專利名稱:梅毒螺旋體(tp)抗體檢驗(yàn)試劑盒及其制備和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種基于流式微球載體技術(shù)的梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum ;TP) 抗體檢驗(yàn)試劑盒及其制備和檢測方法,屬于免疫分析醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
梅毒近年來在我國的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢。2010年4月份衛(wèi)生部公布,在全 國27種法定報告的甲、乙類傳染病中發(fā)病數(shù)居前五位的病種依次為病毒性肝炎、肺結(jié)核、 痢疾、梅毒和甲型Hmi流感,其中梅毒排第三位,2009年為第四位,2005年為第五位。梅毒是人體感染蒼白螺旋體后發(fā)生的不僅僅局限于皮膚或生殖系統(tǒng)的慢性全身 性傳染病,主要經(jīng)性接觸、母嬰、血液傳播。目前,檢測感染者血清梅毒螺旋體抗體是診斷梅 毒螺旋體感染的主要辦法,分非特異性反應(yīng)素抗體方法和檢測特異性抗體方法兩大類。甲 苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)(TRUST)和快速血漿反應(yīng)素試驗(yàn)(RPR)試驗(yàn)是目前國內(nèi)采供血機(jī)構(gòu) 篩查獻(xiàn)血者及醫(yī)院初步診斷可以患者的梅毒血清學(xué)方法。TPPA法為確診試驗(yàn),特異性高,但 是成本較高、操作繁瑣、結(jié)果易受主觀判斷影響及不適于批量標(biāo)本檢測。,研究新的快速、簡 便、敏感且特異的診斷方法,對梅毒早期發(fā)現(xiàn)、治療和防止擴(kuò)散有重要意義。流式微球載體技術(shù)是使用流式細(xì)胞術(shù)和高聚分子微球載體檢測生物分子的新技 術(shù)。該技術(shù)在微載體表面進(jìn)行免疫吸附反應(yīng),通過流式細(xì)胞儀測量示蹤物的熒光強(qiáng)度,具有 高靈敏度、分辨率和穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)。另外,使用不同直徑和內(nèi)置熒光的微球載體,可在同一 試管進(jìn)行多價分析,形成高效檢測模式。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于流式微載體技術(shù)的梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒 及其制備和檢測方法,可進(jìn)行包括TP在內(nèi)多價抗體檢測。在檢測方法上有別于以往的固定 態(tài)的凝集、吸附,而是對流動的單個微球逐一高速檢測,具有高靈敏度、特異性和穩(wěn)定性高 的特點(diǎn),適用于梅毒螺旋體篩查和輔助診斷。本發(fā)明的技術(shù)方案一種基于流式微球載體技術(shù)的梅毒螺旋體(TP)抗體檢驗(yàn)試 劑盒,其特征在于試劑盒的組分包括探針包被的微球載體、陰性對照血清、陽性對照血清、 熒光標(biāo)記抗體和樣本稀釋液。其中所述的微球載體是一種高聚分子微球,材質(zhì)是乳膠、硅、樹脂,或可塑性聚合 材料,直徑2-20微米,在其表面以共價鍵歐聯(lián)包被重組TP抗原。熒光標(biāo)記抗體為連接熒光 物質(zhì)的抗人免疫球蛋白抗體,包括(但不限于)羊、兔、鼠、雞抗人免疫球蛋白。一種基于流式微球載體技術(shù)的梅毒螺旋體抗體檢驗(yàn)試劑盒的制備方法,在于1)微球載體的制備重組TP抗原與活化的高聚分子微球按比例混合,2_8°C孵育4 小時以上,用PBS緩沖液洗滌離心后,加入一定濃度的牛血清白蛋白封閉,孵育30分鐘,完 成流式微球載體的制備。2)其它組分的制備陰性對照血清是非TP患者(5-10例)的混合血清,陽性對照血清為經(jīng)確診的TP抗體陽性血清,樣本稀釋液為含有小牛血清白蛋白(1%)的磷酸緩沖液 (PBS)。一種基于流式微球載體技術(shù)的梅毒螺旋體抗體檢驗(yàn)試劑盒的檢測,在于借助流式 細(xì)胞儀檢測對TP抗體定性和定量檢驗(yàn),以及包括TP抗體在內(nèi)的多價檢測。其中定性檢測是用陰性、陽性對照血清為參照,根據(jù)待測樣品的熒光強(qiáng)度判斷感 染與否,強(qiáng)度大于或等于陰性檢測值的2. 1倍時為陽性,小于時為陰性。定量檢測是使用一組已知濃度的陽性對照血清,以此制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,用以對受測 樣本的定量分析。包括TP抗體在內(nèi)指標(biāo)作多價檢測,涉及使用不同直徑和不同內(nèi)置熒光的微球載 體的混合。每種微球載體包被一種探針,可捕獲一種特異性配體,最后使用流式細(xì)胞儀分析 將其區(qū)分。上述所有檢測均借助流式細(xì)胞儀。有益效果本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)行包括TP在內(nèi)的多價抗體檢測,既可定性檢測又 可定量檢測,借助流式細(xì)胞儀及計(jì)算機(jī)技術(shù)間接檢測待測抗體。其在靈敏度、特異性和穩(wěn)定 性是現(xiàn)有技術(shù)所不及的。本發(fā)明經(jīng)53例具有代表性的血清檢驗(yàn)結(jié)果見表1、2,以健康體檢者為對照,F(xiàn)CMA 檢測抗TP-IgG和TP-IgM靈敏度為100%和75. 00%,特異度分別為100%和94. 74%。表1. FCMA檢測血清TP-IgG抗體陽性率 表2. FCMA檢測血清ΤΡ-IgM抗體陽性率
具體實(shí)施例方式1.本發(fā)明所涉及的一種基于流式微球載體法梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒組分實(shí) 施例(1)基因工程重組TP抗原包被的高聚分子球微載體(2)熒光標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體(3)陰性對照血清(4)陽性對照血清
(5)樣本稀釋液2.本發(fā)明所涉及的一種基于流式微球載體法梅毒螺旋體(TP)抗體檢測試劑盒制 備實(shí)施例(1)基因工程重組TP抗原包被的高聚分子球微載體微球載體的材質(zhì)是乳膠、硅、樹脂、苯乙烯,溴苯乙烯,或丙烯酸,丙烯酸胺、甲基丙 烯酸鹽、氯化乙烯、氯化苯乙烯、乙烯醋酸鹽制成的聚亞胺脂和聚合性單體。用基因工程重 組T P抗原包被聚苯乙烯微球,2-8°C卵育4小時以上,PBS洗滌、離心除去未結(jié)合的包被抗 原,再用牛血清封閉白蛋白微球上的空白點(diǎn),制成T P抗原特異性微球載體。(2)熒光標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體熒光標(biāo)記抗體,包括(但不限于)熒光標(biāo)記的羊、兔、鼠抗人IgG、IgM、IgA。熒光 染料包括(但不限于)熒光素異硫氰酸(FITC)、四甲基若丹明、藻紅素蛋白(PE)、Cy-色素、 硫氰酸、葉綠素蛋白、羧基熒光素、碘化物、納米硅及其它生物或化學(xué)熒光染料。(3)陰性對照血清陰性對照血清是健康者的混合血清,可以稀釋一定倍數(shù),例如50、100、500倍。(4)陽性對照血清陽性對照血清為經(jīng)確診的梅毒抗體陽性血清,可以稀釋一定倍數(shù),例如50、100、 500倍。熒光強(qiáng)度大于臨界值,稀釋倍數(shù)與陰性對照血清一致。(5)樣本稀釋液磷酸鹽緩沖液(PBS),pH7. 2 士0. 2 ; 牛血清蛋白;0. 5%疊氮鈉 (NaN3)。3.本發(fā)明所涉及的一種基于流式微球載體法梅毒螺旋體抗體定性、定量及多價檢 測。定性檢測實(shí)施例臨界值(cut-off值)計(jì)算臨界值=陰性對照熒光強(qiáng)度 值X2. 1。測定樣本熒光強(qiáng)度值>臨界值,抗-TP抗體陽性;測定樣本熒光強(qiáng)度值<臨界 值時,抗-TP抗體陰性。定量檢測實(shí)施例方法是在試劑盒中配置4-5個不同濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)血清,例如 10、100、500、1000、2000ng/mL,用流式細(xì)胞儀制作濃度-強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線,橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng) 度,縱坐標(biāo)為血清濃度,以此計(jì)算受測樣本中的TP抗體含量。多價檢測實(shí)施例將不同直徑微米的微球載體,分別包被上特異性抗原,然后將它 們按比例混合,在同一試管同步檢測不同配體。例如,同時測定梅毒、HIV、衣原體和支原體。4.本發(fā)明所涉及的一種基于流式微球載體法梅毒螺旋體(TP)抗體檢測試劑盒檢 測實(shí)施例①設(shè)定空白對照管(只加微球載體)、0標(biāo)準(zhǔn)管(加微球載體和標(biāo)記抗體)、陰性 對照管(加陰性對照血清)、陽性對照管(加陽性對照血清)和若干待測樣本管(加待測樣 本);②給所有管加樣本稀釋液90微升,微球載體10微升。③給陰性對照管和陽性對照管 分別加陰性和陽性對照血清2μ 1(1 50稀釋),給待測樣本管加待側(cè)血清2μ 1(1 50稀 釋),4°C培養(yǎng)30min。④給以上各管加磷酸緩沖液4毫升,離心(3500r/min,5min) 2次,倒棄 上清液。⑤給以上各管(除空白對照管)加羊抗人IgG-FITC(或羊抗人IgM-FITC) 10 μ 1, 4°C培養(yǎng)30min。⑥重復(fù)④一次。⑦給各管加PBS0. 5毫升,上流式細(xì)胞儀檢測。
權(quán)利要求
一種基于流式微球載體技術(shù)的梅毒螺旋體(TP)抗體檢驗(yàn)試劑盒,其特征在于試劑盒的組分包括重組TP抗原包被的微球載體、陰性對照血清、陽性對照血清、熒光標(biāo)記抗體和濃縮樣本稀釋液。
2.權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于微球載體是一種高聚分子微球,材質(zhì)是乳膠、 硅、樹脂,或可塑性聚合材料,直徑2-20微米,并且以共價鍵歐聯(lián)重組TP抗原。
3.權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于熒光標(biāo)記抗體是熒光標(biāo)記的羊、兔、鼠抗人免 疫球蛋白中的一種或是幾種。
4.一種基于流式微球載體技術(shù)的梅毒螺旋體(TP)抗體檢驗(yàn)試劑盒的制備方法,其特 征在于1)微球載體的制備重組TP抗原與活化的高聚分子微球按比例混合,2-8°C溫育4小 時以上,用PBS緩沖液洗滌、離心、棄上清液,加入一定濃度的牛血清白蛋白封閉液,溫育30 分鐘,完成流式微球載體的制備;2)其它組分的制備陰性對照血清是健康人的血清,陽性對照血清為經(jīng)確診的TP抗體 陽性血清,熒光標(biāo)記抗體為羊、兔和鼠抗人免疫球蛋白抗體,樣本稀釋液中含有PBS、小牛血 清白蛋白、疊氮鈉。
5.一種基于流式微球載體技術(shù)的梅毒螺旋體抗體檢驗(yàn)試劑盒的檢測,其特征在于借助 流式細(xì)胞儀檢測對TP抗體定性或定量檢驗(yàn),以及包括TP抗體在內(nèi)的多價檢測。
6.權(quán)利要求5所述的試劑盒的檢測,其特征在于定性檢測是用陰性、陽性對照血清為 參照,根據(jù)待測樣品的熒光強(qiáng)度來定性,強(qiáng)度大于或等于陰性檢測值的2. 1倍時為陽性,小 于時為陰性。
7.權(quán)利要求5所述的試劑盒的檢測,其特征在于定量檢測是使用一組已知濃度的陽性 對照血清,以此制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,用以對受測樣本的定量分析。
8.權(quán)利要求5所述的試劑盒的檢測,其特征在于包括TP抗體在內(nèi)指標(biāo)作多價檢測,涉 及使用不同直徑微球載體和不同內(nèi)置熒光的的混合物,每種微球載體包被一種探針,用該 混合物與血清等樣本在同一試管共培養(yǎng),每種微球載體捕獲一種特異性配體,最后使用流 式細(xì)胞儀分析將其區(qū)分。
9.權(quán)利要求5所述的試劑盒的檢測,其特征在于借助流式細(xì)胞儀檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于流式微球載體技術(shù)的梅毒螺旋體(TP)抗體檢驗(yàn)試劑盒及其制備和檢測方法,屬于免疫分析醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域。具體包括用TP重組抗原包被高聚分子微球,用牛血清白蛋白封閉空白結(jié)合點(diǎn),制成特異性TP探針-高聚分子微球;與待測標(biāo)本共培養(yǎng)捕獲TP抗體,洗滌離心除去未結(jié)合的TP抗體,再加入熒光標(biāo)記的抗人IgG或IgM抗體;使用流式細(xì)胞儀檢測微球的熒光強(qiáng)度,對受測抗體進(jìn)行定性或定量分析。本方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn),并可對標(biāo)本進(jìn)行微量、多價分析。
文檔編號G01N33/571GK101881772SQ20101021504
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月1日
發(fā)明者林遠(yuǎn), 王月華 申請人:南京工業(yè)大學(xué)