專利名稱：一種恩拉霉素完全抗原的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種恩拉霉素完全抗原的合成方法，本發(fā)明屬于有機化學(xué)及免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域， 本發(fā)明合成的恩拉霉素完全抗原用于制備特異性識別化學(xué)獸藥恩拉霉素的抗體和研制高 效快速檢測恩拉霉素微含量的免疫速測試劑盒。
背景技術(shù)：
抗生素發(fā)明以來，不僅在人類疾病的治療和預(yù)防方面效果顯著，同時在畜牧業(yè)飼 料添加劑方面也發(fā)揮著巨大的作用。抗生素對動物的促生長作用是在20世紀(jì)40年代后期 由Stocktadt等人發(fā)現(xiàn)，以后相繼發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、β -內(nèi)酚胺類等抗生素加入 飼料中，都有促進(jìn)生長、增重、增產(chǎn)、提高飼料報酬作用。1950年美國FDA正式批準(zhǔn)允許在飼 料中添加抗生素?？股貙τ谛笄莸纳L和提高生產(chǎn)性能的作用是肯定的，而且很穩(wěn)定，許 多國家的畜禽業(yè)都長期應(yīng)用抗生素添加劑。實踐證明，合理地使用抗生素添加劑能促進(jìn)畜 禽生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率。同時也有報告顯示，不允許在飼料中添加抗生素或其他抗菌促生 長劑的國家，會造成畜牧業(yè)生產(chǎn)成本增加，盈利減少，同時也有可能引發(fā)諸如生態(tài)環(huán)境及國 家之間的貿(mào)易戰(zhàn)等問題。但為了避免由于抗生素的濫用引起耐藥菌株大量繁殖或使藥物在 畜產(chǎn)品中的殘留量增大，對畜禽生長及人體健康造成直接危害，應(yīng)用畜禽專用的抗生素飼 料添加劑已迫在眉睫。只有對其進(jìn)行全面的認(rèn)識并合理的應(yīng)用，提高其應(yīng)用水平，才能充分 發(fā)揮其有利作用又能避免對人類健康造成危害。恩拉霉素，英文名稱=Enramycin ；中文名又稱恩來霉素、恩霉素、安來霉素、持 久霉素，其主要成分是恩拉霉素A =C107H138N26O31C12 R = CH3和恩拉霉素B :C1(18H14(1N26031C12 R = C2H50H。本品是由日本武田藥品研究所于1966年由土壤中分離出來的放線菌 (Streptomyces fungicidiousNO. B5477)經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一種由不飽和脂肪酸和上二種 氨基酸結(jié)合而成的多肽類(Polypepide)抗生素，并因其強大的殺菌作用而被稱之為 Enduracidin0該藥品于1973年正式在日本獲得批準(zhǔn)為抗生素飼料添加劑，應(yīng)用至今；于 1993年該藥在中國登記注冊，并開始應(yīng)用，由于該藥品具有不被腸道降解吸收可保持原有 抗菌活性，臨床試驗時與現(xiàn)有抗生素或抗菌藥間無交叉耐藥性等優(yōu)點，現(xiàn)今應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng) 廣泛，尤其是在雞和豬的飼養(yǎng)中，應(yīng)用形式主要為預(yù)混劑 8%)，2007年使用量已達(dá) 上千噸。作為飼料添加劑恩拉霉素有如下優(yōu)點1.臨床應(yīng)用研究方面，與其他抗生素添加劑相比，用量少的情況下飼料系數(shù)更低， 生長速度更快，并能改善畜牧業(yè)的商品性能。2.藥效學(xué)研究方面，恩拉霉素對主要的革蘭氏陽性菌都具有強大的殺菌作用。恩 拉霉素對乙肝病毒(HBV)抗原有較強的抑制作用，對乙肝e抗原(HBeAg)也有較好的抑制 效果.因此對HBVDNA及抗原都有較好的抑制作用。恩拉霉素與臨床上現(xiàn)有的抗生素或抗 菌藥之間不存在交叉耐藥性。敏感菌幾乎不對恩拉霉素產(chǎn)生耐藥性，在實驗條件下，耐藥性 的產(chǎn)生也非常緩慢，即使出現(xiàn)，耐藥性也不穩(wěn)定，而且極易丟失。
3.藥物殘留研究方面，恩拉霉素內(nèi)服極不易被吸收，藥物主要通過糞便排出體外。4.毒理學(xué)研究方面，恩拉霉素毒性很低；急性毒性實驗表明，恩拉霉素在口服、皮 下或肌肉注射給藥時實際無毒。5.恩拉霉素的鹽酸鹽對熱、光照和潮濕有極好的穩(wěn)定性。恩拉霉素在飼料中具有 很高的穩(wěn)定性，在室溫條件下長期儲藏很少降解，在制成顆粒料過程中也非常穩(wěn)定，與飼料 混合后在室溫下長期儲藏效價下降甚微。恩拉霉素在腸道內(nèi)不被降解，能夠保持原有的抗 菌活性。隨著人們生活水平的提高以及對濫用抗生素的防范意識的提高，逐漸關(guān)注日益廣 泛應(yīng)用的恩拉霉素在殘留量方面的危害，尤其對動物源性食品中的殘留量，為此各國均在 進(jìn)出口貿(mào)易中對其添加劑的成分和含量均有嚴(yán)格限定。目前，酶聯(lián)免疫法(ELISA)基于抗原抗體反應(yīng)和酶化學(xué)反應(yīng)，具有靈敏、快速、簡 便、特異性好、樣品需求少，對昂貴儀器以及專業(yè)操作人員的依賴程度較低等優(yōu)點，非常適 于現(xiàn)場監(jiān)控和樣品的批量檢測，而且酶聯(lián)免疫法的操作過程所需試劑大部分為無機化學(xué)試 劑，且用量較少，因此該法環(huán)境友好型檢測方法。但現(xiàn)在國內(nèi)外尚未有理想的針對恩拉霉素 殘留免疫檢測方法的報道，僅日本厚生省對該項殘留物質(zhì)有畜、水產(chǎn)性食品有常規(guī)檢測技 術(shù)報道。為了彌補這一空白，有必要設(shè)計和制備以恩拉霉素自身為半抗原(僅具有免疫反 應(yīng)性而不具有免疫原性的小分子化合物)與載體蛋白偶聯(lián)形成恩拉霉素既具有免疫原性 又具有免疫反應(yīng)性的完全抗原，在此基礎(chǔ)上才能建立相關(guān)的酶聯(lián)免疫檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種恩拉霉素完全抗原的合成方法，將該完全抗原用于動 物體恩拉霉素殘留量及免疫檢測上，具有檢測快速、操作簡便、成本低的優(yōu)點。本發(fā)明的技術(shù)方案一種恩拉霉素完全抗原的合成方法，以恩拉霉素為半抗原，用 戊二醛法將其與牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶 聯(lián)比；步驟為(1)恩拉霉素完全人工抗原的合成配制A液稱取71. 64g磷酸氫二鈉(Na2HP04 · 2H20)，用重蒸水配制成IOOOmL溶 液，濃度為0. 2mol/L，置于4°C下保存?zhèn)溆?；配制B液稱取31. 21g磷酸二氫鈉(NaH2PCM)，用重蒸水配成IOOOmL溶液，濃度為 0. 2mol/L，置于4°C下保存?zhèn)溆?；配制C液取A液72. OmL,B液28. OmL于250mL三角瓶中，配成pH7. 2的磷酸鹽緩 沖溶液(PBS)，置于4°C下保存?zhèn)溆?；配制D液用移液管吸取0. 25mL戊二醛液體，將其配成IOOmL溶液，得0. 25%的
戊二醛溶液，置于4°C下保存；配制E液配制含碳酸鈉(Na2CO3) 10g/L及乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) lmol/L的堿 性EDTA溶液，置于4°C下保存，以備處理透析袋；稱取恩拉霉素20mg盛于IOOmL錐形瓶中，稱取牛血清蛋白BSA20mg于5號試管中。 向試管中加入C溶液約3mL，待牛血清蛋白BSA完全溶解后轉(zhuǎn)移到有恩拉霉素的錐形瓶中， 再用C溶液洗滌試管，將牛血清蛋白BSA完全移入錐形瓶，共用C溶液10mL。待恩拉霉素基本溶解后，向錐形瓶中加入1，4_ 二氧六環(huán)10mL，混勻。將磁力攪拌器放入反應(yīng)器后把錐形 瓶放在一個含少量水的大燒杯中，再將燒瓶置于25°C水浴，開啟攪拌器，約5min后，保持?jǐn)?拌狀態(tài)，向反應(yīng)器內(nèi)逐滴加入D溶液5mL，滴加完畢后仍保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，反應(yīng)4h，即得恩拉霉 素完全抗原混合液；透析袋前處理取20cm的透析袋，將其置于E溶液中，于沸水中煮沸30min，稍冷 后用蒸餾水沖洗:3min將其洗凈，另取IOOcm長的棉線一根，用其一端將透析袋的一端扎緊， 保證不會漏液，保存在4°C去離子水中備用；透析將恩拉霉素完全抗原混合液由漏斗口轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，且將透析袋封口，懸 于盛有適量蒸餾水的大燒杯中，在4°C冰箱內(nèi)開始透析，透析72h，每天換水2次，最后使用 冷凍干燥法將透析袋中的液體制成粉末，即得到恩拉霉素完全抗原恩拉霉素-牛血清白 蛋白；(2)恩拉霉素完全抗原的鑒定恩拉霉素完全抗原采用分光光度法鑒定其偶聯(lián)結(jié) 果，利用牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，從曲線上比對得到抗原溶液的蛋白濃度，計算摩 爾吸光系數(shù)數(shù)ε，再測定恩拉霉素完全抗原的偶聯(lián)比。偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，雖然 測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對含量)的原 理建立起來的。分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別測定被 偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光 譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。摩爾吸光系數(shù)ε 用pH = 7. 2的PBS溶液配制恩拉霉素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，通過紫外 掃描可知恩拉霉素的最大吸收波長為278nm，在278nm處測吸光值，每個濃度做平行樣并計 算摩爾吸光系數(shù)ε。偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的牛血清蛋白溶液，采用考馬斯亮藍(lán)測 定法，將每個濃度做平行樣，在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。將 抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的 相應(yīng)的蛋白濃度。偶聯(lián)比測定用pH = 7. 2的PBS溶液配制標(biāo)準(zhǔn)濃度的牛血清蛋白溶液，將偶聯(lián)產(chǎn) 物完全抗原用pH = 7. 2的PBS溶液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度，在278nm處測吸光值，以pH = 7. 2的 PBS溶液為空白，測出牛血清蛋白溶液的吸光值為Al，偶聯(lián)產(chǎn)物的吸光值為A2，則偶聯(lián)比率 r 為 Y = [ (A1-A2) / ε ]/(C/67000)。其中ε為摩爾吸光系數(shù)(Ι^πιοΓ1)，67000為牛血清蛋白的分子量，C為牛血清蛋 白濃度(μΕ'πιΓ1)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明成功合成了恩拉霉素的人工抗原，合成步驟簡潔，有 效，可完全用于免疫分析當(dāng)中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足國內(nèi)對其研 究的需要。
具體實施例方式實施例1(1)恩拉霉素完全抗原的制備
配制A液稱取71. 64g磷酸氫二鈉(Na2HP04 · 2H20)，用重蒸水配制成IOOOmL溶 液，濃度為0. 2mol/L，置于4°C下保存?zhèn)溆?；配制B液稱取31. 21g磷酸二氫鈉(NaH2PCM)，用重蒸水配成IOOOmL溶液，濃度為 0. 2mol/L，置于4°C下保存?zhèn)溆?；配制C液取A液72. OmL,B液28. OmL于250mL三角瓶中，配成pH7. 2的磷酸鹽緩 沖溶液(PBS)，置于4°C下保存?zhèn)溆?；配制D液用移液管吸取0. 25mL戊二醛液體，將其配成IOOmL溶液，得0. 25%的
戊二醛溶液，置于4°C下保存；配制E液配制含碳酸鈉(Na2CO3) 10g/L及乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) lmol/L的堿 性EDTA溶液，置于4°C下保存，以備處理透析袋；稱取恩拉霉素20mg盛于IOOmL錐形瓶中，稱取牛血清蛋白(BSA) 20mg于5號試管 中。向試管中加入C溶液約3mL，待牛血清蛋白(BSA)完全溶解后轉(zhuǎn)移到有恩拉霉素的錐形 瓶中，再用C溶液洗滌試管，將牛血清蛋白(BSA)完全移入錐形瓶，共用C溶液10mL。待恩 拉霉素基本溶解后，向錐形瓶中加入1，4_ 二氧六環(huán)10mL，混勻。將磁力攪拌器放入反應(yīng)器 后把錐形瓶放在一個含少量水的大燒杯中，再將燒瓶置于25°C水浴，開啟攪拌器，約5min 后，保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，向反應(yīng)器內(nèi)逐滴加入D溶液5mL，滴加完畢后仍保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，反應(yīng)4h， 即得恩拉霉素完全抗原混合液；透析袋前處理取20cm的透析袋，將其置于E溶液中，于沸水中煮沸30min，稍冷 后用蒸餾水沖洗:3min將其洗凈，另取IOOcm長的棉線一根，用其一端將透析袋的一端扎緊， 保證不會漏液，保存在4°C去離子水中備用；透析將恩拉霉素完全抗原混合液由漏斗口轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，且將透析袋封口，懸 于盛有適量蒸餾水的大燒杯中，在4°C冰箱內(nèi)開始透析，透析72h，每天換水2次，最后使用 冷凍干燥法將透析袋中的液體制成粉末，即得到恩拉霉素完全抗原恩拉霉素-牛血清白 蛋白；(2)恩拉霉素完全抗原的鑒定恩拉霉素完全抗原采用分光光度法鑒定其偶聯(lián)結(jié) 果，利用牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，從曲線上比對得到抗原溶液的蛋白濃度，計算摩 爾吸光系數(shù)數(shù)ε，再測定恩拉霉素完全抗原的偶聯(lián)比。偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，雖然 測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對含量)的原 理建立起來的。分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別測定被 偶聯(lián)的兩種分子濃度，在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光 譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。摩爾吸光系數(shù)ε 用pH = 7. 2的PBS溶液配制恩拉霉素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，通過紫外 掃描可知恩拉霉素的最大吸收波長為278nm，在278nm處測吸光值，每個濃度做平行樣并計 算摩爾吸光系數(shù)ε。偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的牛血清蛋白溶液，采用考馬斯亮藍(lán)測 定法，將每個濃度做平行樣，在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。將 抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的 相應(yīng)的蛋白濃度。
偶聯(lián)比測定用pH = 7. 2的PBS溶液配制標(biāo)準(zhǔn)濃度的牛血清蛋白溶液，將偶聯(lián)產(chǎn) 物完全抗原用pH = 7. 2的PBS溶液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度，在278nm處測吸光值，以pH = 7. 2的 PBS溶液為空白，測出牛血清蛋白溶液的吸光值為Al，偶聯(lián)產(chǎn)物的吸光值為A2，則偶聯(lián)比率 r 為■· Y = [ (A1-A2) / ε ]/(C/67000)。其中ε為摩爾吸光系數(shù)(Ι^πιοΓ1)，67000為牛血清蛋白的分子量，C為牛血清蛋 白濃度(μΕ'πιΓ1)。
權(quán)利要求
1.恩拉霉素完全人工抗原的合成配制A液稱取71. 64g磷酸氫二鈉(Na2HPO4 · 2H20)，用重蒸水配制成IOOOmL溶液，濃 度為0. 2mol/L，置于4°C下保存?zhèn)溆?；配制B液稱取31. 21g磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，用重蒸水配成IOOOmL溶液，濃度為 0. 2mol/L，置于4°C下保存?zhèn)溆?；配制C液取A液72. OmL,B液28. OmL于250mL三角瓶中，配成pH7. 2的磷酸鹽緩沖溶 液(PBS)，置于4°C下保存?zhèn)溆?；配制D液用移液管吸取0. 25mL戊二醛液體，將其配成IOOmL溶液，得0. 25 %的戊二 醛溶液，置于4°C下保存；配制E液配制含碳酸鈉(Na2CO3) 10g/L及乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) lmol/L的堿性 EDTA溶液，置于4°C下保存，以備處理透析袋；稱取恩拉霉素20mg盛于IOOmL錐形瓶中，稱取牛血清蛋白BSA20mg于5號試管中。向 試管中加入C溶液約3mL，待牛血清蛋白BSA完全溶解后轉(zhuǎn)移到有恩拉霉素的錐形瓶中，再 用C溶液洗滌試管，將牛血清蛋白BSA完全移入錐形瓶，共用C溶液10mL。待恩拉霉素基本 溶解后，向錐形瓶中加入1，4_ 二氧六環(huán)10mL，混勻。將磁力攪拌器放入反應(yīng)器后把錐形瓶 放在一個含少量水的大燒杯中，再將燒瓶置于25°C水浴，開啟攪拌器，約5min后，保持?jǐn)嚢?狀態(tài)，向反應(yīng)器內(nèi)逐滴加入D溶液5mL，滴加完畢后仍保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，反應(yīng)4h，即得恩拉霉素 完全抗原混合液；透析袋前處理取20cm的透析袋，將其置于E溶液中，于沸水中煮沸30min，稍冷后用 蒸餾水沖洗:3min將其洗凈，另取IOOcm長的棉線一根，用其一端將透析袋的一端扎緊，保證 不會漏液，保存在4°C去離子水中備用；透析將恩拉霉素完全抗原混合液由漏斗口轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，且將透析袋封口，懸于盛 有適量蒸餾水的大燒杯中，在4°C冰箱內(nèi)開始透析，透析72h，每天換水2次，最后使用冷凍 干燥法將透析袋中的液體制成粉末，即得到恩拉霉素完全抗原恩拉霉素-牛血清白蛋白；
2.恩拉霉素完全人工抗原的鑒定恩拉霉素完全人工抗原采用分光光度法鑒定其偶 聯(lián)結(jié)果，利用牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，從曲線上比對得到抗原溶液的蛋白濃度，計 算摩爾吸光系數(shù)數(shù)ε，再測定恩拉霉素完全人工抗原的偶聯(lián)比。
全文摘要
一種恩拉霉素完全抗原的合成方法，屬于有機化學(xué)及免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以恩拉霉素為半抗原，用戊二醛法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。本發(fā)明成功合成了恩拉霉素的人工抗原，合成步驟簡潔，有效，完全用于酶免疫分析，為相關(guān)的酶免疫分析的檢測快速、操作簡便、降低成本提供技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號G01N33/53GK102079786SQ20101055643
公開日2011年6月1日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者嚴(yán)玉寶, 余華, 葉健強, 周岷江, 崔鵬博, 廖黨金, 文豪, 曹冶, 李江凌, 李紅, 胡娟, 謝晶, 趙素君, 陳世界 申請人:嚴(yán)玉寶, 余華, 葉健強, 周岷江, 崔鵬博, 廖黨金, 文豪, 曹冶, 李江凌, 李紅, 胡娟, 謝晶, 趙素君, 陳世界