 Lcn2 突變蛋白，在 4 。C 下用 PBS 中的 10 Pg/mLStrepMAB-Immo (IBA, Gottingen, Germany)包被 96 孔 MaxiSorp 聚苯乙烯微量滴定板(Nunc, Langenselbold, Germany)過夜，然后在室溫下用 PBS/T (具有 0. I % (v/v) Tween 20的PBS)中的3 % (w/v) BSA封閉I個(gè)小時(shí)。用PBS/T的3次洗滌步驟之后，每孔應(yīng)用來自上文的120 ML細(xì)胞提取物，然后以300 rpm孵育I.5小時(shí)。洗滌之后，加入來自實(shí)施例2的生物素化的AP 40至濃度為0. 5剛，然后孵育I小時(shí)。作為對(duì)照，使用生物素化的Ova,而非A P 40。再次洗滌各孔，用PBS/T中1:5000稀釋的50 ML的ExtrAvidin/AP綴合物(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)檢測(cè)結(jié)合的生物素化的肽或蛋白，之后在100mM Tris/HCl, pH 8.8，100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 中的 100 ML 0. 5 mg/mL 對(duì)硝基苯磷酸酯(AppIiChem, Darmstadt, Germany)存在下進(jìn)行信號(hào)顯不長(zhǎng)達(dá)I小時(shí)。在SpectraMax250 讀板儀(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)中測(cè)量 405 nm 下的吸光度?；蛘?，將來自實(shí)施例2的0.5剛非生物素化的AP 40直接固定在96孔MaxiSorp聚苯乙烯微量滴定板(Nunc, Langenselbold, Germany)上,然后進(jìn)行封閉。在與來自上文的細(xì)胞提取物一起孵育并洗漆之后，經(jīng)由Strep-標(biāo)簽II、使用1:1500稀釋的Streptactin/AP綴合物(IBA, Gottingen, Germany)檢測(cè)結(jié)合的Lcn2突變蛋白。作為對(duì)照,將0.5 MMOva固定到ELISA板上。實(shí)施例6 :經(jīng)由過濾器夾心的菌落篩詵分析鑒定對(duì)Trx-A P 28特異的Lcn2突變蛋直在用如實(shí)施例4中描述的Trx-A ^ 28進(jìn)行6個(gè)循環(huán)的噬菌粒選擇之后，經(jīng)由BstXI(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)在質(zhì)粒 phNGALl24 (SEQ ID NO: 42)上亞克隆經(jīng)突變的Lcn2基因盒，所述質(zhì)粒編碼這樣的融合蛋白0mpA信號(hào)肽、具有C端Strep-標(biāo)簽II(Schmidt and Skerra (2007) Nat. Protoc. 2，1528-1535)的 Lcn2 編碼區(qū)、然后使琥珀型終止密碼子以及用于來自鏈球菌G蛋白(Schlehuber等人(2000) J. Mol. Biol. 297，1105-1120)的白蛋白結(jié)合。結(jié)構(gòu)域(ABD)的基因。然后進(jìn)行過濾器夾心的菌落篩選分析，由此從涂在親水濾膜(PVDF型GVWP，0. 22V- m; Millipore, Schwalbach, Germany)上的菌落釋放Lcn2_ABD融合蛋白，然后功能性捕獲在下面的第二個(gè)膜(Inimobilon-P膜，0.45 U m; Millipore, Schwalbach, Germany)上，所述第二個(gè)膜包被了人血清白蛋白(HSA, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany),之后進(jìn)行由 Schlehuber 等人((2000) J. Mol. Biol. 297，1105-1120)詳細(xì)描述的程序。用來自實(shí)施例2的PBS/T中的100 nM DIG標(biāo)記的Trx-A ^ 28探測(cè)該膜I個(gè)小時(shí)。用抗DIGFab/喊性憐酸酶(AP)綴合物(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)檢測(cè)結(jié)合的革巴標(biāo)綴合物，之后用5-溴-4-氯-3-D引哚基磷酸酯、4-甲苯胺藍(lán)G3CIP; AppliChem, Darmstadt,Germany)和氮藍(lán)四唑(NBT; AppliChem, Darmstadt, Germany)進(jìn)行顯色反應(yīng)。在此膜上鑒定到具有強(qiáng)烈顏色信號(hào)的點(diǎn)之后，從第一過濾器上挑取相應(yīng)菌落，然后經(jīng)繁殖與第二個(gè)菌落篩選中進(jìn)行并排比較。為此目的，將分離的細(xì)菌以及表達(dá)對(duì)照Lcn2突變蛋白(例如野生型脂質(zhì)運(yùn)載蛋白)的細(xì)菌點(diǎn)到新鮮的親水膜上，然后使之生長(zhǎng)直到小菌落可見。對(duì)DIG標(biāo)記的Trx-AP 28以及DIG標(biāo)記的對(duì)照蛋白Trx和Ova測(cè)試結(jié)合情況。將在第二個(gè)篩選中對(duì)Trx-A ^ 28靶標(biāo)產(chǎn)生特異信號(hào)的Lcn2突變蛋白進(jìn)一步繁殖以進(jìn)行質(zhì)粒分離和之后的序列分析。實(shí)施例7 :可溶產(chǎn)牛和鈍化對(duì)A 13和ED-B特異的Lcn2突奪蛋白通過在大腸桿菌BL21 (Studier 和 Moffat (1986) J. Mol. Biol. 189， 113-130)、大腸桿菌 W3110 (Bachmann (1990) Microbiol. Rev. 54，130-197)、大腸桿菌JM83 (Yanisch-Perron 等人(1985) Gene 33, 103-119)或大腸桿菌 supE 菌株 TGl-F-(大腸桿菌 K12 TGl 的一種衍生物[Kim 等人(2009) J. Am.，Chem. Soc. 131，3565-3576]，使用吖啶橙由其游離基因而加工而成)的外周胞質(zhì)分泌，產(chǎn)生重組Lcn2及其突變蛋白，為了進(jìn)行可溶蛋白表達(dá)，使用質(zhì)粒phNGAL98 (SEQ ID NO: 27)，其編碼OmpA信號(hào)肽與成熟Lcn2蛋白(SEQ ID NO: 28)和C端Str印-標(biāo)簽II的融合蛋白，由此該質(zhì)粒攜帶用于單向亞克隆該突變的基因盒的兩個(gè)不相容的BstXI限制性位點(diǎn)。通過Strep-標(biāo)簽 IKSchmidt 和 Skerra (2007) Nat. Protoc. 2, 1528-1535)、然后通過使用 PBS 緩沖液在 Superdex 75 HR10/30 柱子(Amersham-Pharmacia, Freiburg,Germany)上進(jìn)行尺寸排阻色譜(SEC),親和純化該可溶蛋白。通過SDS-PAGE (Fling和Gregerson (1986) Anal. Biochem. 155, 83-88)檢測(cè)蛋白純度。通過在 280 nm下使用下述計(jì)算的消光系數(shù)進(jìn)行吸光度測(cè)量，測(cè)定蛋白濃度對(duì)于野生型Lcn2 (SEQ ID NO: 44)為31400 IT1CnT1,對(duì)于 A 3 特異突變蛋白 Hl-Gl (SEQ ID NO: 43)為 26930 M'nT1、對(duì)于 S1-A4(SEQ ID NO: 38)為 24410 M'nT1，對(duì)于 US7 (SEQ ID NO: 41)為 26930 M-1Cm' ED-B 特異Lcn2突變蛋白的計(jì)算的消光系數(shù)為對(duì)于突變蛋白N7A (SEQ ID NO: 20)為37930M4CnT1,對(duì)于 N7E (SEQ ID NO: 22)為 22920 M'nT1，對(duì)于 N9B (SEQ ID NO: 24)為 21430M4CnT1,對(duì)于 NlOD (SEQ ID NO: 26)為 39420 M-1CnT1 (Gasteiger 等人，上文)。實(shí)施例8 :在ELISA實(shí)驗(yàn)中測(cè)量對(duì)不同A P靶標(biāo)的結(jié)合活件為了選擇性捕獲攜帶C 端 Strep-標(biāo)簽 II (Schmidt 和 Skerra (2007) Nat.Protoc. 2，1528-1535)的 Lcn2突變蛋白，在4。C下用 PBS 中的 10 Pg/mL Str印MAB-Immo(IBA, Gottingen, Germany)包被 96 孔 MaxiSorp 聚苯乙烯微量滴定板(Nunc,Langenselbold, Germany)過夜,然后在室溫下用PBS/T中的3 % (w/v) BSA封閉I個(gè)小時(shí)。在用PBS/T的3次洗滌步驟之后，將50 ML來自實(shí)施例7的經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白的I剛?cè)芤簯?yīng)用到全部孔中I個(gè)小時(shí)。洗滌之后，加入50 ML來自實(shí)施例2的系列稀釋的生物素化的靶標(biāo)A P 40、MBP-A P 40或Trx-A ^ 28并孵育I個(gè)小時(shí)，由此將來自實(shí)施例2的生物素化形式的0va、MBP和Trx用作陰性對(duì)照蛋白。再次洗滌各孔，然后用PBS/T中1:5000稀釋的 50 ML 的 ExtrAvidin/AP 綴合物(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)檢測(cè)結(jié)合的綴合物 I 個(gè)小時(shí)，之后在 100 mM Tris/HCl，pH 8. 8，100 mM NaClj 5 mM MgCl2 中的 1000.5 mg/mL對(duì)硝基苯磷酸酯(AppliChem，Darmstadt, Germany)存在下進(jìn)行信號(hào)顯示。在 SpectraMax 250 讀板儀(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)中測(cè)量 405 nm 下吸光度 AA/At 的時(shí)間，然后用 KaleidaGraph 軟件(Synergy software, Reading, PA)將數(shù)據(jù)擬合到方程AA = AAmax X [L]tot/ (Kd + [L]tot)中，其中[L]t(rt表示應(yīng)用的配體綴合物的濃度，Kd為解離常數(shù)(Voss和Skerra (1997)Protein Eng. 10, 975-982)?；蛘?，為了進(jìn)行“直接"ELISA，將2剛來自實(shí)施例2的未標(biāo)記的A P 40靶標(biāo)吸附到96孔MaxiSorp聚苯乙烯微量滴定板(Nunc, Langenselbold, Germany)上,然后用經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白孵育，其經(jīng)由Strep-標(biāo)簽II、使用1:1500稀釋的鏈霉親和素/AP綴合物(GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK)進(jìn)行檢測(cè)。作為對(duì)照,將來自實(shí)施例2的2M-M MBP 吸附到 ELISA 板上。在 SpectraMax 250 讀板儀(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)中測(cè)量405 nm下的吸光度?；蛘?，以與上文描述的“捕獲”ELISA相似的方式進(jìn)行“競(jìng)爭(zhēng)性”ELISA。再次地，在固定Str印MAB-Immo并洗滌之后，將50 ML來自實(shí)施例7的經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白的I剛?cè)芤簯?yīng)用到全部孔中I個(gè)小時(shí)。洗滌之后，在不同濃度的游離未標(biāo)記的靶標(biāo)作為競(jìng)爭(zhēng)物存在下，應(yīng)用固定濃度為5 nM (對(duì)于S1-A4)或40 nM (對(duì)于US7)的來自實(shí)施例2的生物素化的靶標(biāo)Trx-A P 28。以100倍過量開始，在每個(gè)步驟中以2倍降低競(jìng)爭(zhēng)物濃度。在這種情況下，將數(shù)據(jù)擬合為sigmoidal方程AA= (AAfflax - AAfflin)/(1+ ([L]totfree/KD)p) + AAfflin其中將曲線斜率p (Hill系數(shù))作為其它參數(shù)。下表I總結(jié)了在不同ELISA程序中以及在表面等離子體共振(參見實(shí)施例9)中測(cè)定的Kd值。表I:
__K |iiM| _
__S1-A4US7 Hl-Gl
A 40 (捕獲 ELISA,參見圖 5)2.7 ±0.1 6.8 ±0.4 16.2 ±1.9
Trx-A 28 (捕獲 ELIS A，參見圖 5) 1.9±0.1 2.4 士 0.2 24.3 士 3.8 MBP-A 40 (捕獲 ELISA，參見圖 5) 4.7 士 0.1 丨 1.4 土 0.6 n.d.A 16-27 (捕獲 ELISA,參見圖 5) 2.6 士 0.3 2.1 ±0.1 n.d.
Trx-A 28 (直接 ELISA,參見圖 6) 16.2 士 4.4 9.6 士丨.7 290 士 62 MBP-A 40 (直接 ELISA,參見圖 6)丨49 士 31 49.7 土 8.1 n.d.
Trx-A 28 (競(jìng)爭(zhēng)性 ELISAt 參見圖 7) 21.7 士 1.5 76.9 士 4.5 n.d.
MBP-A 40 (SPR,參見圖8，實(shí)施
例 9)_ 1.71.3n.d.實(shí)施例9 :經(jīng)由表面等離子體共振(SPR)測(cè)量對(duì)A 13的結(jié)合活件
在Biacore X system (Biacore, Uppsala, Sweden)上、使用 PBS/T (含有 0. 005% (v/v) Tween 20的PBS)作為流動(dòng)緩沖液，進(jìn)行Lcn2突變蛋白的實(shí)時(shí)分析。使用標(biāo)準(zhǔn)的胺偶聯(lián)化學(xué)，將來自實(shí)施例2的MBP-A P 40在10 mM乙酸鈉，pH 4. 5中的50 l^g/mL溶液固定到 CMD 2001 芯片(Xantec, Diisseldorf, Germany)上，從而得到 1455 共振單位(RU)的配體密度。以范圍為2 nM至125 nM的濃度和10 ML/min的流量應(yīng)用來自實(shí)施例7的經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白S1-A4和US7。通過減去針對(duì)對(duì)照通道測(cè)得的相應(yīng)信號(hào)，校正感應(yīng)譜，所述對(duì)照通道已被活化且用乙醇胺封閉。通過用BIAevaluation軟件V 3. 0 (Karlsson等人(1991) J. Immunol. Methods 145，229-240)擬合，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)評(píng)估。在此步驟期間，整體擬合km和kf速率，而對(duì)每條曲線局部地?cái)M合最大響應(yīng)差異Rmax。實(shí)施例10 :經(jīng)由SPOT臘h的表位作圖確定A P表位在如Frank ((2002) J. TmmunoI. Methods 262, 13-26)描述的自動(dòng)化程序中，使用MultiPep RS儀器(Intavis, Koln, Germany)和來自同一供應(yīng)商的活化氨基酸,制備用于進(jìn)行Lcn2突變蛋白S1-A4和US7的A P表位作圖的SPOT膜(Amino-PEG500_UC540片，100 X 150 mm, Intavis, Koln, Germany)。在膜上以連續(xù)的六聚體、十聚體和十五聚體合 成A P 40氨基酸序列(SEQ ID NO: 29)，每一個(gè)均具有I個(gè)氨基酸的錯(cuò)位，從而覆蓋整個(gè)序列。這些肽的C端共價(jià)地連接到膜上，而它們的N端被乙酰基化。固定的Str印-標(biāo)簽II用作該檢測(cè)方法的陽(yáng)性對(duì)照。用95 % 三氟乙酸(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)、3 % 三異丙基娃燒(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)和2 %蒸懼水進(jìn)行側(cè)鏈脫保護(hù)2個(gè)小時(shí)。在用二氯甲燒(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)洗漆膜4次、用二甲基甲酰胺(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)洗漆兩次和用乙醇洗漆兩次之后,風(fēng)干該膜。在使用之前，該膜用乙醇洗滌一次、用PBS (4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mMNaCl, pH 7. 4)洗滌3次，然后用PBS/T(含有0. I % (v/v) Tween 20 的PBS)中的3 % (w/v)BSA封閉I個(gè)小時(shí)。在用PBS/T洗滌3次之后，將膜用PBS/T中的Lcn2突變蛋白S1-A4 (50nM)、US7 (100 nM)或野生型Lcn2 (100 nM)孵育I個(gè)小時(shí)，然后用PBS/T洗滌3次。然后，用 PBS/T 中的 1:1500 稀釋的鏈霉親和素/AP 綴合物(GE Healthcare, Buckinghamshire,UK)孵育該膜I個(gè)小時(shí)，以經(jīng)由Strep-標(biāo)簽II進(jìn)行蛋白檢測(cè)。之后，將該膜用PBS/T洗滌 3 次，在 AP 緩沖液(100 mM Tris/HCl, pH 8.8，100 mM NaCl, 5 mM MgCl2)中洗滌 I次，然后用5-溴-4-氯-3-n引哚基磷酸酯、4-甲苯胺藍(lán)(BCIP; AppliChem, Darmstadt,Germany)和氮藍(lán)四唑(NBT; AppliChem, Darmstadt, Germany)在 AP 緩沖液進(jìn)行顯色反應(yīng)，如 Schlehuber 等人((2000) J. Mol. Biol. 297，1105-1120)所述。比較分別用S1-A4和野生型Lcn2孵育的膜，僅在用S1-A4孵育膜后產(chǎn)生了明顯的點(diǎn)，而在用野生型Lcn2孵育膜后沒有產(chǎn)生。在十五聚體A 3 40片段的情況下，基序LVFFAED看起來對(duì)于S1-A4的結(jié)合是重要的。在較短的六聚體和十聚體肽序列的情況下，檢測(cè)到S1-A4結(jié)合到最小基序VFFAED和FFAEDV。在此分析中，Lcn2突變蛋白US7顯示了類似的表位圖譜。實(shí)施例11 :在ThT聚集分析講行與A P具有親和力的Lcn2突變蛋白的功能分析在存在或不存在各種Lcn2突變蛋白的情況下，使來自實(shí)施例2的固定和均勻單體的非生物素化的AP 40進(jìn)行 thioflavin T聚集分析。Thioflavin T (ThT; Sigma-Aldrich,Steinheim, Germany)與富含P _片層的淀粉樣纖維和低聚前體特異地結(jié)合，但是不與單體AP肽結(jié)合,所述結(jié)合伴隨著ThT突光的增加(Khurana等人(2005) J. Struct. Biol.151， 229-238)。為此，將ThT溶解于蒸餾水至濃度為I mM。通過用5 mM甘氨酸/NaOH，pH 8. 5將I mM母液稀釋到終濃度為5剛制備工作溶液。在37 ° C下無需攪拌，孵育500 ML 200m 40在蒸餾水中的I: I混合物(根據(jù)實(shí)施例2進(jìn)行溶解)和PBS中的來自實(shí)施例7的20 m Lcn2突變蛋白。在不同時(shí)間點(diǎn)的每次熒光測(cè)量之前，短暫渦旋樣品10次，將20 ML的各樣品與180 ML ThT工作溶液混合。在突光分光儀(LS 50 B, Perkin Elmer, Waltham,USA)中，用450 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和482 nm的發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量熒光強(qiáng)度。如圖9所示，Lcn2突變蛋白US7顯示了 1:10的比率的A P 40聚 集強(qiáng)抑制。實(shí)施例12 :制備含有額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)的重組纖連蛋白片段將人纖連蛋白的3種不同重組片段用作選擇的靶標(biāo)僅額外結(jié)構(gòu)域-B (命名為ED-B; Zardi 等人(1987) EMBO Journal, 6，2337-2342);在其相鄰結(jié)構(gòu)域 7 和 8 中的相同結(jié)構(gòu)域(稱為FN7B8);和包含常規(guī)結(jié)構(gòu)域7、8和9的FN789，因而缺少ED-B (Carnemolla等人(1996)，Int. J.癌癥，68，397-405 ;Leahy 等人(1994) Proteins 19，48-54)。將FN7B8、FN789 和 ED-B 的編碼序列克隆在載體 pASK75 (Skerra (1994) Gene151，131-135)或其衍生物 pASG-IBA-33 (IBA, G5ttingen, Germany)上，從而分別得到pASK75-FN7B8 (SEQ ID NO: 13)、pASK75_FN789 (SEQ ID NO: 17)和 pASG-IBA_33_EDB(SEQ ID NO: 15)。全部構(gòu)建體在羧基端提供His6標(biāo)簽，以經(jīng)由固定化金屬親和色譜(IMAC)進(jìn)行純化，在大腸桿菌TG1/F—[大腸桿菌K12 TGl的衍生物(Gibson (1984) Studies onthe Epstein-Barr virus genome, Cambridge University, England)]或 BL21 (Studier和Moffatt (1986)，189，113-130)的細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生了可溶蛋白。因此，在37 ° C下在含有100呢/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，使攜帶該表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌的2L培養(yǎng)物生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期中期。加入200吒/L無水四環(huán)素(Acros，Geel, Belgium)之后，在37° C下繼續(xù)生長(zhǎng)5至7個(gè)小時(shí)。通過離心濃集細(xì)胞，重懸于35 ml冰冷的色譜緩沖液(40 mM Hepes/NaOH,
I M NaCl, pH 7.5)中，然后通過超聲(S250D, Branson, Danbury CT, USA)裂解。下文給出的純化操作程序?qū)τ谌咳N重組纖連蛋白片段而言是相同的。將經(jīng)澄清的裂解液施加于 Zn2+/IDA_Sepharose 柱子(GE Healthcare, Munich, Germany),所不柱子裝有10 mM ZnSO4并用40 mM Hepes/NaOH, I M NaCl, pH 7. 5平衡。用色譜緩沖液中的0至300 mM咪唑(用HCl調(diào)節(jié)pH)之間的淺梯度洗脫結(jié)合的蛋白。通過混合了終濃度為I mM的EDTA的SDS-PAGE鑒定含有重組蛋白的級(jí)分，然后針對(duì)20 mM Hepes/NaOH, pH 7. 4透析過夜。之后，將蛋白裝載于離子交換色譜柱子(Resource Q, GE Healthcare, Munich,Germany)上,所示柱子用20或40 mM Hepes/NaOH, pH 7. 4平衡。為了洗脫結(jié)合的纖連蛋白片段，使用0至300 mM NaCl的梯度。最后，通過SDS-PAGE分析和尺寸排阻色譜確定蛋白的純度。為了通過280 nm處的吸光度測(cè)量測(cè)定蛋白的濃度，使用下述計(jì)算的消光系數(shù)(Gasteiger等人(2003) NucleicAcids Res. 31，3784-3788):對(duì)于 FN7B8 為 31，400W1，對(duì)于 FN789 為 28420 ifW1，對(duì)于ED-B為11460 M-1Cm'通常，每2L搖瓶培養(yǎng)物獲得約10至20 mg經(jīng)純化的蛋白。將經(jīng)純化的蛋白保存于4° C下，用于全部實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)供應(yīng)商的手冊(cè)，在室溫下，以過量(4:1摩爾比率)的洋地黃毒苷-3-0-甲基羰基-e -氛基己酸-N-輕基玻拍酸亞胺酷(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)進(jìn)行I個(gè)小時(shí)的經(jīng)純化纖連蛋白片段的洋地黃毒苷標(biāo)記。為了去除游離的洋地黃毒苷，將蛋白溶液施加于 F1D-IO 脫鹽柱子(GE Healthcare, Munich, Germany),所示柱子用 40 mM Tris/HCl, 115 mM NaCl和I mM EDTA, pH 7. 5平衡。通過SDS_PAGE、ESI質(zhì)譜或經(jīng)由用抗洋地黃毒苷_AP、Fab片段(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)染色的點(diǎn)印記檢查洋地黃毒苷化成功與否和蛋白的完整性。實(shí)施例13 :通討噬菌體展示詵擇與ED-B具有親和力的Lcn2奪體使用基于合成的基因集合的Lcn2隨機(jī)噬菌粒文庫(kù)進(jìn)行一共4個(gè)噬菌粒展示選擇循環(huán)，所示合成的基因集合最初由Sloning BioTechnology GmbH合成，如實(shí)施例I中所述。對(duì)于第一個(gè)選擇循環(huán)，將約5xl012個(gè)重組噬菌粒溶解于補(bǔ)充了 50 mM苯甲脒的300
L TBS/E (40 mM Tris/HCl, 115 mM NaCl and I mM EDTA, pH 7. 4)中，然后通過加入TBS 中的 100 M-L 8 % (w/v) BSA (Sigma-Aldrich, Munich, Germany)封閉 30 分鐘，所述 TBS含有0. 4 % (v/v) Tween 20 [聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯；AppliChem, Darmstadt,Germany])。然后用抗洋地黃毒苷 IgG 磁珠(Europa Bioproducts, Cambridge, UK)將此溶液孵育I個(gè)小時(shí)，所述磁珠已經(jīng)用TBS/T (含有0.1 % (v/v) Tween 20的TBS)中的2 %(w/v) BSA封閉了 I個(gè)小時(shí)，并裝載了 400耵的0，1 m洋地黃毒苷標(biāo)記的重組FN7B89(參見實(shí)施例12)。在經(jīng)由磁體收集珠子并丟棄上清液之后，用TBS/T進(jìn)行10個(gè)洗滌步驟，然后首先用400 m的0. I M三乙基胺(未調(diào)節(jié)pH)洗脫剩余結(jié)合的噬菌粒6分鐘，然后用350 W的0. I M甘氨酸/HCl pH 2. 2第二次洗脫8分鐘。收集洗脫液，然后分別用適合量的2 M乙酸或50 W 0.5 M Tris堿立刻中和，合并，并用于感染指數(shù)生長(zhǎng)的大腸桿菌XLl-Blue。滴定噬菌粒，然后在根據(jù)已公開的操作程序進(jìn)行下一個(gè)淘洗步驟之前再次擴(kuò)增(Beste等人(1999) PNAS 96，1898-903 ;Schlehuber 等人(2000) J Mol Biol 297 1109-20)。對(duì)于第二輪選擇，使用約2xl012個(gè)擴(kuò)增的噬菌粒，并通過與400 W的231 nmol/ml游離重組ED-B競(jìng)爭(zhēng)而洗脫結(jié)合的噬菌粒75分鐘。在第三和第四個(gè)選擇循環(huán)中，首先用100 nM洋地黃毒苷標(biāo)記的FN7B8將約2xl012個(gè)擴(kuò)增的噬菌粒孵育I個(gè)小時(shí)。然后，在抗洋地黃毒苷IgG磁珠上捕獲噬菌粒-抗原復(fù)合物20分鐘。用TBS/T洗滌珠子10次之后，通過與400 W的140至231 nmol/ml游離重組ED-B競(jìng)爭(zhēng)而洗脫結(jié)合的噬菌粒75分鐘。實(shí)施例14 :通過篩詵ELISA詵擇與ED-B具有親和力的Lcn2變體通過篩選ELISA監(jiān)測(cè)Lcn2突變蛋白的富集，所述Lcn2突變蛋白由實(shí)施例13中描述的噬菌體展示選擇得到，特異性地結(jié)合靶標(biāo)蛋白ED-B。使用來自上一個(gè)淘洗步驟的合并的質(zhì)粒制備物，經(jīng)由BstXI將經(jīng)突變的基因盒亞克隆到表達(dá)質(zhì)粒phNGAL98上，其編碼用于在大腸桿菌中外周胞質(zhì)產(chǎn)生的OmpA信號(hào)肽和具有C端Strep-標(biāo)簽II (Schmidt andSkerra (2007) Nat. Protoc. 2，1528-1535)的Lcn2編碼區(qū)的融合蛋白。如下進(jìn)行在96孔板中可溶表達(dá)各Lcn2突變蛋白用隨機(jī)挑選的單個(gè)菌落接種含有100 ^g/ml氨芐西林的 100 M-I TB 培養(yǎng)基(Tartof 和 Hobbs (1987) Bethesda Research Laboratory Focus 9,12),然后在37° C下振搖(500至800 rpm; Thermomixer comfort; Eppendorf, Hamburg,Germany)孵育5個(gè)小時(shí)。對(duì)于每個(gè)克隆，用10 W該培養(yǎng)物接種100 W的新鮮培養(yǎng)基，然后在37° C下振搖孵育I至2個(gè)小時(shí)，然后將溫度降低至22° C。進(jìn)一步孵育2-4小時(shí)之后,用0. 2 Mg/ml無水四環(huán)素(Acros, Geel, Belgium)在指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞中表達(dá)Lcn2突變蛋白12-14個(gè)小時(shí)。在室溫下并振搖,通過加入含有l(wèi)mg/ml溶菌酶(Roche Diagnostics,Mannheim, Germany)的 40 2xBBS(0. 2 M 硼酸鹽/NaOH, 160 mM NaCl, I mM EDTA, pH8. 0)進(jìn)行蛋白的外周胞質(zhì)釋放I個(gè)小時(shí)。用TBS中的40 10 % w/v BSA(Applichem,Darmstadt, Germany)和0, 5 % Tween-20封閉裂解液I個(gè)小時(shí)，然后通過離心10分鐘,從粗提取物中去除細(xì)胞碎片。為了將FN7B8 或 FN789 吸附在 96 孔 Nunc Maxisorp 板 (Thermo FisherScientific, Langenselbold, Germany)的表面上，每孔加入 50 的 TBS 中的 100 M-g/ml蛋白溶液，然后在4° C下孵育過夜。在用TBS/T的三次洗滌步驟之后，在室溫下，用TBS/T中的2 % (w/v) BSA封閉孔3個(gè)小時(shí)，并且在暴露于來自大腸桿菌的粗提取物之前重復(fù)洗滌。為了進(jìn)行ELISA，每孔施加50 W的經(jīng)澄清的裂解液，孵育I個(gè)小時(shí)，然后用TBS/T洗滌三次。用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物(TBS/T中1:1500; GE Healthcare, Munich,Germany)，使用底物即 0. I M Tris/HCl, 0. I M NaCl, 5 mM MgCl2, pH 8. 8 中的4-硝基苯憐酸酯(pNpp, 0. 5 mg/ml; AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany),檢測(cè)結(jié)合的 Lcn2 突變蛋白(參見實(shí)施例16)。在此篩選ELISA中鑒定了四個(gè)克隆。在后面的實(shí)驗(yàn)(參見實(shí)施例16_18)中，發(fā)現(xiàn)這四個(gè)Lcn2突變蛋白還在ED-B陽(yáng)性的人結(jié)腸癌細(xì)胞的ELISA、SPR-分析和免疫熒光顯微術(shù)顯示了對(duì)FN7B8的特異結(jié)合活性。將這些Lcn2突變蛋白命名為N7A (SEQ ID NO: 20)、N7E (SEQ ID NO: 22)、N9B (SEQ ID NO: 24)和 NlOD (SEQ ID NO: 26)。實(shí)施例15 Lcn2及其變體的可溶蛋白產(chǎn)牛和純化詳見實(shí)施例7。實(shí)施例16 :在ELISA中測(cè)量對(duì)ED-B的結(jié)合活件為了將FN7B8 或 FN789 吸附到 96 孔 Nunc Maxisorp 板(Thermo FisherScientific, Langenselbold, Germany)的表面上，每孔加入 50 的 TBS 中的 100 M-g/ml蛋白溶液，然后在室溫下孵育2個(gè)小時(shí)。此外，為了包括對(duì)照蛋白，將空白孔暴露于TBS/ET 中的 120 M-I 2 % (w/v) BSA (AppliChem, Darmstadt, Germany) 在三次洗漆步驟之后，用 TBS/ET 中的 120 M-I 2 % (w/v) BSA (AppliChem, Darmstadt, Germany)封閉孔 2個(gè)小時(shí)，并且重復(fù)洗滌，然后加入50 ML系列稀釋的經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白并孵育I個(gè)小時(shí)。再次洗滌各孔，然后用TBS/T中1:1500稀釋的50 ML鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物(GE Healthcare, Munich, Germany)檢測(cè)結(jié)合的Lcn2突變蛋白I個(gè)小時(shí)，之后在100mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 8. 8 中的 50 ML 0. 5 mg/mL 對(duì)硝基苯磷酸酯(AppliChem, Darmstadt, Germany)存在下進(jìn)行信號(hào)顯不。在 SpectraMax 250 讀板儀(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中測(cè)量405 nm下吸光度AA/At的時(shí)間，然后用KaleidaGraph 軟件(Synergy software, Reading, PA)將數(shù)據(jù)擬合到方程AA = AAmax x [L]tot/(KD + [L]tJ其中[L]t(rt表示應(yīng)用的配體綴合物的濃度，Kd為解離常數(shù)(Voss和Skerra (1997)Protein Eng. 10，975-982)。發(fā)現(xiàn) Lcn2 變體 N7A、N9B 和 NlOD 以 14. 8 nM (N7A)、40. I nM(N9B) ,30. 0 nM (N7E)和51. 2 (NlOD)的Kd值特異性地結(jié)合FN7B8，但是不結(jié)合FN789或BSA。實(shí)施例17 :經(jīng)由表面等離子體共振(SPR)測(cè)暈對(duì)重組纖連蛋白FN7B8的結(jié)合活性在BIAcore X 系統(tǒng)(BIAcore, Uppsala, Sweden)上，使用 HBS/ET(20 mM Hepes,pH 7.5，150 mM NaCl, I mM EDTA，含有 0.005 % (v/v) Tween 20)作為流動(dòng)緩沖液，進(jìn)行Lcn2突變蛋白的實(shí)時(shí)分析。使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)(Biacore, Uppsala, Sweden),將10 mM乙酸鈉，pH 4. 0中的200 l^g/ml重組FN7B8溶液固定在CMD 200 m傳感器芯片(XanTecbioanalytics, Duesseldorf, Germany)上，從而得到約500共振單位(RU)的配體密度。以25 m/min的流量、以2. 5至160 nM的濃度應(yīng)用經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白。
通過減去針對(duì)對(duì)照通道測(cè)得的相應(yīng)信號(hào)，校正感應(yīng)譜，所述對(duì)照通道已被活化且用乙醇胺封閉。通過用 BIAevaluation 軟件 V 4. I (Karlsson 等人(1991) J. TmmunoI.Methods 145，229-240)擬合，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)評(píng)估。表2.通過表面等離子體共振測(cè)定所選擇的Lcn2突變蛋白對(duì)FN7B8的動(dòng)力學(xué)結(jié)合數(shù)據(jù)。
Lcn2 變體 Ikon [M-V]Ikoff [s-1]|Kd [M]
N7A4.6x10 2.6xlCT25.8xl0_9
N7E4. IxlO63. OxlCT27.2xlCT9
N9B2. IxlO67. 5xl0_23.6xlCT8
NlODL 5x10 5.8xl0_23.8xlCT8實(shí)施例18 :免瘡染色ED-B陽(yáng)件的CaCo2細(xì)朐在37° C下和加濕氣氛中，在Nunc Lab-Tek II室載玻片 系統(tǒng)(每個(gè)載玻片4個(gè)室；Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Germany)上、在 MEM 中，培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞(CaCo2 細(xì)胞由 H. Daniel, Technische Universitat Miinchen, Germany 友情提供；Pujuguet等人，Am. J. Pathol. 148，579-592)，所述MEM具有依格氏鹽和L-谷氨酰胺，并補(bǔ)充了 10 %胎牛血清、Ix MEM非必需氨基酸和50 Mg/ml慶大霉素(PAA Laboratories,Pasching, Austria)，直到細(xì)胞匯合度為約50至70 %。用PBS (無Ca2+和Mg2+的杜氏;PAA Laboratories, Pasching, Austria)、然后用蒸懼水洗漆附著于載玻片的細(xì)胞單層，之后固定，用含有5 Mg/ml DAPI (4、6-二脒基-2-苯基卩引哚；Sigma-Aldrich, Munich,Germany )的冰冷甲醇復(fù)染5分鐘。在暗處進(jìn)行后續(xù)全部孵育。洗滌固定的細(xì)胞，然后用500 m I剛野生型Lcn2、Lcn2 突變蛋白、PBS 或 ED-B 特異抗體 scFv-L19 (Pini 等人(1998) J. Biol. Chem. 273，21769-21776)孵育I小時(shí)。這些試劑全部純化為Str印-標(biāo)簽II融合蛋白(Schmidt和Skerra,上文)。用PBS洗漆細(xì)胞,然后用未標(biāo)記的抗體StrepMABimmo (PBS中5 Mg/ml;IBA, G5ttingen, Germany)孵育I小時(shí)，之后進(jìn)行2個(gè)洗滌步驟。最后，使用PBS中1:200稀釋的熒光標(biāo)記的抗小鼠IgG (H+L) F(ab')2片段Dylight-488綴合物(Cell SignalingTechnology, Danvers, USA)作為第二抗體,檢測(cè)與CaCo2細(xì)胞的特異結(jié)合。當(dāng)在Axiovert40 CFL顯微鏡(Carl Zeiss, Gottingen, Germany)下觀察時(shí)，全部Lcn2變體以及抗體scFv-L19顯示了特異的細(xì)胞染色，而重組野生型Lcn2和PBS在此分析中顯示了可忽略的信號(hào)。實(shí)施例19 :經(jīng)由在位置36處的Hl-Gl中交換自由的半胱氨酸殘基，產(chǎn)生A g特異的Lcn2突奪蛋白HlGA和HlGV提供定點(diǎn)突變將Cys36替代為Ala或Val。為此，用簡(jiǎn)并寡脫氧核苷酸DH_4 (SEQID NO: 45)和第二寡脫氧核苷酸J08rev (SEQ ID NO: 48)以及編碼Lcn2突變蛋白Hl-Gl的質(zhì)粒DNA作為模板(SEQ ID NO: 37)，進(jìn)行PCR。經(jīng)由BstXI將擴(kuò)增的片段亞克隆在表達(dá)質(zhì)粒phNGAL98上并測(cè)序，從而鑒定各替換變體。取決于引入的氨基酸交換，將所得的Lcn2變體命名為 HlGA (SEQ ID NO: 49，50)和 HlGV (SEQ ID NO: 51，52)。實(shí)施例20 :使用大腸桿菌培養(yǎng)物，以高光密度可溶產(chǎn)生和純化新的Ag特異的 Lcn2突奪蛋白HlGA和HlGV通過在大腸桿菌JM83中外周胞質(zhì)分泌產(chǎn)生重組Lcn2及其突變蛋白。為了進(jìn)行可溶蛋白表達(dá)，使用了具有編碼HlGA (SEQ ID NO: 49)或HlGV (SEQ ID NO: 51)的相應(yīng)BstXI插入片段的質(zhì)粒phNGAL98。在攪拌下于22 ° C，在含有100 mg/L氨芐西林(Amp)的2 L LB培養(yǎng)基中使培養(yǎng)物生長(zhǎng)。通過加入無水四環(huán)素(aTc)至終濃度為0. 2 mg/L，在OD550 = 2 . 5的細(xì)胞密度時(shí)，誘導(dǎo)基因表達(dá)。在孵育5個(gè)小時(shí)之后，通過離心收集細(xì)胞，重懸于40 mL含有0.1 mg/mL溶菌酶的冰冷的外周胞質(zhì)分級(jí)緩沖液(0.5 M蔗糖，I mM EDTA,100 mM Tris-HCl pH 8.0)中，然后在冰上孵育30分鐘。通過重復(fù)離心沉淀所得的球形體，然后揮手含有可溶重組蛋白的上清液。通過Strep-標(biāo)簽II經(jīng)親和純化可溶蛋白，然后在Superdex 75 HR 10/30柱子上使用 PBS 緩沖液(4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7.4)進(jìn)行尺寸排阻色譜(SEC)。通過SDS-PAGE檢查蛋白純度。通過在280 nm下使用AP特異的突變蛋白HlGA(SEQ ID NO: 50)和HlGV (SEQ ID NO: 52)的計(jì)算的消光系數(shù)27055 M-lcm-l進(jìn)行吸光度測(cè)量，測(cè)定蛋白濃度。實(shí)施例21 :在BiacoreX儀器上經(jīng)由表面等離子體共振測(cè)量對(duì)MBP-A P 40的結(jié)合活性在BiacoreX系統(tǒng)上使用 PBS/T (4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH7. 4，含有0. 005 % (v/v) Tween 20)作為流動(dòng)緩沖液，進(jìn)行Lcn2突變蛋白HlGA或HlGV與MBP-AMO (SEQ ID NO: 33)之間的相互作用的實(shí)時(shí)分析。使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)，將10 mM乙酸鈉，pH 4. 5中的來自實(shí)施例2的MBP-A ^ 40的15 l^g/mL溶液固定到CMD 2001芯片(Xantec, Diisseldorf, Germany)上，從而得到1316共振單位(RU)的配體密度。以4 nM至128 nM范圍的濃度、以20 ML/min的流量應(yīng)用來自實(shí)施例20的經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白HlGA和H1GV。通過減去針對(duì)對(duì)照通道(已被活化且用乙醇胺封閉)測(cè)得的相應(yīng)信號(hào)，以及減去針對(duì)緩沖液注入的平均值測(cè)得的信號(hào)，對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行雙重參照。整體使用BIAevaluation軟件 V 3. 0 (Karlsson 等人(I99I) J. TmmunoI. Methods 145, 229-240)擬合動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。實(shí)施例22 :在Biacore TlOO儀器上經(jīng)由表面等離子體共振測(cè)量對(duì)A P 40的結(jié)合活性在BiacoreTlOO 系統(tǒng)(Biacore, Uppsala, Sweden)上使用 PBS/T (4 mM KH2PO4,16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7. 4，含有 0.005 % (v/v) Tween 20)作為流動(dòng)緩沖液，進(jìn)行Lcn2突變蛋白HlGA與A MO (SEQ ID NO: 29)之間的相互作用的實(shí)時(shí)分析。使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)，將10 mM乙酸鈉pH 4. 5中的來自實(shí)施例2的A P 40的10 l^g/mL溶液固定到CMD芯片(Biacore, Uppsala, Sweden)上,從而得到325 RU的配體密度。以I nM至32nM范圍的濃度、以30 ML/min的流量應(yīng)用來自實(shí)施例20的經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白H1GA。注入的系列稀釋的HlGA的連接和解離時(shí)間均為300 S，以獲得km信息。為了準(zhǔn)確測(cè)定低kf速率，使用7200 s的解離時(shí)間分析最高濃度。如實(shí)施例21中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙重參考。使用Biacore TlOO Evaluation軟件V2. 0. 3進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和動(dòng)力學(xué)擬合,從整個(gè)數(shù)據(jù)組測(cè)得了結(jié)合反應(yīng)的km和k。#整體使用I: I結(jié)合模型擬合數(shù)據(jù)。實(shí)施例23 :在ThT聚集分析中對(duì)Lcn2突奪蛋白HlGA講行功能分析
為了進(jìn)行Thioflavin T (ThT)聚集分析，將合成的A P肽(SEQ ID NO: 29)在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)中溶解 12 個(gè)小時(shí)。在真空蒸發(fā)HFIP，并將AP溶解于合適體積的雙蒸水中，在4 ° C下超聲15分鐘，然后過濾(Costar Spin-X離心管過濾器醋酸纖維素膜，0. 45 Mm; Corning Inc. , Corning,NY)。然后立刻將溶解的單體AP用于聚集分析。在不存在或存在不同摩爾比率的Lcn2突變蛋白或BSA的情況下，在0.5 x PBS中于37 ° C下并攪拌，孵育500 W的I mg/ml 。一式三份地制備聚集反應(yīng)。為了進(jìn)行熒光測(cè)量，將周期性取得的20 m樣品與終濃度為0. 5 X PBS中50 m的180 m ThT混合，然后使用 FluoroMax-3 突光光度儀(H0RIBA Jobin Yvon, Grasbrunn, Germany)以 450 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和482 nm的發(fā)射波長(zhǎng)分析。實(shí)施例24 :經(jīng)由表面等離子體共振(SPR)測(cè)量對(duì)重組纖連蛋白單個(gè)結(jié)構(gòu)域ED-B的結(jié)合活性在BIAcore X 儀器上，使用 HBS/ET (20 mM Hepes, pH 7.5，150 mM NaCl, I mMEDTA，含有0.005 % (v/v) Tween 20)作為流動(dòng)緩沖液，進(jìn)行Lcn2突變蛋白的實(shí)時(shí)相互作用分析。使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)，將10 mM乙酸鈉，pH 4. 0中的重組ED-B的100吒/ml溶液固定在CMD 200 m傳感器芯片上，從而得到約180共振單位(RU)的配體密度。以2. 5至160nM的濃度、以25 ML/min的流量應(yīng)用經(jīng)純化的Lcn2突變蛋白。通過減去針對(duì)對(duì)照通道測(cè)得的相應(yīng)信號(hào)，校正感應(yīng)譜，所述對(duì)照通道已被活化且用乙醇胺封閉。通過用BIAevaluation軟件 V 4. I (Karlsson 等人(1991) J. TmmunoI. Methods 145, 229-240)整體擬合,進(jìn)行動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)評(píng)估。在此步驟期間，整體擬合km和kf速率，而對(duì)每條曲線局部地?cái)M合最大響應(yīng)差異1 _。在NlOD的情況下，將異源分析物競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)模型用于數(shù)據(jù)擬合，從而得到兩組動(dòng)力學(xué)常數(shù)。表3.通過表面等離子體共振測(cè)定的Lcn2突變蛋白對(duì)ED-B的動(dòng)力學(xué)結(jié)合數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生源自人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 (Lcn2，hNGAL)的突變蛋白的方法，其中所述突變蛋白以可檢測(cè)的親和力結(jié)合給定非天然靶標(biāo)，所述方法包括 (a)使編碼人Lcn2蛋白的核酸分子發(fā)生突變，所述突變發(fā)生在編碼對(duì)應(yīng)于人Lcn2線性多肽序列的序列位置96、100和106的任何序列位置中的至少一個(gè)的核苷酸三聯(lián)體處，從而得到一種或多種突變蛋白核酸分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其進(jìn)一步包括 (b)在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)在(a)中獲得的所述一種或多種突變蛋白核酸分子，以及 (c)通過選擇和/或分離富集對(duì)給定靶標(biāo)具有可檢測(cè)的結(jié)合親和力的一種或多種突變蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的方法，其進(jìn)一步包括使所述核酸分子發(fā)生突變，所述突變至少發(fā)生在編碼Lcn2的所述序列位置96、100和106中任一個(gè)的核苷酸三聯(lián)體的1、2或全部3個(gè)處。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括使所述核酸分子發(fā)生突變，所述突變至少發(fā)生在編碼hLcn2線性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、103、125、127、132 和 134 中任一個(gè)的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或全部17個(gè)核苷酸三聯(lián)體處。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的方法，其通過僅以核苷酸三聯(lián)體組實(shí)現(xiàn)的替換，使至少在編碼hLcn2線性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 134 中任一個(gè)的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)核苷酸三聯(lián)體處發(fā)生隨機(jī)突變。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在突變期間，編碼半胱氨酸的核苷酸三聯(lián)體不用于替換。
7.—種通過根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的方法可獲得的源自Lcn2蛋白的突變蛋白，所述突變蛋白在對(duì)應(yīng)于Lcn2線性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置中的任一個(gè)處包含至少一個(gè)突變的氨基酸殘基，并且其中所述突變蛋白以可檢測(cè)的親和力結(jié)合給定非天然靶標(biāo)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白在Lcn2線性多肽序列的序列位置96、100和106處包含2或3個(gè)突變的氨基酸殘基。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8所述的突變蛋白，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于Lcn2線性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、103、125、127、132和 134 的序列位置中的任一個(gè)處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)突變的氨基酸殘基。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9中任一項(xiàng)所述的突變蛋白，其在Lcn2線性多肽序列的序列位置 36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 134 中的任一個(gè)處包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17個(gè)突變的氨基酸殘基。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的突變蛋白，其在Lcn2線性多肽序列的序列位置36、40、41、.49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 134 中的任一個(gè)處包含.18、19或20個(gè)突變的氨基酸殘基。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至11中任一項(xiàng)所述的突變蛋白，其中所述非天然靶標(biāo)選自肽、蛋白、蛋白的片段或結(jié)構(gòu)域、和小有機(jī)分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的突變蛋白，其中所述小有機(jī)分子為顯示免疫半抗原的特征的化合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的突變蛋白，其中所述肽具有2-45個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的突變蛋白，其中所述肽為P淀粉樣肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的突變蛋白，其中所述P淀粉樣肽為A￠40肽或A￠42肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白相對(duì)成熟hLcn2野生型氨基酸序列包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸替代，所述氨基酸替代選自Leu36 — Val 或 Cys ;Ala40 — Tyr 或 Lys 或 Val ;Ile41 — Thr 或 Ser 或 Leu ;Gln49 —Leu或Trp ；Leu70 — Gly ；Arg72 — Gly 或Asp ；Lys73 — Leu或Thr 或Asp ；Asp77 — Asn或 His 或 Leu ;Trp79 — Lys ；Asn96 — lie 或 Arg ;Tyrl00 — Gln 或 Arg 或 Glu ;Leul03—Met 或 Arg 或 Gly ;Tyrl06 — Tyr 或 Ala 或 Trp ;Lysl25 — Thr 或 Val 或 Glu ;Serl27—Gly 或 Gln 或 Ala ;Tyrl32 — Met 或 Ser 或 Thr ;以及 Lysl34 — Asn。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的突變蛋白，其具有SEDID NO: 39 (S1-A4)或SEQ ID NO:41 (US7)或 SEQ ID NO: 43 (Hl-Gl)的序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的突變蛋白，其中所述蛋白為纖連蛋白或其結(jié)構(gòu)域。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的突變蛋白，其中所述纖連蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)轭~外結(jié)構(gòu)域B或其片段。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白相對(duì)成熟hLcn2野生型氨基酸序列包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸替代，所述氨基酸替代選自Leu36 — Lys 或Glu 或Arg或Ala ;Ala40 — His 或Met 或Thr 或 Ser ;Ile41 — Asp 或Arg或 Trp 或 Leu ;Gln49 — Arg 或 Ala 或 Tyr ;Leu70 — Leu 或 Arg 或 Met ;Arg72 — Val 或Arg 或 Gln 或 Met ;Lys73 — His 或 Arg 或 Ser ;Asp77 — Asn 或 His 或 Lys 或 Arg ;Trp79—Arg 或 Met 或 Leu ;Asn96 — Lys 或 Ala 或 Ser ;Tyrl00 — Trp 或 Pro 或 Lys ;Leul03—His 或 Pro ;Tyrl06 — Phe 或 Trp 或 Thr ;Lysl25 — Arg 或 His 或 Thr ;Serl27 — Tyr或 Phe Ala ；Tyrl32 — Leu 或 Phe ;Lysl34 — Glu 或 His 或 Gly 或 Phe ;以及 Serl46 —Asn0
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的突變蛋白，其具有SEDID NO: 20 (N7A)或SEQ ID NO: 22(N7E)或 SEQ ID NO: 24 (N9B)或 SEQ ID NO: 26 (NlOD)的序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求7至22中任一項(xiàng)所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白相對(duì)成熟hLcn2野生型氨基酸序列進(jìn)一步包含選自Gln28 — His和Cys87 — Ser的氨基酸替代。
24.根據(jù)權(quán)利要求I至23中任一項(xiàng)所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白在對(duì)應(yīng)于Lcn2線性多肽序列的序列位置137和145的序列位置中的任一個(gè)處不包含突變的氨基酸殘基。
25.根據(jù)權(quán)利要求7至24中任一項(xiàng)所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白相對(duì)成熟hLcn2野生型氨基酸序列包含選自Tyr52 — Gln或Val ;Ser68 — Lys或Asn ;Arg81 —Trp或Asn或His的氨基酸替代。
26.根據(jù)權(quán)利要求7至25中任一項(xiàng)所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白與選自下述的化合物綴合有機(jī)分子、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、有色標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、半抗原、洋地黃毒苷、生物素、細(xì)胞抑制劑、毒素、金屬絡(luò)合物、金屬以及膠體金。
27.根據(jù)權(quán)利要求7至26中任一項(xiàng)所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白在其N端和/或其C端融合至融合配偶體，所述融合配偶體為蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域或肽。
28.根據(jù)權(quán)利要求7至26中任一項(xiàng)所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白與延長(zhǎng)所述突變蛋白的血清半衰期的化合物綴合。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的突變蛋白，其中所述延長(zhǎng)血清半衰期的化合物選自聚亞烷基二醇分子、羥乙基淀粉、免疫球蛋白的Fe部分、免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域、白蛋白結(jié)合肽以及白蛋白結(jié)合蛋白。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的突變蛋白，其中所述聚亞烷基二醇為聚乙二醇(PEG)或其活化的衍生物。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白的融合配偶體為延長(zhǎng)所述突變蛋白的血清半衰期的蛋白結(jié)構(gòu)域。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的突變蛋白，其中所述蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)槊庖咔虻鞍椎腇e部分、免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域、白蛋白結(jié)合肽、或白蛋白結(jié)合蛋白。
33.根據(jù)權(quán)利要求29或32所述的突變蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合蛋白為細(xì)菌白蛋白結(jié)構(gòu)域或脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的突變蛋白，其中所述細(xì)菌白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)殒溓蚓鶪蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
35.根據(jù)權(quán)利要求29或32所述的突變蛋白，其中所述白蛋白結(jié)合肽具有式Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys,其中 Xaa1 是 Asp>Asn>Ser>Thr 或 Trp ；Xaa2 是 Asn、Gln、His、lie、Leu 或 Lys ；Xaa3 是 Ala、Asp、Phe> Trp 或 Tyr ；Xaa4 是 Asp、Gly、Leu、Phe> Ser 或 Thr0
36.根據(jù)權(quán)利要求I至35中任一項(xiàng)所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白以IMM或更低、100剛或更低、I剛或更低、500 nM、200 nM或更低、100 nM或更低、50 nM或更低、10nM或更低、或者I nM或更低的KD結(jié)合所述給定非天然祀標(biāo)。
37.一種核酸分子，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求7至36中任一項(xiàng)所述突變蛋白的核苷酸序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地連接至調(diào)節(jié)序列從而能夠表達(dá)所述核酸分子。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的核酸分子，其包含在載體中。
40.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的核酸分子，其包含在噬菌粒載體中。
41.一種宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求37至40中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
42.一種用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求7至36中任一項(xiàng)所述的突變蛋白的方法，其中通過基因工程方法從編碼所述突變蛋白的核酸開始生產(chǎn)所述突變蛋白、所述突變蛋白的片段或所述突變蛋白的融合蛋白以及另一多肽。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中在細(xì)菌或真核宿主生物體中生產(chǎn)所述突變蛋白并且從此宿主生物體或其培養(yǎng)物中分離所述突變蛋白。
44.一種藥物組合物，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求7至36中任一項(xiàng)所述的突變蛋白。
45.根據(jù)權(quán)利要求7至36中任一項(xiàng)所述的突變蛋白用于結(jié)合/檢測(cè)給定靶標(biāo)的用途，其包括(a)使所述突變蛋白與推測(cè)含有所述靶標(biāo)的測(cè)試樣品接觸，以及 (b)通過合適的信號(hào)檢測(cè)突變蛋白/靶標(biāo)復(fù)合物。
46.根據(jù)權(quán)利要求7至36中任一項(xiàng)所述的突變蛋白用于使化合物以預(yù)先選擇的部位為靶向的用途，其包括 (a)使所述突變蛋白與所述化合物接觸，以及 (b)將突變蛋白/化合物復(fù)合物遞送至所述預(yù)先選擇的部位。
47.根據(jù)權(quán)利要求7至36中任一項(xiàng)所述的突變蛋白用于與給定靶標(biāo)形成復(fù)合物的用途。
48.如權(quán)利要求7至36中任一項(xiàng)限定的突變蛋白用于制備藥物組合物的用途。
49.如權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)限定的突變蛋白的用途，其中所述藥物組合物用于治療神經(jīng)退行性疾病。
50.根據(jù)權(quán)利要求47所述的用途，其中所述神經(jīng)退行性疾病為阿爾茨海默氏病。
51.如權(quán)利要求19至22中任一項(xiàng)限定的突變蛋白的用途，其中所述藥物組合物用于癌癥的治療、纖維化的治療、涉及新血管形成的疾病的治療、或炎癥的治療。
52.一種診斷或分析試劑盒，其包含如權(quán)利要求7至36中任一項(xiàng)限定的突變蛋白。
53.一種治療哺乳動(dòng)物的神經(jīng)退行性疾病的方法，所述方法包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效量的如權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)限定的突變蛋白。
54.一種用于治療哺乳動(dòng)物的選自癌癥、纖維化和炎癥的疾病的方法，所述方法包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效量的如權(quán)利要求17至20中任一項(xiàng)限定的突變蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生突變蛋白的新文庫(kù)和源自人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2(Lcn2，hNGAL)的新突變蛋白以及相關(guān)蛋白，所述蛋白以可檢測(cè)的親和力結(jié)合給定靶標(biāo)。本發(fā)明還涉及編碼這樣的突變蛋白的相應(yīng)的核酸分子以及用于產(chǎn)生所述核酸分子的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于生產(chǎn)這樣的突變蛋白的方法。例如，這樣的突變蛋白可以用于結(jié)合天然生物分子的致病形式，例如阿爾茨海默氏病中的β淀粉樣肽，并使其耗盡，或者可以以與腫瘤新生血管相關(guān)的纖連蛋白額外結(jié)構(gòu)域B為靶向。
文檔編號(hào)G01N33/566GK102770764SQ201080055370
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日
發(fā)明者A·斯克拉, D·欣茲, G·馬欽內(nèi)爾, M·格鮑爾, M·胡爾斯邁爾, S·勞特 申請(qǐng)人:皮里斯股份公司