專利名稱：特異于鈣粘素-17的抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般性地涉及免疫學和分子生物學領域。更具體地，本文提供了抗細胞粘著分子鈣粘素-17的抗體和其它治療性蛋白，編碼此類抗體和治療性蛋白的核酸，用于制備本發(fā)明的單克隆抗體和其它治療性蛋白的方法，以及用于治療疾病(例如由鈣粘素-17 的表達/活性介導的，和/或與其配體的異常表達/活性相關的)的方法。
背景技術：
鈣粘素是鈣依賴性的細胞粘著分子。在連接的細胞中，它們優(yōu)選地以嗜同性的方式與其自身相互作用；因此，鈣粘素可促成對異質細胞類型的分選。鈣粘素分子鈣粘素-17 也已知為肝-腸鈣粘素或腸肽相關轉運子HPT-1。鈣粘素-17可在肝和腸的形態(tài)組織中起作用。其還參與腸的肽轉運。鈣粘素-17結構的特征在于，其具有含有7個鈣粘素結構域的細胞外結構域、單一的疏水性跨膜結構域和短的C末端胞質尾區(qū)。僅已知一種人鈣粘素-17 同種型，即Genbank登錄號NM_004063。鈣粘素-17在SWISS-PR0T和trEMBL數(shù)據(jù)庫(由瑞士生物信息研究所(SIB)和歐洲生物信息研究所(EBI)所有，可在www. expasy. com獲得) 中具有登錄號Q 12864。小鼠的鈣粘素-17直向同源物019R100)與人鈣粘素-17顯示出 76%的同一性。根據(jù)SWISS-PR0T，鈣粘素-17在胃腸道和胰管中表達。其未在腎、肺、肝、腦、腎上腺或皮膚中被檢測到。鈣粘素-17的表達已在下列中被報導胃癌(參見，例如Ito et al.，Virchows_Arch. 20050ct ；447(4) :717-22 ；Su et al, Mod Pathol. 2008Nov ；21(11) 1379-86 ；Ko et al. , Biochem Biophys Res Commun. 2004Jun25 ；319 (2) :562-8 ；禾口 Dong et al.，Dig Dis Sci 2007Feb ；52 (2) :536-42)，胰腺癌和結腸直腸癌(Su et al.，Mod Pathol. 2008Nov ；21 (11) :1379-86)以及肝細胞癌(Wong et al. , BiochemBiophys Res Commun. 2003Nov 21 ；311 (3) :618-24)。國際專利申請 W02008/(^6008 公開了鈣粘素-17 作為結腸直腸癌的標記物以及作為治療性抗體和其它藥物試劑的生物學靶點。發(fā)明概述本發(fā)明提供了針對鈣粘素-17的抗體、編碼此類抗體和治療性蛋白的核酸；用于制備抗鈣粘素17單克隆抗體和其它治療性蛋白的方法；和用于治療疾病的方法，所述疾病為例如鈣粘素-17介導的病癥，例如人類的癌癥，包括結腸直腸癌。因此，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體，尤其是鼠的、嵌合的、人源化的和全人單克隆抗體，所述單克隆抗體與鈣粘素-17結合并且顯示出一種或多種所需的功能特性。此類特性包括例如，與人類鈣粘素-17的高親和力特異性結合。還提供了使用本發(fā)明的抗體、 蛋白和組合物治療多種由鈣粘素-17介導的疾病的方法。
本發(fā)明提供了結合人鈣粘素-17上的表位的分離的單克隆抗體或其抗原結合部分、抗體片段或抗體模擬物，所述表位被含有包含選自SEQ ID NO 38，35，36，37，39，40，41， 42，43，44，45和46所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含選自SEQ ID NO =49,47,48,50, 51，52，53，54，55，56，57和58所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體識別。在一些實施方式中，所述分離的抗體是IgGl，IgG2，IgG3或IgG4同種型的全長抗體。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體選自完整抗體、抗體片段、人源化抗體、單鏈抗體、免疫綴合物、去巖藻糖化(defucosylated)的抗體，和雙特異性抗體。抗體片段可以選自UniBody、結構域抗體和納米抗體(Nanobody)。在一些實施方式中，本發(fā)明的免疫綴合物包含治療劑。在本發(fā)明的另一個方面，治療劑是細胞毒素或放射性的同位素。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體選自Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer、 Versabody 禾口 Duocalin。在備選實施方式中，本發(fā)明的組合物包含分離的抗體或抗原結合部分和藥學上可接受的載體。在其它方面，本發(fā)明的抗體是包含根據(jù)本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結合部分和藥學上可接受的載體的組合物。在一些實施方式中，本發(fā)明包括編碼結合人類鈣粘素-17上的表位的分離的抗體或抗原結合部分的重鏈或輕鏈的分離的核酸分子。本發(fā)明的其它方面包括包含此類核酸分子的表達載體和包含此類表達載體的宿主細胞。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了用于制備抗鈣粘素-17抗體的方法，所述方法包括步驟獲得包含編碼本發(fā)明的抗體的一個或多個核酸分子的宿主細胞；使所述宿主細胞在宿主細胞培養(yǎng)物中生長；為宿主細胞培養(yǎng)物提供所述一個或多個核酸分子被表達的條件；和從宿主細胞或宿主細胞培養(yǎng)物中回收抗體。在其它實施方式中，本發(fā)明涉及用于治療或預防與表達鈣粘素-17的靶細胞相關的疾病的方法，所述方法包括步驟向受試者施用有效治療或預防該疾病的量的抗鈣粘素-17抗體或其抗原結合部分。在一些方面，通過本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分治療或預防的疾病是人類的癌癥。在一些實施方式中，通過本發(fā)明的抗體治療或預防的疾病是結腸直腸癌。在其它實施方式中，本發(fā)明涉及用于治療或預防與表達鈣粘素-17的靶細胞相關的疾病的抗鈣粘素-17抗體或其抗原結合部分。在一些方面，通過本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分治療或預防的疾病是人類的癌癥。在一些實施方式中，通過本發(fā)明的抗體治療或預防的疾病是結腸直腸癌。在其它實施方式中，本發(fā)明涉及抗鈣粘素-17抗體或其抗原結合部分用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療或預防與表達鈣粘素-17的靶細胞相關的疾病。在一些方面， 通過本發(fā)明的藥物治療或預防的疾病是人類的癌癥。在一些實施方式中，通過本發(fā)明的藥物治療或預防的疾病是結腸直腸癌。在其它實施方式中，本發(fā)明是結合人類鈣粘素-17上的表位的分離的單克隆抗體或其抗原結合部分、抗體片段或抗體模擬物，所述表位被含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體識別，所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)選自SEQ ID NO :35所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ IDNO :47所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :36所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO :48所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ IDNO :37所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO 48所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO 38所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ IDNO 49所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO 39所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO :50所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ IDNO :40所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO 51所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO 40所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ IDNO 54所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO 40 所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO :55所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ IDNO 41所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO :52所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO 42所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ IDNO 53所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :43所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO :56所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列； SEQ IDNO 44所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO 55所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :45所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ IDNO :57所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :46所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO :58所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。在進一步的方面，抗體選自完整抗體、抗體片段、人源化抗體、單鏈抗體、免疫綴合物、去巖藻糖化的抗體和雙特異性抗體。在本發(fā)明的進一步的方面，抗體片段選自Uni Body、結構域抗體和納米抗體(Nanobody)。在一些實施方式中，抗體模擬物選自Affibody、 DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody和Duocalin。在進一步的實施方式中，組合物包含分離的抗體或其抗原結合部分和藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，本發(fā)明是編碼本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結合部分的重鏈或輕鏈的分離的核酸分子；在進一步的方面，可以包括包含此類核酸的表達載體和包含此類表達載體的宿主細胞。本發(fā)明的另一個實施方式是表達本發(fā)明的任一抗體或其抗原結合部分的雜交瘤。本發(fā)明的其它方面涉及制備本發(fā)明的抗體的方法，包括步驟使用鈣粘素-17肽免疫動物；從所述動物的B-細胞回收mRNA ；將所述mRNA轉變?yōu)閏DNA ；在噬菌體中表達所述cDNA，從而由所述cDNA編碼的抗鈣粘素_17抗體被呈遞在所述噬菌體的表面；選擇呈遞抗鈣粘素-17抗體的噬菌體；從所述選擇的噬菌體回收編碼所述抗-鈣粘素-17免疫球蛋白的核酸分子；在宿主細胞中表達所述回收的核酸分子；和從所述宿主細胞回收結合鈣粘素-17的抗體。在本發(fā)明的一些方面，分離的單克隆抗體或其抗原結合部分結合具有SEQ ID NO 136或137的氨基酸序列的鈣粘素-17多肽上的表位，所述表位被含有包含選自SEQ ID NO 38，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45或46所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含選自 SEQID NO :49，47，48，50，51，52，53，54，55，56，57或58所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗體識別。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將通過以下不應被解釋為限制性的詳細描述和實施例而是顯然的。本申請各處所引用的所有參考文獻、Genbank條目、專利和公開的專利申請的內容明確地通過引用方式并入本文。


圖1顯示了 PTA001_A1單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 59)和氨基酸序列(SEQ ID NO :35)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO 1), CDR2 (SEQ ID NO 5)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 14)區(qū)域。圖2顯示了 PTA001_A2單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 60) 和氨基酸序列(SEQ ID N0:36)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :2)，CDR2 (SEQ ID NO 6)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 15)區(qū)域。圖3顯示了 PTA001_A3單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 61) 和氨基酸序列(SEQ ID N0:37)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :3)，CDR2 (SEQ ID NO 7)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 16)區(qū)域。圖4顯示了 PTA001_A4單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 62) 和氨基酸序列(SEQ ID N0:38)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO -Λ), CDR2 (SEQ ID NO :8)禾口 CDR3 (SEQ ID NO :17)區(qū)域。圖5顯示了 PTA001_A5單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO :63) 和氨基酸序列(SEQ ID NO :39)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :3)，CDR2 (SEQ ID NO 7)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 18)區(qū)域。圖6顯示了 PTA001_A6、PTAOO 1_A9和PTA001_A10單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序歹Ij (SEQ ID NO 64)和氨基酸序列(SEQ IDNO :40)。劃線的是 CDRl (SEQ ID NO 3), CDR2 (SEQ ID NO 7)和 CDR3 (SEQID NO 16)區(qū)域。圖7顯示了 PTA001_A7單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 65) 和氨基酸序列(SEQ ID N0:41)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :3)，CDR2 (SEQ ID NO 9)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 19)區(qū)域。圖8顯示了 PTA001_A8單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 66) 和氨基酸序列(SEQ ID N0:42)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :3)，CDR2 (SEQ ID NO 7)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 16)區(qū)域。圖9顯示了 PTA001_A11單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 67) 和氨基酸序列(SEQ ID N0:43)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :3)，CDR2 (SEQ ID NO :10)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 20)區(qū)域。圖10顯示了 PTA001_A12單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:
68)和氨基酸序歹Ij(SEQ ID N0:44)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO 3)，CDR2 (SEQ ID NO 11) 和 CDR3(SEQ ID NO :21)區(qū)域。圖11顯示了 PTA001_A13單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO
69)和氨基酸序歹Ij(SEQ ID N0:45)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO 3)，CDR2 (SEQ ID NO 12) 和 CDR3(SEQ ID NO :18)區(qū)域。圖12顯示了 PTA001_A14單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:
70)和氨基酸序歹Ij(SEQ ID N0:46)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO 2)，CDR2 (SEQ ID NO 13) 和 CDR3(SEQ ID NO :15)區(qū)域。圖13顯示了 PTA001_A1單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 71) 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:47)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :22)，CDR2 (SEQ ID NO 28)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 32)區(qū)域。圖14顯示了 PTA001_A2和PTA001_A3單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO :72)和氨基酸序列(SEQ ID NO :48)。劃線的是CDRl (SEQ ID NO :23)，CDR2 (SEQ ID NO 29)和 CDR3 (SEQ ID NO :33)區(qū)域。圖15顯示了 PTA001_A4單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 73) 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:49)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :24)，CDR2 (SEQ ID NO 30)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 34)區(qū)域。圖16顯示了 PTA001_A5單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 74) 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:50)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :25)，CDR2 (SEQ ID NO 31)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 33)區(qū)域。圖17顯示了 PTA001_A6單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 75) 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:51)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :23)，CDR2 (SEQ ID NO 29)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 33)區(qū)域。圖18顯示了 PTA001_A7單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 76) 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:52)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :26)，CDR2 (SEQ ID NO 29)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 33)區(qū)域。圖19顯示了 PTA001_A8單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 77) 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:53)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :25)，CDR2 (SEQ ID NO 31)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 33)區(qū)域。圖20顯示了 PTA001_A9單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 78) 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:54)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :23)，CDR2 (SEQ ID NO 29)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 33)區(qū)域。圖21顯示了 PTA001_A10和PTA001_A12單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列 (SEQ ID N0:79 禾口 al)和氨基酸序列(SEQ ID NO :55)。劃線的是 CDRl (SEQ ID NO 25), CDR2 (SEQ ID NO 29)和 CDR3 (SEQ IDNO 33)區(qū)域。圖22顯示了 PTA001_A11單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 80) 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:56)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :27)，CDR2 (SEQ ID NO 29)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 33)區(qū)域。圖23顯示了 PTA001_A13單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 82) 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:57)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :25)，CDR2 (SEQ ID NO 31)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 33)區(qū)域。圖對顯示了 PTA001_A14單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 83) 和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:58)。劃線的是 CDRl (SEQ IDNO :23)，CDR2 (SEQ ID NO 29)禾口 CDR3 (SEQ ID NO 33)區(qū)域。圖25顯示了 PTA001_A1的重鏈CDRl區(qū)域的核苷酸序列(SEQ IDNO 84)與小鼠種系Vh7-39核苷酸序列的核苷酸M0469(SEQ ID NO :125)的比對，以及下列的重鏈 ⑶Rl區(qū)域的核苷酸序列與小鼠種系VhII基因H17核苷酸序列的核苷酸67-96 (SEQ ID NO 126)的比對PTA001_A2 和 PTA001_A14(SEQ ID NO :85) ；ΡΤΑ001_Α3，ΡΤΑ001_A5, PTA001_ A6, ΡΤΑ001_A7，PTA001_A8，PTA001_A9，PTA001_A10，PTA001_A11，ΡΤΑ001_A 12 禾P ΡΤΑ001_ A13(SEQ ID NO :86)；以及 ΡΤΑ001_A4 (SEQ ID NO :87)。圖沈顯示了下列的重鏈⑶R2區(qū)域的核苷酸序列與小鼠種系VhII區(qū)域Vh105核苷酸序列的核苷酸 1096-1146 (SEQ ID NO :127)的比對PTA001_A2 (SEQ ID NO :89) ；PTAOO 1_ A3，PTAOO1_A5，PTAOO1_A6，PTAOO1_A8，PTAOO1_A9 和 PTAOO1_A10(SEQ ID NO :90) ；PTAOO1_ A4(SEQID NO :91) ；PTA001_A7(SEQ ID NO :92) ;PTA001_A11(SEQ ID NO :93) ；PTA001_ A12(SEQ ID NO :94) ；PTAOO 1_A 13 (SEQ ID NO 95)；以及 PTAOO 1_A14 (SEQ ID NO :96)。圖27顯示了 PTAOO 1_A1的輕鏈CDRl區(qū)域的核苷酸序列(SEQ IDNO :105)與小鼠種系VkI-IIO核苷酸序列的核苷酸1738-1785 (SEQ IDNO :128)的比對；ΡΤΑ001_A4的輕鏈CDRl 區(qū)域的核苷酸序列(SEQ IDNO 107)與小鼠種系VK8_30核苷酸序列的核苷酸510-560 (SEQ ID NO 130)的比對；以及下列的輕鏈⑶Rl區(qū)域的核苷酸序列與小鼠種系VJ4-140核苷酸序列的核苷酸 1807-1854 (SEQ ID NO :133)的比對:ΡΤΑ001_Α2, ΡΤΑ001_A3, PTA001_A6, PTAOO 1_A9 禾口 PTAOO 1_A14(SEQID NO :106) ；PTA001_A5 禾口 PTA001_A13 (SEQ ID NO :108)； PTA001_A7(SEQ ID NO :109) ；PTA001_A8(SEQ ID NO :110) ；PTA001_A10(SEQID NO :111)； PTA001_A 11 (SEQ ID NO :112)；以及 ΡΤΑ001_A12 (SEQ IDNO :113)。圖沘顯示了 PTAOO 1_A4的輕鏈CDR2區(qū)域的核苷酸序列(SEQ IDNO :116)與小鼠種系VK8-30核苷酸序列的核苷酸606-626 (SEQ ID NO :131)的比對；以及下列的輕鏈 ⑶R2區(qū)域的核苷酸序列與小鼠種系VJ4-140核苷酸序列的核苷酸1900-1920 (SEQ ID NO 134)的比對=PTAOO 1_Α2, ΡΤΑ001_A3, PTA001_A6, PTA001_A9 禾口 PTA001_A14 (SEQID NO 115) ；PTA001_A5 和 PTA001_A13(SEQ ID NO :117) ；ΡΤΑ001_A7，ΡΤΑ001_A10，ΡΤΑ001_A11 禾口 PTA001_A 12 (SEQ ID NO :118)；以及 ΡΤΑ001_A8 (SEQ ID NO :119)。圖四顯示了 PTA001_A1的輕鏈CDR3區(qū)域的核苷酸序列(SEQ IDNO :120)與小鼠種系VkI-IIO核苷酸序列的核苷酸1948-1971 (SEQ IDNO :129)的比對；PTA001_A4的輕鏈CDR3 區(qū)域的核苷酸序列(SEQ IDNO 122)與小鼠種系VK8_30核苷酸序列的核苷酸723-749 (SEQ ID NO 132)的比對；以及下列的輕鏈⑶R3區(qū)域的核苷酸序列與小鼠種系VJ4-140核苷酸序列的核苷酸 2017-2043 (SEQ ID NO :135)的比對ΡΤΑ001_Α2，ΡΤΑ001_Α3，ΡΤΑ001_ A6, ΡΤΑ001_A9, PTA001_A10, PTA001_A11，PTA001_A12 禾口 PTA001_A14(SEQ ID NO :121)； PTA001_A5，PTA001_A8 和 PTA001_A 13 (SEQ ID NO :123)；以及 ΡΤΑ001_A7 (SEQ IDNO :124)。圖30顯示了使用PTA001_A4單克隆抗體對鈣粘素-17進行的蛋白質印跡分析。圖31顯示了在LoVo細胞中對于ΡΤΑ001_A4的FACS分析的結果。圖32顯示了在LoVo和LS174T細胞中對于ΡΤΑ001_A4的FACS分析的結果。圖33A顯示了溫育60分鐘后，ΡΤΑ001_A4/ 二抗FITC綴合物復合物與LoVo細胞的表面結合。圖3 顯示了與LoVo細胞溫育120分鐘后，PTA001_A4/ 二抗FITC綴合物復合物的內吞作用。圖34A顯示了在LoVo結腸癌細胞中，通過MabZAP測定檢測的PTA001_A4的內吞
作用結果。圖34B顯示了在LoVo結腸癌細胞中，通過MabZAP測定檢測的PTA001_A4的內吞
作用結果。圖34C顯示了在LS174T結腸癌細胞中，通過MabZAP測定檢測的PTA001_A4的內
吞作用結果。圖34D顯示了在LS174T結腸癌細胞中，通過MabZAP測定檢測的PTA001_A4的內吞作用結果。圖35A顯示了在LoVo結腸癌細胞中，通過MabZAP測定檢測的PTA001_A4的內吞
作用結果。圖35B顯示了在LS174T結腸癌細胞中，通過MabZAP測定檢測的PTA001_A4的內吞作用結果。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及以高親和力特異性結合鈣粘素-17的分離的抗體，包括但不限于例如單克隆抗體。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體包含特定的結構特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本發(fā)明提供了分離的抗體，去巖藻糖化的抗體，免疫綴合物，雙特異性分子， affibodies,結構域抗體，納米抗體和unibodies，制備所述分子的方法，和包含所述分子與藥學載體的藥物組合物。本發(fā)明還涉及使用所述分子的方法，例如用來檢測鈣粘素-17，以及用來治療與鈣粘素-17的表達(例如鈣粘素-17在腫瘤上的表達)相關的疾病，所述腫瘤包括結腸直腸癌的那些腫瘤。為了使本發(fā)明更容易理解，首先定義了一些術語。其它的定義貫穿于詳細描述中而給出。術語“鈣粘素-17"，〃肝-腸鈣粘素〃，“Li-鈣粘素”，“腸肽相關轉運子HPT-I”* “CDH 17”可互換地使用。國際專利申請W02008/(^6008中，鈣粘素_17還被鑒定為OGTAOO1， 該申請通過引用方式全文并入本文。在一些情況下，該公開中的人類抗體可以與來自人類以外的其它物種的鈣粘素-17交叉反應。在一些實施方式中，抗體可以是完全特異于一種或多種人類鈣粘素-17的，并且可以不顯示出物種或其它類型的非人類交叉反應活性。示例性的人類鈣粘素-17的完整氨基酸序列具有Genbank登記號NM_004063。術語“免疫應答”是指例如淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞和由上述細胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細胞因子和補體)的作用，該作用引起對于入侵的病原體、感染了病原體的細胞或組織、癌性細胞或正常人類細胞或組織(在自身免疫或病理性炎癥的情況下)的選擇性損傷、對它們的破壞，以及從人體清除它們。“信號轉導途徑”是指在將信號從細胞的一個部分傳送至細胞的另一個部分中發(fā)揮作用的多種信號轉導分子之間的生物化學關系。如本文所使用的，用語“細胞表面受體” 包括例如能夠接收信號并將此信號跨越細胞的質膜傳送的分子和分子的復合物。本發(fā)明的 “細胞表面受體”的實例是鈣粘素-17受體。本文所稱的術語“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結合片段(即“抗原結合部分”)或單鏈。“抗體”是指可包含由二硫鍵互連的至少2個重鏈(H)和2個輕鏈(L)的糖蛋白，或其抗原結合部分。每個重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中簡寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)。 重鏈恒定區(qū)包含3個結構域CH1，Ch2和Ch3。每個輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文中簡寫為\ 或\)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含1個結構域C” Vh和/\區(qū)可以進一步細分為被稱作互補決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)，其散布在更為保守的被稱作框架區(qū)(FR)的區(qū)域內。每個Vh 和V\由3個⑶R和4個FR構成，按照下列順序從氨基末端至羧基末端排列FR1，⑶R1， FR2，⑶R2，F(xiàn)R3，⑶R3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結合域。抗體的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應子細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。
“抗體"的定義包括但不限于全長抗體、抗體片段、單鏈抗體、雙特異性抗體、迷你抗體(minibodies)、結構域抗體、合成的抗體(有時在本文中稱作“抗體模擬物”)，嵌合抗體、人源化抗體、抗體融合(有時稱作“抗體綴合物”)，以及每一種各自的片段。在一個實施方式中，抗體為抗體片段。特異性抗體片段包括但不限于(i)由VL， VH，CL和CHl結構域組成的Fab片段，(ii)由VH和CHl結構域組成的Fd片段，(iii)由單一抗體的VL和VH結構域組成的Fv片段，(iv)由單一的可變結構域組成的dAb片段，(ν) 分離的⑶R區(qū)域，(vi)F(ab' )2片段，其為包含兩個相連的Fab片段的二價片段，(vii) 單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結構域與VL結構域通過允許所述兩個結構域締合以形成抗原結合位點的肽連接子相連，(viii)雙特異性單鏈Fv 二聚體，和(ix)" diabodies" 或"triabodies"，其為通過基因融合構建的多價或多特異性片段?？贵w片段可以被修飾。 例如，所述分子可以通過摻入連接VH和VL結構域的二硫橋而被穩(wěn)定化?？贵w形式和架構的實例被描述于 Holliger & Hudson，2006，NatureBiotechnology 23(9) :11洸_1136，和 Carter 2006,Nature ReviewsImmunology 6 :343-357中，并且其中所引用的參考文獻均明確地通過引用而并入。在一個實施方式中，本文所公開的抗體可以是多特異性抗體，并且特別是雙特異性抗體(有時也稱作“diabodies”)。這些是結合兩種(或更多種)不同抗原的抗體?？赏ㄟ^本領域已知的多種方式制造diabodies，例如化學地制備或從雜交的雜交瘤制備。在一個實施方式中，所述抗體為迷你抗體。迷你抗體是最小化的抗體樣蛋白，其包含與CH3 結構域相連的scFv。在一些情況中，scFv可與Fc區(qū)相連并且可包括一些或全部鉸鏈區(qū)。 關于多特異性抗體的描述，參見 Holliger& Hudson，2006，Nature Biotechnology 23(9) 1U6-1136，并且其中所引用的參考文獻均明確地通過引用而并入。如本文中所使用的，“⑶R”是指抗體可變結構域的互補決定區(qū)。已由Kabat開發(fā)了對CDR中所包括的殘基的系統(tǒng)化鑒別(Kabat et al.，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes ofHealth，Bethesda)，這也備選地由 Chothia 開發(fā)了 (Chothia & Lesk，1987， J.Mol. Biol. 196 :901-917 ；Chothia et al. , 1989, Nature342 :877-883 ；Al-Lazikani et al.，1997，J. Mol. Biol. 273 :927-948)。為了本發(fā)明的目的，與 Chothia 所定義的 CDR 相比，本發(fā)明的CDR被定義為略微更小的殘基組。在本文中，VL CDR被定義為包括位置 27-32 (CDRl)，50-56 (CDR2)和 91-97 (CDR3)的殘基，其中編號是根據(jù) Chothia 的。因為 Chothia與Kabat定義的VL⑶R是相同的，這些VL⑶R位置的編號也是根據(jù)Kabat的。在本文中，VH CDR被定義為包括位置27-33 (CDRl)，52-56 (CDR2)和95-102 (CDR3)的殘基，其中編號是根據(jù)Chothia的。這些VH CDR位置對應于Kabat位置27-35 (CDRl)，52-56 (CDR2) 和 95-102(CDR3)。如本領域技術人員將認可的，本文中所公開的CDR可包括變體，例如當將本文中所公開的CDR回復突變?yōu)椴煌目蚣軈^(qū)時。通常，個體變體CDR與本文所述序列的氨基酸同一性為至少80 %，更典型地具有優(yōu)選至少85 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %， 97^,98^,99%和幾乎100%的漸增的同一性。類似地，關于本文中所鑒別的結合蛋白的核酸序列，“核酸序列同一性百分比(％)"被定義為候選序列中與抗原結合蛋白編碼序列中的核苷酸殘基同一的核苷酸殘基的百分比。一種具體的方法利用了設置為默認參數(shù)的WU-BLAST-2的BLASTN模塊，其中重疊跨越和重疊部分被分別設置為1和0. 125?！愕?，編碼個體變體CDR的核苷酸序列與本文中所示核苷酸序列的核酸序列同一性為至少80 %，更典型地具有優(yōu)選至少80 %，81 %，82 %，83 %，84 %，85 %，86 %，87 %， 88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98% 或 99%，和幾乎 100% 的漸增的同一性。因此，‘‘變體OTR"與本發(fā)明的親本⑶R具有特定的同源性、相似性或同一性并且共享生物學功能，其包括但不限于，親本⑶R的特異性和/或活性的至少80^,81^,82%, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%或 99%。雖然引入氨基酸序列變異的位點或區(qū)域是預先確定的，不需要預先確定突變本身。例如，為了優(yōu)化給定位點的突變的表現(xiàn)，可在靶密碼子或靶區(qū)域處進行隨機誘變并且就所需活性的最佳組合篩選所表達的抗原結合蛋白CDR變體。在具有已知序列的DNA中預先確定的位點處制造取代突變的技術是公知的，例如，M13引物誘變和PCR誘變。使用本文中描述的抗原結合蛋白活性測定來進行對突變體的篩選。氨基酸取代通常是單個堿基的；插入通常將為大約一個(1)至大約二十個00) 氨基酸殘基的數(shù)量級，雖然可能容忍顯著更大的插入。缺失的范圍為大約一(1)個至大約二十00)個氨基酸殘基，雖然在一些情況下，缺失可以大得多?？衫萌〈⑷笔А⒉迦牖蚱淙我饨M合來實現(xiàn)最終的衍生物或變體。通常，這些變化在幾個氨基酸上進行以使分子的改變最小化，特別是抗原結合蛋白的免疫原性和特異性。然而，在某些情況下可以容忍更大的變化。如本文中所用的，‘‘Fab〃或〃 Fab區(qū)域〃是指包含VH，CHl，VL和CL免疫球蛋白結構域的多肽。Fab可以指分離的此區(qū)域，或在全長抗體、抗體片段或Fab融合蛋白、或本文所列的任何其它抗體實施方式的情境中的此區(qū)域。如本文所用的，‘‘Fv"或〃 Fv片段〃或〃 Fv區(qū)域〃是指包含單個抗體的VL和 VH結構域的多肽。如本文所用的，“框架"是指除去被定義為CDR的那些區(qū)域之外的抗體可變結構域的區(qū)域。每個抗體可變結構域框架可被進一步細分為由CDR分隔的連續(xù)區(qū)域(FR1，F(xiàn)R2， FR3 和 FR4)。如本文中所使用的，術語抗體的“抗原結合部分”(或簡稱“抗體部分”)是指保持與抗原(例如鈣粘素-17)特異性結合的能力的抗體的一個或多個片段。已經(jīng)表明抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段執(zhí)行。術語抗體的“抗原結合部分”所涵蓋的結合片段的實例包括⑴Fab片段，其是由/νκ，Vh,Cl和ChI結構域組成的單價片段；(ii)F(ab‘ )2 片段，其為包含在鉸鏈區(qū)由二硫橋連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)Fab’片段，其實質上是具有部分鉸鏈區(qū)的 Fab (見，F(xiàn)UNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed. ,3. sup. rd ed. 1993)； (iv)由Vh和ChI結構域組成的Fd片段；(ν)由抗體的單一臂的\和Vh結構域組成的Fv片段；(vi) dAb 片段(Ward et al.，(1989)Nature 341 :544-546)，其由 Vh 結構域組成；(vii) 分離的互補決定區(qū)(CDR)；和(viii)納米抗體包含單一可變域和2個恒定域的重鏈可變區(qū)。此外，雖然Fv片段的兩個結構域八/Vk和Vh是由單獨的基因編碼的，但是可以使用重組方法通過合成的連接子將它們連接起來，所述連接子使其成為單一的蛋白鏈，其中八/Vk和Vh區(qū)配對以形成單價分子(已知為單鏈Fv(scFv)；見例如Bird et al. (1988) Science 242 :423-426 ；和 Huston et al. (1988) Proc. Natl. _Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此類單鏈抗體也意在被涵蓋于術語抗體的“抗原結合部分”中。這些抗體片段是使用本領域技術人員已知的常規(guī)技術獲得的，按照與完整抗體相同的方式就功用來篩選片段。如本文中所使用的，“分離的抗體”意指實質上不含具有不同的抗原特異性的其它抗體的抗體(例如，特異性結合鈣粘素-17的分離的抗體是實質上不含特異性結合除了鈣粘素-17之外的抗原的抗體)。然而，特異性結合鈣粘素-17的分離的抗體可以具有與其它抗原(例如來自其它物種的鈣粘素-17分子)的交叉反應活性。此外和/或任選地，分離的抗體可以實質上不合不是通常在自然界中發(fā)現(xiàn)的形式的其它細胞物質和/或化學物質。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體是重組蛋白質，分離的蛋白質或基本上純的蛋白質?！胺蛛x的”蛋白質至少伴隨一些其在天然狀態(tài)中所通常結合的物質，例如在給定樣品中構成總蛋白質的至少約5%，或至少約50%按重量。理解的是，取決于情況，分離的蛋白質可構成總蛋白質含量的5%至99. 9%按重量。例如，可通過使用可誘導的啟動子或高表達啟動子而以顯著更高的濃度制備蛋白質，從而使得蛋白質以增加的濃度水平被制備。在重組蛋白質的情形中，定義包括在不天然地產(chǎn)生抗體的、本領域已知的廣泛生物體和/或宿主細胞中產(chǎn)生所述抗體。如本文中所使用的，術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體成分”是指單一分子成分的抗體分子的制備物。單克隆抗體成分顯示出對于特定表位的單一的結合特異性和親和力。如本文中所使用的，“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如IgM 或 IgGl)。用語“識別抗原的抗體”和“特異于抗原的抗體”在本文中與術語“特異性結合抗原的抗體”可互換地使用。術語“抗體衍生物”是指抗體的任何經(jīng)修飾的形式，例如抗體與另一種試劑或抗體的綴合物。例如，本發(fā)明的抗體可與毒素、標記等綴合。本發(fā)明的抗體可以是非人的、嵌合的、人源化的或全人的。關于嵌合的和人源化抗體概念的描述，參見Clark et al，2000和其中所引用的參考文獻(Clark，2000，Immunol Today 21:397-402)。嵌合抗體包括非人抗體的可變區(qū)，例如小鼠或大鼠來源的VH和VL結構域，其與人抗體的恒定區(qū)可操作地連接(參見，例如美國專利號4，816，567)。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的抗體是人源化的。 如本文中所使用的，“人源化的"抗體是指包含人框架區(qū)(FR)和非人(通常是小鼠或大鼠)抗體的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)的抗體。提供CDR的非人抗體被稱為"供體"， 而提供框架的人免疫球蛋白被稱為"受體"。原則上，人源化依賴于將供體CDR移植到受體(人)VL和VH框架上(美國專利No號5，225，539)。這一策略被稱作"⑶R移植〃。 常常需要將選擇的受體框架殘基"回復突變"為相應的供體殘基以重新獲得在起初的移植構建體中喪失的親和力(US 5, 530, 101 ；US 5, 585, 089 ；US5, 693, 761 ；US 5, 693, 762 ； US 6, 180, 370 ；US 5, 859, 205 ；US5, 821, 337 ；US 6, 054, 297 ；US 6,407,213)。人源化抗體最佳地還將包含至少一部分免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白的)恒定區(qū)，并因此將通常包含人Fc區(qū)域。用于人源化非人抗體的方法是本領域公知的，并且可基本上根據(jù)Winter 和同事的方法進行(Jones et al, 1986, Nature 321 :522-525 ；Riechmann et al.，1988， Nature 332 :323-329 ；Verhoeyen et al,1988, Science, 239 1534-1536) 人源化鼠單克隆抗體的其它實例也是本領域已知的，例如結合下列的抗體人蛋白C(0' Connor et al，1998，Protein Eng 11 :321-8)，白介素 2 受體(Queen et al，1989，Proc Natl Acad Sci，USA 86 :10(^9-33)，和人表皮生長因子受體 2 (Carter et al, 1992, Proc Natl Acad SciUSA 89:4觀5-9)。在備選的實施方式中，本發(fā)明的抗體可以是全人的，即抗體的序列完全或基本上是人的。本領域已知許多用于生成全人抗體的方法，包括使用轉基因小鼠 (Bruggemann et al, 1997,Curr OpinBiotechnol 8 :455-458)或與選擇方法相結合的人抗體庫(Griffithset al, 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108)。術語“人源化抗體”意指這樣的抗體其中源自另一哺乳動物物種(例如小鼠)的種系的CDR序列被移植到人類框架序列上?？梢栽谌祟惪蚣苄蛄袃冗M行另外的框架區(qū)修飾。術語“嵌合抗體”意指這樣的抗體其中可變區(qū)序列源自一個物種而恒定區(qū)序列源自另一物種，例如這樣的抗體其中可變區(qū)序列源自小鼠抗體而恒定區(qū)序列源自人類抗體。術語“特異性結合”(或"免疫特異性結合")不是意欲指抗體唯一地結合其目的靶標。而是，如果抗體對與其目的靶標的親和力是其對于非靶分子的親和力的約5倍大的話，那么抗體"特異性結合"。合適地，沒有與不希望的物質(特別是健康的人或動物的天然存在的蛋白質或組織)的顯著交叉反應或交叉結合?？贵w對于靶分子的親和力將是其對于非靶分子的親和力的例如，至少約5倍，例如10倍、例如25倍、特別是50倍、以及特別是 100倍或更多。在一些實施方式中，抗體與其它結合試劑以及抗原的特異性結合是指至少 IO6M-1的結合親和力?？贵w可以，例如以下列親和力結合至少約lOl1，例如在約IO8M4至約ΚΑΤ1之間，約ΚΑΤ1至約ΙΟ1、-1，或約IOkT1至約10"ΜΛ抗體可以，例如以下列的EC50 結合50ηΜ或更少，IOnM或更少，InM或更少，IOOpM或更少，或更優(yōu)選地IOpM或更少。如本文中所使用的，術語“不實質性結合”蛋白質或細胞的意思是不與蛋白或細胞結合，或者不以高親和力與蛋白或細胞結合，即，以IxKTfiM或更高，更優(yōu)選lxl(^M或更高，更優(yōu)選1χ10_4Μ或更高，更優(yōu)選1Χ10_3Μ或更高，甚至更優(yōu)選1Χ10_2Μ或更高的Kd與蛋白或細胞結合。如本文中所使用的，術語“EC5Q”意指通過定量引起50%的最大應答/效應的濃度而得的化合物效力。EC5tl可通過Scratchard或FACS測定。如本文中所使用的，術語〃 Kass。?！盎?Ka”意指特定的抗體-抗原相互作用的結合速率，而如本文中所使用的，術語"Kdis“或“Kd，”意指特定的抗原-抗體相互作用的解離速率。如本文中所使用的，術語“K/意指解離常數(shù)，其由Kd%Ka之比(即Kd/Ka)獲得，并且被表示為摩爾濃度(M)?？梢允褂帽绢I域已確立的方法測定抗體的Kd值。用于測定抗體
Kd的優(yōu)選方法是使用表面等離子共振，優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)例如Biacore 系統(tǒng)。如本文中所使用的，術語對IgG抗體的“高親和力”是指對于靶抗原的Kd為1χ1(ΓΜ 或更低，更優(yōu)選切10、或更低，更優(yōu)選1χ10_8Μ或更低，更優(yōu)選&10_9Μ或更低，更優(yōu)選 1x101或更低的抗體。然而，“高親和力”結合對于其它的抗體同種型可變化。例如，對于 IgM同種型的“高親和力”結合是指具有10_6Μ或更低，更優(yōu)選1(ΓΜ或更低，更優(yōu)選10_8Μ或更低的Kd的抗體。術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上的與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由連續(xù)的氨基酸或者由通過蛋白的三級折疊而并置的非連續(xù)氨基酸形成。 由連續(xù)氨基酸形成的表位在暴露于變性溶劑后通常仍然會保留，而通過三級折疊形成的表位在經(jīng)變性溶劑處理后通常會喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8， 9，10，11，12，13，14或15個氨基酸。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文中描述的技術，例如χ射線結晶和二維核磁共振(見，例如Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996))。因此，本發(fā)明中還包括與本文描述的抗體(即ΡΤΑ001_Α1，ΡΤΑ001_A2, PTA001_ A 3，ΡΤΑ001_A4，PTA001_A5，PTA001_A6，PTA001_A7，ΡΤΑ001_A8，ΡΤΑ001_A9，ΡΤΑ001_A10， PTA001_A11，PTA001_A12，PTA001_A13 和 PTA001_A14)結合(即識別)相同的表位的抗體。 可以通過以統(tǒng)計學上顯著的方式與針對靶抗原的參考抗體的交叉競爭(即競爭性抑制其結合)的能力來鑒定結合相同表位的抗體。例如，如果抗體結合相同或結構相似的表位(例如重疊表位)，或空間上鄰近的表位(當結合時引起抗體之間的空間位阻)，則可以發(fā)生競爭性抑制?？梢允褂贸Ｒ?guī)測定法來確定競爭性抑制，其中待測免疫球蛋白抑制參考抗體與共同抗原的特異性結合。有多種類型的競爭性結合測定法是已知的，例如固相直接或間接放射免疫測定(RIA)，固相直接或間接酶免疫測定(EIA)，夾心式競爭測定(見 Stahli et al.，Methodsin Enzymology 9 :242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA (見 Kirkland et al.，J. Immunol. 137 :3614(1986))；固相直接標記測定，固相直接標記夾心式測定(見 Harlow and Lane, Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988))；使用 1-125 標記物的固相直接標記 RIA (見 Morel et al.，Mol. Immunol. 25(1) :7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA(Cheung etal. , Virology 176 :546(1990))和直接標記 RIA (Moldenhauer et al.，Scand. J. Immunol. 32 :77(1990))。 通常，此類測定法包括使用結合于固體表面的純化的抗原或攜帶這些的任一的細胞、未標記的測試免疫球蛋白和標記的參考免疫球蛋白。通過測定在存在測試免疫球蛋白的情況下與固體表面或細胞結合的標記物的量來測量競爭性抑制。通常測試免疫球蛋白過量存在。通常，當競爭性抗體過量存在時，其將以至少50% -55%,55% -60%,60% -65%, 65% -70%,70% -75%或更多來抑制參考抗體與共同抗原的特異性結合。其它技術包括例如，表位定位法，例如抗原抗體復合物的晶體的χ射線分析，其提供表位的原子分辨率。其它的方法監(jiān)控抗體與抗原片段或抗原的突變變體的結合，其中， 由于抗原序列內的氨基酸殘基的修飾而導致的結合的喪失通常被認為是表位組分的指征。 此外，還可以使用用于表位定位的計算組合方法。這些方法依賴于目的抗體從組合噬菌體展示肽文庫中親和分離特定短肽的能力。然后所述肽被認為是用于定義對應于用于篩選肽文庫的抗體的表位的引導(lead)。對于表位定位，還開發(fā)了計算算法，已經(jīng)表明其定位構象型不連續(xù)表位。如本文中所使用的，術語“受試者”包括任何人或非人動物。術語“非人動物”包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類、綿羊、狗、貓、馬、母牛、雞、 兩棲類、爬行類等。在以下部分中進一步詳細描述了本發(fā)明的各個方面?？光}粘素-17抗體
本發(fā)明的抗體的特征在于抗體的特定功能特征或特性。例如，抗體特異性結合人鈣粘素-17。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體以高親和力結合鈣粘素-17，例如以8x10_7M或更低，更通常為ΙχΙΟΛ 或更低的Kd結合。本發(fā)明的抗鈣粘素-17抗體優(yōu)選顯示出一個或多個下列特征以50ηΜ或更低，IOnM或更低，InM或更低，IOOpM或更低，或更優(yōu)選IOpM或更低的 EC50結合人鈣粘素-17 ；結合表達鈣粘素-17的人細胞。在一個實施方式中，抗體優(yōu)選結合存在于鈣粘素-17中的抗原性表位，所述表位不存在于其它蛋白中?？贵w通常結合鈣粘素-17但不結合其它蛋白，或者，以低親和力例如 IxlO-6M或更高，更優(yōu)選IxlO-5M或更高，更優(yōu)選IxlO-4M或更高，更優(yōu)選IxlO3M或更高，更優(yōu)選lxl(^M或更高的Kd與蛋白結合。優(yōu)選地，抗體不與相關蛋白結合，例如，抗體實質上不與其它細胞粘附分子結合。在一個實施方式中，抗體可以被內吞進入表達鈣粘素-17的細胞。用于評價抗體內吞的標準測定法是本領域已知的，包括例如HumZap內吞測定法。用于評價抗體與鈣粘素-17的結合能力的標準測定法是本領域已知的，包括例如，ELISA、蛋白質印跡、RIA和流式細胞術分析。在實施例中詳細描述了適宜的測定法?？贵w的結合動力學(例如結合親和力)也可以通過本領域已知的標準測定法來評估，例如通過 B i aCO Γe 系統(tǒng)分析。為了評估與Raj i或Daudi B細胞腫瘤細胞的結合，可以從公眾可獲得的來源例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得Raji (ATCOteposit No. CCL-86)或Daudi (ATCC Deposit No. CCL-213)細胞，并用于標準測定法(例如流式細胞術分析)中。本發(fā)明的單克隆抗體本發(fā)明的優(yōu)選抗體是單克隆抗體PTA001_A1，PTAOO 1_A2, PTAOO 1_A3, PTAOO 1_ A4, PTAOO 1_A5，PTAOO 1_A6，PTAOO 1_A7，PTAOO 1_A8，PTAOO 1_A9，PTAOO 1_A10，PTA001_A11， PTAOO 1_A12, PTA001_A13和PTA001_A14，如實施例1_6中所描述進行分離和結構表征。 PTAOO1_A1，PTAOO1_A2，PTAOO1_A3，PTAOO1_A4，PTAOO1_A5，PTAOO1_A6，PTAOO1_A7，PTAOO1_ A8，PTAOO 1_A9，PTAOO 1_A10，PTAOO 1_A11，PTAOO 1_A12，PTAOO 1_A13 和 PTAOO 1_A 14 的 Vh 氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO :35-46 中。PTA001_A1，PTA001_A2，PTA001_A3，PTA001_A4，PTA001_ A5, PTAOO 1_A6, PTAOO 1_A7, PTAOO 1_A8, PTAOO 1_A9, PTAOO 1_A10, PTA001_A11, PTAOO 1_A12， PTAOO 1_A 13 和 PTA001_A14 的 Vk 氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO :47-58 中。鑒于這些抗體中的每一個都能結合鈣粘素-17，可以“混合并匹配”所述Vh和Vk序列以產(chǎn)生本發(fā)明的其它抗鈣粘素-17結合分子?？梢允褂蒙衔暮蛯嵤├忻枋龅慕Y合測定法(例如ELISA)來測試此類“混合并匹配”的抗體與鈣粘素-17的結合。優(yōu)選地，當混合并匹配Vh和Vk鏈時，來自特定VH/VK對的Vh序列被替換為結構上相似的Vh序列。類似地， 優(yōu)選地，來自特定VH/VK對的Vk序列被替換為結構上相似的Vk序列。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了抗體，其包含含有選自SEQ ID NO :38，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45 和 46 所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有選自SEQ ID NO :49，47，48，50，51，52，53，54，55，56，57和58所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中所述抗體特異性結合素-17，優(yōu)選人鈣粘素-17。優(yōu)選的重鏈和輕鏈的組合包括包含SEQ ID NO 35的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 47的氨基酸序
包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 48的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 37的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 48的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 38的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 49的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 39的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 50的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 40的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 51的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 41的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 52的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 42的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 53的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 40的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 54的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 40的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 55的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 43的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 56的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 44的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 55的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 45的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 57的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或包含SEQ ID NO 46的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO 58的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供了包含PTA001_A1，PTAOO 1_A2, PTAOO 1_A3, PTAOO 1_A4, PTAOO1_A5, PTAOO1_A6, PTAOO1_A7, PTAOO1_A8, PTAOO1_A9, PTAOO1_A10, PTA001_A11， PTAOO 1_A12, PTAOO 1_A 13 和 PTA001_A14 的重鏈和輕鏈 CDRl，CDR2 和 CDR 3 或其組合的抗體。PTA001_A1， PTAOO1_A2, PTAOO1_A3, PTAOO1_A4, PTAOO1_A5, PTAOO1_A6, PTAOO1_A7, PTAOO1_A8, PTAOO1_A9, PTAOO1_A10, PTA001_A11，PTAOO1_A12, PTAOO1_A13 禾P PTAOO1_ A14 的 VhCDRI 的氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO :1_4 中。PTAOO 1_A1, PTAOO 1_A2, PTAOO 1_ A3, PTAOO1_A4， PTAOO1_A5， PTAOO1_A6， PTAOO1_A7， PTAOO1_A8， PTAOO1_A9， PTAOO1_A10， PTA001_A11, PTAOO 1_A12, PTAOO 1_A 13 和 PTAOO 1_A 14 的 VHCDR2 的氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO :5-13 中。PTA001_A1，PTAOO1_A2, PTAOO1_A3, PTAOO1_A4, PTAOO1_A5, PTAOO1_A6, PTAOO 1_A7，PTAOO 1_A8，PTAOO 1_A9，PTAOO 1_A10，PTA001_A11，PTAOO 1_A12，PTAOO 1_A 13 禾P PTAOO 1_A 14 的 VhCDR3 的氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO :14-21 中。PTAOO 1_A1，PTAOO 1_A2， PTAOO 1_A3，PTAOO 1_A4，PTAOO 1_A5，PTAOO 1_A6，PTAOO 1_A7，PTAOO 1_A8，PTAOO 1_A9，PTAOO 1_A10, PTA001_A11, PTAOO 1_A12, PTAOO 1_A 13 禾Π PTAOO 1_A 14 的 VkCDRI 的氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO :22-27 中。PTAOO1_A1，PTAOO1_A2，PTAOO1_A3，PTAOO1_A4，PTAOO1_A5，PTAOO1_ A6, PTAOO1_A7,PTAOO1_A8,PTAOO1_A9,PTAOO1_A 10，PTAOO1_A11,PTAOO1_A12,PTAOO1_A13 和 PTAOO 1_A 14 的 VKCDR2 的氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO :28-31 中。PTAOO 1_A1, PTAOO 1_ A2, PTAOO1_A3， PTAOO1_A4， PTAOO1_A5， PTAOO1_A6， PTAOO1_A7， PTAOO1_A8， PTAOO1_A9， PTAOO 1_A10, PTA001_A11, PTAOO 1_A12，PTAOO 1_A 13 和 PTAOO 1_A 14 的 VKCDR3 的氨基酸序列顯示于 SEQ IDNO :32-34 中。使用 Kabat 系統(tǒng)(Kabat, Ε. A.，et al. (1991) Sequencesof Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91—3242)標示 CDR 區(qū)。鑒于這些抗體中的每一個都能結合鈣粘素-17并且抗原結合特異性主要由⑶R1， ⑶R2和⑶R3區(qū)提供，所以可以“混合并匹配” VhCDRI,⑶R2和⑶R3序列和VkCDRI，⑶R2和 ⑶R 3序列(即，可以混合并匹配來自不同抗體的⑶R，雖然每一個抗體通常包含VhCDRI, ⑶R2和⑶R 3和VkCDRI,⑶R2和⑶R 3)以產(chǎn)生本發(fā)明的其它抗鈣粘素-17結合分子。因此，本發(fā)明特別包括重鏈和輕鏈的CDR的每種可能的組合?？梢允褂蒙衔暮蛯嵤├忻枋龅慕Y合測定法(例如ELiSA、Biacore 分析)來測試此類“混合并匹配”的抗體與鈣粘素-17的結合。優(yōu)選地，當混合并匹配VhCDR序列時， 來自特定％序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替換為結構上相似的CDR序列。類似地，當混合并匹配VfDR序列時，來自特定Vk序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列優(yōu)選被替換為結構上相似的CDR序列。對于本領域普通技術人員而言將為很顯然的是可以通過將一個或多個Vh和/或/VKCDR區(qū)序列替換為來自如本文中公開的單克隆抗體PTA001_A1， ΡΤΑ001_A2，ΡΤΑ001_A3，ΡΤΑ001_A4，ΡΤΑ001_A5，ΡΤΑ001_A6，ΡΤΑ001_A7，ΡΤΑ001_A8，ΡΤΑ001_ A9, ΡΤΑ001_A 10, ΡΤΑ001_A 11, ΡΤΑ001_A 12, ΡΤΑ001_A 13 和 PTA001_A14 的 CDR 序列的結構上相似的序列來產(chǎn)生新的Vh和Vk序列。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了包含下列的分離的單克隆抗體或其抗原結合部分包含選自SEQ ID NO :1_4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶Rl ；包含選自SEQ ID NO :5_13的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R2 ；包含選自SEQ ID NO :14-21的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3 ；包含選自SEQ ID NO :22-27的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDRl ；包含選自SEQ ID NO :28-31的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶R2 ；和包含選自SEQ ID NO :32-34的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶R3 ；并且所有可能的組合都是可能的，其中所述抗體特異性結合鈣粘素-17，優(yōu)選人鈣粘素-17。在優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 1的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 5的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 14的重鏈可變區(qū)CDR3 ；含有SEQ ID NO 22的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 28的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口含有SEQ ID NO 32的輕鏈可變區(qū)CDR3。
在另一個優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 2的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 6的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 15的重鏈可變區(qū)CDR3 ；含有SEQ ID NO 23的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 29的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和含有SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 3的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 7的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 16的重鏈可變區(qū)CDR3 ；含有SEQ ID NO 23的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 29的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和含有SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 4的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 8的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 17的重鏈可變區(qū)CDR3 ；含有SEQ ID NO 24的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 30的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和含有SEQ ID NO 34的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 3的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 7的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)CDR3 ；含有SEQ ID NO 25的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 31的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口含有SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 3的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 9的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)CDR3 ；含有SEQ ID NO 26的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 29的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和含有SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 3的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 7的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 16的重鏈可變區(qū)CDR3 ；
含有SEQ ID NO :25的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 31的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和含有SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 3的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 7的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 16的重鏈可變區(qū)CDR3 ；含有SEQ ID NO 25的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 29的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和含有SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 3的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 10的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 20的重鏈可變區(qū)CDR3 ；含有SEQ ID NO 27的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 29的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口含有SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 3的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 11的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)CDR3 ；含有SEQ ID NO 25的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 29的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和含有SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 3的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 12的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)CDR3 ；含有SEQ ID NO 25的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 31的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；禾口含有SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一個優(yōu)選的實施方式中，抗體包含含有SEQ ID NO 2的重鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 13的重鏈可變區(qū)CDR2 ；含有SEQ ID NO 15的重鏈可變區(qū)CDR3 ；含有SEQ ID NO 23的輕鏈可變區(qū)CDRl ；含有SEQ ID NO 29的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和含有SEQ ID NO 33的輕鏈可變區(qū)CDR3。本領域公知的是不依賴于⑶Rl和/或⑶R2域，⑶R3域能夠單獨地決定抗體對于關聯(lián)抗原(cognate antigen)的結合特異性，并且基于共同的⑶R3序列可預測性地產(chǎn)生具有相同結合特異性的多個抗體。見，例如Klimka et al. ,British J. of Cancer 83(2) 252-260 (2000)(其描述了僅使用鼠抗-⑶30抗體Ki_4的重鏈可變區(qū)⑶R3域來產(chǎn)生人源化抗-CD30 抗體)；Beiboer et al.，J. Mol. Biol. 296 :833-849 (2000)(其描述了僅使用親本鼠M0C-31抗-EGP-2抗體的重鏈CDR3序列的重組上皮糖蛋白_2 (EGP-2)抗體)；Rader et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 95 :8910-8915(1998)(其描述了使用鼠抗-整合素 α ν β 3抗體LM609的重鏈和輕鏈可變⑶R3域的一組人源化抗-整合素α ν β 3抗體，其中每個抗體成員在CDR3域之外包含不同的序列并且能夠與親本鼠抗體結合相同的表位，其親和力等于或高于親本鼠抗體)；Barbas et al.，J. Am. Chem. Soc. 116 :2161-2162 (1994)(其公開了 CDR3域提供了對與抗原結合的最顯著的貢獻)；Bartas et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :2529-2533(1995)(其描述了將針對人胎盤 DNA 的 3 個 Fab(SI_l，SI-40 和 SI-32)的重鏈⑶R3序列移植到抗-破傷風類毒素Fab的重鏈上，從而替換已有的重鏈 CDR3,并且證明7 CDR3域單獨地賦予結合特異性)；和Ditzel et al.，J. Immunol. 157 739-749 (1996)(其描述了移植研究，其中僅將親本多特異性Fab LNA3的重鏈⑶R3轉移至單特異性IgG破傷風類毒素-結合性Fab p313抗體的重鏈上就足以保留親本Fab的結合特異性)。這些參考文獻中的每一篇通過引用方式全文并入本文。因此，本發(fā)明提供了包含來自源于人或非人動物的抗體的一個或多個重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體能夠特異性地結合鈣粘素-17。在一些方面，本發(fā)明提供了包含來自非人類抗體(例如小鼠或大鼠抗體)的一個或多個重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體能夠特異性結合鈣粘素-17。在一些實施方式中，包含來自非人類抗體的一個或多個重鏈和/或輕鏈⑶R3域的此類本發(fā)明的抗體相對于對應的親本非人類抗體而言，(a)能夠與其競爭結合；(b)保留功能性特性；(c)結合至相同的表位；和/或(d)具有相似的結合親和力。在其它方面，本發(fā)明提供了包含來自人類抗體(例如獲自非人動物的人類抗體) 的一個或多個重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中所述人類抗體能夠特異性結合鈣粘素-17。在其它方面，本發(fā)明提供了包含來自第一人類抗體(例如獲自非人動物的人類抗體)的一個或多個重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中所述第一人類抗體能夠特異性結合鈣粘素-17并且其中來自所述第一人類抗體的CDR3域替換缺乏對于鈣粘素-17的結合特異性的人類抗體的CDR3域，以產(chǎn)生能夠特異性結合鈣粘素-17的第二人類抗體。在一些實施方式中，包含來自第一人類抗體的一個或多個重鏈和/或輕鏈CDR3域的此類本發(fā)明的抗體相對于對應的親本第一人類抗體而言，(a)能夠與其競爭結合；(b)保留功能性特性；(c)結合至相同的表位；和/或(d)具有相似的結合親和力。具有特定種系序列的抗體在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。例如，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了包含重鏈可變區(qū)的分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，所述重鏈可變區(qū)是鼠Vh7-39基因、鼠VhII區(qū)域VH 105基因或鼠VhII基因H17的產(chǎn)物或源自鼠Vh7-39基因、鼠VhII區(qū)域VH 105基因或鼠VhII基因H17，其中所述抗體特異性結合鈣粘素-17。在另一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了包含輕鏈可變區(qū)的分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，所述輕鏈可變區(qū)是鼠VkI-I 10基因、鼠VK8-30基因或鼠VJ4-140基因的產(chǎn)物或源自鼠VkI-IIO基因、鼠VK8_30基因或鼠VJ4-140基因，其中所述抗體特異性結合鈣粘素-17。在另一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結合部分， 其中所述抗體包含是鼠乂117-39基因的產(chǎn)物或源自鼠VH7_39基因(該基因包括如SEQ ID NO :125 所示的核苷酸序列)的重鏈可變區(qū)；包含是鼠VkI-IIO基因的產(chǎn)物或源自鼠VkI-IIO基因(該基因包括如SEQ ID NO 128和1 所示的核苷酸序列)的輕鏈可變區(qū)；并且特異性結合鈣粘素-17，優(yōu)選人鈣粘素-17。分別具有乂“^日和VkI-IIO的Vh和 Vk的抗體的實例為PTA001_A1。在另一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結合部分， 其中所述抗體包含是鼠VhII基因H17或鼠VhII區(qū)域VH 105基因的產(chǎn)物或源自鼠VhII基因H17 或鼠VhII區(qū)域VH 105基因(所述基因分別包括如SEQID NO 126和127所示的核苷酸序列)的重鏈可變區(qū)；包含是鼠VK8_30基因的產(chǎn)物或源自鼠VK8_30基因(該基因包括如SEQ ID NO: 130，131和132所示的核苷酸序列)的輕鏈可變區(qū)；并且特異性結合鈣粘素-17，優(yōu)選人鈣粘素-17。分別具有VhII基因H17或VhII區(qū)域VH 105的Vh和VK8_30的Vk的抗體的實例為 PTAOO1_A4。在另一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結合部分， 其中所述抗體包含是鼠VhII基因H17或鼠VhII區(qū)域VH 105基因的產(chǎn)物或源自鼠VhII基因H17 或鼠VhII區(qū)域VH 105基因(所述基因分別包括如SEQID NO 126和127所示的核苷酸序列)的重鏈可變區(qū)；包含是鼠VJ4-140基因的產(chǎn)物或源自鼠VJ4-140基因(該基因包括如SEQ ID NO 133,134和135所示的核苷酸序列)的輕鏈可變區(qū)；并且特異性結合鈣粘素-17，優(yōu)選人鈣粘素-17。分別具有VhII基因H17或VhII區(qū)域 VH 105 的 V!^PVk24-140 的抗體的實例為 PTAOO 1_A2，PTAOO 1_A3，PTAOO 1_A5，PTAOO 1_ A6, PTAOO 1_A7, PTAOO 1_A8, PTAOO 1_A9, PTAOO 1_A10, PTA001_A11, PTAOO 1_A12，PTAOO 1_A 13 禾口 PTAOO1_A14。如本文中所使用的，如果抗體的可變區(qū)獲自使用鼠種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)， 則人類抗體包含“是特定種系序列的產(chǎn)物”或“源自特定種系序列”的重鏈或輕鏈可變區(qū)。 此類系統(tǒng)包括使用目的抗原篩選展示于噬菌體上的鼠免疫球蛋白基因文庫?？梢酝ㄟ^將抗體的氨基酸序列與鼠種系免疫球蛋白的氨基酸序列進行比較并選擇在序列上與抗體的序列最接近(即具有最大的％同一性)的鼠種系免疫球蛋白序列來鑒定“是鼠種系免疫球蛋白序列的產(chǎn)物”或“源自鼠種系免疫球蛋白序列”的抗體。“是特定的鼠種系免疫球蛋白序列的產(chǎn)物”或“源自特定的鼠種系免疫球蛋白序列”的抗體可以包含相比于種系序列的氨基酸差異，所述差異是由于例如天然發(fā)生的體細胞突變或故意引入的定點突變。然而，所選擇的抗體在氨基酸序列上通常與鼠種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列至少90%同一，并且當與其它物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如人的種系序列)相比時，包含那些將抗體鑒定為是鼠的氨基酸殘基。在一些情況下，抗體在氨基酸序列上可以與種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列至少95 %或甚至至少96 %，97 %，98 %或99 %同一。通常，相對于鼠種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列，源于特定鼠種系序列的人類抗體將顯示出不超過10個氨基酸差異。在一些情況下，相對于種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列，抗體可以顯示出不超過5個或甚至不超過4、3、2或1個氨基酸差異。同源抗體在另一個實施方式中，本發(fā)明的抗體包含含有同源于本文描述的優(yōu)選抗體的氨基酸序列的氨基酸序列的重鏈和輕鏈可變區(qū)，并且其中所述抗體保留本發(fā)明的抗鈣粘素-17 抗體的所需功能特性。例如，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO :35_46的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列；所述輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO :47_58的氨基酸序列至少80%同一的氨基酸序列；并且所述抗體結合人鈣粘素-17。所述抗體可以以50nM或更少，IOnM或更少，InM或更少，IOOpM或更少，或更優(yōu)選地 IOpM或更少的EC5tl結合人鈣粘素-17。抗體還可以結合經(jīng)過人鈣粘素-17轉染的CHO細胞。在多個實施方式中，抗體可以是例如人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在其它實施方式中，Vh和/或Vk氨基酸序列可以與上文給出的序列85 %，90 %， 95 %，96 %，97 %，98 %或99 %同源。含有與上文給出的序列的Vh和Vk區(qū)具有高度同源性 (即80%或更高)WV1^P Vk區(qū)的抗體可以這樣獲得使編碼SEQ ID NO :59-83的核酸分子發(fā)生誘變(例如定點誘變或PCR介導的誘變)，然后使用本文描述的功能測定法就保留的功能測試所編碼的經(jīng)改變的抗體。兩個序列之間的百分比同一性取決于這兩個序列共有的相同位置的數(shù)目(即％ 同源性=相同位置的數(shù)目/總位置數(shù)目xlOO)，這考慮到了缺口數(shù)目和每個缺口的長度，缺口的引入是為了兩個序列的最優(yōu)比對?？梢允褂脭?shù)學算法(例如以下非限制性實施例中描述的)來實現(xiàn)序列的比較和確定兩個序列之間的百分比同一性?？梢允褂貌⑷氲紸LIGN程序(2. 0版)中的E. Meyers和W. Miller的算法(Comput. Appl. Biosci.，4 :11-17(1988))來確定兩個氨基酸序列之間的百分比同一性，其中使用 PAM120權重殘基表，缺口長度罰分為12，缺口罰分為4。此外，可以使用并入到GCG軟件包(可以從http//www. gcg. com獲得)中的GAP程序中的Needleman禾口 Wunsch的算法 (J. Mol. Biol. 48 :444-453(1970))來確定兩個氨基酸序列之間的百分比同一性，其中使用 Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，缺口權重為16，14，12，10，8，6或4，長度權重為1,2, 3,4, 5或6。
另外或備選地，本發(fā)明的蛋白序列還可以被用作“查詢序列”以針對公共的數(shù)據(jù)庫進行搜索，以便例如鑒定相關的序列?？梢允褂肁ltschul，et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 403-10的XBLAST程序(2. 0版)進行此類搜索?？梢允褂肵BLAST程序、得分=50、詞長= 3來進行BLAST蛋白搜索，以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的缺口化比對,可以使用如 Altschul etal. , (1997)Nucleic Acids Res. 25(17) 3389-3402中描述的GappedBLAST。當使用BLAST和Gapped BLAST程序時，可以使用各自程序(例如 XBLAST 和 NBLAST)的默認參數(shù)。見 http://www. ncbi. nlm. nih. gov。
具有保守性修飾的抗體
在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體包含含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些CDR序列中的一個或多個包含基于本文描述的優(yōu)選抗體(例如 PTA001_A1，PTAOO 1_A2, PTAOO 1_A3, PTAOO 1_A4, PTAOO 1_ A5, PTAOO 1_A6, PTAOO 1_A7, PTAOO 1_A8, PTAOO 1_A9, PTAOO 1_A10, PTA001_A11, PTAOO 1_A12， PTA001_A13或PTA001_A14)的指定氨基酸序列或其保守性修飾，并且其中所述抗體保留本發(fā)明的抗鈣粘素-17抗體的所需功能特性。因此，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，包含含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)和含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中
重鏈可變區(qū)⑶R3序列包含選自SEQ ID NO :14-21的氨基酸序列及其保守性修飾的氨基酸序列；
輕鏈可變區(qū)⑶R3序列包含選自SEQ ID NO :32-34的氨基酸序列及其保守性修飾的氨基酸序列；并且所述抗體結合人鈣粘素-17。
此類抗體可以50nM更少、IOnM或更少、InM或更少、IOOpM或更少或更優(yōu)選地IOpM或更少的EC5tl結合人鈣粘素-17。
抗體還可以結合經(jīng)過人鈣粘素-17轉染的CHO細胞。
在優(yōu)選的實施方式中，重鏈可變區(qū)⑶R2序列包含選自SEQ ID NO :5_13的氨基酸序列及其保守性修飾的氨基酸序列；并且輕鏈可變區(qū)⑶R2序列包含選自SEQ ID NO 28-31 的氨基酸序列及其保守性修飾的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方式中，重鏈可變區(qū) CDRl序列包含選自SEQ ID NO 1_4的氨基酸序列及其保守性修飾的氨基酸序列；并且輕鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQ ID NO :22-27的氨基酸序列及其保守性修飾的氨基酸序列。
在多個實施方式中，抗體可以是例如人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
如本文中所使用的，術語“保守性序列修飾”意指不顯著影響或改變含有氨基酸序列的抗體的結合特性的氨基酸修飾。此類保守性修飾包括氨基酸置換、添加和缺失?？梢酝ㄟ^本領域已知的標準技術(例如定點誘變和PCR介導的誘變)將修飾導入本發(fā)明的抗體中。保守性氨基酸置換是這樣的置換其中氨基酸殘基被替換為具有相似側鏈的氨基酸殘基。具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族已經(jīng)在本領域中被定義。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電極性側鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支側鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，本發(fā)明的抗體的CDR區(qū)內的一個或多個氨基酸殘基可以被替換為來自相同側鏈家族的其它氨基酸殘基，并且可以使用本文描述的功能測定法就保留的功能來檢測經(jīng)改變的抗體。
SEQ ID NO :1_4的重鏈⑶Rl序列可以包含一個或多個保守性序列修飾，例如1、 2、3、4、5或更多個氨基酸置換、添加或缺失；SEQID NO :22-27的輕鏈⑶Rl序列可以包含一個或多個保守性序列修飾，例如1、2、3、4、5或更多個氨基酸置換、添加或缺失；SEQ ID NO: 5-13中顯示的重鏈⑶R2序列可以包含一個或多個保守性序列修飾，例如1、2、3、4、5或更多個氨基酸置換、添加或缺失；SEQ ID NO :28-31中顯示的輕鏈⑶R2序列可以包含一個或多個保守性序列修飾，例如1、2、3、4、5或更多個氨基酸置換、添加或缺失；SEQ ID NO :14-21 中顯示的重鏈⑶R3序列可以包含一個或多個保守性序列修飾，例如1、2、3、4、5或更多個氨基酸置換、添加或缺失；和/或SEQ ID NO 32-34中顯示的輕鏈⑶R3序列可以包含一個或多個保守性序列修飾，例如1、2、3、4、5或更多個氨基酸置換、添加或缺失。
與本發(fā)明的抗-鈣粘素-17抗體結合相同表位的抗體
在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了與本發(fā)明的任意鈣粘素-17單克隆抗體結合人鈣粘素-17上的相同表位的抗體(即，具有與本發(fā)明的任意單克隆抗體交叉競爭結合鈣粘素-17的能力的抗體)。在優(yōu)選的實施方式中，用于交叉競爭研究的參考抗體可以是單克隆抗體PTA001_A1(其具有分別如SEQ ID NO :35和47所示的Vh和Vk序列)，單克隆抗體 PTAOO 1_A2 (其具有分別如SEQ ID NO 36和48所示的Vh和Vk序列)，單克隆抗體PTAOO 1_ A3 (其具有分別如SEQ ID N0:37和48所示的￥11和￥1 序列)，單克隆抗體？14001_々4(其具有分別如SEQ IDNO 38和49所示的Vh和Vk序列)，單克隆抗體PTA001_A5 (其具有分別如SEQ ID NO 39和50所示的Vh和Vk序列)，單克隆抗體PTAOO 1_A6 (其具有分別如SEQ ID N0:40和51所示的VH和VK序列)，單克隆抗體PTA001_A7(其具有分別如SEQ ID NO: 41和52所示的Vh和Vk序列)，單克隆抗體PTAOO 1_A8 (其具有分別如SEQ ID NO 42和53 所示的Vh和Vk序列)，單克隆抗體PTA001_A9 (其具有分別如SEQ ID NO 40和M所示的 Vh和Vk序列)，單克隆抗體PTAOO 1_A 10 (其具有分別如SEQ IDNO 40和55所示的Vh和Vk 序列)，單克隆抗體PTAOO 1_A11(其具有分別如SEQ ID NO 43和56所示的Vh和Vk序列)， 單克隆抗體PTAOO 1_A 12 (其具有分別如SEQ ID NO 44和55所示的Vh和Vk序列)，單克隆抗體PTAOO 1_A 13 (其具有分別如SEQ ID NO 45和57所示的Vh和Vk序列)或單克隆抗體 PTAOO 1_A 14 (其具有分別如SEQ ID NO 46和58所示的Vh和Vk序列)?？梢栽跇藴实拟}粘素-17 結合測定中基于它們與 PTA001_A1，PTAOO 1_A2, PTAOO 1_A3, PTAOO 1_A4, PTAOO 1_ A5, PTAOO 1_A6, PTAOO 1_A7, PTAOO 1_A8, PTAOO 1_A9, PTAOO 1_A10, PTA001_A11, PTAOO 1_A12， PTA001_A13或PTA001_A14交叉競爭的能力來鑒定此類交叉競爭性抗體。例如，可以使用 BIAcore分析、ELISA測定法或流式細胞術來證明與本發(fā)明的抗體的交叉競爭。測試抗體抑制例如 PTAOO 1_A1, PTAOO 1_A2, PTAOO 1_A3, PTAOO 1_A4, PTAOO 1_A5, PTAOO 1_A6, PTAOO 1_ A7, PTAOO 1_A8，PTAOO 1_A9，PTAOO 1_A10，PTA001_A11，PTAOO 1_A12，PTAOO 1_A 13 或 PTAOO 1_ A14與人鈣粘素-17結合的能力證明該測試抗體能夠競爭PTA001_A1，PTAOO 1_A2, PTAOO 1_ A3, PTAOO1_A4， PTAOO1_A5， PTAOO1_A6， PTAOO1_A7， PTAOO1_A8， PTAOO1_A9， PTAOO1_A10， PTA001_A11, PTAOO 1_A12, PTA001_A13 或 PTA001_A14 與人鈣粘素-17 的結合，因此與 PTAOO1_A1，PTAOO1_A2，PTAOO1_A3，PTAOO1_A4，PTAOO1_A5，PTAOO1_A6，PTAOO1_A7，PTAOO1_ A8, PTAOO 1_A9, PTAOO 1_A10, PTA001_A11, PTAOO 1_A12, PTA001_A13 或 PTA001_A14 結合人鈣粘素-17上的相同表位。
工程化和修飾的抗體
還可以使用具有本文公開的一個或多個Vh和/或\序列的抗體作為起始材料來工程化修飾的抗體，從而制備本發(fā)明的抗體，所述修飾的抗體與所述起始抗體相比可具有改變的特性。可以通過修飾一個或兩個可變區(qū)(即％和/或^內(例如一個或多個CDR 區(qū)內和/或一個或多個框架區(qū)內)的一個或多個氨基酸來工程化抗體。另外或備選地，可以通過修飾恒定區(qū)內的殘基來工程化抗體，例如，為了改變抗體的效應子功能。
在一些實施方式中，可以使用⑶R移植來工程化抗體的可變區(qū)。抗體主要通過位于6個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(CDR)內的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。為此，相對于CDR 外的序列而言，CDR內的氨基酸序列在各抗體之間更加多樣化。由于CDR序列負責多數(shù)抗體-抗原相互作用，所以可能通過構建表達載體來表達模擬特定的天然存在的抗體的特性的重組抗體，所述表達載體包含移植到來自具有不同性質的不同抗體的框架序列上的來自所述特定的天然存在的抗體的CDR序列(見，例如Riechmann，L. et al. (1998)Nature 332 323-327 Jones,P. et al. (1986)Nature 321:522-525 ；Queen,C. et al. (1989)Proc. Natl. Acad. See. U. S. A. 86 :10029-10033 ；Winter 的美國專利號 5，225，539 和 Queen 等人的美國專利號 5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，762 和 6，180，370)。
因此，本發(fā)明的另一個實施方式涉及分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含含有分別選自SEQ ID NO 1-4 ；SEQ ID NO 5-13 ；和SEQ ID NO 14-21的氨基酸序列的CDRl，CDR2和CDR 3序列；所述輕鏈可變區(qū)包含含有分別選自SEQ ID NO 22-27 ；SEQ ID NO :28-31 ；禾口 SEQ ID NO :32-34的氨基酸序列的⑶R1，⑶R2和⑶R3序列。因此，此類抗體包含單克隆抗體PTA001_A1，PTAOO 1_A2, PTAOO1_A3，PTAOO1_A4，PTAOO1_A5，PTAOO1_A6，PTAOO1_A7，PTAOO1_A8，PTAOO1_A9，PTAOO1_ AlO，PTA001_A11, PTAOO 1_A12，PTAOO 1_A 13 或 PTAOO 1_A 14 的 Vh 和 VkCDR 序列，但可以包含來自這些抗體的不同框架序列。
此類框架序列可以獲自包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或公開的文獻。例如，鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可在下列中找到IMGT(國際 ImMunoGeneTics)鼠種系序列數(shù)據(jù)庫(可在因特網(wǎng)上，于imgt. cines. fr/獲得)，以及 Kabat, Ε. A. , et al. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,U. S. Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo. 91-3242 ； 其中每一個的內容均明確地通過引用方式并入本文。作為另一個實例，鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可在Genbank數(shù)據(jù)庫中找到。
使用本領域技術人員熟知的被稱作Gapped BLAST (Altschul etal. (1997) Nucleic Acids Research 25 :3389-3402)的一種序列相似性搜索方法針對匯編的蛋白質序列數(shù)據(jù)庫來比較抗體蛋白序列。BLAST是啟發(fā)式的算法，因為抗體序列與數(shù)據(jù)庫序列之間的統(tǒng)計學上顯著的比對可能包含所比對單詞的高得分區(qū)段配對(high-scoringsegment pairs, HSP)0其得分不能通過延伸或截短被改善的區(qū)段配對被稱作命中。簡要地，數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列被翻譯，F(xiàn)Rl至FR3框架區(qū)之間并包括FRl和FR3的區(qū)域被保留。數(shù)據(jù)庫序列具有98個殘基的平均長度。去除那些在蛋白的整個長度上精確匹配的重復序列。 BLAST蛋白質搜索以默認的標準參數(shù)(除了被關閉的低復雜性過濾外)使用blastp程序以及BL0SUM62的置換矩陣，過濾產(chǎn)生序列匹配的5個最高命中。以所有6個框翻譯核苷酸序列，并且在數(shù)據(jù)庫序列的匹配區(qū)段中不含終止密碼子的框被認為是潛在的命中。繼而使用 BLAST程序tblastx (其以所有6個框翻譯抗體序列)進行確認，并將這些翻譯與以所有6 個框動態(tài)翻譯的數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進行比較。
同一性(identity)是抗體序列與蛋白質數(shù)據(jù)庫在序列全長上的精確的氨基酸匹配。正數(shù)(同一 +置換匹配)是不相同的，而是由BL0SUM62置換矩陣引導的氨基酸置換。 如果抗體序列以相同的同一性與數(shù)據(jù)庫序列中的兩個匹配，則具有最多正數(shù)的命中將被確定為匹配序列命中。
用于本發(fā)明的抗體中的優(yōu)選的框架序列是與本發(fā)明所選擇的抗體所使用的框架序列在結構上相似的那些，例如，與本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體所使用的Vh7-39框架序列， VhII基因H17框架序列，VhII區(qū)域VH 105框架序列，VkI-IIO框架序列，VK8_30框架序列和 /或VJ4-140框架序列相似?？梢詫fDRl，⑶R2和⑶R 3序列和VfDRl，⑶R2和⑶R3序列移植到與框架序列所源自的種系免疫球蛋白基因中所發(fā)現(xiàn)的那些序列具有相同序列的框架區(qū)上；或者，可以將CDR序列移植到相比于種系序列包含一個或多個突變的框架區(qū)上。 例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在一些情況下，使框架區(qū)內的殘基突變有益于維持或增強抗體的抗原結合能力(見例如 Queen 等人的美國專利號 5，530，101 ；5, 585，089 ；5, 693，762 和 6，180，370)。
另一種類型的可變區(qū)修飾是使Vh和/或VKCDR1，CDR2和/或CDR3區(qū)內的氨基酸殘基突變，從而改善目的抗體的一種或多種結合特性(例如親和力)?？梢赃M行定點誘變或PCR介導的誘變以導入突變，并且可以在如本文描述和實施例中提供的體外或體內測定法中評價對于抗體結合或其它感興趣的功能特性的影響。在一些實施方式中，導入保守性修飾(如上文所討論)。備選地，可進行非保守性修飾。突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但優(yōu)選為置換。此外，通常改變⑶R區(qū)內的不多于1個、2個、3個、4個或5個殘基，雖然如本領域技術人員將理解的，在其它區(qū)域(例如框架區(qū))中的變異可更大。
因此，在另一個實施方式中，本公開提供了分離的抗-鈣粘素-17單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區(qū)，所述抗體或其抗原結合部分包含(a)VhCDRI區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :1-4的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1_4相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VfDR2區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :5_13的氨基酸序列或與SEQ ID NO :5-13相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列； (c)VHCDR3區(qū)，其包含選自SEQ ID NO 14-21的氨基酸序列或與SEQ ID NO :14-21相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(d) VkCDRI區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :22-27的氨基酸序列或與SEQ ID NO :22-27相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VKOTR2區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :28-31的氨基酸序列或與SEQ IDNO :28-31具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VKCDR3區(qū)， 其包含選自SEQ ID NO :32-34的氨基酸序列或與SEQ ID NO :32-34相比具有1、2、3、4或5 個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。
本發(fā)明的工程化抗體包括這樣的抗體其中對Vh和/或Vk內的框架殘基進行了修飾，例如以便改善抗體的特性。通常，進行此類框架修飾以降低抗體的免疫原性。例如，一種方式是使一個或多個框架殘基“回復突變”至對應的種系序列。更特別地，經(jīng)歷了體細胞突變的抗體可以包含不同于抗體所衍生自的種系序列的框架殘基?？梢酝ㄟ^將抗體框架序列與抗體所衍生自的種系序列進行比較來鑒定此類殘基。
另一種類型的框架修飾包括使框架區(qū)內、甚至是一個或多個⑶R區(qū)內的一個或多個殘基突變，以去除T細胞表位，從而降低抗體潛在的免疫原性。該方法也被稱作“去免疫”，在Carr等人的美國專利公開號2003/0153043中有更詳細的描述。
除了框架或CDR區(qū)內的修飾之外或作為其備選，可以對本發(fā)明的抗體進行工程化以使其包括Fc區(qū)內的修飾，通常是為了改變抗體的一種或多種功能特性，例如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞性細胞毒性。此外，可以對本發(fā)明的抗體進行化學修飾(例如，可以向抗體連接一個或多個化學部分)或進行修飾以改變其糖基化， 這也是為了改變抗體的一種或多種功能特性。這些實施方式中的每一個在下文有更詳細的描述。Fc區(qū)內的殘基的編號是Kabat的EU索引中的編號。
在一個實施方式中，修飾CHl的鉸鏈區(qū)，從而改變(例如增大或減少)鉸鏈區(qū)內的半胱氨酸殘基數(shù)目。這種方法在Bodmer等人的美國專利號5，677，425中有更詳細的描述。 CHl的鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基數(shù)目被改變是為了例如促進輕鏈和重鏈的組合，或為了增加或降低抗體的穩(wěn)定性。
在另一個實施方式中，使抗體的Fc鉸鏈區(qū)突變以減小抗體的生物學半衰期。更具體地，將一個或多個氨基酸突變導入Fc鉸鏈片段的CH2-CH3結構域界面區(qū)域，從而抗體相對于天然Fc鉸鏈結構域葡萄球菌蛋白A(SpA)結合，具有受損的SpA結合。該方法在Ward 等人的美國專利號6，165，745中有更詳細的描述。
在另一個實施方式中，修飾抗體以增加其生物學半衰期。有多種方法是可能的。例如，可以導入一種或多種下列突變T252L，T254S, T256F，如Ward的美國專利號6，277，375 中所描述的。備選地，為了增加生物學半衰期，可以在CHl或Q區(qū)內改變抗體以使其包含獲自IgG的Fc區(qū)的CH2結構域的2個環(huán)的清道夫受體結合表位，如I^resta等人的美國專利號5，869，046和6，121，022中所描述的。
在另一個實施方式中，按照W02007/059782中的描述以UniBody的形式產(chǎn)生抗體， 該文獻通過引用方式全文并入本文。
在其它實施方式中，通過將至少一個氨基酸殘基替換為不同的氨基酸殘基來改變 Fc區(qū)，以改變抗體的效應子功能。例如，選自氨基酸殘基234，235，236，237，四7，318，320 和322的一個或多個氨基酸可以被替換為不同的氨基酸殘基，從而抗體對于效應子配體具有改變的親和力，但保持親本抗體的抗原結合能力。針對其的親和力被改變的效應子配體可以是例如Fc受體或補體的Cl組分。該方法在Winter等人的美國專利號5，624，821和 5，648，260中有更詳細的描述。
在另一個實例中，可以將選自氨基酸殘基329，331和322的一個或多個氨基酸替換為不同的氨基酸殘基，從而抗體具有改變的Clq結合和/或減少的或消除的補體依賴性細胞毒性(⑶C)。該方法在Idusogie等人的美國專利號6，194，551中有更詳細的描述。
在另一個實例中，改變氨基酸位置231和239中的一個或多個氨基酸殘基，從而改變抗體固定補體的能力。該方法在Bodmer等人的PCT公開WO 94/29351中有更詳細的描述。
在另一個實例中，通過修飾下列位置上的一個或多個氨基酸來修飾Fc區(qū)以增加抗體的介導抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗體對于Fc γ受體的親和力238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278， 280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315， 320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382， 388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438 或 439。該方法在 Presta 的 PCT 公開 WO 00/42072中有更詳細的描述。此外，已經(jīng)定位了人IgGl上的對于Fc γ Rl，F(xiàn)c γ RII， Fc YRIII和Fcfoi的結合位點，并且已經(jīng)描述了具有改善的結合的變體(見aiields，R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 :6591-6604)。顯示了在位置 256，290，298，333，334 和 339 上的特定突變會改善與Fc γ RIII的結合。另外，顯示了以下組合突變會改善Fc γ RIII結合 T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A。其它的 ADCC 變體被描述于，例如 W02006/019447 中。
在另一個實例中，可修飾Fc區(qū)域以增加抗體的半衰期，通常是通過增加與Fcfoi受體的結合，如，在例如 PCT/US2008/088053, US7, 371，826，US 7，670，600 和 WO 97/34631 中所描述的。
在另一個實施方式中，修飾抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化的抗體(即抗體缺少糖基化)?？梢愿淖兲腔?，以便例如增加抗體對于抗原的親和力?？梢酝ㄟ^例如改變抗體序列內的一個或多個糖基化位點來完成此類碳水化合物修飾。例如，可以進行一個或多個氨基酸置換，其導致消除一個或多個可變區(qū)框架糖基化位點，從而消除該位點處的糖基化。此類無糖基化可以增加抗體對于抗原的親和力。該方法在Co等人的美國專利號 5，714，350和6，350，861中有更詳細的描述，并且可通過去除位置297處的天冬酰胺實現(xiàn)。
另外或備選地，可以制備具有改變的糖基化類型的抗體，例如具有減少的數(shù)量的巖藻糖殘基的低巖藻糖化抗體或具有增加的等分GlcNac結構的抗體。這在本領域內有時被稱作“工程化糖型”。已經(jīng)證明此類改變的糖基化模式會增加抗體的ADCC能力。通?？梢酝ㄟ^兩種方式來實現(xiàn)此類碳水化合物修飾，例如在一些實施方式中，在具有改變的糖基化裝置(machinery)的宿主細胞中表達抗體。本領域中已經(jīng)描述了具有改變的糖基化裝置的細胞，并且可被用作宿主細胞而在其中表達本發(fā)明的重組抗體，從而產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體。參考P0TELLIGENT 技術。例如，細胞系Ms704，Ms705和Ms709缺少巖藻糖轉移酶基因FUT8(a (1,6)巖藻糖轉移酶)，從而在Ms704，Ms705和Ms709細胞系中表達的抗體在其碳水化合物上缺少巖藻糖。通過使用2個替換載體(見Yamane等人的美國專利公開號 2004/0110704 和 Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22) 靶向破壞CH0/DG44細胞中的FUT8基因而創(chuàng)建Ms704，Ms705和Ms709FUT8-/_細胞系。作為另一個實例，Hanai等人的EP 1，176，195描述了具有功能受損的FUT8基因(其編碼巖藻糖轉移酶)的細胞系，從而在此細胞系中表達的抗體顯示出低巖藻糖化(通過減少或消除al，6鍵-相關的酶)。Hanai等人還描述了具有低的或不具有將巖藻糖添加至結合抗體的Fc區(qū)的N-乙酰葡萄糖胺的酶活性的細胞系，例如大鼠骨髓瘤細胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。I^resta的PCT公開WO 03/035835描述了變體CHO細胞系Lecl3細胞，其具有減小的將巖藻糖附加至Asn (四7)-連接的碳水化合物的能力，也導致在該宿主細胞中表達的抗體的低巖藻糖化(同樣見 Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277 :26733-26740)。 Umana等人的PCT公開WO 99/54342描述了被工程化為表達糖蛋白修飾性糖基轉移酶(例如beta(l，4)-N-乙酰葡糖胺基轉移酶ΙΙΙ(&ιΤΠΙ))的細胞系，從而在所述經(jīng)工程化的細胞系中表達的抗體顯示出增加的等分GlcNac結構，這產(chǎn)生抗體的增加的ADCC活性(同樣見Umana et al. (1999)Nat. Biotech. 17 :176-180)。備選地，可以使用巖藻糖苷酶切除抗體的巖藻糖殘基。例如，巖藻糖苷酶α -L-巖藻糖苷酶從抗體中去除巖藻糖殘基(Tarentino， A. L. et al. (1975)Biochem. 14 :5516-23)。
備選地，可使用糖基化通路酶的小分子抑制劑來實現(xiàn)工程化糖型(特別是無巖藻糖基化)。參見例如 Rothman et al. ,Mol. Immunol. 26(12) :113-1123(1989) ；Elbein, FASEB J. 5 :3055(1991) ；PCT/US2009/042610 和美國專利號 7，700，321。
本發(fā)明涉及的本文中的抗體的另一種修飾是聚乙二醇化?？梢詫⒖贵w進行聚乙二醇化，以便例如增加該抗體的生物學(例如血清)半衰期。為了使抗體聚乙二醇化，通常使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(例如PEG的有反應活性酯或醛衍生物)在使一個或多個PEG基團附加至所述抗體或抗體片段的條件下反應。優(yōu)選地，通過與有反應活性的PEG 分子(或類似的有反應活性的水溶性聚合物)發(fā)生?；磻蛲榛磻獊磉M行聚乙二醇化。如本文中所使用的，術語“聚乙二醇”意在涵蓋任意形式的已經(jīng)被用于衍生其它蛋白的 PEG，例如單(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在一些實施方式中，將被聚乙二醇化的抗體是無糖基化的抗體。用于將蛋白聚乙二醇化的方法是本領域已知的，并且可被應用于本發(fā)明的抗體。見，例如，Nishimura等人的EP O 154 316和 Ishikawa 等人的 EP O 401 384。
在其它的實施方式中，例如，當將本發(fā)明的抗體用于診斷或檢測目的時，抗體可包含標記物。本文中“經(jīng)標記的”是指化合物附著了至少一種元件、同位素或化學化合物，以使得能夠檢測所述化合物。一般而言，標記物屬于下述三類a)同位素標記物，其可以是放射性的或重同位素；b)磁性的、電的、熱的；和c)有色的或發(fā)光的染料；盡管標記物也包括酶和粒子(例如磁性粒子)。優(yōu)選的標記物包括但不限于熒光鑭系元素復合物(包括銪和鋱的那些)，并且熒光標記包括但不限于量子點、熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、曙紅、赤蘚紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、Malacite綠、二苯乙烯、熒光黃、Cascade藍、德克薩斯紅、 Alexa 染料、Cy 染料和 Richard P. Haugland 的 Molecular Probes Handbook (第六版)中所描述的其它物質，所述文獻通過引用而在此明確地并入。
抗體的物理性質
可以通過抗鈣粘素-17抗體的各種物理性質進一步表征本發(fā)明的抗體?？梢允褂枚喾N測定法基于這些物理性質來檢測和/或區(qū)分不同類別的抗體。
在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體可以在輕鏈或重鏈可變區(qū)中包含一個或多個糖基化位點。一個或多個糖基化位點在可變區(qū)中的存在可以導致由于改變的抗原結合而產(chǎn)生的增加的抗體免疫原性或抗體PK的改變(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41: 673-702 ；Gala FA and Morrison SL(2004)J Immunol 172 :5489-94 ；Wallicket al(1988)J Exp Med 168 :1099-109 ；Spiro RG (2002)Glycobiology 12 :43R-56R ；Parekh et al (1985) Nature 316 :452-7 ；Mimura et al. (2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化發(fā)生在含有N-X-S/T序列的基序上?？梢允褂肎lycoblot測定法來測試可變區(qū)的糖基化，該測定法切割抗體以產(chǎn)生Fab，然后使用測量高碘酸鹽氧化和khiff堿形成的測定法檢測糖基化。備選地，可以使用Dionex光色譜法(Dionex-LC)來檢測可變區(qū)糖基化，其從Fab上將糖切割為單糖，并分析單一糖的含量。在一些情況下，優(yōu)選制備不含可變區(qū)糖基化的抗-鈣粘素-17抗體。這可以如下實現(xiàn)通過選擇在可變區(qū)內不含糖基化基序的抗體，或者使用本領域熟知的標準技術使糖基化基序內的殘基突變。
在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的抗體不含天冬酰胺異構位點。在N-G或D-G序列可能分別發(fā)生脫酰胺或異天冬氨酸效應。脫酰胺或異天冬氨酸效應導致產(chǎn)生異天冬氨酸， 其通過形成脫離側鏈羧基末端(而非主鏈)的紐結的結構而降低抗體的穩(wěn)定性。可以使用等量(iso-quant)測定法來測量異天冬氨酸的產(chǎn)生，其使用反相HPLC來檢測異天冬氨酸。
每一種抗體都具有獨特的等電點(pi)，但是一般地，抗體將落在6至9.5的pH 范圍內。IgGl抗體的pi通常落在7至9.5的pH范圍內。IgG4抗體的pi通常落在6至 8的pH范圍內。抗體可具有該范圍之外的pi。雖然效應一般是未知的，但是存在以下推測具有處于正常范圍之外的Pl的抗體在體內條件下可能具有某些解折疊和不穩(wěn)定性。 可以使用毛細等電聚焦測定法來測試等電點，其產(chǎn)生PH梯度并且可以使用激光聚焦用于增加的精確性(Janini et al (2002)Electrophoresis 23 :1605-11 ；Ma et al. (2001) Chromatographia53 :S75_89 ；Hunt et al(1998)J Chromatogr A 800 :355-67)。在一些情況下，優(yōu)選的是含有落在正常范圍內的Pl值的抗鈣粘素-17抗體。這可以如下實現(xiàn)通過選擇具有在正常范圍內的Pl的抗體，或通過使用本領域熟知的標準技術使帶電的表面殘基突變。
每種抗體都將具有指示熱穩(wěn)定性的熔化溫度(Krishnamurthy Rand Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。較高的熱穩(wěn)定性表示更大的總體上體內抗體穩(wěn)定性?？梢允褂眉夹g(例如差別掃描量熱法(Chen et al (2003)Pharm Res 20: 1952-60 ；Ghirlandoet al (1999) Immunol Lett 68 :47-52))來測量抗體的熔點。Tmi 表示抗體的最初解折疊的溫度。Tm2表示抗體的完全解折疊的溫度。一般地，優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體的Tmi大于60°C，優(yōu)選大于65°C，更優(yōu)選大于70°C。備選地，可以使用圓二色譜法測量抗體的熱穩(wěn)定性(Murray etal. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)。
在優(yōu)選的實施方式中，選擇不迅速降解的抗體?？梢允褂萌绫绢I域熟知的毛細管電泳(CE)和 MALDI-MS (Alexander AJ 禾口 Hughes DE (1995) Anal Chem 67 :3626-32)來測量抗鈣粘素-17抗體的片段化。
在另一個優(yōu)選實施方式中，選擇具有最小的聚集效應的抗體。聚集可以導致引發(fā)不想要的免疫應答和/或改變的或不利的藥代動力學性質。一般地，具有25%或更低，優(yōu)選 20%或更低，更優(yōu)選15%或更低，更優(yōu)選10%或更低，更優(yōu)選5%或更低的聚集的抗體是可以接受的。可以通過數(shù)種本領域熟知的技術(包括尺寸排阻柱(SEC)高效液相色譜(HPLC) 和光散射)來測量聚集，以鑒定單體、二聚體、三聚體或多聚體。
工程化抗體的方法
如上文所討論的，可以通過修飾Vh和/或Vk序列或與其相連的恒定區(qū)，使用具有本文公開的V1^n Vk序列的抗鈣粘素-17抗體來產(chǎn)生新的抗鈣粘素-17抗體。因此，在本發(fā)明的另一個方面，利用本發(fā)明的抗鈣粘素-17抗體(例如PTA001_A1，PTAOO 1_A2, PTAOO 1_ A3, PTAOO1_A4， PTAOO1_A5， PTAOO1_A6， PTAOO1_A7， PTAOO1_A8， PTAOO1_A9， PTAOO1_A10， PTA001_A11, PTAOO 1_A12, PTA001_A13或PTA001_A14)的結構特征來產(chǎn)生結構上相關的保持本發(fā)明的抗體的至少一種功能特性(例如結合人鈣粘素-17)的抗鈣粘素-17抗體。例如，可以將 PTA001_A1，PTAOO 1_A2，PTAOO 1_A3, PTAOO 1_A4, PTAOO 1_A5, PTAOO 1_A6, PTAOO 1_A7, PTAOO 1_A8，PTAOO 1_A9，PTAOO 1_A10，PTA001_A11，PTAOO 1_A12，PTAOO 1_A 13 或 PTAOO 1_ A14或其突變的一個或多個CDR區(qū)與已知的框架區(qū)和/或其它CDR重組地組合，以產(chǎn)生另外的、重組工程化的、如上文討論的本發(fā)明的抗鈣粘素-17抗體。其它類型的修飾包括之前的部分中所描述的那些。用于工程化方法的起始材料是本文提供的一個或多個Vh和/或Vk 序列，或其一個或多個CDR區(qū)。為了產(chǎn)生工程化抗體，無需實際上制備出(即表達為蛋白) 具有本文提供的一個或多個Vh和/或Vk序列或其一個或多個CDR區(qū)的抗體。相反，使用序列內包含的信息作為起始材料來產(chǎn)生衍生自原始序列的“第二代”序列，然后制備該“第二代”序列并表達為蛋白。
因此，在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于制備抗鈣粘素-17抗體的方法，包括
提供⑴包含選自SEQ ID NO :1_4的CDRl序列、選自SEQ ID NO :5_13的CDR2 序列和/或選自SEQ ID NO 14-21的⑶R3序列的重鏈可變區(qū)抗體序列；和/或(ii)包含選自SEQ ID NO 22-27的CDRl序列、選自SEQ ID NO 28-31的CDR2序列和/或選自SEQ ID NO 32-34的⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)抗體序列；
改變所述重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內的至少一個氨基酸殘基以產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；和
將所述改變的抗體的序列表達為蛋白。
可以使用標準的分子生物學技術來制備并表達所述改變的抗體序列。
優(yōu)選地，由改變的抗體序列編碼的抗體是這樣的抗體其保留本文描述的抗鈣粘素-17抗體的一種、一些或全部功能特性，所述功能特性包括但不限于以IxlO-7M或更低的 Kd結合人鈣粘素-17 ；結合經(jīng)鈣粘素-17轉染的人CHO細胞。
可以使用本領域可獲得的和/或本文描述的標準測定法(例如實施例中給出的那些(例如流式細胞術，結合測定法))來評估經(jīng)改變的抗體的功能特性。
在本發(fā)明的工程化抗體的方法的一些實施方式中，可以在抗鈣粘素-17抗體編碼序列的全長或部分上隨機或選擇性地導入突變，并且可以就結合活性和/或如本文描述的其它功能特性篩選所產(chǎn)生的經(jīng)修飾的抗鈣粘素-17抗體。本領域中已經(jīng)描述了突變方法。 例如，Short的PCT公開WO 02/092780描述了使用飽和誘變、合成連接組裝或其組合來產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。備選地，Lazar等人的PCT公開W003/074679描述了使用計算篩選法來優(yōu)化抗體的生理化學特性的方法。
編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子
本發(fā)明的另一個方面涉及編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。核酸可以存在于完整細胞、細胞裂解物中或以部分純化的或實質上純的形式存在。當使用標準技術(包括堿/SDS 處理、CsCl顯帶(banding)、柱色譜、瓊脂糖凝膠電泳和本領域熟知的其它技術)從其它細胞成分或其它污染物(例如其它細胞核酸或蛋白)中純化出來時，核酸是“分離的”或“使得實Μ 屯的”。JiLF· Ausubel，et al. ,ed. (1987) CurrentProtocoIs in Molecular Biology, Greene Publishing and ffileylnterscience, New York。本發(fā)明的核酸可以是例如 DNA 或 RNA，并且可以包含或不合內含子序列。在優(yōu)選的實施方式中，核酸是cDNA分子。
可以使用標準的分子生物學技術獲得本發(fā)明的核酸。對于由雜交瘤表達的抗體， 可以通過標準的PCR擴增或cDNA克隆技術獲得編碼由雜交瘤制備的抗體的輕鏈和重鏈的CDNA0對于獲自人免疫球蛋白基因文庫的抗體(例如使用噬菌體展示技術)，可以從該文庫回收編碼抗體的核酸。
本發(fā)明的優(yōu)選的核酸分子是編碼PTA001_A1，PTAOO 1_A2, PTAOO 1_A3, PTAOO 1_ A4, PTAOO 1_A5，PTAOO 1_A6，PTAOO 1_A7，PTAOO 1_A8，PTAOO 1_A9，PTAOO 1_A10，PTA001_A11， PTAOO 1_A12, PTA001_A13或PTA001_A14單克隆抗體的V1^P Vk序列的核酸分子。編碼 PTAOO1_A1，PTAOO1_A2，PTAOO1_A3，PTAOO1_A4，PTAOO1_A5，PTAOO1_A6，PTAOO1_A7，PTAOO1_ A8，PTAOO 1_A9，PTAOO 1_A10，PTAOO 1_A11，PTAOO 1_A12，PTAOO 1_A13 和 PTAOO 1_A 14 的 Vh 序列的 DNA序列顯示在 SEQ ID NO :59-70 中。編碼 PTAOO 1_A1，PTAOO 1_A2，PTAOO 1_A3，PTAOO 1_ A4, PTAOO 1_A5，PTAOO 1_A6，PTAOO 1_A7，PTAOO 1_A8，PTAOO 1_A9，PTAOO 1_A10，PTA001_A11， PTA001_A12，PTA001_A13 和 PTA001_A14 的 Vk 序列的 DNA 序列顯示在 SEQ ID NO :71-83 中。
本發(fā)明的其它優(yōu)選核酸是與SEQ ID NO :59_83所示的序列之一具有至少80%序列同一性，例如至少85%，至少90%，至少95%，至少98%，或至少99%序列同一性的核酸， 所述核酸編碼本發(fā)明的抗體，或其抗原結合部分。
兩個核酸序列之間的百分比同一性是序列中核苷酸相同的位置的數(shù)目，考慮到了缺口數(shù)目和每個缺口的長度，缺口的引入是為了兩個序列的最優(yōu)比對的需要。可以使用數(shù)學算法(例如上文描述的Meyers和Miller的算法或Altschul的XBLAST程序)來實現(xiàn)序列的比較和確定兩個序列之間的百分比同一性。
另外，本發(fā)明的優(yōu)選核酸包含SEQ ID NO :59_83所示的核酸序列的一個或多個 CDR編碼部分。在該實施方式中，核酸可以編碼PTAOO 1_A1，PTAOO 1_A2，PTAOO 1_A3，PTAOO 1_ A4, PTAOO 1_A5，PTAOO 1_A6，PTAOO 1_A7，PTAOO 1_A8，PTAOO 1_A9，PTAOO 1_A10，PTA001_A11， PTAOO 1_A 12, PTAOO 1_A 13 或 PTAOO 1_A 14 的重鏈 CDR1，CDR2 和 / 或 CDR3 序列或 PTAOO 1_A1， PTAOO 1_A2，PTAOO 1_A3，PTAOO 1_A4，PTAOO 1_A5，PTAOO 1_A6，PTAOO 1_A7，PTAOO 1_A8，PTAOO 1_ A9，PTAOO 1_A10，PTAOO 1_A11，PTAOO 1_A12，PTAOO 1_A13 或 PTAOO 1_A14 的輕鏈 CDR1，CDR2 和 /或CDR3序列。
與SEQ ID NO 59-83 (VH和Vk序列)的CDR編碼部分具有至少80 %，例如至少 85 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %，或至少99 %序列同一性的核酸也是本發(fā)明的優(yōu)選核酸。此類核酸與SEQ ID NO :59-83的對應部分可在非⑶R編碼區(qū)和/或⑶R編碼區(qū)中相區(qū)別。當所述區(qū)別在⑶R編碼區(qū)中時，核酸編碼的核酸⑶R區(qū)與PTAOO 1_A1，PTAOO 1_A2， PTAOO 1_A3，PTAOO 1_A4，PTAOO 1_A5，PTAOO 1_A6，PTAOO 1_A7，PTAOO 1_A8，PTAOO 1_A9，PTAOO 1_ AlO，PTAOO 1_A11，PTAOO 1_A12，PTAOO 1_A13 或 PTAOO 1_A14 的對應的 CDR 序列相比通常包含一個或多個如本文定義的保守性序列修飾。
一旦獲得編碼Vh和Vk區(qū)段的DNA片段，可以通過標準重組DNA技術進一步操作這些DNA片段，例如，以便將可變區(qū)基因轉變?yōu)槿L抗體鏈基因，轉變?yōu)镕ab片段基因，或轉變?yōu)閟cFv基因。在這些操作中，編碼Vk或Vh的DNA片段可操作地與另一個編碼另一蛋白 (例如抗體恒定區(qū)或靈活的連接子)的DNA片段連接。如本文的情境中所使用的，術語“可操作地連接”意指兩個DNA片段被連接在一起，從而由這兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持是符合讀框的。
可以通過將編碼Vh的DNA可操作地與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1，CH2和CH3)的另一 DNA分子連接而將編碼Vh區(qū)的分離的DNA轉變?yōu)槿L重鏈基因。鼠重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領域已知的(見，例如 Kabat，Ε. A.，el al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH公開號No. 91-3242)，可以通過標準的PCR擴增來獲得包含這些區(qū)域的DNA 片段。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgA, IgE, IgM或IgD恒定區(qū)，但最優(yōu)選是 IgGl或IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因，可以將編碼Vh的DNA可操作地與僅編碼重鏈CHl恒定區(qū)的另一 DNA分子連接。
可以通過將編碼\的DNA可操作地與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一 DNA分子連接而將編碼區(qū)的分離的DNA轉變?yōu)槿L輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。鼠輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領域已知的(見，例如Kabat，Ε. Α.，el al. (1991) Sequence of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department ofHealth and Human Services, NIH公開號No. 91-3242)，可以通過標準的PCR擴增來獲得包含這些區(qū)域的DNA 片段。在優(yōu)選的實施方式中，輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)。
為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼Vh和的DNA片段可操作地與編碼靈活連接子(例如編碼氨基酸序列(Gly4^er)3W)另一片段連接，從而Vh和序列可以被表達為連續(xù)的單鏈蛋白，其中和通過所述靈活連接子被連接(見，例如Bird et al. (1988) Science 242 :423-426 ；Huston et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883 ； McCafferty et al. ， (1990)Nature348 :552-554)。
單克隆抗體的產(chǎn)生
根據(jù)本發(fā)明，鈣粘素-17或者其片段或衍生物可被用作免疫原以產(chǎn)生免疫特異性地與此種免疫原相結合的抗體?？赏ㄟ^任何便利的手段來分離此類免疫原。本領域技術人員將認識到，許多用于生產(chǎn)抗體的程序是可得的，例如，如在下列中所描述 的Antibodies, ALaboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring HarborLaboratory (1988), Cold Spring Harbor, N. Y。本領域技術人員還將了解，模擬抗體的結合片段或Fab片段也可通過各種程序由遺傳信息制備(Antibody Engineering A Practical Approach(Borrebaeck, C., ed. ),1995, Oxford University Press, Oxford ； J. Immunol.149,3914-3920(1992))
在本發(fā)明的一個實施方式中，產(chǎn)生了針對鈣粘素-17的特定結構域的抗體。在具體的實施方式中，將鈣粘素-17的親水性片段作為免疫原用于抗體的生產(chǎn)。
在抗體的生產(chǎn)中，可通過本領域已知的技術來實現(xiàn)對于所需抗體的篩選，例如 ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)。例如，為了選擇識別鈣粘素-17的特定結構域的抗體，可針對結合含有所述結構域的鈣粘素-17片段的產(chǎn)物來測定所產(chǎn)生的雜交瘤。為了選擇特異性結合第一鈣粘素-17同源物但不特異性結合(或較弱地結合)第二鈣粘素-17同源物的抗體， 可基于對于所述第一鈣粘素-17同源物的積極結合以及對于所述第二鈣粘素-17同源物缺乏結合(或減少的結合)來進行選擇。類似地，為了選擇特異性結合鈣粘素-17但不特異性結合(或較弱地結合)同一蛋白的不同同種型(例如與鈣粘素-17具有相同核心肽的不同糖型)的抗體，可基于對于鈣粘素-17的積極結合以及對于所述不同的同種型(例如不同的糖型)缺乏結合(或減少的結合)來進行選擇。因此，本發(fā)明提供了這樣的抗體(例如單克隆抗體)與對于鈣粘素-17的不同同種型(例如糖型)的結合相比，其以更高的親和力結合鈣粘素-17(例如至少2倍、如至少5倍，特別是至少10倍的更高的親和力)。
可用于本發(fā)明的方法中的多克隆抗體是源自經(jīng)免疫的動物的血清的抗體分子的異質性群體?？墒褂梦捶旨壍拿庖哐??？墒褂帽绢I域已知的各種程序來產(chǎn)生鈣粘素-17、 鈣粘素-17的片段、鈣粘素-17相關多肽或鈣粘素-17相關多肽的片段的多克隆抗體。例如，一種方式是使用例如本領域熟知的固相肽合成方法來純化目的多肽或合成目的多肽。 見例如，Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed. , Meth. Enzymo 1. Vol 182(1990) ；Solid Phase PeptideSynthesis, Greg B. Fields ed. , Meth. Enzymol. Vol 289(1997) ；Kiso et al, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo)38 :1192-99,1990 ；Mostafavi et al, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1 :255-60,1995 ；Fujiwara et al, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo)44 :1326-31,1996。然后，所選擇的多肽可被用于通過注射而免疫各種宿主動物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體。可使用各種佐劑(即免疫刺激劑)來增強免疫應答；取決于宿主物種，這包括但不限于完全或不完全弗氏佐劑、礦物凝膠(例如氫氧化鋁)、表面活性物質(例如溶血卵磷脂)、普朗尼克多元醇、聚陰離子、肽、 油乳劑、匙孔血藍蛋白、二硝基酚、和佐劑例如BCG(卡介苗菌株)或短小棒狀桿菌。其它的佐劑也是本領域熟知的。為了制備抗鈣粘素-17的單克隆抗體(mAbs)，可使用任何這樣的技術其允許在培養(yǎng)物中由連續(xù)的細胞系產(chǎn)生抗體分子。例如，最初由Kohler和Milstein (1975，Nature 256 =495-497)開發(fā)的雜交瘤技術、以及三元雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor et al. ,1983, Immunology Today 4 :72)和EBV-雜交瘤技術來生產(chǎn)人單克隆抗體(Cole et al. ,1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96)。 此類抗體可以是任何免疫球蛋白類別，包括IgG，IgM, IgE, IgA, IgD和任何其亞類。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可在體外或體內培育。在本發(fā)明的其它實施方式中，可利用已知的技術在無菌動物中生產(chǎn)單克隆抗體(PCT/US90/02M5，在此通過引用而并入)。用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。在小鼠中產(chǎn)生雜交瘤是被良好建立了的程序。免疫方案和分離用于融合的經(jīng)免疫的脾細胞的技術是本領域已知的。融合伴侶 (例如鼠骨髓瘤細胞)和融合程序也是已知的。單克隆抗體包括但不限于人單克隆抗體和嵌合單克隆抗體(例如人-小鼠嵌合體)?？梢曰谌缟衔牡拿枋龆苽涞姆侨藛慰寺】贵w的序列來制備本發(fā)明的嵌合抗體或人源化抗體。可以從非人目標雜交瘤獲得編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA并使用標準的分子生物學技術進行工程化以使其包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用本領域已知的方法(見，例如Cabilly等人的美國專利號4，816，567) 將鼠可變區(qū)連接至人恒定區(qū)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領域已知的方法(見，例如Winter的美國專利號5，225，539和Queen等人的美國專利號5，530，101 ；5，585,089 ； 5，693，762和6，180，370)將鼠CDR區(qū)插入至人框架中。可使用這樣的轉基因或轉染色體(transchromosomic)小鼠來生產(chǎn)全人抗體其不能表達內源性的免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因但是可表達人重鏈和輕鏈基因。用所選擇的抗原(例如鈣粘素-17的全部或部分)以通常的方式免疫所述轉基因小鼠?？墒褂贸Ｒ?guī)的雜交瘤技術獲得針對所述抗原的單克隆抗體。所述轉基因小鼠帶有的人免疫球蛋白轉基因在B細胞分化的過程中重排，并隨后經(jīng)歷類別轉換和體細胞突變。因此，使用這種技術，有可能產(chǎn)生治療上有用的IgG，IgA, IgM和IgE抗體。這些轉基因和轉染色體小鼠包括 HuMAb Mouse (Medarex ，Inc.)禾口 KM Mouse 株的小鼠。Lonberg 和 Huszar (1995， Int. Rev. Immunol. 13 :65-93)描述了 HuMAb Mouse 株(Medarex Inc.) 0 關于用此技術生產(chǎn)人抗體和人單克隆抗體以及生產(chǎn)此類抗體的方案的詳細討論，見例如美國專利 5，625，126 ；美國專利5，633，425 ；美國專利5，569，825 ；美國專利5，661，016和美國專利 5，545, 806。KMmouse 株是指攜帶人重鏈轉基因和人輕鏈轉染色體的小鼠，其被詳細描述于 Ishida 等的 PCT 公開 WO 02/43478 中。另外，本領域中可以獲得表達人免疫球蛋白基因的備選的轉基因動物系統(tǒng)，可用于產(chǎn)生本發(fā)明的鈣粘素-17抗體。例如，可以使用被稱作XenomouSe(Amgen，Inc.)的備選轉基因系統(tǒng)；此類小鼠被描述于例如Kucherlapati等人的美國專利號5，939，598 ； 6,075，181 ；6，114，598 ；6，150，584 和 6，162，963 中?？墒褂帽环Q為“引導選擇”的技術來產(chǎn)生識別所選表位的全人抗體。在這種方法中，使用所選的非人單克隆抗體(例如小鼠抗體)來引導選擇識別相同表位的全人抗體 (Jespers et al. (1994) Bio/technology 12:899-903)。此外，本領域中可以獲得表達人免疫球蛋白基因的備選的轉染色體動物系統(tǒng)， 可用于產(chǎn)生本發(fā)明的鈣粘素-17抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉染色體和人輕鏈轉染色體的小鼠，其被稱作“TC小鼠”；此類小鼠被描述于Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :722-727中。此外，本領域中已經(jīng)描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉染色體的母牛(Kuroiwa et al. (2002)Nature Biotechnology20 :889-894 和 PCT 申請 W0/2002/092812)，并且可被用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗鈣粘素-17抗體。還可以使用這樣的SCID小鼠來制備本發(fā)明的人單克隆抗體向其中重構了人免疫細胞，從而可以在免疫后產(chǎn)生人類抗體應答。此類小鼠被描述于例如Wilson等人的美國專利號 5，476，996 和 5，698，767 中?？梢酝ㄟ^使用噬菌體展示技術來產(chǎn)生并且就與所選靶標的結合而篩選多肽庫，從而產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。見例如，Cwirla et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,6378-82, 1990 ；Devlin et al.，Science249，404-6，1990，Scott 和 Smith, Science 249,386-88， 1990 ；以及Ladner等人，美國專利號5，571，698。噬菌體展示方法的基本概念是在編碼待篩選的多肽的DNA與所述多肽之間建立物理關聯(lián)。這種物理關聯(lián)是由噬菌體顆粒提供的， 其將多肽作為衣殼的一部分展示，所述衣殼包裝著編碼所述多肽的噬菌體基因組。在多肽與其遺傳物質之間建立物理關聯(lián)允許對攜帶不同多肽的很大數(shù)目的噬菌體同時進行大規(guī)模篩選。展示出具有與靶標的親和力的多肽的噬菌體與靶標結合并且這些噬菌體通過針對靶標的親和力篩選而被富集。可從其各自的基因組來確定這些噬菌體所展示的多肽的特性(identity)。使用這些方法，被鑒別為具有對于所需靶標的結合親和力的多肽然后可通過常規(guī)的手段被大量合成。見例如，美國專利號6，057，098，在此將其全部并入，包括所有的表格、附圖和權利要求。特別地，此類噬菌體可被用于展示由庫或組合的抗體文庫(例如人或鼠的)表達的抗原結合結構域?？捎每乖瓉磉x擇或鑒別表達結合目的抗原的抗原結合結構域的噬菌體，例如使用經(jīng)標記的抗原或者結合至或被捕獲至固體表面或珠的抗原。用于這些方法中的噬菌體通常是絲狀噬菌體，其包括從噬菌體表達的fd和M13結合結構域，其中Fab，F(xiàn)v或經(jīng)二硫穩(wěn)定的Fv抗體結構域與噬菌體基因III或基因VIII蛋白重組地融合?？捎糜谥苽浔景l(fā)明的抗體的噬菌體展示方法包括下列中所公開的Brinkman et al, J. Immunol. Methods 182:41-50(1995) ；Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186(1995) ；Kettleborough et al. , Eur. J. Immunol. 24 952-958 (1994) ；Persicet al. , Gene 1879-18(1997) ；Burton et al. , Advances inlmmunology 57:191-280(1994) ；PCT 申請 No. PCT/GB91/01134 ;PCT 公開 WO 90/02809 ； WO 91/10737 ；WO 92/01047 ；WO 92/18619；W093/11236 ；WO 95/15982 ；WO 95/20401 ；以及美國專利號 5，698，426 ；5，223，409 ；5，403，484 ；5，580，717 ；5，427，908 ；5，750，753 ； 5，821，047 ；5，571，698 ；5，427，908 ；5，516，637 ；5，780，225 ；5，658，727 ；5，733，743 和 5，969，108 ；其中的每一個都在此以其全部通過引用而被并入。如上面的參考文獻中所描述的，噬菌體選擇之后，來自噬菌體的抗體編碼區(qū)可被分離并用于產(chǎn)生完整的抗體，包括人抗體或任何其它所需的抗原結合片段，并在任何所希望的宿主中被表達，包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母和細菌，例如如下文中所詳述的。例如，也可通過使用本領域中已知的方法、采用重組產(chǎn)生Fab，F(xiàn)ab'和F(ab' )2 片段的技術，所述方法為例如下列中所公開的PCT公開WO 92/22324 ；Mullinax et al., BioTechniques 12(6) :864-869 (1992)；和 Sawai et al.，AJRI 34 :26-34 (1995)；以及 Better etal.，Science 240 :1041-1043 (1988)(所述參考文獻以其全部通過引用而被并入)。可用于生產(chǎn)單鏈Fv和抗體的技術的實例包括下列中所描述的那些美國專利 4, 946, 778^P5,258, 498 ；Huston et al,Methods inEnzymology 203:46—88(1991) ；Shu et al, PNAS 90:7995-7999(1993)；以及 Skerra et al, Science 240:1038-1040(1988)。本發(fā)明提供了抗鈣粘素-17免疫球蛋白分子的功能活性片段、衍生物或類似物。 功能活性片段是指所述片段、衍生物或類似物能夠引起抗-抗個體型抗體(即第三抗體)， 其與所述片段、衍生物或類似物所源自的抗體識別相同的抗原。具體地，在特別的實施方式中，免疫球蛋白分子個體型的抗原性可通過刪除特異性識別抗原的CDR序列C末端的框架和⑶R序列而被提高。為了確定哪些⑶R序列結合抗原，可通過本領域已知的任何結合測定方法，在與抗原的結合測定中使用含有CDR序列的合成肽。本發(fā)明提供抗體片段，例如但不限于F(ab' )2片段和Fab片段。可通過已知的技術產(chǎn)生識別特定表位的抗體片段。F(ab' )2片段是由可變區(qū)，輕鏈恒定區(qū)和重鏈的CHl結構域組成的，并且是通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生的。Fab片段是通過還原F(ab' )2 片段的二硫橋產(chǎn)生的。本發(fā)明還提供本發(fā)明的抗體的重鏈和輕鏈二聚體，或其任何最小的片段，例如Fv或單鏈抗體(SCAs)(例如，如下列中所描述的美國專利4，946，778 ； Bird,1988, Science 242 :423-42 ；Huston et al.，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-5883 ；和Ward et al.，1989，Nature 334 :544- )，或與本發(fā)明的抗體具有相同的特異性的任何其它分子。單鏈抗體是由通過氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段而產(chǎn)生單鏈多肽形成的?？墒褂迷诖竽c桿菌中組裝功能性Fv片段的技術(Skerra et al. ,1988, Science 242 :1038-1041)。在其它實施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的免疫球蛋白(或其功能活性片段)的融合蛋白，例如其中所述免疫球蛋白通過共價鍵(例如，肽鍵)在N末端或C末端與不是免疫球蛋白的另一個蛋白(或其部分，優(yōu)選蛋白的至少10、20或50個氨基酸的部分)的氨基酸序列相融合。優(yōu)選地，所述免疫球蛋白或其片段在恒定結構域的N末端與其它蛋白共價連接。如上文中所述，此類融合蛋白可促進純化、增加體內的半衰期以及提高抗原跨過上皮屏障而向免疫系統(tǒng)的遞送。本發(fā)明的免疫球蛋白包括經(jīng)修飾的類似物和衍生物，所述修飾為例如通過共價連接任何類型的分子，只要所述共價連接不損害免疫特異性結合。例如(但是不作為限制) 所述免疫球蛋白的衍生物和類似物包括被進一步修飾的那些，例如所述進一步修飾是通過糖基化、乙?；?、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通過已知保護性/阻礙性基團的衍生、蛋白水解切割、與細胞配體或其它的蛋白相連等?？赏ㄟ^已知的技術進行許多化學修飾中的任意，包括但不限于特定的化學切割、乙?；?、甲酰化等。此外，所述類似物或衍生物可含有一個或多個非經(jīng)典氨基酸。小鼠的免疫可以使用鈣粘素-17抗原和/或重組鈣粘素-17的純化的或富集的制備物或表達鈣粘素-17的細胞來免疫小鼠。優(yōu)選地，小鼠在第一次輸注時是6-16周齡。例如，可以使用鈣粘素-17抗原的純化的或重組的制備物(IOOyg)腹膜內地免疫小鼠。以多種抗原獲得的累積的經(jīng)驗已經(jīng)表明當以完全弗氏佐劑中的抗原通過腹膜內 (IP)方式進行免疫時，小鼠有應答。然而，發(fā)現(xiàn)除了弗氏佐劑以外的其它佐劑也是有效的。 另外發(fā)現(xiàn)在不存在佐劑的情況下，全細胞是高度免疫原性的?？梢酝ㄟ^眶后取血獲得的血漿樣品在免疫程序的過程中監(jiān)控免疫應答?？梢酝ㄟ^ELISA篩選血漿(如下文描述)以就滿意的滴度進行測試?？梢栽谔幩狼斑B續(xù)3天使用抗原通過靜脈內方式對小鼠加強免疫， 并在5天后取出脾臟。在一個實施方式中，可以使用A/J小鼠株(Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.)。制備產(chǎn)生單克隆抗體的轉染瘤可以使用例如本領域熟知的重組DNA技術與基因轉染方法的組合(例如 Morrison, S. (1985) Science 229 :1202)在宿主細胞轉染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，為了表達抗體或其抗體片段，可以通過標準的分子生物學技術(例如，PCR 擴增或使用表達目的抗體的雜交瘤進行cDNA克隆)獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的 DNA,并且可以將該DNA插入至表達載體，從而基因與轉錄和翻譯控制序列可操作地連接。 在此情境中，術語“可操作地連接的”意指抗體基因被連接到載體中，從而該載體內的轉錄和翻譯控制序列發(fā)揮其調節(jié)該抗體基因的轉錄和翻譯的預期功能。將表達載體和表達控制序列選擇為與所用的表達宿主細胞相容的。可用本發(fā)明的兩種表達載體共轉染宿主細胞，第一種載體編碼衍生自重鏈的多肽而第二種載體編碼衍生自輕鏈的多肽。這兩種載體可含有相同的選擇性標志物，使得能夠平等地表達重鏈和輕鏈多肽。備選地，可使用編碼重鏈和輕鏈多肽的單一載體。在這種情形中，輕鏈應被置于重鏈之前以避免過量的無毒性重鏈(Proudfoot，1986，Nature322 :52 ； Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :2197)。重鏈和輕鏈的編碼序列可包含 cDNA 或基因組DNA。通過標準方法(例如抗體基因片段和載體上的互補性限制性位點的連接，或者， 如果不存在限制性位點，則進行平末端連接)將抗體基因插入至表達載體。本文描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)可用于產(chǎn)生任何抗體同種型的全長抗體基因通過將所述輕鏈和重鏈可變區(qū)插入至已經(jīng)編碼所需的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達載體，從而Vh區(qū)段可操作地連接于該載體內的Ch區(qū)段，并且Vk區(qū)段可操作地連接于該載體內的Q區(qū)段。另外或備選地，重組表達載體可以編碼促進抗體鏈從宿主細胞分泌的信號肽?？梢詫⒖贵w鏈基因克隆到載體中，從而信號肽與抗體鏈基因的氨基末端符合讀框地連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白的蛋白的信號肽)。除了抗體鏈基因之外，本發(fā)明的重組表達載體攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞內表達的調節(jié)序列。術語“調節(jié)序列”意在包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如多腺苷化信號)，它們控制抗體鏈基因的轉錄或翻譯。此類調節(jié)序列被描述于例如 Goeddel (GeneExpression Technology. Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego,CA(1990))中。本領域技術人員將理解，表達載體的設計、包括調節(jié)序列的選擇可取決于如下因素，例如，待轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白的表達水平等。用于哺乳動物宿主細胞表達的優(yōu)選的調節(jié)序列包括指導蛋白在哺乳動物細胞中高水平表達的病毒元件，例如源自下列病毒的啟動子和/或增強子巨細胞病毒(CMV)，猴病毒40 (SV40)，腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤。備選地，可以使用非病毒的調節(jié)序列，例如泛素啟動子或β-球蛋白啟動子。另外，調節(jié)元件包括來自不同來源的序列，例如SRa啟動子系統(tǒng)，其包含來自SV40早期啟動子和1型人T細胞白血病病毒的長末端重復的序列 (Takebe, Y. et al. (1988)Mol. Cell. Biol. 8 :466-472)。除了抗體鏈基因和調節(jié)序列之外，本發(fā)明的重組表達載體可以攜帶另外的序列， 例如調節(jié)載體在宿主細胞中的復制的序列(例如復制起始點)和可選擇的標志物基因。所述可選擇的標志物基因促進其中導入了載體的宿主細胞的選擇(見，例如Axel等人的美國專利號4，399，216，4，634，665和5，179，017)。例如，通?？蛇x擇的標志物基因賦予其中導入了載體的宿主細胞對藥物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。優(yōu)選的可選擇標志物基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于在dhfr-宿主細胞中以氨甲蝶呤選擇/擴增)和neo基因(用于G418選擇)。為了表達輕鏈和重鏈，通過標準技術將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉染到宿主細胞中。術語“轉染”的多種形式意在涵蓋通常用于將異源DNA導入原核或真核宿主細胞中的多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-右旋糖酐轉染等。雖然理論上有可能在原核或真核宿主細胞中表達本發(fā)明的抗體，但是在真核細胞(最優(yōu)選在哺乳動物宿主細胞中)表達抗體是最優(yōu)選的，因為此類真核細胞(尤其是哺乳動物細胞)比原核細胞更易于組裝和分泌正確折疊且免疫上有活性的抗體。已經(jīng)報道了抗體基因的原核表達對于高產(chǎn)率產(chǎn)生活性抗體是無效的(Boss，Μ. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6 :12-13)。用于表達本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞，其與載體(例如來自人巨細胞病毒的主要即刻早期基因啟動子元件(Foecking et al, 1986, Gene 45 :101 ；Cockettet al, 1990, Bio/Technology 8 2)相結合；dhfr-CHO 細胞，描述于 Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 :4216_4220，與 DHFR 可選擇標志物一起使用，例如描述于 R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159 601-621中；NSO骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。特別地，對于與NSO骨髓瘤細胞一起使用，另一種優(yōu)選的表達系統(tǒng)是公開于WO 87/04462 (Wilson的)，WO 89/01036 (Bebbington 的)和EP 338，841 (Bebbington的)中的GS基因表達系統(tǒng)。
可使用各種宿主表達載體系統(tǒng)來表達本發(fā)明的抗體分子。此類宿主表達系統(tǒng)代表媒介(通過所述媒介，目的編碼序列可被產(chǎn)生并隨后被純化)，但是也代表細胞(當其被轉化或轉染了適當?shù)暮塑账峋幋a序列時，原位表達本發(fā)明的抗體分子)。這些包括但不限于， 經(jīng)含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的微生物例如細菌(例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；經(jīng)含有抗體編碼序列的重組酵母表達載體轉化的酵母 (例如酵母屬(Saccharomyces)、赤壁酵母屬(Pichia))；經(jīng)含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；經(jīng)含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV ；煙草花葉病毒，TMV)感染的、或者經(jīng)含有抗體編碼序列的重組質粒表達載體(例如Ti質粒)轉化的植物細胞系統(tǒng)；或帶有重組表達構建體的哺乳動物細胞系統(tǒng)(例如COS，CHO, BHK, 293, 3T3細胞)，所述構建體含有下列啟動子源自哺乳動物細胞基因組(例如金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒(例如腺病毒晚期啟動子； 牛痘病毒7. 5K啟動子)的啟動子。在細菌系統(tǒng)中，可根據(jù)所表達的抗體分子所欲的用途有利地選擇許多表達載體。 例如，當要生產(chǎn)大量此類蛋白時，對于產(chǎn)生包含抗體分子的藥物組合物，可能需要的是指導易純化的融合蛋白產(chǎn)物高水平表達的載體。此類載體包括但不限于大腸桿菌表達載體 pUR278 (Ruther et al. , 1983, EMBO J. 2 1791)，其中抗體編碼序列可被單獨地連接到載體中并與IacZ編碼區(qū)同框，從而產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye & houye，1985，Nucleic Acids Res. 13 :3101-3109 ；Van Heeke & Schuster, 1989，J. Biol. Chem. 24 :5503-5509)等。 PGEX載體也可被用于表達外來多肽，作為與谷胱甘肽轉移酶(GST)的融合蛋白。一般而言， 此類融合蛋白是可溶的并且可如下容易地從裂解的細胞中純化通過吸附和結合到基質谷胱甘肽-瓊脂糖珠上，隨后在游離谷胱甘肽的存在下洗脫。pGEX載體被設計為包括凝血酶或因子)(a蛋白酶切割位點，從而經(jīng)克隆的靶基因產(chǎn)物可從GST部分被釋放。在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)被用作載體，以表達外來基因。此病毒在草地夜蛾細胞中生長。可將抗體編碼序列單獨地克隆到病毒的非必要區(qū)域 (例如多角體基因)中并將其置于AcNPV啟動子(例如多角體啟動子)的控制之下。在哺乳動物宿主細胞中，可利用許多基于病毒的表達系統(tǒng)(例如，腺病毒表達系統(tǒng))。如上文所討論的，可選擇這樣的宿主細胞株其調節(jié)被插入的序列的表達，或以所需的特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物。此種對蛋白質產(chǎn)物的修飾(例如糖基化)和加工(例如剪切)對于蛋白質的功能可能是重要的。對于長期、高產(chǎn)率地生產(chǎn)重組抗體而言，穩(wěn)定的表達是優(yōu)選的。例如，可如下生產(chǎn)穩(wěn)定表達目的抗體的細胞系用包含抗體的核苷酸序列以及可選擇標志物(例如新霉素或潮霉素)的核苷酸序列的表達載體轉染細胞，并且就可選擇標志物的表達進行選擇。此類經(jīng)工程化的細胞系可特別用于篩選和評價與抗體分子直接或間接相互作用的化合物?？赏ㄟ^載體擴增而增加抗體分子的表達水平(關于綜述，見BetDbington和 Hentschel, The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammaliancells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York， 1987))。當表達抗體的載體系統(tǒng)中的標志物是可擴增的時候，宿主細胞培養(yǎng)物中存在的抑制劑水平的增加將增加標志物基因的拷貝數(shù)。由于所擴增的區(qū)域是與抗體基因相關的，抗體的產(chǎn)生也將增加(Crouse et al, 1983, Mol. Cell. Biol. 3 257)
當把編碼抗體基因的重組表達載體導入哺乳動物宿主細胞中時，通過將宿主細胞培養(yǎng)一段時間而產(chǎn)生抗體，所述時間足以允許抗體在該宿主細胞中表達或更優(yōu)選地，允許抗體被分泌到該宿主細胞所生長的培養(yǎng)基中。一旦本發(fā)明的抗體分子被重組地表達，可通過本領域已知的任何純化抗體分子的方法將其純化，例如通過色譜法(例如離子交換色譜、親和色譜(如使用蛋白A或特定抗原的親和色譜)、和尺寸柱色譜)，離心，差異溶解性， 或任何其它的用于純化蛋白的標準技術。備選地，通過使用特異于所表達的融合蛋白的抗體，可容易地純化任何融合蛋白。 例如，Janknecht等人描述的系統(tǒng)允許容易地純化在人細胞系中表達的非變性融合蛋白 (Janknecht et al. , 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897)。在這一系統(tǒng)中，目的基因被亞克隆到牛痘重組質粒中，從而使基因的開放閱讀框被翻譯地融合至由6個組氨酸殘基組成的氨基末端標簽。此標簽作為融合蛋白的基質結合結構域。將來自感染了重組牛痘病毒的細胞的提取物加載到M2+次氮基乙酸-瓊脂糖柱上，并且用含有咪唑的緩沖液選擇性地洗脫經(jīng)組氨酸標記的蛋白。表征抗體與抗原的結合通過這些方法產(chǎn)生的抗體然后可如下被選擇首先用純化的目的多肽就親和力和特異性進行篩選，如果需要的話，將結果與用希望排除結合的多肽獲得的抗體親和力和特異性進行比較?？赏ㄟ^例如標準的ELISA就與鈣粘素-17的結合測試抗體。篩選過程可涉及將純化的多肽固定在微量滴定板的單獨的孔中。然后，將含有潛在抗體或抗體組的溶液置于各個微量滴定孔中并溫育約30分鐘至2小時。然后清洗所述微量滴定孔，并將經(jīng)標記的二抗(如果所產(chǎn)生的抗體為小鼠抗體，所述二抗為例如與堿性磷酸酶綴合的抗小鼠抗體)加入孔中，溫育大約30分鐘，然后清洗。將底物加入孔中，在抗經(jīng)固定的多肽的抗體存在的位置將出現(xiàn)顏色反應。然后可在所選擇的測定設計中就親和力和特異性對這樣鑒別的抗體進行進一步分析。在靶蛋白免疫測定的開發(fā)中，純化的靶蛋白作為標準，用于判斷使用所選擇的抗體的免疫測定的靈敏度和特異性。由于不同抗體的結合親和力可能不同，某些抗體對(例如在夾心測定中)可能在空間上等彼此干擾，相比于抗體的絕對親和力和特異性，抗體的測定表現(xiàn)可能是更重要的量度。本領域技術人員將認識到，可采用許多方法來生產(chǎn)抗體或結合片段，以及就親和力與特異性篩選和選擇各種多肽，但是這些方法不改變本發(fā)明的范圍。為了測定所選擇的抗鈣粘素-17單克隆抗體是否結合獨特的表位，可以使用商業(yè)上可獲得的試劑(Pierce，Rockford，IL)將每個抗體生物素化。可以使用鈣粘素-17包被的ELISA平板，使用未標記的單克隆抗體和生物素化的單克隆抗體，進行競爭性研究?？梢允褂每股鞍祖溇?堿性磷酸酶探針檢測生物素化的mAb的結合。為了測定純化的抗體的同種型，可以使用特異于特定同種型的抗體的試劑進行同種型ELISA?？梢酝ㄟ^蛋白質印跡就與鈣粘素-17抗原的反應活性進一步測試抗鈣粘素-17抗體。簡要地，可以制備鈣粘素-17并使其進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳之后，將分離的抗原轉移至硝酸纖維素膜，以10%的胎牛血清封閉，并用待測的單克隆抗體進行探測。
還可以通過例如流式細胞術通過監(jiān)控抗體與表達鈣粘素-17的細胞的結合來測定本發(fā)明的抗體結合特異性。通常，可以使用編碼鈣粘素-17的表達載體來轉染細胞系(例如CHO細胞系)。轉染的蛋白可以包含標簽，例如myc標簽，優(yōu)選在N末端，以便使用針對該標簽的抗體進行檢測。可以通過將經(jīng)轉染的細胞與抗體一起溫育并檢測所結合的抗體來測定本發(fā)明的抗體與鈣粘素-17的結合。抗體與轉染的蛋白上的標簽的結合可被用作陽性對照。還可以使用相同的方法(測定與鈣粘素-17的結合的方法)通過測定抗體是否與其它蛋白(例如鈣粘素家族的其它成員)結合來進一步研究本發(fā)明的抗體對于鈣粘素-17 的特異性。免疫綴合物另一方面，本發(fā)明提供了與治療性部分(例如細胞毒素，藥物(如免疫抑制劑)或放射性毒素)綴合的抗鈣粘素-17抗體或其片段。此類綴合物在本文中被稱作“免疫綴合物”。包括一種或多種細胞毒素的免疫綴合物被稱作“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒性試劑包括任何對于細胞有害(例如殺死細胞)的試劑。實例包括紫杉醇，細胞松弛素B，短桿菌肽D，溴乙啶，依米丁，絲裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，長春新堿，長春堿，秋水仙堿，多柔比星，柔紅霉素，二羥基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光神霉素，放線菌素D，1-去氫睪留酮，糖皮質激素類，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛爾，和嘌呤霉素，及其類似物或同源物。治療性試劑還包括，例如抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖孢苷、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪)，烷化劑(例如氮芥、噻替派苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和環(huán)己亞硝脲^CNU)、cycl0th0Sphamide、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順二氯二氨基鉬(II) ((DDP)順鉬))，蒽環(huán)類(例如柔紅霉素(以前的道諾霉素)和多柔比星)，抗生素(例如更生霉素(以前的放線菌素)、博來霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))，和抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春花堿)?？膳c本發(fā)明的抗體綴合的治療性細胞毒素的其它優(yōu)選的實例包括duocarmycins、 calicheamicins、美登素和auristatins，及其衍生物。calicheamicin抗體綴合物的實例是商業(yè)上可得的(Mylotarg ; American Home Products)0可以使用本領域可獲得的連接子技術將細胞毒素與本發(fā)明的抗體綴合。已經(jīng)用于將細胞毒素與抗體綴合的連接子類型的實例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽連接子?？梢赃x擇連接子而使得例如，易于被溶酶體區(qū)室內的低PH切割，或易于被蛋白酶 (例如優(yōu)先在腫瘤組織中表達的蛋白酶，例如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D))切割。細胞毒素的實例在例如下述中被描述美國專利號6，989，452，7，087，600， 禾口 7,129,261，禾口 PCT 串請 Nos. PCT/US2002/17210, PCT/US2005/017804, PCT/ US2006/37793, PCT/US2006/060050, PCT/US2006/060711, W02006/110476,以及美國專利申請No. 60/891，028，所有這些均在此以其全部通過引用而并入。關于細胞毒素類型、連接子和用于將治療劑與抗體綴合的方法的進一步討論，還見Mito, G.et al. (2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55 :199-215 ；Trail,P. A. et al. (2003)Cancer Immunol. Immunother. 52 328-337 ；Payne, G. (2003)Cancer Cell 3 :207-212 ；Allen, Τ. M. (2002)Nat. Rev. Cancer 2 :750-763 ；Pastan, I.禾口 Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3 1089-1091 ；Senter, P.D.和 Springer, C. J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53 :247_264。
本發(fā)明的抗體還可以與放射性同位素綴合以產(chǎn)生細胞毒性放射藥劑，也稱作放射免疫綴合物。可與抗體綴合用于診斷或治療的放射性同位素的實例包括但不限于碘131、 銦111、釔90和镥177。用于制備放射免疫綴合物的方法是本領域已經(jīng)建立的。放射免疫綴合物的實例是商業(yè)上可得的，包括Zeval in (IDEC Pharmaceuticals)和Bexxar (Corixa !Pharmaceuticals)，類似的方法也可被用于使用本發(fā)明的抗體來制備放射免疫綴合物。本發(fā)明的抗體綴合物可被用于修飾給定的生物學應答，且藥物部分將不被解釋為受限于經(jīng)典的化學治療劑。例如，藥物部分可以是具有所需生物學活性的蛋白或多肽。此類蛋白可以包括，例如酶促活性的毒素或其活性片段，例如相思豆毒素，蓖麻毒素A，假單胞菌外毒素，或白喉毒素；蛋白，例如腫瘤壞死因子或干擾素-Y ；或者，生物學應答修飾劑例如，淋巴因子、白細胞介素-1 (“IL-1”)，白細胞介素-2(“IL-2”)，白細胞介素-6(“IL-6”)， 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其它生長因子。將此類治療性部分與抗體相綴合的技術是公知的，見例如Arnonet al.， "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy，， 在 Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy 中，Reisfeld et al. (eds.), pp.243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985) ；Hellstrom et al. ,"Antibodies For Drug Delivery", 在 ControlledDrug Delivery (2nd Ed.)中，Robinson et al. (eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987) ；Thorpe, "Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review，，,在 MonoclonalAntibodies' 84 :Biological And Clinical Applications 中，Pinchera et al. (eds. ) , pp. 475-506 (1985) ；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy，，,在Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy 中， Baldwin et al. (eds. ), pp. 303-16 (Academic Press 1985),禾口 Thorpe et al. , Immunol. Rev. ,62 :119-58(1982)。雙特異性分子在另一個方面，本發(fā)明的特征在于包含本發(fā)明的抗鈣粘素-17抗體或其片段的雙特異性分子。本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分可以被衍生或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白(例如另一抗體或針對受體的配體)，以產(chǎn)生結合至少兩個不同結合位點或靶分子的雙特異性分子。本發(fā)明的抗體事實上可以被衍生或連接至多于一種其它功能分子以產(chǎn)生結合多于兩個不同結合位點和/或靶分子的多特異性分子；此類多特異性分子也意在被如本文中所使用的術語“雙特異性分子”所涵蓋。為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子，本發(fā)明的抗體可以被官能地連接(例如通過化學偶聯(lián)、遺傳融合、非共價結合或其它)至一種或多種其它結合分子，例如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物，從而產(chǎn)生雙特異性分子。因此，本發(fā)明包括雙特異性分子，其包含至少一種針對鈣粘素-17的第一結合特異性和針對第二靶表位的第二結合特異性。在本發(fā)明的具體實施方式
中，所述第二靶表位是Fc受體，例如人Fc γ RI (⑶64)或人Fc α受體(⑶89)。因此，本發(fā)明包括能夠結合表達 Fc YR或Fc α R的效應子細胞(例如，單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMN))、并結合表達鈣粘素-17的靶細胞的雙特異性分子。這些雙特異性分子將表達鈣粘素-17的細胞靶向效應子細胞并激發(fā)Fc受體介導的效應子細胞活性，例如表達鈣粘素-17的細胞的吞噬作用，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)，細胞因子釋放，或產(chǎn)生超氧陰離子。在本發(fā)明的一個實施例中，其中雙特異性分子是多特異性的，該分子除了抗-Fc 結合特異性和抗鈣粘素-17結合特異性之外，可以進一步包括第三結合特異性。在一個實施方式中，所述第三結合特異性是抗-增強因子(EF)部分，例如與參與細胞毒性活性的表面蛋白結合，從而增加抗靶細胞的免疫應答的分子?！翱乖鰪娨蜃硬糠帧笨梢允墙Y合給定分子(例如抗原或受體)從而導致針對Fc受體或靶細胞抗原的結合決定簇的效應的增強的抗體、功能抗體片段或配體。“抗增強因子部分”能夠結合Fc受體或靶細胞抗原。備選地， 抗增強因子部分能夠結合與第一和第二結合特異性所結合的實體不同的實體。例如，抗增強因子部分能夠結合細胞毒性T-細胞(例如，通過⑶2，⑶3，⑶8，⑶觀，⑶4，⑶40，ICAM-I 或其它引起抗靶細胞的增強的免疫應答的免疫細胞)。在一個實施方式中，本發(fā)明的雙特異性分子包含作為結合特異性的至少一種抗體，或其抗體片段，包括例如Fab，F(xiàn)ab' , F(ab' )2，F(xiàn)v, Fd, dAb或單鏈Fv?？贵w也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或其任何最小片段，例如Fv或如Ladner等人的美國專利號4，946，778 中描述的單鏈構建體，其內容明確地通過引用方式并入。在一個實施方式中，由單克隆抗體提供了對于Fc Y受體的結合特異性，其結合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻斷。如本文中所使用的，術語“IgG受體”是指位于染色體1上的 8個Y-鏈基因中的任一個。這些基因編碼總共12個跨膜或可溶性受體同種型，其被分組為 3 個 Fc γ 受體類另Ij :Fc y RI (CD64) ,FcyRII (CD32)和 Fc γ RIII (CD16)。在一個優(yōu)選的實施方式中，F(xiàn)c γ受體是人高親和性Fc YRI。人Fc YRI是72kDa的分子，其顯示出對于單體I gG的高親和力(IO8-KAT1)。某些優(yōu)選的抗-Fc γ單克隆抗體的產(chǎn)生和表征描述于Fanger等人的PCT公開WO 88/00052和美國專利號4，954，617中，其教導通過引用方式完全并入本文。這些抗體結合 Fc γ RI，F(xiàn)c γ RII或Fc γ RIII的表位，其結合位點不同于受體的Fc γ結合位點，因此，它們的結合實質上不被生理水平的IgG阻斷。用于本發(fā)明的特定的抗-Fc γ RI抗體是mAb 22， mAb 32,mAb 44,mAb 62和mAb 197。產(chǎn)生mAb 32的雜交瘤可以從美國典型微生物保藏中心 ATCC以登記號HB9469獲得。在其它實施方式中，抗-Fc γ受體抗體是單克隆抗體22的人源化形式(Η22)。Η22抗體的產(chǎn)生和表征被描述于Graziano，R. F. et al. (1995) J. Immunol 155(10) :4996-5002和iTempest等人的PCT公開W094/10332中。產(chǎn)生H22抗體的細胞系保藏于美國典型微生物保藏中心，其被命名為HA022CL1，登記號為CRL 11177。在其它優(yōu)選的實施方式中，針對Fc受體的結合特異性由結合人IgA受體的抗體提供，例如Fc-α受體(Fe α RI (⑶89))，其結合優(yōu)選不被人免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術語〃 IgA受體〃意在包括位于染色體19上的1個α-基因(FcaRI)的基因產(chǎn)物。已知該基因編碼數(shù)個備選地剪接的跨膜的陽至IlOkDa的同種型。Fc α RI (⑶89)在單核細胞 /巨噬細胞、嗜曙紅細胞和嗜中性粒細胞上組成性表達，但是在非效應子細胞群體上不表達。FcaRI具有針對IgAl和IgA2的中等親和力( hlOl1)，在暴露于細胞因子(例如 G-CSF 或 GM-CSF)時該親和性增加(Morton，H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunologyl6 :423-440)。已經(jīng)描述了 4種Fc α RI-特異性單克隆抗體，稱作A3，A59，A62和 A77，它們結合 IgA 配體結合域外的 FcaRI(Monteiro，R. C. et al. (1992) J. Immunol. 148 1764)。Fc α RI和Fc γ RI是用于本發(fā)明的雙特異性分子的優(yōu)選的激發(fā)受體，因為它們(1) 主要表達在免疫效應子細胞(例如單核細胞、ΡΜΝ、巨噬細胞和樹突細胞)上；(2)以高水平表達(例如5，000-100, 000/細胞)；(3)是細胞毒性活性(例如ADCC、吞噬作用)的介導劑；和⑷介導靶向它們的抗原(包括自身抗原)的增強的抗原呈遞?？稍诒景l(fā)明的雙特異性分子中采用的抗體有鼠的，嵌合的和人源化的單克隆抗體。可以使用本領域已知的方法通過綴合組成性結合特異性(例如抗-FcR和抗鈣粘素-17結合特異性)來制備本發(fā)明的雙特異性分子。例如，可以分別產(chǎn)生雙特異性分子的每種結合特異性，然后彼此綴合。當結合特異性是蛋白或肽時，可以使用多種偶聯(lián)或交聯(lián)劑來進行共價綴合。交聯(lián)劑的實例包括蛋白Α、碳二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；?硫代乙酸酯(SATA) ,5,5' - 二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰-苯二馬來酰亞胺(oPDM)、 N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)和硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷"I"羧酸酯(硫代-SMCC)(見例如Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160 1686 ；Liu,MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :8648)。其它方法包括描述于 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132 ；Brennan et al. (1985) Science 229 :81-83 和 Glennie etal. (1987) J. Immunol. 139 :2367-2375)中的那些。優(yōu)選的綴合劑是 SATA 和硫代-SMCC，二者皆可從 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)獲得。當結合特異性是抗體時，它們可以通過兩個重鏈的C末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合來綴合。在特別優(yōu)選的實施方式中，在綴合之前修飾鉸鏈區(qū)以使其包含奇數(shù)的巰基殘基，優(yōu)選1 個。備選地，兩種結合特異性可在同一載體中被編碼，并且在相同的宿主細胞中被表達和組裝。當雙特異性分子是mAbxmAb，mAbxFab，F(xiàn)abxF (ab' )2或配體xFab融合蛋白時， 該方法是特別有用的。本發(fā)明的雙特異性分子可以是包含1個單鏈抗體和結合決定簇的單鏈分子，或包含2個結合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以包含至少2種單鏈分子。用于制備雙特異性分子的方法被描述于例如美國專利號5，260, 203 ；5, 455，030 ； 4，881，175 ；5，132，405 ；5，091，513 ；5，476，786 ；5，013，653 ；5，258，498 ；和 5，482，858 中， 所有這些文獻均明確地通過弓I用方式并入本文?？梢酝ㄟ^例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、FACS分析、生物測定(例如生長抑制)或蛋白質印跡測定來確認雙特異性分子與它們的特定靶標之間的結合。這些測定法中的每一種一般通過采用特異于目的復合物的經(jīng)標記的試劑(例如抗體)來檢測特別感興趣的蛋白-抗體復合物的存在。例如，可以使用例如識別并特異性結合抗體-FcR復合物的酶聯(lián)抗體或抗體片段來檢測FcR-抗體復合物。備選地，可以使用多種其它免疫測定法中的任一種來檢測復合物。例如，可以對抗體進行放射性標記并 fflT^M^^llJ^ (RIA) (ffeintraub, B. ， Principles of Radioimmunoassays, SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques, The EndocrineSociety, March，1986，通過引用方式并入本文)?？梢酝ㄟ^例如使用Y計數(shù)器或閃爍計數(shù)器或放射自顯影的方法來檢測放射性同位素。抗體片段和抗體模擬物
本發(fā)明不限于傳統(tǒng)抗體，可以通過使用抗體片段和抗體模擬物來實施。如下文詳述，現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了多種抗體片段和抗體模擬物技術并且是本領域廣泛已知的。雖然多種這些技術(例如結構域抗體、納米抗體和UniBody)利用傳統(tǒng)抗體結構的片段或其它修飾， 但也有備選的技術，例如Affibody、DARPin, Anticalin、Avimer和Versabody，它們采用這樣的結合結構雖然它們模擬傳統(tǒng)抗體結合，但是它們是通過不同的機制產(chǎn)生的并且通過不同的機制發(fā)揮作用。結構域抗體(dAb)是抗體的最小功能結合單元，對應于人類抗體的重鏈(Vh)或輕鏈的可變區(qū)。結構域抗體具有大約13kDa的分子量。Domantis已經(jīng)開發(fā)了一系列全人Vh和\dAb的大的和高度功能性的文庫(每個文庫中有超過100億個不同的序列)， 并使用這些文庫來選擇特異于治療靶標的dAb。與很多傳統(tǒng)抗體不同，結構域抗體在細菌、 酵母和哺乳動物細胞系統(tǒng)中良好地表達?？梢酝ㄟ^參考美國專利6，291, 158 ；6, 582，915 ； 6，593,081 ；6，172，197 ；6, 696, 245 ；美國系列號 2004/0110941 ；歐洲專利申請?zhí)?1433846 和歐洲專利 0368684 和 0616640 ；W005/035572, W004/101790, W004/081026, W004/058821, W004/003019和W003/002609來獲得結構域抗體及其制備方法的進一步詳細內容，這些文獻的每篇皆通過引用方式全文并入本文。納米抗體是抗體衍生的治療蛋白，其包含天然存在的重鏈抗體的獨特的結構和功能特性。這些重鏈抗體包含單一的可變域(VHH)和2個恒定域(CH2和CH3)。重要地，所克隆和分離的VHH域是非常穩(wěn)定的多肽，其攜帶原始重鏈抗體的完全的抗原結合能力。納米抗體與人類抗體的Vh域具有高度同源性，并且可以進一步被人源化而不喪失任何活性。重要地，納米抗體具有低免疫原性潛力，已經(jīng)使用納米抗體先導化合物在靈長類研究中證實了這一點。納米抗體組合了傳統(tǒng)抗體的優(yōu)點與小分子藥物的重要特征。像傳統(tǒng)抗體一樣，納米抗體顯示出針對它們的靶標的高靶標特異性、高親和性和低內在毒性。然而，像小分子藥物一樣，它們能夠抑制酶并容易地接觸受體縫隙。此外，納米抗體是極度穩(wěn)定的，可以通過注射之外的方式來施用(見，例如WO 04/041867，通過引用方式全文并入本文)并且易于制造。納米抗體的其它優(yōu)點包括識別不常見的或隱藏的表位(由于它們的尺寸小)、以高親和力和選擇性結合到蛋白靶標的腔中或活性位點中(由于它們獨特的三維結構)、藥物形式的靈活性、半衰期的調節(jié)(tailoring)和藥物發(fā)現(xiàn)的容易性和速度。納米抗體由單基因編碼，在幾乎所有原核和真核宿主中高效產(chǎn)生，所述宿主例如大腸桿菌(見，例如US 6，765，087，通過引用方式全文并入本文)、霉菌[例如曲霉屬 (Aspergillus)或木霄屬(Trichoderma)]禾口酵母[例如酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)或畢赤酵母屬(Pichia)](見，例如US 6，838，254，通過引用方式全文并入本文)。生產(chǎn)過程可以按比例擴大，已經(jīng)生產(chǎn)了數(shù)量為數(shù)千克的納米抗體。由于納米抗體顯示出相對于傳統(tǒng)抗體的優(yōu)越的穩(wěn)定性，所以它們可以被配制為長保質期、即用型的溶液。納米克隆(nanoclone)方法(見例如WO 06/079372，通過引用方式全文并入本文)是用于產(chǎn)生針對需要的靶標的納米抗體的專利方法，其是基于自動化的高通量選擇B 細胞，并且可以被用于本發(fā)明的情境中。UniBody是另一種抗體片段技術；然而其是基于去除IgG4抗體的鉸鏈區(qū)的。鉸鏈區(qū)的缺失產(chǎn)生基本上是傳統(tǒng)的IgG4抗體一半大小的分子，并且具有單價結合區(qū)，而不是如 IgC4抗體的二價結合區(qū)。還公知的是IgG4抗體是惰性的，因此不與免疫系統(tǒng)相互作用，這對于治療無需免疫應答的疾病是有利的，并且該優(yōu)點被傳遞給UniBody。例如，UniBody可以發(fā)揮抑制或沉默而不殺死與其結合的細胞的功能。另外，UniBody與癌細胞的結合不刺激它們增殖。此外，由于UniBody是傳統(tǒng)IgG4抗體的大約一半大小，所以它們可顯示出在較大的實體腫瘤上的更好的分布，具有潛在的有利功效。UniBody以類似于完整IgG4抗體的速率從身體中被清除，并且能夠以類似于完整抗體的親和力結合其抗原?？梢酝ㄟ^參考專利申請W02007/059782獲得關于UniBody的進一步詳細內容，該文獻通過引用方式全文并入本文。AfTibody分子代表基于58個氨基酸殘基的蛋白結構域的一類新的親和蛋白，其衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG結合性結構域之一。這種三螺旋束結構域已經(jīng)被用作支架以構建組合型嗜菌粒文庫，可以使用噬菌體展示技術從所述文庫中選擇靶向所需分子的 Affibody 變體(Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, NygrenPA, Binding proteins selected from combinatorial libraries ο fan α -helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol1997 ; 15 :772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Humanimmunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002 ；269 :2647-55)。 Affibody分子簡單、堅實的結構結合其低分子量(6kDa)使其適合于多種應用，例如，作為檢測試齊Ll (Ronmark J, Hansson M, Nguyen Τ, et al, Construction and characterization of affibody-Fcchimeras produced in Escherichia coli， J Immunol Methods2002 ； 261 :199-211)以及用于抑制受體相互作用(Sandstorm K，Xu Z，F(xiàn)orsberg G，Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80co_stimulation signal by a CD28_binding Affibody liganddeveloped by combinatorial protein engineering，Protein Eng2003 ； 16 691-7)?？梢酝ㄟ^參考美國專利號5831012獲得關于Affibody及其生產(chǎn)方法的進一步的詳細內容，該文獻通過引用方式全文并入本文。經(jīng)標記的Affibody也可用于測定同種型豐度的成像應用中。DARPin(設計的錨蛋白重復蛋白)是已經(jīng)被開發(fā)用于利用非抗體多肽的結合能力的抗體模擬DRP(設計的重復蛋白)技術的一個實例。重復蛋白(例如錨蛋白或富含亮氨酸的重復蛋白)是普遍存在的結合性分子，與抗體不同，其存在于細胞內和細胞外。它們獨特的模塊架構的特征在于重復性的結構單元(重復)，這些重復性的結構單元堆積在一起以形成延長的、顯示出可變和模塊靶標結合表面的重復結構域?；谶@種模塊性，可以產(chǎn)生具有高度多樣性的結合特異性的多肽的組合型文庫。該策略包括顯示可變表面殘基的自我相容的重復的共有設計，以及將它們隨機組裝到重復結構域中?？梢栽诩毦磉_系統(tǒng)中以非常高的產(chǎn)率產(chǎn)生DARPin，它們屬于已知的最穩(wěn)定的蛋白。已經(jīng)選擇了針對多種靶蛋白(包括人類受體、細胞因子、激酶、人類蛋白酶、病毒和膜蛋白)的高特異性、高親和力的DARPin?？梢垣@得具有單數(shù)位nM至pM范圍的親和力的 DARPin。DARPin已被用于廣泛的應用中，包括ELISA、夾心式ELISA、流式細胞術分析 (FACS)、免疫組化(IHC)、芯片應用、親和純化或蛋白質印跡。還證明了 DARPin在細胞內區(qū)室中具有高度活性，例如作為融合至綠色熒光蛋白(GFP)的細胞內標志物蛋白。DARPin還被用于以PM范圍內的IC50抑制病毒的進入。DARPin不僅對于阻斷蛋白-蛋白相互作用是理想的，而且還抑制酶。已經(jīng)成功抑制了蛋白酶、激酶和轉運蛋白，常常是變構抑制模式。 在腫瘤上非常快的和特異性的富集和非常有利的腫瘤與血液的比例使DARPin非常適合于體內診斷或治療方法。關于DARPin和其它DRP技術的其它信息可見于美國專利申請公開號 2004/01320 和國際專利申請公開號WO 02/20565，二者均通過引用方式全文并入本文。Anticalin是另一種抗體模擬技術，然而在該情況下，結合特異性源自 lipocalin，其是在人組織和體液中天然且豐富表達的低分子量蛋白家族。Lipocalin已經(jīng)進化為在體內執(zhí)行多種與化學上敏感的或不可溶的化合物的生理學轉運和儲存相關的功能。Lipocalin具有堅實的內在結構，包含高度保守的β -桶，其在蛋白的1個末端支持4個環(huán)。這些環(huán)形成進入結合袋的入口，并且分子的該部分中的構象差異解釋了單個的 1 ipocal in之間結合特異性的差異。雖然由保守的片層框架支持的高變環(huán)的總體結構暗示其是免疫球蛋白，但是 lipocalin與抗體在大小方面具有顯著差異其由160-180個氨基酸的單一多肽鏈組成，其略微大于單一的免疫球蛋白結構域?？寺×?Lipocalin并使它們的環(huán)經(jīng)歷工程化以產(chǎn)生Anticalin。已經(jīng)產(chǎn)生了結構上多樣的Anticalin的文庫并且Anticalin展示允許選擇和篩選結合功能，然后在原核或真核系統(tǒng)中表達并產(chǎn)生可溶性蛋白用于進一步的分析。研究已經(jīng)成功地表明了可以開發(fā)并分離特異于幾乎任意人類靶蛋白的Anticalin，并且可以獲得nM或更高范圍的結合親和力。Anticalin也可以被制為雙靶向蛋白的形式，即所謂的Duocalin。Duocalin結合使用標準制造方法容易地產(chǎn)生的一個單體蛋白中的兩個單獨的治療靶標，并且保持靶標特異性和親和性，與其兩個結合結構域的結構方向無關。通過單一分子調整多個靶標在已知涉及多于一個單一誘因的疾病中是特別有利的。此外，雙或多價結合形式(例如Duocalin)具有靶向疾病中的細胞表面分子、介導對于信號轉導途徑的激動效應或誘導增強的內吞效應(通過結合并簇集細胞表面受體)的巨大潛力。此外，Duocalin的高內在穩(wěn)定性與單體Anticalin是相當?shù)模@為Duocalin提供了靈活的配制和遞送潛在可能性。關于Antical in的其它信息可以見美國專利號7，250，297和國際專利申請公開號 WO 99/16873，二者均通過引用方式全文并入本文。用于本發(fā)明的情境中的另一種抗體模擬技術是Avimer。Avimer是通過體外外顯子改組和噬菌體展示而由人細胞外受體結構域的大家族進化來的，其產(chǎn)生具有結合和抑制特性的多結構域蛋白。已經(jīng)表明連接多個獨立的結合結構域會產(chǎn)生親和力并產(chǎn)生與常規(guī)的單表位結合蛋白相比改進的親和力和特異性。其它潛在優(yōu)點包括在大腸桿菌中簡單并有效產(chǎn)生多靶標-特異性分子，改進的熱穩(wěn)定性和對于蛋白酶的抗性。已經(jīng)獲得了針對多種靶標的亞nM的親和力的Avimer。關于Avimer的其它信息可以見美國專利申請公開號2006/(^86603， 2006/0234299,2006/0223114,2006/0177831,2006/0008844,2005/0221384,2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756,這些文獻全部通過引用方式全文并入本文。Versabody是另一種可用于本發(fā)明的情境中的抗體模擬技術。Versabody是具有 > 15%的半胱氨酸的3-5kDa的小蛋白，其形成高的二硫化物密度支架，替代通常的蛋白質具有的疏水性核心。將大數(shù)目的疏水性氨基酸(構成疏水性核心)替換為小數(shù)目的二硫化物導致產(chǎn)生更小的、更加親水的(更少的聚集和非特異性結合)、對于蛋白酶和熱的抗性更高并且具有更低密度的T-細胞表位的蛋白，因為對于MHC呈遞貢獻最大的殘基是疏水性的。公知所有這4個特征影響免疫原性，并且預期它們聯(lián)合起來會引起免疫原性的大幅降低。Versabody的啟迪來源于由水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蝸牛和銀蓮花屬(anemone)產(chǎn)生的天然的可注射的生物藥物，這些藥物已知顯示出出人預料的低免疫原性。從所選擇的天然蛋白家族出發(fā)，通過設計并通過篩選尺寸、疏水性，蛋白水解性抗原加工，而使表位密度最小化至遠低于天然可注射蛋白的平均水平。鑒于Versabody的結構，這些抗體模擬物提供了多方面的形式，包括多價性、多特異性、多種半衰期機制、組織靶向模塊以及不存在抗體Fc區(qū)。此外，Versabody是在大腸桿菌中以高產(chǎn)率制備的，由于它們的親水性和小的尺寸，Versabody是高度可溶的并且可以被配制為高濃度。Versabody具有格外的熱穩(wěn)定性(它們可以被煮沸)并且提供延長的保質期。關于Versabody的其它信息可以見美國專利申請公開號2007/0191272，該文獻通過引用方式全文并入本文。以上提供的關于抗體片段和抗體模擬技術的詳細描述不是意在窮舉所有的可用于本說明書的情境的技術。例如，并且也不是以限制的方式有多種其它的技術可被用于本發(fā)明的情境中，所述技術包括備選的基于多肽的技術，例如互補決定區(qū)的融合，如 Qui et al.，NatureBiotechnology，25 (8) 921-9 Q007)(通過引用方式全文并入本文) 所概述的；以及基于核酸的技術(例如RNA適體技術，其描述于美國專利號5，789，157、 5，864，026,5，712，375,5，763，566,6，013，443,6，376，474,6，613，526,6，114，120, 6，261，774和6，387，620中(全部通過引用方式并入本文))。藥物組合物在另一個方面，本發(fā)明提供了組合物，例如藥物組合物，其包含與藥學上可接受的載體一起配制的一種或組合的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結合部分。此類組合物可以包括一種或組合的(例如兩種或更多種不同的)本發(fā)明的抗體或免疫綴合物或雙特異性分子。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以包含結合靶抗原上的不同表位或具有互補活性的抗體 (或免疫綴合物或雙特異性物質)的組合。本發(fā)明的藥物組合物還能夠以組合治療(即與其它試劑相組合)的方式被施用。 例如，組合治療可包括本發(fā)明的抗鈣粘素-17抗體，其與至少一種其它抗腫瘤試劑、或者抗炎或免疫抑制試劑組合。可以用于組合治療的治療劑的實例在下文中關于本發(fā)明的抗體的用途部分有更詳細的描述。如本文中所使用的，“藥學上可接受的載體”包括生理上相容的任意的和所有的溶齊 、分散介質、包被物、抗細菌和抗真菌試劑、等滲和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，所述載體適合于靜脈內、肌肉內、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(例如通過注射或輸注)。取決于施用途徑，可以將活性化合物(即抗體、免疫綴合物或雙特異性分子)包被于材料內以保護化合物免受酸和其它可能滅活該化合物的天然條件的作用。本發(fā)明的藥物化合物可以包括一種或多種藥學上可接受的鹽。“藥學上可接受的鹽”是指保持親本化合物的所需生物學活性并且不賦予任何不希望的毒理學效應的鹽(見例如Berge, S. M.，et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66 :1_19)。此類鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括衍生于非毒性無機酸(例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、 亞磷酸等)的那些，以及衍生自非毒性的有機酸(例如脂肪族單和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等)的那些。堿加成鹽包括衍生自堿土金屬(例如鈉、鉀、鎂、鈣等)的那些，以及衍生自非毒性有機胺(例如N，N' -二芐乙烯二胺、 N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等)的那些。本發(fā)明的藥物組合物還可以包含藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；( 油溶性抗氧化劑，例如維生素C棕櫚酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯 (BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。可用于本發(fā)明的藥物組合物中的適宜的水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、 多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適宜的混合物；植物油，例如橄欖油；和可注射的有機酯，例如油酸乙酯?？梢岳缤ㄟ^使用包被物質(例如卵磷脂)、通過維持需要的顆粒大小(在分散液的情況下)和通過使用表面活性劑來維持合適的流體性。這些組合物還可以包含佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可以通過滅菌程序(見上文)和通過包括多種抗細菌和抗真菌試劑(例如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、 苯酚山梨酸等)來確保防止微生物的存在。還可能需要向組合物中加入等滲劑，例如糖、氯化鈉等。另外，可以通過加入延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現(xiàn)可注射藥物形式的延長的吸收。藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液，和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。此類介質和試劑在藥學活性物質中的用途是本領域已知的。除非任何常規(guī)介質或試劑達到與活性化合物不相容的程度，其在本發(fā)明的藥物組合物中的使用均被考慮到。也可以向組合物中整合補充性活性化合物。治療組合物通常在制造和儲存條件下必須是無菌的和穩(wěn)定的。組合物可以被配制為溶液、微乳液、脂質體或其它適合于高藥物濃度的有序結構。載體可以是溶劑或分散介質，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及適宜的它們的混合物?？梢岳缤ㄟ^使用包被物質(例如卵磷脂)，通過維持所需的顆粒大小(在分散液的情況下)和通過使用表面活性劑來維持合適的流體性。在很多情況下，優(yōu)選使組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在所述組合物中包括延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來實現(xiàn)可注射組合物的延長的吸收。無菌可注射溶液可以這樣制備將所需量的活性化合物加入到合適的溶劑與一種或組合的上文所列成分(根據(jù)需要)中，然后滅菌微過濾。一般地，通過將活性化合物加入到含有基本分散介質和來自上述的所需其它成分的無菌媒介中來制備分散劑。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其由之前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分的粉末加上任何其它所需的成分?？梢耘c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將根據(jù)被治療的受試者和特定的施用模式而變化。可以與載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效應的組合物的量。一般地，在100%中，此量的范圍是大約0. 01%至大約99%的活性成分，優(yōu)選大約0. 1 %至大約70 %，最優(yōu)選大約1 %至大約30 %的活性成分與藥學上可接受的載體的組合。將劑量方案調整為提供最佳的所需應答(例如治療應答)。例如，可以施用單一推注，可以在一定時間內施用數(shù)次經(jīng)劃分的劑量，或者可以根據(jù)治療狀況的緊急性所顯示的而按比例減少或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制為單元劑型以便容易施用和用于劑量的均一性。如本文中所使用的，單元劑型是指適合作為用于待治療的受試者的單元化劑量的物理上不連續(xù)的單元；每個單元包含預定量的活性化合物(計算為產(chǎn)生所需的治療效應)與所需的藥學載體相聯(lián)合。本發(fā)明的單元劑型的規(guī)格由下列規(guī)定并直接依賴于下列(a)活性化合物的獨特特征和待實現(xiàn)的特定治療效應；和(b)組合領域中內在的限制，例如用于治療個體中的敏感性的活性化合物。對于抗體的施用，劑量范圍為大約0. 0001至100mg/kg，更通常是0. 01至5mg/kg 的宿主體重。例如，劑量可以是0. 3mg/kg體重、lmg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或 10mg/kg體重，或在l-10mg/kg的范圍內。示例性的治療方案使得每周施用一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3個月一次或每3至6個月一次。對于本發(fā)明的抗鈣粘素-17抗體，優(yōu)選的劑量方案包括lmg/kg體重或;3mg/kg體重(通過靜脈內施用)， 使用下列給藥安排之一給予所述抗體(i)每4周1次共6劑，然后每3個月1次；(ii)每 3周1次；(iii)3mg/kg體重1次，然后lmg/kg體重每3周1次。在一些方法中，同時施用兩種或更多種具有不同結合特異性的單克隆抗體，在這種情況下，所施用的每種抗體的劑量均在所表明的范圍內。通常多次地施用抗體。單次劑量之間的間隔可以是例如，每周、每月、每三個月或每年。間隔也可以是不規(guī)律的，如通過測量針對患者中的靶抗原的抗體的血液水平所指明的。在一些方法中，將劑量調整為達到大約1-1000 μ g/ml的血漿抗體濃度，在一些方法中是大約25-300 μ g/ml。備選地，可以以緩釋制劑施用抗體，在這種情況下，需要更少頻率的施用。劑量和頻率根據(jù)患者中的抗體的半衰期而變化。一般地，人類抗體顯示出最長的半衰期，其次是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。施用的劑量和頻率可以根據(jù)治療是預防性的還是治療性的而變化。在預防性應用中，在長時間段內以相對不經(jīng)常的間隔施用相對低的劑量。一些患者在其余生持續(xù)接受所述處理。在治療性應用中，有時需要以相對短的間隔施用相對高的劑量，直至減少或終止疾病的進展，優(yōu)選直至患者顯示出疾病癥狀的部分或完全緩解。 此后，可以按照預防性方案向患者施用。本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實際劑量水平可以變化，以獲得有效達到針對特定患者、組合物和施用模式的所需治療性應答而對所述患者無毒性的活性成分的量。 所選擇的劑量水平將取決于多種藥物動力學因素，包括所采用的本發(fā)明的特定成分或其酯、鹽或酰胺的活性，施用途徑，施用時間，所采用的特定化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時間，與所采用的特定成分組合使用的其它藥物、化合物和/或材料，被處理的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康和先前的醫(yī)療史，以及醫(yī)學領域熟知的其它因素。“治療上有效劑量”的本發(fā)明的抗鈣粘素-17抗體優(yōu)選引起疾病癥狀的嚴重性的降低，無疾病癥狀期的頻率和持續(xù)時間的增加，或防止由于疾病折磨而造成的損害或失能。例如，為了治療鈣粘素-17+腫瘤，“治療上有效的劑量”優(yōu)選使細胞生長或腫瘤生長相對于未經(jīng)治療的受試者被抑制至少大約20%，更優(yōu)選至少大約40%，更優(yōu)選至少大約60%，更優(yōu)選至少大約80 %?？梢栽陬A測人類腫瘤中的功效的動物模型系統(tǒng)中評價化合物抑制腫瘤生長的能力。備選地，可以通過測定化合物抑制細胞生長的能力評價組合物的這種性質，此類抑制可以通過本領域技術人員已知的測定法在體外被測量。治療上有效量的治療化合物能夠減小腫瘤大小，或緩解受試者中的癥狀。本領域普通技術人員將能夠基于例如下列因素來確定所述量受試者的尺寸(size)、受試者癥狀的嚴重性以及特定組合物或所選擇的施用途徑?？梢允褂帽绢I域已知的多種方法中的一種或多種通過一種或多種施用途徑來施用本發(fā)明的組合物。如本領域技術人員將理解的，施用途徑和/或模式將根據(jù)需要的結果而變化。用于本發(fā)明的抗體的優(yōu)選施用途徑包括靜脈內、肌肉內、真皮內、腹膜內、皮下、脊椎或其它腸胃外施用途徑，例如通過注射或輸注。如本文中所使用的，短語“腸胃外施用” 的意思是除了經(jīng)腸道和表面施用以外的施用模式，通常通過注射，并且包括但不限于靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、真皮內、腹膜內、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關節(jié)內、 囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。備選地，本發(fā)明的抗體可以通過非腸胃外途徑而被施用，例如表面，表皮或粘膜施用途徑，例如，鼻內，經(jīng)口，經(jīng)陰道，經(jīng)直腸，舌下或表面。可以使用將保護化合物不會快速釋放的載體來制備活性化合物，例如控釋制劑， 包括移植物、透皮貼和微膠囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備此類制劑的很多方法已經(jīng)被專利化或者是本領域技術人員通常已知的。見，例如Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., New York, 1978?？梢允褂帽绢I域已知的醫(yī)療設備來施用治療組合物。例如，在優(yōu)選的實施方式中，可以使用無針頭的皮下注射設備來施用本發(fā)明的治療組合物，例如公開于美國專利號 5，399，163 ；5，383，851 ；5，312，335 ；5，064，413 ；4，941，880 ；4，790，824 ；或 4，596，556 中的設備。用于本發(fā)明的移植物和模塊的熟知的實例包括美國專利號4，487，603，其公開了用于以受控速率分散藥物的可移植的微輸注泵；美國專利號4，486，194，其公開了用于透過皮膚施用藥物的治療設備；美國專利號4，447，233，其公開了以精確的輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國專利號4，447，224，其公開了用于持續(xù)性藥物遞送的可變流可移植輸注裝置；美國專利號4，439，196，其公開了具有多腔隔室的滲透性藥物遞送系統(tǒng)；和美國專利號4，475，196，其公開了滲透性藥物遞送系統(tǒng)。這些專利通過引用方式并入本文。許多其它此類植入物、遞送系統(tǒng)和模塊是本領域技術人員已知的。在一些實施方式中，可以將本發(fā)明的人單克隆抗體配制為確保在體內的適當分布。例如，血腦屏障(BBB)排除許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療性化合物穿越BBB (如果需要)，可以將它們配制于例如脂質體中。關于制造脂質體的方法，見例如美國專利4，522，811 ；5, 374，548 ；和5，399，331。脂質體可以包含一種或多種被選擇性轉運到特定細胞或器官、由此增強靶向的藥物遞送的部分(見，例如V. V. Ranade (1989) J. Clin. Phafmacol.29 :685)。示例性的靶向部分包括葉酸或生物素(見，例如Low等人的美國專利 5,416,016)；甘露糖苷⑴mezawa et al.，(1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 1038)；抗體(P. G. Bloeman et al. (1995)FEBSLett. 357 140 ；M. Owais et al. (1995) Antimicrob. AgentsChemother. 39 180)；表面活性齊[J蛋白 A 受體(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233 134) ；pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 9090)；另外見 K. Keinanen ；Μ. L. Laukkanen(1994)FEBSLett. 346 :123 J. J. Killion ； I. J. Fidler(1994)Immunomethods4 :273。用途和方法本發(fā)明的抗體(尤其是人類抗體)、抗體組合物和方法具有多種體外和體內的診斷性和治療性用途，所述用途涉及診斷和治療鈣粘素-17介導的病癥。在一些實施方式中，可以在體外或離體地向培養(yǎng)物中的細胞施用這些分子，或例如體內向人類受試者施用這些分子，以治療、預防和診斷多種病癥。如本文中所使用的，“受試者”意在包括人和非人動物。非人動物包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類、綿羊、狗、貓、母牛、馬、雞、兩棲類和爬行類。優(yōu)選的受試者包括具有由鈣粘素-17活性介導的病癥的人類患者。所述方法特別適合用于治療具有與異常的鈣粘素-17表達相關的病癥的人類患者。當與另一種試劑一起施用針對鈣粘素-17的抗體時， 可以按照任意順序或同時施用二者。鑒于本發(fā)明的抗體針對鈣粘素-17的特異性結合，本發(fā)明的抗體可被用于特異性地檢測細胞表面上的鈣粘素-17的表達，此外，本發(fā)明的抗體可被用于通過免疫親和純化法純化鈣粘素-17。此外，鑒于鈣粘素-17在腫瘤細胞上表達，本發(fā)明的抗體、抗體組合物和方法可被用于治療具有腫瘤形成性病癥的受試者，例如其特征在于存在表達鈣粘素-17的腫瘤細胞的病癥，包括例如結腸直腸癌。已顯示鈣粘素-17在抗體結合時被內吞(如下面的實施例 10中所示)，因此使得本發(fā)明的抗體能夠被用于任何有效負荷的作用機制中，例如ADC方法、放射免疫綴合物或ADEPT方法。在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體(例如人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)可被用于檢測鈣粘素-17的水平，或在其膜表面上包含鈣粘素-17的細胞的水平，所述水平可以與某些疾病癥狀相關聯(lián)。備選地，抗體可被用于抑制或阻斷鈣粘素-17 的功能，繼而可以與預防或緩解某些疾病癥狀相關聯(lián)，從而暗示鈣粘素-17是所述疾病的介導者。這可以如下實現(xiàn)將樣品和對照樣品與抗鈣粘素-17抗體在允許在所述抗體與鈣粘素-17之間形成復合物的條件下接觸。檢測在抗體與鈣粘素-17之間形成的任何復合物， 并在樣品和對照中進行比較。在另一個實施方式中，最初可以就與體外治療或診斷用途相關的結合活性測試本發(fā)明的抗體(例如人類抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)。例如，可以使用以下實施例中描述的流式細胞術測定法來檢測本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的抗體(例如單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子、免疫綴合物和組合物)在治療和診斷鈣粘素-17相關的疾病中有額外的用處。例如，單克隆抗體、多特異性或雙特異性分子和免疫綴合物可被用于在體內或體外引發(fā)一種或多種下列生物學活性抑制表達鈣粘素-17的細胞生長和/或殺死表達鈣粘素-17的細胞；在存在人效應子細胞的情況下介導表達鈣粘素-17的細胞的吞噬或ADCC ；或阻斷鈣粘素-17配體與鈣粘素-17的結
I=I O在具體的實施方式中，所述抗體(例如單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)在體內被用于治療、預防或診斷多種鈣粘素-17相關的疾病。鈣粘素-17相關的疾病的實例尤其包括表現(xiàn)出結腸直腸癌的人類癌組織。適合于在體內和體外施用本發(fā)明的抗體成分(例如單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫綴合物)的途徑是本領域熟知的，并且可以由本領域普通技術人員選擇。 例如，可以通過注射(例如靜脈內或皮下)施用抗體成分。所使用的分子的適宜劑量將取決于受試者的年齡和重量以及抗體成分的濃度和/或制劑。如上文所述，本發(fā)明的抗-鈣粘素-17抗體可以與一種或多種其它治療劑(例如細胞毒性試劑、放射毒性試劑或免疫抑制劑)共同施用?？贵w可以與試劑(例如免疫復合物)連接或者可以與所述試劑分別施用。在后者的情況下(分別施用)，可以在所述試劑之前、之后或與其并行地施用抗體，或者可以與其它已知的治療(例如抗癌治療例如放射) 共同施用。此類治療劑尤其包括抗腫瘤劑，例如多柔比星(阿霉素)、順鉬、硫酸博來霉素、 卡莫司汀、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺羥基脲，它們自身僅在對患者有毒性或亞毒性的水平才有效。以100mg/kg的劑量每4周1次通過靜脈內施用順鉬，以60-75mg/ml的劑量每21天通過靜脈內施用阿霉素。其它適于與本發(fā)明的抗體共同施用的試劑包括其它用于治療癌癥
(例如胰腺癌或結腸直腸癌)的試劑，例如Avastin ，5FU和吉西他濱。與化療試劑共同
施用本發(fā)明的抗鈣粘素-17抗體或其抗原結合片段提供了通過不同的機制起作用而對人類腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性效應的兩種抗癌試劑。此類共同施用能夠解決由于出現(xiàn)藥物抗性或腫瘤細胞的抗原性變化(這會使它們對于抗體無反應)而產(chǎn)生的問題。靶標特異性效應子細胞(例如與本發(fā)明的成分(例如單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子)連接的效應子細胞)也可用作治療劑。用于靶向的效應子細胞可以是人白細胞，例如巨噬細胞、嗜中性粒細胞或單核細胞。其它的細胞包括嗜酸細胞、天然殺傷細胞和其它攜帶IgG-或IgA-受體的細胞。如果需要，可以從待治療的受試者獲得效應子細胞。靶標特異性效應子細胞可以作為生理上可接受的溶液中的細胞的懸浮液而被施用。所施用的細胞的數(shù)目可以是IO8-IO9的數(shù)量級，但是將根據(jù)治療目的而變化。一般地，所述量將足以獲得在靶細胞(例如表達鈣粘素-17的腫瘤細胞)上的定位，并通過例如吞噬影響細胞殺傷。施用途徑也可以變化。使用靶標特異性效應子細胞的治療可以與用于去除靶細胞的其它技術聯(lián)合進行。 例如，使用本發(fā)明的成分(例如單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子)和/或用這些成分裝備的效應子細胞的抗腫瘤治療可與化療聯(lián)合使用。另外，組合免疫治療可被用于將兩個不同的細胞毒性效應子群體引向腫瘤細胞排斥。例如，連接于抗-Fe-γ RI或抗-CD3的抗鈣粘素-17抗體可與IgG-或IgA-受體特異性結合劑聯(lián)合使用。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子還可被用于調節(jié)效應子細胞上的Fc YR或 Fc γ R水平，例如通過對細胞表面上的受體加帽和清除它們。抗-Fc受體的混合物也可被用于此目的。
也可以在存在補體的情況下使用具有補體結合位點的本發(fā)明的成分(例如單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫綴合物)，所述位點為例如來自IgGl，IgG-2或 IgG-3或IgM的結合補體的部分。在一個實施方式中，可以通過加入補體或含補體的血清來補充以本發(fā)明的結合劑和合適的效應子細胞對包含靶細胞的細胞群體的離體處理?？梢酝ㄟ^補體蛋白的結合來改善使用本發(fā)明的結合劑包被的靶細胞的吞噬。在另一個實施方式中，也可以通過補體來裂解用本發(fā)明的成分(例如單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子) 包被的靶細胞。在另一個實施方式中，本發(fā)明的成分不激活補體。本發(fā)明的成分(例如單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫綴合物)也可以與補體一起施用。在一些實施方式中，本公開物提供了包含抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補體的組合物。當補體位于接近抗體、多特異性或雙特異性分子的位置時，這些組合物可以是有利的。備選地，本發(fā)明的抗體、多特異性或雙特異性分子和補體或血清可以被單獨施用。在本發(fā)明范圍內的還有包含本發(fā)明的抗體成分(例如單克隆抗體、雙特異性或多特異性分子或免疫綴合物)和使用說明書的試劑盒。所述試劑盒還可以包含一種或多種另外的試劑，例如免疫抑制試劑、細胞毒性試劑或放射毒性試劑，或一種或多種另外的本發(fā)明的抗體(例如具有互補活性的、結合鈣粘素-17抗原上的與第一抗體所結合的表位不同的表位的抗體)。因此，可以向以本發(fā)明的抗體成分治療的患者另外施用(在施用本發(fā)明的抗體之前、與之同時或之后)增強或增加抗體的治療效應的另一種治療劑(例如細胞毒性試劑或放射毒性試劑)。在其它實施方式中，可以另外使用調節(jié)(例如增強或抑制)Fcy或FC γ受體的表達或活性的試劑來處理受試者，例如用細胞因子處理受試者。用于在使用多特異性分子進行處理的過程中施用的優(yōu)選細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ (IFN-y)和腫瘤壞死因子(TNF)。本發(fā)明的成分(例如抗體、多特異性和雙特異性分子)也可被用于靶向表達Fc YR 或鈣粘素-17的細胞，例如用于標記此類細胞。對于此類應用，結合劑可以被連接至可以被檢測的分子。因此，本發(fā)明提供了用于離體或在體外定位表達Fc受體(例如Fc γ R或鈣粘素-17)的細胞的方法?？蓹z測的標記物可以是例如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。在具體的實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中的鈣粘素-17抗原的存在的方法，或測量鈣粘素-17抗原的量的方法，所述方法包括使特異性結合鈣粘素-17的單克隆抗體或其抗原結合部分在允許在抗體或其部分與鈣粘素-17之間形成復合物的條件下接觸樣品和對照樣品。然后檢測復合物的形成，其中，樣品與對照樣品相比較，復合物形成的差異表示樣品中鈣粘素-17抗原的存在。在其它實施方式中，本發(fā)明提供了用于治療受試者中由鈣粘素-17介導的病癥的方法，所述病癥為例如人類的癌癥，包括結腸直腸癌。在另一個實施方式中，本發(fā)明的免疫綴合物可以通過將化合物連接至抗體而被用于將所述化合物(例如治療劑、標記物、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制劑等)靶向具有鈣粘素-17細胞表面受體的細胞。例如，抗鈣粘素17抗體可以被綴合于美國專利號6，281，354 和 6，548，530，美國專利公開號 2003/0050331,2003/0064984,2003/0073852 和 2004/0087497，或公開于WO 03/02觀06中的任意毒素化合物。因此，本發(fā)明還提供了用于離體或在體內定位表達鈣粘素-17的細胞的方法(例如使用可檢測的標記物，例如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)。備選地，免疫綴合物可以通過將細胞毒素或放射性毒素靶向鈣粘素-17而被用于殺死具有鈣粘素-17細胞表面受體的細胞。通過下列實施例進一步闡釋了本發(fā)明，下列實施例不應被解釋為進一步的限制。本說明書中引用的所有參考文獻，包括但不限于所有的論文、公開物、專利、專利申請、展示、文本、報告、書稿、宣傳冊、書、互聯(lián)網(wǎng)公布、雜志文章、期刊、產(chǎn)品情況說明書等， 在此通過引用方式全文并入本說明書。關于本文的參考文獻的討論僅僅意在總結它們的作者所作出的論斷，不是承認任何參考文獻構成現(xiàn)有技術，申請人保留對所引用的參考文獻的精確性和妥當性提出質疑的權利。雖然已經(jīng)通過闡釋以及為了清楚理解的目的的實施例的方式對前述發(fā)明進行了一定的詳細描述，但根據(jù)本發(fā)明的教導，對于本領域普通技術人員顯而易見的是，可以不脫離隨附的權利要求的精神或范圍對本發(fā)明作出一定的改變和修飾。
實施例實施例1 構建噬菌體展示文庫通過標準重組方法在細菌中產(chǎn)生了由鈣粘素-17的細胞外結構域的結構域1-2構成的重組蛋白(SEQ ID NO 136)并將其用作抗原進行免疫(見下文)。還通過標準重組方法真核地合成了由鈣粘素-17的全長細胞外結構域構成的重組蛋白(SEQ ID NO 137)并將其用于篩選。免疫和mRNA分離如下構建了用于鑒別結合鈣粘素-17的分子的噬菌體展示文庫。使用弗氏完全佐劑中的IOOyg蛋白(在第0天)以及IOOyg抗原(在第觀天)，用重組的鈣粘素-17抗原 (細胞外結構域的結構域1-2)腹膜內免疫A/J小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor, Me.)。通過眼窩后竇穿刺而獲得小鼠的測試取血。如果通過測試滴度，認為所述滴度是高的(通過ELISA，使用通過親和素固定的生物素化的鈣粘素-17抗原(Reacti-Bind(TM) NeutrAvidin(TM)-包被的聚苯乙烯板，Pierce, Rockford，111.)，在第 70,71 和 72 天用 IOOyg蛋白對小鼠進行加強免疫，隨后處死并實施脾切除術(在第77天)。如果認為抗體的滴度不滿意，在第56天用100 μ g抗原對小鼠進行加強免疫并在第63天進行測試取血。 如果獲得了滿意的滴度，在第98，99和100天用IOOyg抗原對動物進行加強免疫并在第 105天收獲脾臟。在層流凈化罩中收獲脾臟并將其轉移到培養(yǎng)皿中，剪掉并丟棄脂肪和結締組織。 通過來自無菌5cc注射器的活塞、在下列的存在下快速浸漬脾臟1. Oml溶液IK25. Og異硫氰酸胍(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)，29. 3ml 無菌水，1. 76ml 0· 75M 梓檬酸鈉 ρΗ7· 0，2. 64ml 10% 十二燒基肌氨酸鈉(Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.), 0.36ml 2-巰基乙醇(Fisher Scientif ic，Pittsburgh，Pa.)。將此脾臟懸浮物推過18規(guī)格 (gauge)的針頭，直至所有的細胞都被裂解，將粘稠的溶液轉移到微量離心管中。用100 μ 1 溶液D清洗培養(yǎng)皿以回收任何剩余的脾臟。然后將此懸浮物推過22規(guī)格的針頭另外5-10次。將樣品平分到兩個微量離心管中并依次加入下列(每次加入后通過顛倒混合) 50 μ 1 2Μ 乙酸鈉 pH 4. 0,0. 5ml 水飽和酚(FisherScientif ic, Pittsburgh, Pa.)，100 μ 1 氯仿/異戊醇49 1 (FisherScientific，Pittsburgh, Pa.)。振蕩此溶液10秒并在冰上孵育15分鐘。在2-8°C、以14krpm離心20分鐘后，將水相轉移到新鮮的管中。加入同等體積的水飽和酚氯仿異戊醇(50 49 1)，將管振蕩10秒。在冰上孵育15分鐘后，將樣品在2-8°C離心20分鐘，將水相轉移到新鮮的管中并在-20°C用等體積的異丙醇沉淀至少30分鐘。于4°C、以14krpm離心20分鐘后，將上清液吸走，簡短地離心管子并從RNA粒狀沉淀中移除所有痕量的液體。將RNA粒狀沉淀各自溶解在300 μ 1溶液D中，相結合，并用等體積的異丙醇在-20°C沉淀至少30分鐘。在4°C以14krpm將樣品離心20分鐘，如同之前一樣吸走上清液，用100 μ 1冰冷的70%乙醇漂洗樣品。然后，再在4°C以14krpm將樣品離心20分鐘，吸掉70%乙醇溶液，并在真空使RNA粒狀沉淀干燥。將所述粒狀沉淀重懸于100 μ 1無菌的、 經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的水中。通過Α260確定濃度，其中對于40yg/ml的濃度所用的吸光度為1.0。將RNA儲存在_80°C?；パaDNA(cDNA)的制備將如上所述從小鼠脾臟純化的總RNA直接用作模板來制備cDNA。用無菌水將RNA(50y g)稀釋至100μ L，并加入10μ L 130ng/y L的寡核苷酸dT12(在Applied Biosystems Model 392DNA合成儀上合成的)。將樣品在70°C加熱10分鐘，然后在冰上冷卻。在冰上，加入40μ L的5*第一鏈緩沖液(Gibco/BRL, Gaithersburg，Md.)，以及 20 μ L 的 0. IM 二硫蘇糖醇(Gibco/BRL，Gaithersburg, Md.)，10 μ L 的 20mM 脫氧核苷三磷酸(dNTP' s, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)，以及 10 μ L 水。然后將樣品在 37°C溫育 2 分鐘。加入 10 μ L 反轉錄酶(Superscript (TM) II，Gibco/BRL, Gaithersburg, Md.)并繼續(xù)于37°C溫育1小時。將cDNA產(chǎn)物直接用于聚合酶鏈式反應(PCR)。通過PCR擴增抗體基因為了使用PCR擴增基本上所有的H和L鏈基因，選擇了對應于基本上所有已公開的序列的引物。由于H和L的氨基末端的核苷酸序列含有可觀的多樣性，合成了 33種寡核苷酸以作為用于H鏈的5'引物，并且合成了四種寡核苷酸以作為KL鏈的5'引物，如 1997年4月4日遞交的美國專利申請系列號08/835，159中所描述的。每條鏈的恒定區(qū)核苷酸序列僅需要一種用于H鏈的3'引物和一種用于KL鏈的3'引物。對于每種引物對進行了 50yL的反應，其中含有50μπιΟ1的5'引物，50μπιΟ1的 3'弓 I 物，0.25yL Taq DNA 聚合痛(5 單位 / μ L，Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind. ) ,3 μ L cDNA(如所述制備的)，5yL 2mM dNTP，s，5 μ L 含有 MgCl2 的 IO^aq DNA 聚合酶緩沖液(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.),以及 H2O 至 50yL。使用 GeneAmp (R) 9600 熱循環(huán)儀(Perkin Elmer, Foster City, Calif.)進行擴增，用下列的熱循環(huán)程序94°C，Imin ；30 個循環(huán)為94°C 20 秒，55°C 30 秒，和 72°C 30 秒；72°C 6 分鐘；4°C。然后使PCR過程的dsDNA產(chǎn)物經(jīng)受僅使用3’引物的不對稱PCR以基本上僅產(chǎn)生靶基因的反義鏈。對于每種dsDNA產(chǎn)物進行了 100 μ L的反應，其中含有200 μ mol的3'引物，2 μ L 的 ds-DNA 產(chǎn)物，0. 5 μ L Taq DNA 聚合酶，10 μ L 的 2mM dNTP，s，10 μ L 含有 MgCl2的 10*TaqDNA 聚合酶緩沖液(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)，以及 H2O 至 100 μ L0使用了如上所述的相同的PCR程序來擴增單鏈(ss) DNA。通過高效液相色譜和激酶化單鏈DNA來純化單鏈DNA通過加入2. 5體積的乙醇和0. 2體積的7. 5Μ乙酸銨，并在_20°C孵育至少30分鐘而乙醇沉淀H鏈ss-PCR產(chǎn)物和L鏈單鏈PCR產(chǎn)物。通過在Eppendorf離心機中于2_8°C、 以14krpm離心10分鐘而離心DNA粒狀沉淀。小心地吸出上清液，簡短地第二次將管子離心。用移液管移除最后一滴上清液。在真空中以中熱使DNA干燥10分鐘。將H鏈產(chǎn)物匯集到210 μ L水中并將L鏈產(chǎn)物另外匯集到210 μ L水中。通過高效液相色譜(HPLC)純化單鏈DNA，使用的是Hewlett Packard 1090HPLC和Gen-Pak(TM) FAX 陰離子交換柱(Millipore Corp.，Milford, Mass.)。用于純化單鏈DNA的梯度顯示在表1中，爐溫為60°C。在^Onm 處監(jiān)測吸光度。從HPLC洗脫的單鏈DNA以0. 5分鐘的級分被收集。對含有單鏈DNA的級分進行乙醇沉淀，如上文所述進行粒狀沉淀并干燥。將經(jīng)干燥的DNA粒狀沉淀匯集到200 μ L 無菌水中。表1-用于純化ss-DNA的HPLC梯度
權利要求
1.結合人鈣粘素-17上的表位的分離的抗體，所述表位被包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體所識別，其中所述重鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO :38，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45和46中所示的氨基酸序列；且所述輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO :49，47，48，50，51，52，53，54，55，56，57和58中所示的氨基酸序列。
2.包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的分離的抗鈣粘素-17抗體，其中所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)選自SEQ ID NO :38中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :49中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :39中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :50中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :40中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :51中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :35中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :47中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :36中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :48中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :37中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :48中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :41中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :52中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :42中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :53中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :40中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO 54中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :40中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :55中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :43中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :56中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :44中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :55中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ ID NO :45中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :57中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；和SEQ ID NO :46中所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列以及SEQ ID NO :58中所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
3.權利要求1或2的抗體，其中所述抗體為IgGl，IgG2，IgG3或IgG4同種型的全長抗體。
4.前述任一權利要求中的抗體，其中所述抗體選自完整抗體、單克隆抗體、抗體片段、人源化抗體、單鏈抗體、去巖藻糖化抗體、抗體模擬物和雙特異性抗體。
5.權利要求4的抗體，其中所述片段選自UniBody，結構域抗體和納米抗體。
6.權利要求4的抗體，其中所述模擬物選自Affibody，DARPin，Anticalin，Avimer, Versabody 禾口 Duocalin。
7.免疫綴合物，其包含與治療劑相綴合的根據(jù)前述任一權利要求的抗體。
8.權利要求7的免疫綴合物，其中所述治療劑為細胞毒素或放射性同位素。
9.組合物，其包含根據(jù)權利要求1-8中任一項的分離的抗體或其抗原結合部分以及藥學上可接受的載體。
10.分離的核酸分子，其編碼根據(jù)權利要求1-8中任一項的抗體或其抗原結合部分的重鏈或輕鏈。
11.表達載體，其包含權利要求10的核酸分子。
12.宿主細胞，其包含權利要求11的表達載體。
13.用于制備抗鈣粘素-17抗體的方法，所述方法包括下列步驟獲得含有編碼權利要求1-8中任一項的抗體的一種或多種核酸分子的宿主細胞；在宿主細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)所述宿主細胞；提供其中所述一種或多種核酸分子被表達的宿主細胞培養(yǎng)條件；和從宿主細胞或宿主細胞培養(yǎng)物中回收抗體。
14.制造抗鈣粘素-17抗體的方法，其包括下列步驟 用鈣粘素-17肽免疫動物；從所述動物的B細胞回收mRNA ； 將所述mRNA轉變?yōu)閏DNA ；在噬菌體中表達所述cDNA從而使由所述cDNA編碼的抗鈣粘素_17抗體被呈遞在所述噬菌體的表面；選擇呈遞抗鈣粘素-17抗體的噬菌體；從所述所選擇的噬菌體回收編碼所述抗鈣粘素-17免疫球蛋白的核酸分子； 在宿主細胞中表達所述回收的核酸分子；和從所述宿主細胞回收結合鈣粘素-17的抗體。
15.用于治療或預防與表達鈣粘素-17的靶細胞相關的疾病的方法，所述方法包括下列步驟以治療或預防所述疾病的有效量向受試者施用權利要求1-8中任一項的抗鈣粘素-17抗體或其抗原結合部分。
16.權利要求15的方法，其中所述疾病是人類癌癥。
17.權利要求16的方法，其中所述人類癌癥是結腸直腸癌。
18.結合具有SEQID NO :136或137的氨基酸序列的多肽上的表位的分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，所述表位被包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體所識別，其中所述重鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO :38，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45和46中所示的氨基酸序列；并且所述輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO :49，47，48，50，51，52，53，54，55，56，57和58中所示的氨基酸序列。
全文摘要
本公開提供了抗體，包括分離的單克隆抗體，其以高親和性特異性地結合鈣粘素-17。還提供了編碼鈣粘素-17抗體的核酸分子、用于表達鈣粘素-17抗體的表達載體、宿主細胞和方法。還提供了包含鈣粘素-17抗體的雙特異性分子和藥物組合物。公開了用于檢測鈣粘素-17的方法，以及用于治療各種癌癥，包括結腸直腸癌的方法。
文檔編號G01N33/574GK102482353SQ201080023755
公開日2012年5月30日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權日2009年4月20日
發(fā)明者C·羅爾夫, J·A·特雷特 申請人:牛津生物療法有限公司