專利名稱：快速檢測單純皰疹病毒i型的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種引起人類多種疾病病原體基因檢測技術(shù)，尤其涉及一種快速檢測 單純皰疹病毒I型熒光定量PCR試劑盒，適用于單純皰疹病毒I型的定性定量檢測。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(Herpse simplex virus，HSV)是一類嚴重危害人類健康、引起人類 多種疾病的常見病原體。HSV有HSVl和HSV2兩個亞型，兩個亞型的核苷酸同源性達50%， 而感染方式和臨床表現(xiàn)卻不相同。HSVl主要通過口腔分泌物的接觸而感染，人群感染率高達50 90%，最常見的感 染部位是口腔和唇，可引起原發(fā)感染，且可造成潛伏感染和復(fù)發(fā)。HSVl原發(fā)感染常引起口 咽部皰疹、皰疹性角膜結(jié)膜炎、腦炎和皮膚皰疹性濕疹等；HSVl潛伏感染位于三叉神經(jīng)節(jié) 和頸上神經(jīng)節(jié)部位，潛伏病毒可被激活轉(zhuǎn)為增殖性感染，病毒沿感覺神經(jīng)纖維軸索下行返 回末梢，在局部上皮細胞內(nèi)增殖，引起局部復(fù)發(fā)性皰疹。近年來隨著口 -生殖器性行為的增 多，HSVl導致的生殖器皰疹正日益增多。因此，準確及時地診斷HSVl對指導臨床治療、評估疾病的發(fā)展和預(yù)后具有重大意 義。近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR, FQ-PCR) 技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強等優(yōu)點在基因表達水平分析(Incetigationof HSV-I, HSV-2, CMV, HHV-6and HHV-8DNA BY real-time PCR in surgicalresection materials of eplepsy patients with mesial temporal lobesclerosis[J]. Journal of the Neurological Sciences. 2008,264 151-156 ；Assessment of bluetongue viraemia in sheep by real-time PCR andcorrelation with viral infectivity. [J]· Journal of the NeurologicalSciences, Available online IOMay 2010)禾口定量檢測 (Quantitativecharacterization of cell transduction by HSV-Iamplicons using flowcytometry and real-time PCR[J]. Journal of the Neurological Sciences2009, 159 :160—166 ；Development of a novel TaqMan real-time PCR assayfordetecting rubella virus RNA. [J]. Journal of the NeurologicalSciences2010,168 :267_271)等 方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當前病毒核酸定量的主要方法，國內(nèi)目前已有關(guān)于丙肝、 乙肝、淋球菌、支原體、衣原體、艾滋病和結(jié)核定量檢測的試劑盒上市。臨床檢測上傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學方法具有靈敏度低、特異性差、假陽性、耗時費 力等缺點；常規(guī)PCR法雖然有簡便、快速、靈敏的優(yōu)勢，但是有不能精確定量和PCR后處理 產(chǎn)生污染導致的假陽性等問題；因此隳待開發(fā)一種精確、靈敏、快速和無污染的臨床檢驗方 法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種快速檢測單純皰疹病毒I型的熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一、PCR 試劑盒該試劑盒包括DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、HSVl標準陽性模板 PMD18-T-HSV1和陰性質(zhì)控標準品；1、DNA 提取液配制0. OlM PBS (28. 94g Na2HPO4 · 12H20, 2. 6g KH2PO4 ·2Η20 加入 1000ml 超凈水混 勻，調(diào)PH到7. 4)；2、熒光定量PCR反應(yīng)液含有單純皰疹病毒I型特異性引物對和熒光探針，1)單純皰疹病毒I型(HSVl)正向引物為5 ‘ -GACGCCATATCCACCACCTTC-3 ‘，反向引物為5' -TGATGTGCGTCGCGTTGTAC-3‘；2)熒光探針序列為 5' -CCACCAACCTGACCGAGTACCCGC-3‘，熒光探針5'端標記報告熒光基團FAM，3'端標記不發(fā)光的淬滅基團標記BHQ，可 以大大減少背景噪音的干擾。3,HSVl標準陽性模板PMD18-T-HSV1是含有單純皰疹病毒I型高度保守基因_糖 蛋白B基因的139個堿基對的核苷酸片段構(gòu)成的PMD18-T載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α
中增殖。4、陰性質(zhì)控標準品 該陰性質(zhì)控標準品為無菌雙蒸水，用于陰性對照。二、PCR試劑盒的制備和檢測方法PCR試劑盒的制備和檢測方法包括下列步驟①配制DNA提取液；②配制熒光定量PCR反應(yīng)液；③配制HSVl標準陽性模板PMD18-T-HSV1 ；④配制陽性定量標準品；⑤配制陰性質(zhì)控標準品；⑥判斷未知樣本的陰陽性應(yīng)用DNA提取液提取未知檢測樣本得到DNA，后再取HSVl陽性定量標準品和陰性 質(zhì)控標準品分別加入裝有熒光定量PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中，然后置于PCR熒光定量儀 中進行反應(yīng)；其中，以陽性定量標準品反應(yīng)曲線作為標準對照，陰性質(zhì)控標準品反應(yīng)曲線作 為陰性對照，以陽性定量標準品反應(yīng)曲線判斷陽性樣本的濃度，從而判斷未知樣本的陰陽 性及濃度。本試劑盒的工作原理在本發(fā)明提供的快速定量檢測單純皰疹病毒I型熒光定量PCR試劑盒中，有標記 了熒光基團的特異性熒光探針，在探針完整時，兩基團在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端 報告基團產(chǎn)生的熒光因為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團淬滅，故體系中沒 有熒光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸， Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性對探針進行切割釋放出報告基團，這樣破壞了兩基團之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，報告基團所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測儀內(nèi) 的熒光計檢測，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對單純皰疹病毒I型的定 量可通過與標準品的循環(huán)域值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中， 熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)個數(shù)，Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小， 起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽性梯度標準模板的Ct值制成 標準曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。 在本發(fā)明提供的檢測單純皰疹病毒I型熒光定量PCR試劑盒中，針對單純皰疹病 毒I型檢測中的特殊性，對不同的靶片段進行反應(yīng)體系，如引物和探針濃度、Mg2+濃度、退火 溫度等的優(yōu)化，并將FQ-PCR技術(shù)(熒光定量PCR技術(shù))和定量檢測系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于 單純皰疹病毒I型定量檢測。通過優(yōu)化方案，反復(fù)實驗，建立了檢測單純皰疹病毒I型熒光 定量PCR方法，并研制出檢測單純皰疹病毒I型熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒的靈敏度可 在每個反應(yīng)體系中檢出10拷貝，可以滿足快速診斷單純皰疹病毒I型的要求。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和積極效果1、定量準確；2、檢測速度快，僅1. 5小時，加上樣品DNA的提取制備，共僅需2小時；3、特異性好，靈敏度高；4、可鑒定檢測單純皰疹病毒I型；5、使用步驟簡單，可重復(fù)性高。本試劑盒可對單純皰疹病毒I型進行快速定性定量檢測，并可替代一直沿用的傳 統(tǒng)的培養(yǎng)法。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步說明。應(yīng)當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克 等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社， 2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。一、關(guān)于制備和檢測方法的實施例1、試劑盒組成與配制①配制DNA提取液DNA提取液組成提取液I 配制 0. OlM PBS (28. 94g Na2HPO4 · 12H20, 2. 6gKH2P04 · 2H20 加入 1000ml 超凈水混勻，調(diào)pH到7. 4)。提取液II 在 pH7. 4Tris-EDTA 緩沖液(ρΗ7· 610mM Tris. HCL，pH8. OlmMEDTA)中， 按照1 100比例加入NP-40混勻后完成配制。將提取液II分裝至5ml凍存管(有蓋透 明管)內(nèi)。分裝量5ml/管。②配制熒光定量PCR反應(yīng)液
a、熒光 PCR IOXBuffer 組成 500mM KClUOOmM Tris-HCl (PH9. 025°C ) U. 0% Triton X-IOO ；
b、熒光定量PCR反應(yīng)液PCR IOXbuffer 5. 0 μ 1，正向引物和反向引物 各 1. 5μ l(10ymol/L)，熒光探針 1. 0 μ 1 (5 μ mol/L)，MgCl25 μ 1 (25mmol/L)，dNTPs 1· 0 μ 1 (10mmol/L)，Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ 1 (5U/ μ 1)，無菌雙蒸水 29. 6 μ 1。③配制HSVl標準陽性模板PMD18-T-HSV濃度為IO9拷貝/ml標準陽性模板PMD18-T-HSV1。④將陽性標準模板系列稀釋為IO8拷貝/ml、107拷貝/ml、106拷貝/ml、105拷貝/ ml、IO4 拷貝 /ml、IO3 拷貝 /ml。⑤配制陰性質(zhì)控標準品該陰性質(zhì)控標準品為無菌雙蒸水。二、關(guān)于試劑盒的應(yīng)用實驗1、使用試劑盒快速檢測單純皰疹病毒I型①用DNA提取液從待測標本中提取HSV1DNA，具體過程如下a、將離心管中液體取500 μ 1轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管中，12000rpm離心5min ；b、棄上清，加入500 μ 1提取液I，12000rpm離心5min ；C、棄上清，加入200 μ 1提取液I，12000rpm離心5min ；d、棄上清，加入50 μ 1提取液II ；e、振蕩混勻，100°C恒溫處理IOmin ；f、12000rpm離心5min，取上清液5 μ 1進行PCR擴增。②對貯存濃度為IO9拷貝/ml標準陽性模板PMD18-T-HSV1進行10倍的系列稀釋， 制備陽性標準品，用紫外分光光度計測定A26tl對標準品定量。將陽性標準模板系列稀釋為 IO8 拷貝 /ml、IO7 拷貝 /ml、IO6 拷貝 /ml、IO5 拷貝 /ml、IO4 拷貝 /ml、IO3 拷貝 /ml。③分別取熒光定量PCR反應(yīng)液各45 μ 1，取①步驟所得HSV1DNA和②步驟稀釋的 HSVl陽性標準模板各5μ 1，并設(shè)陰性對照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測儀 上平行做PCR檢測。循環(huán)條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C 30s, 58°C 40s，5個循環(huán)；94°C 30s, 58°C40s，35個循環(huán)(收集熒光信號)。把熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時 進行，所用熒光為FAM，其吸收波長494nm，發(fā)射波長522nm。④通過比較待測樣品和相應(yīng)標準品的循環(huán)域值Ct值，對待測樣品的起始拷貝數(shù)
進行定量。2、實驗結(jié)果熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，運用儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為 HSVl標準陽性模板IO8拷貝/ml、IO7拷貝/ml、IO6拷貝/ml、IO5拷貝/ml、IO4拷貝/ml、IO3 拷貝 /ml 的 Ct 值分別為 17. 52，20. 64，24. 43，27. 88，30. 69，34. 42 ；陰性對照為 0 或 40 ；反復(fù)重復(fù)試驗3次，得到Ct值進行統(tǒng)計學分析P > 0. 05，數(shù)據(jù)差異無顯著意義，說 明其不同批次之間的檢測結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。從上述實例可以說明，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準確，而且，熒光定 量PCR檢測試劑盒對樣品的檢測僅需2個小時就能完成，而傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)法約需1周左 右才能完成，使用該試劑盒可以大大縮短檢測時間，并且傳統(tǒng)方法不能鑒定區(qū)別檢測單純 皰疹病毒I型和單純皰疹病毒II型。該試劑盒的操作只需1人即可完成整個定量操作過程，一次可檢測32-384個(由定量檢測儀的型號決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費。
權(quán)利要求
一種快速檢測單純皰疹病毒I型的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于包括DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、HSV1標準陽性模板PMD18 T HSV1和陰性質(zhì)控標準品；熒光定量PCR反應(yīng)液含有單純皰疹病毒I型特異性引物對和熒光探針；單純皰疹病毒I型 HSV1正向引物為5′ GACGCCATATCCACCACCTTC 3′，反向引物為5′ TGATGTGCGTCGCGTTGTAC 3′；熒光探針序列為5′ CCACCAACCTGACCGAGTACCCGC 3′，熒光探針5′端標記報告熒光基團FAM，3′端標記不發(fā)光的淬滅基團標記BHQ，可以大大減少背景噪音的干擾，標準陽性模板PMD18 T HSV1是含有單純皰疹病毒I型高度保守基因 糖蛋白B基因的139個堿基對的核苷酸片段構(gòu)成的PMD18 T載體，該載體可在大腸桿菌DH5α中增殖。
2.按權(quán)利要求1所述的PCR試劑盒的制備方法，其特征在于包括下列步驟①配制DNA提取液；②配制熒光定量PCR反應(yīng)液；③配制HSVl標準陽性模板PMD18-T-HSV1；④配制陽性定量標準品；⑤配制陰性質(zhì)控標準品；⑥判斷未知樣本的陰陽性。
3.按權(quán)利要求2所述的PCR試劑盒的制備方法，其特征在于步驟③ HSVl標準陽性模板PMD18-T-HSV1包含的gB基因的核苷酸序列為 GACGCCATATCCACCACCTTCACCACCAACCTGACCGAGTACCCGCTCTCGCGCGTNGACCTGGGGGACTGCATCGGCAAGGACGCCCGCGACGCCATGGACCGCATMTTMGCCCGCAGGTACAACGCGACGCACATMA ； N:G或者T;M:C或者T。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測單純皰疹病毒I型的熒光定量PCR試劑盒，涉及一種引起人類多種疾病病原體基因檢測技術(shù)，適用于單純皰疹病毒I型定性定量檢測。本發(fā)明由DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、HSV1標準陽性模板PMD18-T-HSV1、陰性質(zhì)控標準品組成；熒光定量PCR反應(yīng)液含有單純皰疹病毒I型特異性引物對和熒光探針。本發(fā)明定量準確；檢測速度快；特異性好，靈敏度高；可鑒定檢測單純皰疹病毒I型；使用步驟簡單，可重復(fù)性高。本試劑盒可對單純皰疹病毒I型進行快速定性定量檢測，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。
文檔編號G01N21/64GK101979668SQ20101053396
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者唐景峰, 王業(yè)富, 王維旭, 趙友云 申請人:武漢百泰基因工程有限公司