專利名稱：檢出對(duì)象的檢出方法和定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢出對(duì)象的檢出方法和定量方法。
背景技術(shù)：
一直以來(lái)，可利用乳膠凝集法作為檢出被檢體中的檢出對(duì)象的方法。乳膠凝集法是在檢出生物體試樣等流體中的抗原時(shí)，將擔(dān)載了與抗原特異性結(jié)合的抗體或其片段的乳膠與流體混合，通過(guò)測(cè)定乳膠的凝集程度來(lái)檢出或定量抗原的方法(例如參照專利文獻(xiàn) 1)。根據(jù)該乳膠凝集法，是作為檢體添加的抗原與多種乳膠結(jié)合抗體交聯(lián)，促進(jìn)乳膠的凝集。如上所述，步驟簡(jiǎn)單，因此可以簡(jiǎn)便且迅速地檢出抗原。但是抗原為微量時(shí)，難以發(fā)生該交聯(lián)，因此乳膠不能充分凝集。因此難以檢出微量的抗原。因此，ELISA法或CLEIA法的利用酶底物反應(yīng)的方法也得到廣泛應(yīng)用。這些方法中，例如使與抗原特異性結(jié)合的一次抗體與抗原結(jié)合，使具有酶的二次抗體與該一次抗體結(jié)合。這里，通過(guò)添加酶的底物、測(cè)定酶催化的反應(yīng)的程度來(lái)檢出或定量抗原。根據(jù)這些方法，例如如果使用發(fā)光試劑作為底物，則添加底物后的發(fā)光的檢出靈敏度高，因此可檢出微量的抗原。但是，在利用酶底物反應(yīng)的方法中，二次抗體或發(fā)光試劑等特殊試劑大多是必須的，作業(yè)成本高。還必須抑制發(fā)光試劑的脫色(脫色現(xiàn)象)，因此不得不使測(cè)定步驟在極短的時(shí)間內(nèi)完成，因此可能導(dǎo)致測(cè)定精度不充分。另一方面，該方法還包含對(duì)試樣和各試劑進(jìn)行溫育的步驟、對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行洗滌的步驟、測(cè)定發(fā)光的步驟等多個(gè)階段，操作繁雜。并且各階段所需的時(shí)間極長(zhǎng)，不適合大規(guī)模處理?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本特公昭58-11575號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題因此，本發(fā)明人等開(kāi)發(fā)了檢出對(duì)象的檢出和定量技術(shù)，該技術(shù)中使用了含有刺激響應(yīng)性聚合物的物質(zhì)與檢出對(duì)象的親和性物質(zhì)結(jié)合而成的結(jié)合物、以及具有電荷的物質(zhì)與檢出對(duì)象的親和性物質(zhì)結(jié)合而成的結(jié)合物(國(guó)際公開(kāi)W02008/001868號(hào)小冊(cè)子)。該技術(shù)是將上述2種結(jié)合物與檢體混合，將所得混合物置于刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下， 然后通過(guò)濁度測(cè)定等來(lái)判定刺激響應(yīng)性聚合物的凝集程度發(fā)生了降低，則判定此時(shí)檢體中存在檢出對(duì)象。根據(jù)該技術(shù)，只使用含有刺激響應(yīng)性聚合物的物質(zhì)、親和性物質(zhì)和具有電荷的物質(zhì)即可實(shí)現(xiàn)，無(wú)需特別使用特殊的試劑即可進(jìn)行，因此成本低且簡(jiǎn)便。并且，只是測(cè)定凝集抑制的程度即可，并不是利用酶的催化反應(yīng)的系統(tǒng)，因此可以迅速地進(jìn)行。但是，上述技術(shù)中，為了判別檢出對(duì)象的存在，大多情形下必須使用進(jìn)行濁度測(cè)定等的精密儀器，優(yōu)選在設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室等的環(huán)境中進(jìn)行檢出或定量。但是，環(huán)境污染檢查、食品檢查等情形通常是在實(shí)驗(yàn)室外等設(shè)備不完善場(chǎng)所進(jìn)行檢出和定量，因此難以判別檢出對(duì)象的存在。本發(fā)明針對(duì)上述情況而設(shè)，其課題在于提供在各種環(huán)境下可以迅速、低成本、簡(jiǎn)便且高精度地檢出、定量檢出對(duì)象的檢出對(duì)象的檢出方法和定量方法。解決課題的手段本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)使2種結(jié)合物與檢體的混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，則由于有無(wú)檢出對(duì)象的存在，源自展開(kāi)載體上的上述結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)有很大差異，從而完成了本發(fā)明。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明具有以下的構(gòu)成。[1]檢出檢體中的檢出對(duì)象的方法，該方法包含以下步驟將第1結(jié)合物和第2結(jié)合物與上述檢體混合，其中，所述第1結(jié)合物是含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第1親和性物質(zhì)結(jié)合而成，所述第2結(jié)合物是具有親水性的第2物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第2親和性物質(zhì)結(jié)合而成；將所得混合物置于上述刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下，使上述混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，或者使所得混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，將上述混合物置于上述刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下；確認(rèn)上述展開(kāi)載體上的源自第1結(jié)合物或第2結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)，上述信號(hào)與上述檢出對(duì)象非存在下不同時(shí)，則判別上述檢體中存在檢出對(duì)象，該方法中，第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)可以與上述檢出對(duì)象的不同部位結(jié)
口 O[2][1]所述的方法，其中，源自第1結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)度比上述檢出對(duì)象非存在下弱時(shí)，判別上述檢體中存在檢出對(duì)象。[3] [1]所述的方法，其中，上述混合物是在除去了第1結(jié)合物的凝集體之后，在上述展開(kāi)載體上展開(kāi)，源自第1結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)度比上述檢出對(duì)象非存在下強(qiáng)時(shí)，判別上述檢體中存在檢出對(duì)象。[4]對(duì)檢體中的檢出對(duì)象進(jìn)行定量的方法，該方法包含以下步驟將第1結(jié)合物和第2結(jié)合物與上述檢體混合，其中，所述第1結(jié)合物是含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第1親和性物質(zhì)結(jié)合而成，所述第2結(jié)合物是具有親水性的第2物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第2親和性物質(zhì)結(jié)合而成；將所得混合物置于上述刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下，使上述混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，或者使所得混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，將上述混合物置于上述刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下；測(cè)定上述展開(kāi)載體上的源自第1結(jié)合物或第2結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)度，根據(jù)上述檢出對(duì)象的量和信號(hào)強(qiáng)度在上述規(guī)定條件下的相關(guān)式算出上述檢體中的檢出對(duì)象的量，該方法中，第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)可以與上述檢出對(duì)象的不同部位結(jié)合。
[5] [4]所述的方法，該方法是測(cè)定源自第1結(jié)合物的凝集體的存在而產(chǎn)生的信號(hào)。[6] [4]所述的方法，其中，上述混合物是在除去第1結(jié)合物的凝集體之后，在上述展開(kāi)載體上展開(kāi)，測(cè)定源自第1結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)度。[7] [1] W]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第1結(jié)合物具有有色顆粒，上述信號(hào)與基于上述有色顆粒的存在而顯示的顏色相關(guān)。[8][1] [7]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第1結(jié)合物或第2結(jié)合物具有在上述展開(kāi)載體上顯色或發(fā)光的物質(zhì)，上述信號(hào)與基于上述顯色或發(fā)光的物質(zhì)的存在而顯示的顏色或光相關(guān)。[9]試劑盒，該試劑盒用于對(duì)檢出對(duì)象進(jìn)行檢出和/或定量，該試劑盒具備第1結(jié)合物、第2結(jié)合物和用于展開(kāi)上述結(jié)合物的展開(kāi)載體，其中，所述第1結(jié)合物是含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第1親和性物質(zhì)結(jié)合而成，所述第2結(jié)合物是具有親水性的第2物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第2親和性物質(zhì)結(jié)合而成。[10] [9]所述的試劑盒，其中，第1結(jié)合物具有有色顆粒。[11] [9]或[10]所述的試劑盒，其中，第1結(jié)合物或第2結(jié)合物具有在上述展開(kāi)載體上顯色或發(fā)光的物質(zhì)。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，檢出對(duì)象存在時(shí)，第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)與該結(jié)合對(duì)象結(jié)合，因此，與第1親和性物質(zhì)結(jié)合的刺激響應(yīng)性聚合物和與第2親和性物質(zhì)結(jié)合的第2物質(zhì)互相接近。由此，電荷部分或親水性部分配置于刺激響應(yīng)性聚合物的附近，因此對(duì)刺激進(jìn)行響應(yīng)的刺激響應(yīng)性聚合物的凝集受到抑制。因此，使混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)時(shí)的信號(hào)根據(jù)檢出對(duì)象的存在量而變化，因此，基于該變化的有無(wú)或程度，可以簡(jiǎn)便地檢出或定量檢出對(duì)象。以上的順序均無(wú)需特別使用任何特殊的試劑、儀器即可進(jìn)行，因此可在各種環(huán)境下、低成本且簡(jiǎn)便地實(shí)施。并且，只是確認(rèn)展開(kāi)后的信號(hào)即可，并不是利用酶的催化反應(yīng)的系統(tǒng)，因此可以迅速地進(jìn)行。


圖1是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的方法中使用的結(jié)合物的概略構(gòu)成圖。圖2是表示上述實(shí)施方式涉及的結(jié)合物的使用狀態(tài)的模式圖。圖3是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的方法的順序圖。圖4是表示本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及的方法的順序圖。圖5是表示本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及的方法的順序圖。圖6是在本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及的方法中使用的、具備展開(kāi)載體的展開(kāi)器具的平面圖。圖7是圖6的展開(kāi)器具的VII-VII線截面圖。圖8是表示圖6的展開(kāi)載體變化的圖。圖9是表示實(shí)施本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及的方法的結(jié)果的照片。圖10是表示實(shí)施本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例涉及的方法的結(jié)果的照片。
具體實(shí)施例方式以下，參照附圖對(duì)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明?！礄z出方法〉[混合·凝集]本發(fā)明的檢出方法中，首先，將結(jié)合物與檢體混合，將該結(jié)合物置于刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下。這里所使用的結(jié)合物至少為2種，對(duì)其中作為必須構(gòu)成要素的第 1結(jié)合物和第2結(jié)合物進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。[第1結(jié)合物]第1結(jié)合物是含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與檢出對(duì)象的第1親和性物質(zhì)結(jié)合而成。(第1物質(zhì))本發(fā)明中使用的第1物質(zhì)是含有刺激響應(yīng)性聚合物的物質(zhì)，該刺激響應(yīng)性聚合物是對(duì)于外部刺激進(jìn)行響應(yīng)、引起結(jié)構(gòu)變化，可調(diào)節(jié)凝集和分散的聚合物。刺激沒(méi)有特別限定，可舉出溫度變化、光的照射、酸或堿的添加(PH的變化)、電場(chǎng)變化等。特別是本發(fā)明中，刺激響應(yīng)性聚合物可以利用可由于溫度變化而發(fā)生凝集和分散的溫度響應(yīng)性聚合物。溫度響應(yīng)性聚合物可舉出具有最低臨界溶液溫度(以下也稱為 LCST)的聚合物或具有最高臨界溶液溫度的聚合物(以下也稱為UCST)。例如，具有LCST為 37°C的最低臨界溶液溫度的聚合物在低于LCST的溫度的水溶液中完全分散，如果將水溫升高至LCST以上，則可以立即凝集。另外，具有UCST為5°C的最高臨界溶液溫度的聚合物在超過(guò)UCST的溫度的水溶液中完全分散，如果將水溫降低至UCST以下，則可以立即凝集。本發(fā)明中使用的具有最低臨界溶液溫度的聚合物可舉出含有N-正丙基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N，N- 二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯?；哙?、N-丙烯酰基嗎啉、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-異丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯?；量┩?、N-甲基丙烯?；哙?、 N-甲基丙烯酰基嗎啉等N取代(甲基)丙烯酰胺衍生物的聚合物；羥丙基纖維素、聚乙烯基醇部分乙?；铩⒕垡蚁┗谆?、(聚氧乙烯-聚氧丙烯)嵌段共聚物、聚氧乙烯月桂基胺等聚氧乙烯烷基胺衍生物；聚氧乙烯失水山梨糖醇月桂酸酯等聚氧乙烯失水山梨糖醇酯衍生物；(聚氧乙烯壬基苯基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯辛基苯基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基苯基醚)(甲基)丙烯酸酯類；和(聚氧乙烯月桂基醚)丙烯酸酯、(聚氧乙烯油基醚)甲基丙烯酸酯等(聚氧乙烯烷基醚)(甲基)丙烯酸酯類等的聚氧乙烯(甲基)丙烯酸酯衍生物等。并且可以使用這些聚合物以及含有這些的至少2種以上單體的共聚物。 還可以利用N-異丙基丙烯酰胺與N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。使用含有(甲基)丙烯酰胺衍生物的聚合物時(shí)，可以使其它可共聚的單體在具有最低臨界溶液溫度的范圍內(nèi)與該聚合物共聚。本發(fā)明中，其中可優(yōu)選利用含有選自N-正丙基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、 N-乙基丙烯酰胺、N，N- 二甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯?；哙?、N-丙烯?；鶈徇?、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-異丙基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N, N- 二甲基甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯?；量┩?、N-甲基丙烯?；哙?、N-甲基丙烯酰基嗎啉的至少1種單體的聚合物或者N-異丙基丙烯酰胺與N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物。還可以利用具有以Val-Pr0-Gly-X-Gly(X為脯氨酸以外的氨基酸)為代表的五聚肽的重復(fù)序列的、來(lái)自彈性蛋白的多肽等。本發(fā)明中使用的具有最高臨界溶液溫度的聚合物可以利用含有選自丙烯酰基甘氨酰胺、丙烯?；哙０?、丙烯?；於０泛捅；劝滨０返鹊闹辽?種單體的聚合物。還可以是含有它們的2種單體的共聚物。在具有最高臨界溶液溫度的范圍內(nèi)，可以使丙烯酰胺、乙酰丙烯酰胺、生物素醇丙烯酸酯(匕‘才f ^一夕 > 一卜)、N-生物素基-N’ -甲基丙烯?；鶃啽０?、丙烯酰基肌氨酰胺、甲基丙烯酰肌氨酰胺、丙烯?；啄蜞奏さ绕渌晒簿鄣膯误w與這些聚合物共聚。本發(fā)明中，刺激響應(yīng)性聚合物可以利用可根據(jù)pH的變化發(fā)生凝集和分散的pH響應(yīng)性聚合物。引起PH響應(yīng)性聚合物的結(jié)構(gòu)變化的pH沒(méi)有特別限定，從可抑制施加刺激時(shí)的第1結(jié)合物、后述的第2結(jié)合物以及檢體的變性等導(dǎo)致的檢出、定量精度降低的角度考慮， 優(yōu)選PH4 10，進(jìn)一步優(yōu)選pH5 9。上述pH響應(yīng)性聚合物可例舉含有羧基、磷酸、磺?；被然鶊F(tuán)作為官能基團(tuán)的聚合物。更具體來(lái)說(shuō)，可以是(甲基)丙烯酸、馬來(lái)酸、苯乙烯磺酸、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、(甲基)丙烯酸磷酰基乙酯、甲基丙烯酸氨基乙酯、氨基丙基(甲基)丙烯酰胺、二甲基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺等具有解離基團(tuán)的單體聚合而成的聚合物，還可以是在不損害PH響應(yīng)能力的程度下，這些具有解離基團(tuán)的單體與其它乙烯基單體(例如，(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯等(甲基)丙烯酸酯類；乙酸乙烯基酯、丙酸乙烯基酯等乙烯基酯類；苯乙烯、氯乙烯、N-乙烯基吡咯烷酮等乙烯基化合物；(甲基)丙烯酰胺類等)共聚而成的聚合物。(微粒)第1物質(zhì)可以含有擔(dān)載著刺激響應(yīng)性聚合物和后述的親和性物質(zhì)的微粒。為了使展開(kāi)載體上的信號(hào)根據(jù)凝集的程度發(fā)生變化，這里所使用的微粒必須具有單獨(dú)的微粒比后述的展開(kāi)載體的孔徑小、且凝集時(shí)比展開(kāi)載體的孔徑大的平均粒徑，其具體組成只要是可以擔(dān)載刺激響應(yīng)性聚合物和親和性物質(zhì)即可，沒(méi)有特別限定。以往的乳膠凝集法中，乳膠根據(jù)檢出對(duì)象的存在而凝集，必須檢出該凝集，為此， 為了提高檢出靈敏度，微粒優(yōu)選具有大的粒徑。而與此相對(duì)，本發(fā)明的方法中，微粒越是小的粒徑，則每單位體積的比表面積增加，與檢出對(duì)象的結(jié)合增加，由此使得刺激響應(yīng)性聚合物的凝集抑制更有效，因此優(yōu)選微粒的粒徑小。不過(guò)，微粒的平均粒徑必須設(shè)定為在非凝集時(shí)比展開(kāi)載體的孔徑小，在凝集時(shí)比展開(kāi)載體的孔徑大。這樣，在使用微粒時(shí)，可考慮凝集抑制的效率、凝集的方法(特別是直徑的變化)、以及展開(kāi)載體的孔徑等適當(dāng)設(shè)定微粒的平均粒徑。通常，該平均粒徑的下限優(yōu)選為0. 001 μ m,更優(yōu)選為0. 010 μ m,最優(yōu)選為0. 1 μ m 微米，上限優(yōu)選為0. 5 μ m，更優(yōu)選為0. 3 μ m，最優(yōu)選為0. 2 μ m。從在展開(kāi)載體上展開(kāi)時(shí)形成與顏色相關(guān)的信號(hào)、該信號(hào)可容易地確認(rèn)或測(cè)定的角度考慮，微粒優(yōu)選為有色顆粒。有色顆粒沒(méi)有特別限定，可以是含有金屬膠體顆粒(例如膠體金顆粒)、聚苯乙烯膠乳等合成高分子、明膠等天然高分子的均勻的球狀顆粒等。不過(guò)， 第1結(jié)合物不僅用于本發(fā)明的方法中，也可用于國(guó)際公開(kāi)W02008/001868號(hào)小冊(cè)子中所述的檢出方法中，這種情形下，可通過(guò)施加磁力來(lái)分離凝集體，由此提高檢出精度(詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)W02008/001868號(hào)小冊(cè)子)。因此，為了提高通用性，微粒優(yōu)選含有磁性物質(zhì)，所述磁性物質(zhì)可以由多元醇和磁鐵礦構(gòu)成。多元醇只要是構(gòu)成單元中至少具有2個(gè)羥基且可與鐵離子結(jié)合的醇結(jié)構(gòu)體即可， 沒(méi)有特別限定，例如可舉出葡聚糖、聚乙烯醇、甘露醇、山梨醇、環(huán)糊精。例如日本特開(kāi) 2005-82538號(hào)公報(bào)中公開(kāi)了使用葡聚糖的微粒狀磁性物質(zhì)的制造方法。還可以使用如甲基丙烯酸縮水甘油基酯聚合物這樣的具有環(huán)氧基、開(kāi)環(huán)后形成多元醇結(jié)構(gòu)體的化合物。(第1親和性物質(zhì))第1親和性物質(zhì)例如可以是識(shí)別檢出對(duì)象的不同抗原決定簇的單克隆抗體。這里所使用的抗體可以是任何型的免疫球蛋白分子，也可以是Fab等具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白分子片段。另外，抗體可以是單克隆抗體也可以是多克隆抗體。[第1結(jié)合物的制作]第1結(jié)合物通過(guò)將第1物質(zhì)與第1親和性物質(zhì)結(jié)合而制作。該結(jié)合方法沒(méi)有特別限定，例如可以在第1物質(zhì)一側(cè)(例如刺激響應(yīng)性聚合物部分)和第1親和性物質(zhì)(例如第1抗體)一側(cè)的雙方結(jié)合互為親和性的物質(zhì)(例如，抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶)，經(jīng)由這些物質(zhì)使第1物質(zhì)與第1親和性物質(zhì)結(jié)合。具體來(lái)說(shuō)，生物素與刺激響應(yīng)性聚合物的結(jié)合如國(guó)際公開(kāi)W001/009141所述，可使生物素等與甲基丙烯酸基或丙烯酸基等聚合性官能基團(tuán)結(jié)合，制成加成聚合性單體，再與其它單體共聚來(lái)進(jìn)行。抗生物素蛋白等與第1親和性物質(zhì)的結(jié)合可按照常規(guī)方法進(jìn)行。 接著，將結(jié)合了生物素的刺激響應(yīng)性聚合物和結(jié)合了抗生物素蛋白的第1親和性物質(zhì)混合，則經(jīng)由抗生物素蛋白和生物素的結(jié)合，使第1親和性物質(zhì)和刺激響應(yīng)性聚合物結(jié)合。另一種方法還可利用以下的方法在制造聚合物時(shí)，使具有羧基、氨基或環(huán)氧基等官能基團(tuán)的單體與其它單體共聚，經(jīng)由該官能基團(tuán)，按照該技術(shù)領(lǐng)域周知的方法，使抗體親和性物質(zhì)(例如Melon Gel (瓜膠)、蛋白Α、蛋白G)與聚合物結(jié)合。使第1抗體與這樣得到抗體親和性物質(zhì)結(jié)合，由此可以制作刺激響應(yīng)性聚合物與檢出對(duì)象抗原的第1抗體結(jié)合的第1結(jié)合物?；蛘?，在制造聚合物時(shí)，使具有羧基、氨基或環(huán)氧基等官能基團(tuán)的單體與其它單體共聚，按照常規(guī)方法使檢出對(duì)象抗原的第1抗體與這些官能基團(tuán)直接結(jié)合?；蛘?，使第1親和性物質(zhì)和刺激響應(yīng)性聚合物與微粒狀的磁性物質(zhì)結(jié)合。在將第1物質(zhì)置于刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下之后，通過(guò)離心進(jìn)行分離，可以純化第1結(jié)合物。第1結(jié)合物的純化可按照以下方法進(jìn)行使微粒狀的磁性物質(zhì)與刺激響應(yīng)性聚合物結(jié)合，進(jìn)一步結(jié)合第1親和性物質(zhì)，然后置于刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下，施加磁力，回收磁性物質(zhì)。微粒狀的磁性物質(zhì)與刺激響應(yīng)性聚合物的結(jié)合可按照經(jīng)由反應(yīng)性官能基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合的方法，或者將聚合性不飽和鍵導(dǎo)入磁性物質(zhì)中的多元醇上的活性氫或多元醇上，進(jìn)行接枝聚合的方法等的本技術(shù)領(lǐng)域周知的方法進(jìn)行(例如，參照ADV. Polym. Sci. ,Vol.4.， pill,1965 或 J. Polymer Sci.，Part-Α,3, pl031,1965)。[第2結(jié)合物]本發(fā)明的方法中，除第1結(jié)合物之外，還使用第2結(jié)合物，該第2結(jié)合物是具有親水性的第2物質(zhì)與檢出對(duì)象的第2親和性物質(zhì)結(jié)合而成。由此可以使檢出靈敏度提高。(第2物質(zhì))
具有親水性的第2物質(zhì)例如為具有電荷的高分子化合物，優(yōu)選為聚陰離子或聚陽(yáng)離子。聚陰離子是指具有多個(gè)陰離子基團(tuán)的物質(zhì)，聚陽(yáng)離子是指具有多個(gè)陽(yáng)離子基團(tuán)的物質(zhì)。聚陰離子的例子可舉出DNA和RNA等核酸。這些核酸是沿著核酸骨架存在多個(gè)磷酸二酯基，由此具有聚陰離子的性質(zhì)。聚陰離子也包含含多個(gè)羧基的多肽(含有谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的多肽)，聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磺酸和含有丙烯酸或甲基丙烯酸作為聚合成分的聚合物，羧甲基纖維素、透明質(zhì)酸和肝素等多糖等。而聚陽(yáng)離子的例子可舉出 聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥(niǎo)氨酸、聚烷基胺、聚乙烯亞胺或聚丙基乙烯亞胺等。聚陰離子(羧基)或聚陽(yáng)離子(氨基)的官能基團(tuán)數(shù)目?jī)?yōu)選為25個(gè)以上。還可舉出具有羧基的膠乳顆粒等。具有親水性的第2物質(zhì)例如為水溶性的高分子化合物，可舉出聚乙二醇、聚丙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷等含有醚鍵的高分子，聚乙烯基醇等含有醇式羥基的高分子， 葡聚糖、環(huán)糊精、瓊脂糖、羥丙基纖維素等水溶性多糖類，含有中性氨基酸的多肽等。這些具有親水性的物質(zhì)可以在高分子鏈中或末端具有用于結(jié)合第2親和性物質(zhì)的官能基團(tuán)等。另外，具有親水性的第2物質(zhì)可以以1種單獨(dú)使用，也可以將多種混合利用。(第2親和性物質(zhì))第2親和性物質(zhì)是可在與第1親和性物質(zhì)不同的部位、與第1親和性物質(zhì)同樣地與檢出對(duì)象結(jié)合的物質(zhì)。第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)例如可以是識(shí)別檢出對(duì)象的不同抗原決定簇的單克隆抗體。[制作方法]第2結(jié)合物通過(guò)使第2物質(zhì)與第2親和性物質(zhì)直接或間接結(jié)合來(lái)制作。例如，可以在第2物質(zhì)一側(cè)以及第2親和性物質(zhì)(例如第2抗體)一側(cè)的雙方結(jié)合互為親和性的物質(zhì)(例如抗生物素蛋白和生物素、谷氨酰胺和谷氨酰胺S轉(zhuǎn)移酶)，經(jīng)由這些物質(zhì)使第2物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)間接結(jié)合，但并不限于此。使第2物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)直接結(jié)合時(shí)，可以經(jīng)由官能基團(tuán)結(jié)合，例如使用官能基團(tuán)時(shí)，可以按照Ghosh等人的方法(Ghosh等人.，Bioconjugate Chem.，1，71 76，1990) 的馬來(lái)酰亞胺-硫醇偶聯(lián)來(lái)結(jié)合。具體來(lái)說(shuō)可以舉出以下2種方法。第1種方法中，首先，向核酸的5’末端導(dǎo)入巰基(別名氫硫基)，另一方面，使 6-馬來(lái)酰亞胺基己酸琥珀酰亞胺酯(例如“EMCS (商品名)”((株)同仁化學(xué)研究所制造)) 與抗體反應(yīng)，導(dǎo)入馬來(lái)酰亞胺基。接著將這2種物質(zhì)經(jīng)由巰基和馬來(lái)酰亞胺基結(jié)合。第2種方法中，首先，與第1種方法同樣，向核酸的5’末端導(dǎo)入巰基，進(jìn)一步使同型雙官能性試劑N，N-1,2-苯撐雙馬來(lái)酰亞胺與該巰基反應(yīng)，由此向核酸的5’末端導(dǎo)入馬來(lái)酰亞胺基，另一方面，向抗體導(dǎo)入巰基。接著將這2種物質(zhì)經(jīng)由巰基和馬來(lái)酰亞胺基結(jié)合。除此之外，將核酸導(dǎo)入蛋白質(zhì)的方法例如已知Nucleic Acids Research第15卷 5275頁(yè)(I987年)和Nucleic Acids Research第I6卷367I頁(yè)(1淵8年)中記載的方法。 這些技術(shù)可應(yīng)用于核酸與抗體的結(jié)合。根據(jù)Nucleic Acids Research第16卷3671頁(yè)(1988年)，首先，使寡核苷酸與六亞甲基四胺、碳二亞胺和1-甲基咪唑反應(yīng)，由此向寡核苷酸的5’末端的羥基中導(dǎo)入巰基。 將導(dǎo)入了巰基的寡核苷酸進(jìn)行純化，然后使用二硫蘇糖醇還原，然后加入2，2’ - 二吡啶二硫化物，經(jīng)由二硫鍵向寡核苷酸的5’末端導(dǎo)入吡啶基。另一方面，使亞氨基硫烷與蛋白質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)入巰基。這些導(dǎo)入了吡啶二硫化物的寡核苷酸與導(dǎo)入了巰基的蛋白質(zhì)混合，使吡啶基與巰基特異性反應(yīng)，從而使蛋白質(zhì)與寡核苷酸結(jié)合。根據(jù)Nucleic Acids Research第15卷5275頁(yè)(1987年)，首先向寡核苷酸的3， 末端導(dǎo)入氨基，與同型雙官能性試劑二硫代-雙-丙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(簡(jiǎn)稱二硫雙丙酰-NHS)反應(yīng)。反應(yīng)后添加二硫蘇糖醇，由此還原二硫雙丙酰-NHS分子中的二硫鍵， 向寡核苷酸的3’末端導(dǎo)入巰基。關(guān)于蛋白質(zhì)的處理，可使用如日本特開(kāi)平5-48100號(hào)公報(bào)所示的異型雙官能性交聯(lián)劑。首先，使具有可與蛋白質(zhì)中的官能基團(tuán)(例如氨基)反應(yīng)的第1反應(yīng)性基團(tuán)(琥珀酰亞胺)、以及可與巰基反應(yīng)的第2反應(yīng)性基團(tuán)(例如馬來(lái)酰亞胺等)的異型雙官能性交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)，向蛋白質(zhì)中導(dǎo)入第2反應(yīng)性基團(tuán)，制成預(yù)先活化的蛋白質(zhì)試劑。將這樣得到的蛋白質(zhì)試劑與硫醇化多核苷酸的巰基共價(jià)鍵合。在使用核酸以外的聚陰離子或聚陽(yáng)離子時(shí)，也可以向它們的末端等導(dǎo)入巰基，按照與上述同樣的操作，制作第2結(jié)合物。再次，返回檢出方法順序的說(shuō)明。將上述的2種結(jié)合物與檢體的混合物置于刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下，則存在檢出對(duì)象時(shí)，刺激響應(yīng)性聚合物由于檢出對(duì)象的電荷部分或親水性部分而受到凝集抑制，發(fā)生分散。而不存在檢出對(duì)象時(shí)，刺激響應(yīng)性聚合物未受到凝集抑制，發(fā)生凝集?？梢詫⒌?結(jié)合物、第2結(jié)合物以及檢體全部同時(shí)混合，也可以將每1種分別混合。參照?qǐng)D1 圖2對(duì)該現(xiàn)象進(jìn)行說(shuō)明。如圖1所示，第1結(jié)合物10含有刺激響應(yīng)性聚合物11，該刺激響應(yīng)性聚合物11經(jīng)由抗生物素蛋白15和生物素17與檢出對(duì)象50的第1抗體13結(jié)合。另外，第1結(jié)合物10 含有微粒狀的磁性物質(zhì)19，在該磁性物質(zhì)19的表面結(jié)合作為第1物質(zhì)的刺激響應(yīng)性聚合物11。而第2結(jié)合物20中，檢出對(duì)象50的第2抗體23與第2物質(zhì)21結(jié)合。第1抗體13 和第2抗體23可以與檢出對(duì)象50的不同部位結(jié)合，因此同樣可以與檢出對(duì)象50結(jié)合。第 2結(jié)合物20經(jīng)由檢出對(duì)象50和刺激響應(yīng)性聚合物11與磁性物質(zhì)19接近，此時(shí)，第2物質(zhì) 21位于磁性物質(zhì)19的附近。如圖2所示，將第1結(jié)合物10、第2結(jié)合物20和檢體的混合物置于規(guī)定條件下，在存在檢出對(duì)象50時(shí)，刺激響應(yīng)性聚合物11由于第2結(jié)合物20中的電荷部分或親水性部分而受到凝集抑制，發(fā)生分散。(圖2(A))。而不存在檢出對(duì)象50時(shí)，刺激響應(yīng)性聚合物11 未受到凝集抑制，發(fā)生凝集(圖2(B))。本實(shí)施方式中的構(gòu)成是第2結(jié)合物20的電荷部分或親水性部分位于磁性物質(zhì)19的附近，但并不限于此，也可以是檢出對(duì)象的電荷部分或親水性部分位于磁性物質(zhì)19的附近的構(gòu)成。為了使刺激響應(yīng)性聚合物11凝集，例如在使用溫度響應(yīng)性聚合物時(shí)，可以將加入了混合液的容器移至溫度響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的溫度下的恒溫槽中。溫度響應(yīng)性聚合物有2種具有最高臨界溶液溫度(以下簡(jiǎn)稱為“UCST”)的聚合物，和具有最低臨界溶液溫度(以下簡(jiǎn)稱為“LCST”)的聚合物。例如，使用LCST為37°C的、具有最低臨界溶液溫度的聚合物時(shí)，通過(guò)將加入了混合液的容器移至37°C以上的恒溫槽中，可以使溫度響應(yīng)性聚合物凝集。另外，使用UCST為5°C的、具有最高臨界溶液溫度的聚合物時(shí)，通過(guò)將加入了混合液的容器移至低于5°C的恒溫槽中，可以使溫度響應(yīng)性聚合物凝集。已知LCST伴隨著溫度響應(yīng)性聚合物的周邊的鹽濃度的增加而降低。因此，通過(guò)將規(guī)定濃度的鹽(例如NaCl)添加到在某一溫度下分散有溫度響應(yīng)性聚合物的溶液中，可以使溫度響應(yīng)性聚合物在一定溫度下凝集。本發(fā)明中使用的鹽可舉出硫酸鋰、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸銨等硫酸鹽；氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、氯化鋇等商化物；硝酸鎂、硝酸鈣等的硝酸鹽；硫氰化鉀等硫氰酸鹽；碳酸鈉、碳酸鉀等碳酸鹽；硼酸鹽；磷酸鹽等。這些鹽可單獨(dú)或?qū)?種以上組合使用。還可舉出乙酸鈉等單羧酸的鈉鹽，天冬氨酸鈉、谷氨酸鈉、亞氨基二乙酸鈉、馬來(lái)酸鈉、丙二酸鈉、草酸鈉、琥珀酸二鈉或酒石酸鈉等二羧酸的鈉鹽，檸檬酸二鈉等三羧酸的鈉鹽，乙二胺四乙酸二鈉等四羧酸的鈉鹽等有機(jī)酸鹽等，也可以利用它們的鉀鹽等有機(jī)酸鹽等。這些鹽可以單獨(dú)或?qū)?種以上組合使用。為了使溫度響應(yīng)性聚合物凝集，例如可以添加鹽的水溶液，形成所需的鹽濃度。用于使溫度響應(yīng)性聚合物凝集的鹽的必須添加量根據(jù)鹽的種類、水溶液的溫度、溫度響應(yīng)性聚合物的種類、溫度響應(yīng)性聚合物的濃度而不同，在水溶液中，終濃度大約為50mM 5M、優(yōu)選為100 IOOOmM的范圍。使用pH響應(yīng)性聚合物時(shí)，可以向加入了混合液的容器中加入酸溶液或堿溶液。具體來(lái)說(shuō)，可以在加入了 PH為引起pH響應(yīng)性聚合物發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的范圍之外的分散混合液的容器中，加入酸溶液或堿溶液，將容器內(nèi)的PH變更為引起pH響應(yīng)性聚合物發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的范圍。例如，使用在PH5以下發(fā)生凝集、超過(guò)pH5則分散的pH響應(yīng)性聚合物時(shí)，可以在加入了超過(guò)PH5下為分散的混合液的容器中加入酸溶液，形成pH為5以下。另外，使用pHIO 以上發(fā)生凝集、低于PHlO則分散的pH響應(yīng)性聚合物時(shí)，可以在加入了在低于pHIO為分散的混合液的容器中加入堿溶液，使PH為10以上。引起pH響應(yīng)性聚合物發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的pH 沒(méi)有特別限定。優(yōu)選pH4 10，進(jìn)一步優(yōu)選pH5 9。具體來(lái)說(shuō)，可舉出含多個(gè)羧基的多肽(含有谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的多肽)，聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、以及含有丙烯酸或甲基丙烯酸作為聚合成分的聚合物，羧甲基纖維素、透明質(zhì)酸、肝素等多糖類，聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥(niǎo)氨酸、聚烷基胺、聚乙烯亞胺和聚丙基乙烯亞胺等。使用光響應(yīng)性聚合物時(shí)，可以對(duì)加入了混合液的容器照射可以使聚合物凝集的波長(zhǎng)的光。使其凝集的優(yōu)選的光根據(jù)光響應(yīng)性聚合物中所含的光響應(yīng)性官能基團(tuán)的種類和結(jié)構(gòu)而不同，通?？蓛?yōu)選使用波長(zhǎng)190 SOOnm的紫外光或可見(jiàn)光。此時(shí)，強(qiáng)度優(yōu)選0. 1 lOOOmW/cm2。從可提高測(cè)定精度的角度考慮，光響應(yīng)性聚合物優(yōu)選在照射用于濁度測(cè)定的光時(shí)難以發(fā)生分散的聚合物，換言之優(yōu)選發(fā)生凝集的聚合物。使用在照射用于濁度測(cè)定的光時(shí)發(fā)生分散的聚合物作為光響應(yīng)性聚合物時(shí)，可通過(guò)縮短光照射時(shí)間來(lái)提高測(cè)定精度。 具體來(lái)說(shuō)，可舉出偶氮苯、螺苯并吡喃和螺苯并噻喃等含有光響應(yīng)性官能基團(tuán)的聚合物寸。將第1結(jié)合物10、第2結(jié)合物20和檢體的混合物置于上述條件下，當(dāng)存在檢出對(duì)象50時(shí)，刺激響應(yīng)性聚合物11由于第2結(jié)合物20中的電荷部分或親水性部分而受到凝集抑制，發(fā)生分散(圖2(A))。而不存在檢出對(duì)象50時(shí)，刺激響應(yīng)性聚合物11未受到凝集抑制，發(fā)生凝集(圖2(B))。溫度響應(yīng)性聚合物的凝集可以在第1結(jié)合物和第2結(jié)合物與檢出對(duì)象結(jié)合后進(jìn)行，也可以同時(shí)并列進(jìn)行，從可縮短處理時(shí)間的角度考慮，優(yōu)選后者。這里，最低臨界溶液溫度如下確定。首先，將試樣放入吸光光度計(jì)的池中，以rc /分鐘的速度使試樣升溫。在該期間記錄550nm下的透過(guò)率變化。這里，以聚合物溶解為透明時(shí)的透過(guò)率為100%，以完全凝集時(shí)的透過(guò)率為0%時(shí)，求出透過(guò)率達(dá)到50%時(shí)的溫度作為 LCST。最高臨界溶液溫度如下確定。以rc /分鐘的速度將試樣冷卻，與最低臨界溶液溫度的情形同樣，記錄^Onm下的透過(guò)率變化。這里，以聚合物溶解為透明時(shí)的透過(guò)率為 100%，以完全凝集時(shí)的透過(guò)率為0%時(shí)，求出透過(guò)率達(dá)到50%時(shí)的溫度作為UCST。[判別]使檢體與結(jié)合物的混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，確認(rèn)該展開(kāi)載體上源自結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)，該信號(hào)與檢出對(duì)象非存在下不同時(shí)，則判別檢體中存在檢出對(duì)象。即，如圖2所示，根據(jù)檢出對(duì)象的有無(wú)，各混合物中的凝集狀態(tài)不同，因此各混合物的展開(kāi)狀態(tài)也不同。因此，在確認(rèn)到與檢出對(duì)象非存在下不同的信號(hào)時(shí)，則可以判別檢體中存在檢出對(duì)象。這樣，判別僅憑對(duì)展開(kāi)載體上的信號(hào)進(jìn)行確認(rèn)即可，無(wú)需特別使用特殊的試劑、儀器即可進(jìn)行，因此可在各種環(huán)境下、低成本且簡(jiǎn)便地實(shí)施檢出。如后所述，將混合物置于刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下的時(shí)期可以是在展開(kāi)之前(將混合物置于凝集條件之后展開(kāi))，也可以與展開(kāi)同時(shí)進(jìn)行(在展開(kāi)中置于凝集條件)。(展開(kāi)載體)本發(fā)明的方法中使用的展開(kāi)載體只要可在水溶液中使微粒展開(kāi)即可，沒(méi)有特別限定。可以是以往公知的色譜用載體。具體來(lái)說(shuō)，可舉出有孔的立體結(jié)構(gòu)膜，例如尼龍膜、硝基纖維素膜等，還可以是合成或天然高分子膜的任意形式。但展開(kāi)載體必須具有比上述微粒的平均粒徑大且比凝集體的凝集直徑小的孔徑，從可以對(duì)應(yīng)各種微粒的通用性的角度考慮，優(yōu)選具有0. ΟΙμ 0. 5μ 左右的孔徑。展開(kāi)和判別的具體順序沒(méi)有特別限定，可以是任意的。以下說(shuō)明優(yōu)選的順序。圖3是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的方法的順序圖。該實(shí)施方式中，將檢體和第1結(jié)合物在上述條件下混合，溫育，進(jìn)一步將第2結(jié)合物在上述條件下混合，溫育。本實(shí)施方式中，在該時(shí)刻，刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件已經(jīng)成立。然后，將展開(kāi)載體由其下端至規(guī)定高度的位置浸入混合物中，在該狀態(tài)下使混合物展開(kāi)。這樣，檢體中不存在檢出對(duì)象時(shí)，當(dāng)大量凝集體在混合物中形成時(shí)，凝集體直徑比孔徑大，因此集中在彎月面，可以確認(rèn)到源自凝集體中的結(jié)合物(通常為微粒)的存在而產(chǎn)生的有色的條帶(信號(hào)的一個(gè)例子)。與此相對(duì)，檢體中存在檢出對(duì)象時(shí)，根據(jù)檢出對(duì)象的存在量，凝集體的量顯著降低，比孔徑小的非凝集體在展開(kāi)載體上移動(dòng)，因此，未確認(rèn)到源自凝集體的存在而產(chǎn)生的有色條帶或者是變淺，同時(shí)可以在廣范圍內(nèi)確認(rèn)到源自非凝集體中的結(jié)合物(通常為微粒)的存在而產(chǎn)生的有色區(qū)域(信號(hào)的一個(gè)例子)。因此，源自凝集體的存在而產(chǎn)生的強(qiáng)度(信號(hào)有色區(qū)域的濃度)比檢出對(duì)象非存在下弱時(shí)，則可以判別檢體中存在檢出對(duì)象。另外，本實(shí)施方式中，根據(jù)信號(hào)有色區(qū)域的位置與檢出對(duì)象非存在下的情形不同，也可以判別檢體中存在檢出對(duì)象。圖4是表示本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及的方法的順序圖。本實(shí)施方式中，如圖 4(a)所示，在偏離展開(kāi)載體的下端的位置(為了方便，并未圖示，實(shí)際上可以是無(wú)法視覺(jué)辨認(rèn))配置可在室溫下使刺激響應(yīng)性聚合物(特別是具有LCST的聚合物)發(fā)生凝集的有效量的鹽(例如NaCl)。不將混合物置于發(fā)生凝集的條件下(例如置于比刺激響應(yīng)性聚合物的LCST低的溫度下)即開(kāi)始展開(kāi)。這樣，檢體中不存在檢出對(duì)象時(shí)，混合物雖然移動(dòng)至配置了鹽的位置，但是在該位置發(fā)生凝集，無(wú)法移動(dòng)，因此發(fā)生集中。與此相對(duì)，檢體中存在檢出對(duì)象時(shí)，混合物即使移動(dòng)至配置了鹽的位置也受到凝集抑制，因此可以通過(guò)該位置進(jìn)一步移動(dòng)。因此未確認(rèn)到源自凝集體的存在而產(chǎn)生的有色條帶或者是變淡，同時(shí)可以在廣范圍內(nèi)確認(rèn)到源自非凝集體中的結(jié)合物(通常為微粒)的存在而產(chǎn)生的有色區(qū)域(信號(hào)的一個(gè)例子)。因此，源自凝集體的存在而產(chǎn)生的強(qiáng)度(信號(hào)有色區(qū)域的濃度)比檢出對(duì)象非存在下弱時(shí)，可以判別檢體中存在檢出對(duì)象。另外，本實(shí)施方式中，源自非凝集體中的結(jié)合物 (通常為微粒)的存在而產(chǎn)生的有色區(qū)域的范圍與非存在下的情形不同，也可以判別檢體中存在檢出對(duì)象。上述實(shí)施方式中，在彎月面可以確認(rèn)到有色條帶，因此在難以將液面保持恒定的環(huán)境下，有色條帶可能不鮮明，但在本實(shí)施方式中，可以在配置了鹽的位置確認(rèn)到有色條帶，因此與液面無(wú)關(guān)，可以使有色條帶鮮明化。該效果對(duì)于在實(shí)驗(yàn)室外等環(huán)境下進(jìn)行檢出時(shí)尤其重要。配置鹽的位置沒(méi)有特別限定，可以是自展開(kāi)載體的下端至上端的任意位置。不過(guò)從在任何方向使用展開(kāi)載體(即，兩個(gè)端部可朝向上下的任意方向)均可獲得同樣信號(hào)的角度考慮，優(yōu)選在展開(kāi)載體的中央附近配置鹽。該效果在實(shí)驗(yàn)室外等環(huán)境下進(jìn)行檢出時(shí)尤其重要。還可以在展開(kāi)載體上設(shè)置顯示展開(kāi)載體的方向的印記等，由此可以使配置鹽的位置的自由度增加。本實(shí)施方式中是在展開(kāi)載體上配置鹽，只要是刺激響應(yīng)性聚合物可發(fā)生凝集的條件即可，沒(méi)有特別限定。具體來(lái)說(shuō)，可以只將展開(kāi)載體的規(guī)定位置設(shè)置為可凝集的溫度，也可以配置達(dá)到凝集PH的酸或堿，或者可以照射光。圖5是表示本發(fā)明的另一實(shí)施方式的方法的順序圖。本實(shí)施方式中，如圖5(a)所示，在偏離展開(kāi)載體下端的位置(為了方便，并未圖示，實(shí)際上可以是無(wú)法視覺(jué)辨認(rèn))上配置當(dāng)與結(jié)合物并存時(shí)則可以在展開(kāi)載體上顯色或發(fā)光的物質(zhì)。使用所述展開(kāi)載體，按照與圖3同樣的順序進(jìn)行展開(kāi)，則如圖5(b)所示，檢體中存在檢出對(duì)象時(shí)，比孔徑小的非凝集體在展開(kāi)載體上移動(dòng)至顯色或發(fā)光物質(zhì)的位置，因此可以在該位置上確認(rèn)到顯色或發(fā)光(信號(hào)的一個(gè)例子)。與此相對(duì)，檢體中不存在檢出對(duì)象時(shí)，大量凝集體在混合物中形成，因此難以確認(rèn)到顯色或發(fā)光。根據(jù)該方案，通過(guò)適當(dāng)選擇顯色或發(fā)光的強(qiáng)度，可以使檢出靈敏度和精度更為提高。本方案中，顯色或發(fā)光相當(dāng)于信號(hào)。顯色或發(fā)光的物質(zhì)可以從以往周知的物質(zhì)中適當(dāng)選擇。顯色物質(zhì)可舉出三嗪、 1，10-菲咯啉等在可見(jiàn)光區(qū)具有吸收帶的物質(zhì)。發(fā)光物質(zhì)可舉出魯米諾、熒光素酶等的熒光、化學(xué)發(fā)光的物質(zhì)。從可肉眼確認(rèn)、無(wú)需光照射儀器等的角度考慮，優(yōu)選顯色物質(zhì)，但并不限于此。使用磁性物質(zhì)時(shí)，可以測(cè)定磁量，這種情形下磁量相當(dāng)于信號(hào)。圖5的方案中，使結(jié)合物有色構(gòu)成，當(dāng)檢體中不存在檢出對(duì)象時(shí)，源自凝集體的存在而產(chǎn)生的有色區(qū)域可以在彎月面所對(duì)應(yīng)的位置確認(rèn)。這樣，信號(hào)可以是1種也可以是多種，可適當(dāng)選擇。圖6是在本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及的方法中使用的、具備展開(kāi)載體30的展開(kāi)器具40的平面圖，圖7是圖6的展開(kāi)器具40的VII-VII線截面圖。如圖7所示，在展開(kāi)器具40中，水平配置的展開(kāi)載體30的一端(圖6中為下端， 圖7中為左端)上配置過(guò)濾器47，同時(shí)在偏離該一端的位置31上配置若與結(jié)合物并存則在展開(kāi)載體30上顯色或發(fā)光的物質(zhì)。另外，展開(kāi)載體30的另一端與吸液體49接觸。過(guò)濾器47可以用與展開(kāi)載體30相同或不同的材料構(gòu)成，但必須是不透過(guò)凝集體且使非凝集體透過(guò)、即具有比上述微粒的平均粒徑大且比凝集體的凝集直徑小的孔徑。另夕卜，吸液體49只要是可吸收混合物中的溶劑即可，沒(méi)有特別限定。該狀態(tài)的展開(kāi)載體30、過(guò)濾器47和吸液體49通過(guò)上夾具41和下夾具42保持，過(guò)濾器47通過(guò)供給口部43露出，位置31可通過(guò)窗口部44由外部觀察。另外，保持的方式?jīng)]有特別限定，從將上夾具41和下夾具42再利用的角度考慮，優(yōu)選上夾具41和下夾具42可以自由安裝和拆卸。使用所述展開(kāi)器具40，將按照與圖3同樣的順序制備的混合物裝入過(guò)濾器47中， 由此，在凝集體被過(guò)濾器47除去之后，混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)。因此，檢體中存在檢出對(duì)象時(shí)，大量的非凝集體透過(guò)過(guò)濾器47，由展開(kāi)載體30上移動(dòng)至位置31，在位置31中可以確認(rèn)到顯色或發(fā)光。與此相對(duì)，檢體中不存在檢出對(duì)象時(shí)，在混合物中形成的大量的凝集體殘留在過(guò)濾器47上，而可透過(guò)過(guò)濾器47的非凝集體極少或不存在，因此難以在位置31確認(rèn)到顯色或發(fā)光。因此，源自凝集體的存在而產(chǎn)生的信號(hào)(這里為顯色和發(fā)光)的強(qiáng)度比檢出對(duì)象非存在下強(qiáng)時(shí)，則可以判別檢體中存在檢出對(duì)象。該實(shí)施方式與上述的實(shí)施方式不同，在展開(kāi)期間、必須將展開(kāi)載體以同樣的姿勢(shì)持續(xù)保持在混合物中這樣的限制較小，因此對(duì)于實(shí)驗(yàn)室外等不存在支撐臺(tái)、或者由于風(fēng)等使外界大氣流動(dòng)的環(huán)境也可以適應(yīng)，因此優(yōu)選?！炊糠椒ā蹈鶕?jù)本發(fā)明的定量方法，首先，將第1結(jié)合物、第2結(jié)合物和檢體混合，將該混合物置于刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的規(guī)定條件下。接著，使混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，測(cè)定該展開(kāi)載體上源自結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)度，根據(jù)檢出對(duì)象的量和信號(hào)強(qiáng)度在規(guī)定條件下的相關(guān)式算出檢體中的檢出對(duì)象的量。展開(kāi)之前的順序與上述的檢出方法通用，因此省略其說(shuō)明。(測(cè)定)測(cè)定可根據(jù)要測(cè)定的信號(hào)的種類，按照以往公知的順序進(jìn)行，可以肉眼或使用測(cè)定儀器進(jìn)行。另外，以下說(shuō)明的相關(guān)式中使用的信號(hào)強(qiáng)度可以是測(cè)定值本身，也可以是根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度的范圍分類的組的評(píng)分值，評(píng)分值是指例如如下所述。評(píng)分0 未確認(rèn)到信號(hào)評(píng)分1 信號(hào)微弱評(píng)分2 明確確認(rèn)到信號(hào)(相關(guān)式)制作與上述規(guī)定條件相同條件下的檢出對(duì)象的量與信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)式。關(guān)于構(gòu)成該相關(guān)式的檢出對(duì)象的量和信號(hào)強(qiáng)度的測(cè)定，數(shù)據(jù)越多越可得到可靠性高的相關(guān)式。這里， 數(shù)據(jù)只要是與2個(gè)以上的檢出對(duì)象的量相關(guān)即可，優(yōu)選與3個(gè)以上的檢出對(duì)象的量相關(guān)。這里，檢出對(duì)象的量與信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)式不僅是表示檢出對(duì)象的量與信號(hào)強(qiáng)度的直接相關(guān)的式子，也可以是檢出對(duì)象的量、與反映信號(hào)強(qiáng)度的參數(shù)或上述評(píng)分值的相關(guān)式。(計(jì)算)通過(guò)將展開(kāi)混合物時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度值代入制作的相關(guān)式中，可以算出檢體中的檢出對(duì)象的量。(檢出對(duì)象)按照以上的檢出方法可檢出的對(duì)象可舉出環(huán)境污染物、飲食品污染物、用于臨床診斷的物質(zhì)，具體的來(lái)說(shuō)可舉出二嗯英、環(huán)境激素、農(nóng)藥、PCB、有機(jī)汞等，朊病毒、霉菌毒素、河豚毒素、抗生素、防霉劑等，體液、尿液、痰、糞便等中所含的人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M、人免疫球蛋白A、人免疫球蛋白E、人白蛋白、人血纖蛋白原(血纖蛋白及其分解產(chǎn)物)、α-甲胎蛋白(AFP)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、肌紅蛋白、癌胚抗原、肝炎病毒抗原、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盤(pán)催乳素(HPL)、HIV病毒抗原、細(xì)菌毒素、細(xì)菌抗原、酶、激素(例如人促甲狀腺激素(TSH)、胰島素等)、藥物等。〈試劑盒〉本發(fā)明也包含用于對(duì)檢出對(duì)象進(jìn)行檢出和/或定量的試劑盒。該試劑盒具備第1 結(jié)合物、第2結(jié)合物和展開(kāi)載體，其中，所述第1結(jié)合物是具有含刺激響應(yīng)性聚合物的凝集性物質(zhì)的第1物質(zhì)與檢出對(duì)象的第1親和性物質(zhì)結(jié)合而成，所述第2結(jié)合物是具有親水性的第2物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第2親和性物質(zhì)結(jié)合而成，所述展開(kāi)載體用于將該結(jié)合物展開(kāi)。第1物質(zhì)或第2物質(zhì)優(yōu)選具有有色顆粒。另外，第1結(jié)合物或第2結(jié)合物優(yōu)選具有在上述展開(kāi)載體上顯色或發(fā)光的物質(zhì)。各構(gòu)成要素的詳細(xì)內(nèi)容如上所述，在此省略。實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)施例中使用的代表性試劑如下所述。PBS 緩沖液將 10 倍濃度的市售 PBS (將 81mM Na2HPO4U4. 7mM KH2PO4,26. 8mM KC1、 1370mM NaCl、pH7. 4 二 ？求 > 夕一 > (株)制造)用純凈水稀釋為1/10 (V/V)使用。純凈水用MILLIP0RE公司制造的“Direct-Q” (商品名)純化的水。實(shí)施例1本實(shí)施例中給出了使用抗TSHii抗體結(jié)合-溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒作為第1結(jié)合物、使用抗TSH α抗體結(jié)合聚丙烯酸鈉作為第2結(jié)合物，檢出人促甲狀腺激素 (TSH)的例子。(第1結(jié)合物的制備)使用Leinco Technologies Inc.制造的抗人TSHi^抗體(抗人促甲狀腺激素β， 克隆195小鼠，類小鼠IgG)，由旭歹^公司用硫代-NHS-生物素進(jìn)行生物素化， 制備生物素化抗人TSHii抗體。鏈霉抗生物素結(jié)合-溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒是將250 μ L 7夕'f 一卜(株)制造的Therma-Max (注冊(cè)商標(biāo))LSA鏈霉抗生物素(0. 4%質(zhì)量)置于1. 5mL的微量管中，進(jìn)一步加入50yL(0.75mg/mL)溶解于PBS緩沖液的生物素化抗人TSH β抗體， 在4°C下顛倒混合15分鐘。將上述微量管加熱至37 °C，然后用磁石回收上述磁性顆粒，除去上清部分。向其中加入250yL PBS緩沖液，進(jìn)行冷卻，使上述磁性顆粒分散。進(jìn)一步將過(guò)量的生物素添加到管內(nèi)，覆蓋鏈霉抗生物素的生物素結(jié)合部位。再次將微量管加熱至37°C， 然后用磁石回收上述磁性顆粒，除去上清部分，由此制備抗人TSHii抗體化溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒。在含有該抗人TSHii抗體化溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒的管內(nèi)加入 500 μ L 含有 0.5% (w/v)BSA( * 夕 公司制造)、0· 5% (w/v) Tween (注冊(cè)商標(biāo))20、IOmM EDTA的PBS緩沖液(pH7. 4)，通過(guò)冷卻使其分散，制備第1結(jié)合物的分散溶液。(第2結(jié)合物的制備)首先，在ImL作為檢出對(duì)象的人促甲狀腺激素(TSH)的第2親和性物質(zhì)即抗人TSHα抗體(抗人促甲狀腺激素α，克隆176小鼠，小鼠IgG，Leinco Technology, Inc.制造，lmg/mL)中加入6mg 2-巰基乙醇，在37 °C下反應(yīng)120分鐘。反應(yīng)后通過(guò) Slide-A-LyzeH商品名)透析盒、IOK MWCO (Pierce)，用500mL PBS緩沖液進(jìn)行透析，除去過(guò)量的2-巰基乙醇，使用排阻極限分子量10000的超濾膜(MILLIP0RE公司制造[Amicon Ultra-4Ultracel 10k])濃縮至0. 5mL，得到小鼠抗人TSH α抗體的還原抗體。將0. 5mL該還原抗體和100 μ L馬來(lái)酰亞胺化聚丙烯酸鈉在4°C下反應(yīng)過(guò)夜，接著使用Superdex-200 10/300GL(GE、“"公司制造)進(jìn)行凝膠過(guò)濾，由此制備標(biāo)記抗體。將該標(biāo)記抗體(該抗體也稱作聚丙烯酸鈉-抗人TSH α抗體結(jié)合物)用含有0.5% (w/v) BSA ( ν々'7公司制造)、0· 5% (w/v) Tween (注冊(cè)商標(biāo))20UOmMEDTA的PBS緩沖液(ρΗ7· 4)稀釋，使蛋白質(zhì)濃度為4μ g/mL，由此制備第2結(jié)合物。上述馬來(lái)酰亞胺化聚丙烯酸鈉如下制備。首先，在安裝了氮?dú)鈱?dǎo)入管、溫度計(jì)和攪拌裝置的IOOmL的三頸燒瓶?jī)?nèi)，將2g丙烯酸(和光純藥工業(yè)公司制造)、0.021g 2-氨基乙烷硫醇(和光純藥工業(yè)公司制造)和0. 023g偶氮二異丁腈(和光純藥工業(yè)公司制造)溶解于50mLN，N-二甲基甲酰胺中，用1小時(shí)進(jìn)行氮置換。然后，在70°C下用7小時(shí)進(jìn)行聚合反應(yīng)。將所得反應(yīng)液減壓濃縮至10mL，用二乙醚進(jìn)行再沉淀，使粘稠狀的物質(zhì)形成粉狀。濾取白色沉淀，進(jìn)一步用真空干燥機(jī)干燥過(guò)夜，由此得到氨基末端聚丙烯酸(收量1. 5g)。將 0. 5克該氨基末端聚丙烯酸和IOmL N，N-二甲基甲酰胺加入到安裝了氮?dú)鈱?dǎo)入管和攪拌裝置的50mL茄型燒瓶中，進(jìn)行溶解。向其中加入!MgEMCS (N-(6-馬來(lái)酰胺己酰氧基)琥珀酰亞胺)(同仁化學(xué)研究所制造)，反應(yīng)過(guò)夜。將所得反應(yīng)液減壓濃縮至lmL，用二乙醚進(jìn)行再沉淀，使粘稠的物質(zhì)形成粉狀。濾取白色沉淀，進(jìn)一步用真空干燥機(jī)干燥過(guò)夜，得到馬來(lái)酰亞胺基末端聚丙烯酸。該馬來(lái)酰亞胺基末端聚丙烯酸的數(shù)均分子量約為130000 (GPC系統(tǒng) 島津制作所制造，柱東y—公司制造，TSKgel Super AW3000,6mm ID. X 150mm，流動(dòng)相 0. IM硝酸鈉)，收量為0. 4g。(檢體的制備)將TSH =Aspen Bio Pharma, Inc.制造的人促甲狀腺激素(活性8. 5IU/mg， WH080/558)的溶液(濃度30 μ g/mL)用才一乂 ·夕'J 二力卟 夕· 4 了夕’7義于4夕義公司制造的“ 卜α 7 (注冊(cè)商標(biāo))TSH，校準(zhǔn)儀1 ( # ~ U 7、一夕1) ”稀釋為0. 06mIU/L、 0. 0012mIU/L，分別將其作為檢體2、3。除了不含有人促甲狀腺激素活性之外，其余均按照同樣的順序制備，將其作為檢體1。(展開(kāi))將150 μ L第1結(jié)合物的分散溶液和200 μ L第2結(jié)合物的分散溶液注入到微量管內(nèi)，用旋渦攪拌器攪拌1秒鐘，然后分別注入50 μ L各檢體1 3，用旋渦攪拌器攪拌后，在室溫(21°C)下溫育5分鐘。從管中采取反應(yīng)液總量，注入到預(yù)先在37°C下保溫的反應(yīng)試管(參照?qǐng)D3)中，在37°C下保溫5分鐘。然后，將尺寸5mmX50mm、具有0. Ιμπι以下的孔徑的、作為展開(kāi)載體的MILLIP0RE 公司制造的膜濾器“Hi-Flow Membrane #SNHF0400”(商品名)放入反應(yīng)管內(nèi)的反應(yīng)液中， 使其自下端浸泡至約IOmm的位置，靜置1分鐘。然后將膜濾器小心地提起，觀察膜濾器上的情形。該結(jié)果如圖9所示。(判別)如圖9所示，在不含有檢出對(duì)象的檢體1中，可以在彎月面所對(duì)應(yīng)的位置(自下端約IOmm)處確認(rèn)到源自凝集體中的結(jié)合物(磁性顆粒)的存在而產(chǎn)生的褐色條帶。與此相對(duì)，在含有檢出對(duì)象的檢體2、3中，未在彎月面所對(duì)應(yīng)的位置上確認(rèn)到褐色條帶，可以在廣范圍內(nèi)確認(rèn)到褐色區(qū)域。因此，當(dāng)彎月面所對(duì)應(yīng)的位置的褐色條帶的濃度比檢出對(duì)象非存在下弱時(shí)，可以判別檢體中存在檢出對(duì)象。另外，即使褐色區(qū)域的位置并未集中在彎月面位置上，而是在廣范圍內(nèi)分布，也可以判別檢體中存在檢出對(duì)象。實(shí)施例2本實(shí)施例中給出使用抗HBs抗體結(jié)合-溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒作為第1結(jié)合物、使用抗HBs抗體結(jié)合聚乙二醇作為第2結(jié)合物、檢出HBs抗原的例子。(第1結(jié)合物的制備)使用PIERCE公司制造的EZ-Link硫代-NHS-生物素試劑盒，Product#21420 (商品名)，按照試劑盒所附的生物素化方法對(duì)(株)特殊免疫研究所制造的抗HBs單克隆抗體 (抗原決定簇a，克隆編號(hào)Hyb-824)進(jìn)行生物素化，制備生物素化抗HBs單克隆抗體。在1. 5mL的微量管中加入500 μ L溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒即^ t e —卜(株)制造的Therma-Max (注冊(cè)商標(biāo))LSA鏈霉抗生物素(30) (0. 2%質(zhì)量)，進(jìn)一步加入50 μ L (0. 75mg/mL)溶解于PBS緩沖液的生物素化抗HBs單克隆抗體，在4°C下用15分鐘顛倒混合。將上述微量管加熱至37°C，然后用磁石回收上述磁性顆粒，除去上清部分，制備抗HBs單克隆抗體化溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒。在含有該抗HBs單克隆抗體化溫度響應(yīng)性聚合物表面修飾磁性顆粒的管中加入 500 μ L 含有 0.5% (w/v)BSA( * 夕 公司制造)、0.5% (w/v) Tween (注冊(cè)商標(biāo))20、IOmM EDTA的PBS緩沖液(pH7. 4)，通過(guò)冷卻使上述磁性顆粒分散，制備第1結(jié)合物的分散溶液。(第2結(jié)合物的制備)使用(株)特殊免疫研究所制造的抗HBs單克隆抗體(抗原決定簇d，克隆編號(hào) Hyb-3423)和抗HBs單克隆抗體(抗原決定簇y，克隆編號(hào)Hyb_3457)代替抗人TSHa抗體，以及使用2-巰基乙胺鹽酸鹽代替2-巰基乙醇，除此之外按照與實(shí)施例1同樣的順序得到兩種抗HBs單克隆抗體的還原抗體。使用馬來(lái)酰亞胺化聚乙二醇代替馬來(lái)酰亞胺化聚丙烯酸鈉，除此之外按照與實(shí)施例1同樣的順序，由這些還原抗體得到兩種標(biāo)記抗體，制備第 2結(jié)合物。所使用的馬來(lái)酰亞胺化聚乙二醇是SUNBRIGHT ME-400MA(商品名)日油(株) 制造，重均分子量40，000。(檢體的制備)將(株)特殊免疫研究所制造的純化HBs抗原用0. 5%BSA( ν ^、公司制造)和 PBS緩沖液(ρΗ7. 4)稀釋為lOOOng/mL的濃度。將該稀釋物用人血清稀釋為lOng/mL的濃度，作為陽(yáng)性檢體(檢體2)，其中，所述人血清是用才一乂^ , ” ^公司制造的“e卜口卞(注冊(cè)商標(biāo))”HBs抗原(批號(hào)2330)試劑盒判斷為陰性的人血清。將該人血清作為陰性檢體(檢體1)。(展開(kāi))使用100 μ L第1結(jié)合物的分散溶液、100 μ L第2結(jié)合物的分散溶液和5 μ L檢體， 除此之外按照與實(shí)施例1同樣的順序在膜濾器上進(jìn)行展開(kāi)，觀察膜濾器上的情形。該結(jié)果如圖10所示。(判別)如圖10所示，在不含有檢出對(duì)象的檢體1中，可以在彎月面所對(duì)應(yīng)的位置(圖中箭頭所示位置)處確認(rèn)到源自凝集體中的結(jié)合物(磁性顆粒)的存在而產(chǎn)生的褐色條帶。 與此相對(duì)，在含有檢出對(duì)象的檢體2中，未在彎月面所對(duì)應(yīng)的位置上確認(rèn)到褐色條帶，可以在廣范圍內(nèi)確認(rèn)到褐色區(qū)域。因此可知，當(dāng)彎月面所對(duì)應(yīng)的位置的褐色條帶的濃度比檢出對(duì)象非存在下弱時(shí)，可以判別檢體中存在檢出對(duì)象。另外，即使褐色區(qū)域的位置并未集中在彎月面位置上，而是廣范圍分布，也可以判別檢體中存在檢出對(duì)象。符號(hào)說(shuō)明10第1結(jié)合物11刺激響應(yīng)性聚合物13第1抗體(第1親和性物質(zhì))15抗生物素蛋白17生物素19磁性物質(zhì)20第2結(jié)合物21第2物質(zhì)23第2抗體(第2親和性物質(zhì))30展開(kāi)載體40展開(kāi)器具41上夾具42下夾具43供給口部44 窗口部47過(guò)濾器50檢出對(duì)象
權(quán)利要求
1.檢出檢體中的檢出對(duì)象的方法，該方法包含以下步驟將第1結(jié)合物和第2結(jié)合物與上述檢體混合，其中，所述第1結(jié)合物是含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第1親和性物質(zhì)結(jié)合而成，所述第2結(jié)合物是具有親水性的第2物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第2親和性物質(zhì)結(jié)合而成；將所得混合物置于上述刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下，使上述混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，或者使所得混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，將上述混合物置于上述刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下；確認(rèn)上述展開(kāi)載體上的源自第1結(jié)合物或第2結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)，上述信號(hào)與上述檢出對(duì)象非存在下不同時(shí)，則判別上述檢體中存在檢出對(duì)象，該方法中，第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)可以與上述檢出對(duì)象的不同部位結(jié)合。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，源自第1結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)度比上述檢出對(duì)象非存在下弱時(shí)，判別上述檢體中存在檢出對(duì)象。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述混合物是在除去了第1結(jié)合物的凝集體之后，在上述展開(kāi)載體上展開(kāi)，源自第1結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)度比上述檢出對(duì)象非存在下強(qiáng)時(shí)，判別上述檢體中存在檢出對(duì)象。
4.對(duì)檢體中的檢出對(duì)象進(jìn)行定量的方法，該方法包含以下步驟將第1結(jié)合物和第2結(jié)合物與上述檢體混合，其中，所述第1結(jié)合物是含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第1親和性物質(zhì)結(jié)合而成，所述第2結(jié)合物是具有親水性的第2物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第2親和性物質(zhì)結(jié)合而成；將所得混合物置于上述刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下，使上述混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，或者使所得混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，將上述混合物置于上述刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下；測(cè)定上述展開(kāi)載體上的源自第1結(jié)合物或第2結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)度，根據(jù)上述檢出對(duì)象的量和信號(hào)強(qiáng)度在上述規(guī)定條件下的相關(guān)式算出上述檢體中的檢出對(duì)象的量，該方法中，第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)可以與上述檢出對(duì)象的不同部位結(jié)合。
5.權(quán)利要求4所述的方法，該方法是測(cè)定源自第1結(jié)合物的凝集體的存在而產(chǎn)生的信號(hào)。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中，上述混合物是在除去第1結(jié)合物的凝集體之后，在上述展開(kāi)載體上展開(kāi)，測(cè)定源自第1結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)度。
7.權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第1結(jié)合物具有有色顆粒，上述信號(hào)與基于上述有色顆粒的存在而顯示的顏色相關(guān)。
8.權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第1結(jié)合物或第2結(jié)合物具有在上述展開(kāi)載體上顯色或發(fā)光的物質(zhì)，上述信號(hào)與基于上述顯色或發(fā)光的物質(zhì)的存在而顯示的顏色或光相關(guān)。
9.試劑盒，該試劑盒用于對(duì)檢出對(duì)象進(jìn)行檢出和/或定量，該試劑盒具備第1結(jié)合物、 第2結(jié)合物和用于展開(kāi)上述結(jié)合物的展開(kāi)載體，其中，所述第1結(jié)合物是含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第1親和性物質(zhì)結(jié)合而成，所述第2結(jié)合物是具有親水性的第2物質(zhì)與上述檢出對(duì)象的第2親和性物質(zhì)結(jié)合而成。
10.權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中，第1結(jié)合物具有有色顆粒。
11.權(quán)利要求9或10所述的試劑盒，其中，第1結(jié)合物或第2結(jié)合物具有在上述展開(kāi)載體上顯色或發(fā)光的物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供在各種環(huán)境下可迅速、低成本、簡(jiǎn)便且高精度地對(duì)檢出對(duì)象進(jìn)行檢出、定量的檢出對(duì)象的檢出方法和定量方法。檢出檢體中的檢出對(duì)象的方法包含以下步驟將第1結(jié)合物和第2結(jié)合物與檢體混合，其中，所述第1結(jié)合物是含有刺激響應(yīng)性聚合物的第1物質(zhì)與檢出對(duì)象的第1親和性物質(zhì)結(jié)合而成，所述第2結(jié)合物是具有親水性的第2物質(zhì)與檢出對(duì)象的第2親和性物質(zhì)結(jié)合而成；將所得混合物置于刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下，使混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，或者使所得混合物在展開(kāi)載體上展開(kāi)，將混合物置于刺激響應(yīng)性聚合物發(fā)生凝集的條件下；確認(rèn)展開(kāi)載體上的源自第1結(jié)合物或第2結(jié)合物的存在而產(chǎn)生的信號(hào)，信號(hào)與檢出對(duì)象非存在下不同時(shí)，則判別檢體中存在檢出對(duì)象。第1親和性物質(zhì)和第2親和性物質(zhì)可以與檢出對(duì)象的不同部位結(jié)合。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102483409SQ201080023788
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月29日
發(fā)明者大西德幸, 木次克彥, 杉田悟 申請(qǐng)人:Jnc株式會(huì)社, 奧索臨床診斷股份有限公司