專利名稱：同步檢測(cè)單純皰疹病毒i型和ⅱ型的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種性傳播疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種同步檢測(cè)單純皰 疹病毒I型和II型熒光定量PCR試劑盒，適用于單純皰疹病毒I型和II型同步定性定量 檢測(cè)。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(Herpse simplex virus，HSV)是一類嚴(yán)重危害人類健康、引起人類 多種疾病的常見(jiàn)病原體。HSV有HSVl和HSV2兩個(gè)亞型，兩個(gè)亞型的核苷酸同源性達(dá)50%， 而感染方式和臨床表現(xiàn)卻不相同。HSVl主要通過(guò)口腔分泌物的接觸而感染。人群感染率高達(dá)50% -90%，最常見(jiàn)的 感染部位是口腔和唇，可引起原發(fā)感染，且可造成潛伏感染和復(fù)發(fā)。HSVl原發(fā)感染常引起口 咽部皰疹、皰疹性角膜結(jié)膜炎、腦炎和皮膚皰疹性濕疹等；HSVl潛伏感染位于三叉神經(jīng)節(jié) 和頸上神經(jīng)節(jié)部位，潛伏病毒可被激活轉(zhuǎn)為增殖性感染，病毒沿感覺(jué)神經(jīng)纖維軸索下行返 回末梢，在局部上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，引起局部復(fù)發(fā)性皰疹。近年來(lái)隨著口 -生殖器性行為的增 多，HSVl導(dǎo)致的生殖器皰疹正日益增多。HSV2則主要通過(guò)性接觸而感染。常潛伏在骶神經(jīng)根區(qū)，可引起生殖器皰疹和新生 兒皰疹，并與女性外陰癌和宮頸癌的發(fā)生有關(guān)；HSV2導(dǎo)致的生殖器皰疹容易復(fù)發(fā)，其復(fù)發(fā) 比HSVl率高5-15倍，是引起人們性心理障礙的主要原因之一，可顯著降低感染者的生活 質(zhì)量；HSV2是人類免疫缺陷病毒(HIV)性傳播的重要協(xié)同輔助因素之一，其感染使HIV感 染的危險(xiǎn)性提高三倍；我國(guó)育齡婦女HSV2的感染率約為2. 5%，孕婦感染HSV2后可導(dǎo)致流 產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒先天異常和新生兒疾病等，嚴(yán)重影響人類優(yōu)生優(yōu)育。因此準(zhǔn)確及時(shí)地診斷和區(qū)分HSVl與HSV2對(duì)指導(dǎo)臨床治療、評(píng)估疾病的發(fā)展和預(yù) 后具有重大意義。臨床檢測(cè)上傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學(xué)方法具有靈敏度低、特異性差、假陽(yáng)性、耗時(shí)費(fèi) 力等缺點(diǎn)；常規(guī)PCR法雖然有簡(jiǎn)便、快速、靈敏的優(yōu)勢(shì)，但是有不能精確定量和PCR后處理產(chǎn) 生污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性等問(wèn)題；因此實(shí)時(shí)熒光定量PCR因其技術(shù)成熟，具有較高的靈敏性和 特異性，已逐步應(yīng)用到臨床中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種同步檢測(cè)單純皰疹 病毒I型和II型的熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一、PCR 試劑盒本試劑盒包括DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、HSVl標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板 PMD18-T-HSVUHSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMDl8-T-HSV2和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；1、DNA 提取液
DNA提取液組成提取液I 配制 0. OlM PBS(28. 94g Na2HP04 · 12Η20，2· 6g KH2P04 · 2H20 加入 1000ml超凈水混勻，調(diào)pH到7. 4)；提取液II 在 pH7. 4Tris-EDTA 緩沖液(ρΗ7· 610mM Tris. HCL，pH8. OlmMEDTA)中， 按照1 100比例加入NP-40混勻后完成配制，將提取液II分裝至5ml凍存管(有蓋透明 管)內(nèi)。分裝量5ml/管。2、熒光定量PCR反應(yīng)液含有單純皰疹病毒I型和II型特異性引物對(duì)和熒光探針單純皰疹病毒I型(HSVl)1)正向引物為 5' -GACGCCATATCCACCACCTTC-3‘，反向引物為5' -TGATGTGCGTCGCGTTGTAC-3‘；2)熒光探針序列為 5' -CCACCAACCTGACCGAGTACCCGC-3‘；熒光探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)HEX，3'端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)標(biāo)記 Eclipse，可以大大減少背景噪音的干擾單純皰疹病毒II型(HSV2)1)正向引物為 5 ‘ GCTTCCTCATCGCGTACCAG-3 ‘，反向引物為5 ‘ -TCCTGCTCCCGCATGTACTC-3 ‘；2)熒光探針序列為 5' -CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG-3‘；熒光探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)標(biāo)記 Eclipse。3、HSVl標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV1是含有單純皰疹病毒I型高度保守基因_GB 基因的139個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的PMDlS-TCm-T載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α
中增殖。HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2是含有單純皰疹病毒II型高度保守基因GB基 因79個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的PMDlS-TCm-T載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α中增殖。4、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品該陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水，用于陰性對(duì)照。二、PCR試劑盒的制備和檢測(cè)方法PCR試劑盒的制備和檢測(cè)方法包括下列步驟①配制DNA提取液；②配制熒光定量PCR反應(yīng)液；③配制HSVl標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV1和HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2 ；④配制陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品；⑤配制陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；⑥判斷未知樣本的陰陽(yáng)性。應(yīng)用DNA提取液提取未知檢測(cè)樣本得到DNA，后再取HSVl陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品、HSV2 陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品分別加入裝有熒光定量PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中，然 后置于PCR熒光定量?jī)x中進(jìn)行反應(yīng)；其中，以陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，陰性 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線作為陰性對(duì)照，以陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線判斷陽(yáng)性樣本的濃度。從而判斷未知樣本的陰陽(yáng)性及濃度。本試劑盒的工作原理在本發(fā)明提供的同步快速定量檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型熒光定量PCR試劑 盒中，有標(biāo)記了熒光基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互 靠近，5'端報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團(tuán)淬滅， 故體系中沒(méi)有熒光信號(hào)的變化。在PCR退火和延伸過(guò)程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引 物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性對(duì)探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)，這 樣破壞了兩基團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定 量檢測(cè)儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對(duì)單純皰疹病 毒I型和II型的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(CT，ThreShold Cycle)相比較得出。CT 值是PCR過(guò)程中，熒光量的積累超過(guò)基底熒光量的循環(huán)個(gè)數(shù)，CT值與起始模數(shù)呈一定比例 關(guān)系，CT值越小，起始模板數(shù)越多，相反，CT值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)模 板的CT值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的CT值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。在本發(fā)明提供的同步檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型熒光定量PCR試劑盒中，針對(duì) 單純皰疹病毒I型和II型檢測(cè)中的特殊性，對(duì)不同的靶片段進(jìn)行反應(yīng)體系，如引物和探針 濃度、Mg2+濃度、退火溫度等的優(yōu)化，并將FQ-PCR技術(shù)(熒光定量PCR技術(shù))和定量檢測(cè)系統(tǒng) 相結(jié)合，將其用于單純皰疹病毒I型和II型同步定量檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立 了同步檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型熒光定量PCR方法，并研制出同步檢測(cè)單純皰疹病毒 I型和II型熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出lOcopies， 可以滿足快速診斷單純皰疹病毒I型和II型的要求。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1、特異性好，靈敏度高，定量準(zhǔn)確；2、檢測(cè)速度快，僅1. 5小時(shí)，加上樣品DNA的提取制備，共僅需2小時(shí)；3、使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高；4、可同步檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型；5、可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣品檢測(cè)。本試劑盒可對(duì)單純皰疹病毒I、II型進(jìn)行快速定性定量檢測(cè)，并可替代一直沿用 的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克 等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社， 2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。一、關(guān)于制備和檢測(cè)方法的實(shí)施例1、試劑盒組成與配制①DNA提取液
提取液I 配制 0. OlM PBS (28. 94g Na2HPO4 · 12H20, 2. 6g KH2PO4 ·2Η20 加入 1000ml 超凈水混勻，調(diào)PH到7. 4)。提取液II 在 pH7. 4Tris-EDTA 緩沖液(ρΗ7· 610mM Tris. HCL，pH8. OlmMEDTA)中， 按照1 100比例加入NP-40混勻后完成配制。將提取液II分裝至5ml凍存管(有蓋透 明管)內(nèi)。分裝量5ml/管。②熒光定量PCR反應(yīng)液(50 μ 1體系)熒光定量PCR 反應(yīng)液包含PCR IOXbuffer 10. 0 μ 1，10 μ mol/L HSVl 正向引 物和反向引物各1. 5μ l，10ymol/L HSV2正向引物和反向引物各1. 5 μ 1，5 μ mol/L HSVl 熒光探針 1. 0 μ 1，5 μ mol/L HSV2 熒光探針 1. 0 μ 1，25mmol/L MgCl27. 0 μ 1, lOmmol/L dNTPsl. 0μ 1,2. 5U/y 1 H0TSTART Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ 1，無(wú)菌雙蒸水 23. 6 μ 1，反應(yīng)液總 體積45 μ 1。其中熒光探針為所示的核苷酸序列，HSVl熒光探針5'端標(biāo)記ΗΕΧ，3'端標(biāo)記 不發(fā)光的淬滅基團(tuán)標(biāo)記Eclipse ;HSV2熒光探針5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基 團(tuán)標(biāo)記Eclipse。③HSVl 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板 PMD18-T-HSV1HSVl標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV1是含有單純皰疹病毒I型高度保守基因gB基 因139個(gè)核苷酸片段構(gòu)成的PMDlS-TCm-T重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α增殖 后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測(cè)A26tl定量并稀釋至IO9Copies/ ml，-20°C保存。貯存濃度為109COpieS/ml，使用前進(jìn)行10倍梯度的系列稀釋。④ HSV2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板 PMD18-T-HSV2HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2是含有單純皰疹病毒II型GB基因79個(gè)核苷酸 片段構(gòu)成的PMDlS-TCm-T重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α增殖后用堿裂解法提 取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測(cè)A26tl定量并稀釋至109COpieS/ml，-20°C保存。 貯存濃度為109COpieS/ml，使用前進(jìn)行10倍梯度的系列稀釋。⑤將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板系列稀釋為IO8拷貝/ml、107拷貝/ml、106拷貝/ml、105拷貝/ ml、IO4 拷貝 /ml、IO3 拷貝 /ml。⑥陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。二、關(guān)于試劑盒的應(yīng)用實(shí)施例1、使用試劑盒同步檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型①在標(biāo)本試管中加入Iml無(wú)菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中， IOOOOg離心lOmin，再重復(fù)洗滌1次。沉淀直接加50 μ 1 DNA提取液充分混勻，沸水浴 IOmin, IOOOOg離心2min,取上清液5 μ 1做PCR反應(yīng)。②將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板系列稀釋為108Cop i es/ml、107Cop ies/ml、lO6Cop ies/ml、 105copies/ml、104cop ies/ml、103cop ies/ml ο③分別取熒光定量PCR反應(yīng)液各45 μ 1，取第①步所得HSV1DNA和第②步稀釋的 HSVl陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板各2. 5 μ 1，取第①步所得HSV2DNA和第②步稀釋的HSV2陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板 各2. 5 μ 1，并設(shè)陰性對(duì)照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測(cè)儀上平行做PCR檢 測(cè)。循環(huán)條件為95°C預(yù)變性300s ；95°C 10s,58°C 40s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。該雙重試劑盒中 HSVl所用的熒光為FAM，其吸收波長(zhǎng)494nm，發(fā)射波長(zhǎng)522nm ；HSV2所用的熒光為R0X，其吸收波長(zhǎng)588nm，發(fā)射波長(zhǎng)608nm。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為 HSVl 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模 108copies/ml、107copies/ml、106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、 103copies/ml 的 CT 值分別為 16. 11，19. 62,22. 33,26. 98,30. 59,34. 02 ；HSV2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模 108copies/ml、107copies/ml、106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml 的 CT 值分別為 16. 71，20. 02，23. 16，27. 35，31. 14，34. 57 ；陰性對(duì)照為 40。反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，得到HSV2值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P > 0. 05，數(shù)據(jù)差異無(wú)顯著意義， 說(shuō)明其不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。從上述實(shí)例可以說(shuō)明，此發(fā)明實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)體系，可以用于HSVl 和HSV2的同步定量檢測(cè)和快速鑒定。在提前處理好臨床樣品的前提下，實(shí)時(shí)TaqMan熒光 定量PCR檢測(cè)只需要花1. 5小時(shí)，而常規(guī)PCR檢測(cè)由于需要PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析，大約需 要4小時(shí)，培養(yǎng)法則需要數(shù)天時(shí)間。而且實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR在擴(kuò)增的同時(shí)以閉管 方式進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光信號(hào)監(jiān)控與分析，從而降低了 PCR產(chǎn)物交叉污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的可能 性，大大加強(qiáng)了檢測(cè)的特異性。TaqMan-MeB探針可以有效鑒別等位基因中單個(gè)堿基的變異。 我們使用陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株，臨床分離株，陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株來(lái)驗(yàn)證了該反應(yīng)體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均 表現(xiàn)出極好的特異性。用本發(fā)明的方法同步檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型具有快速簡(jiǎn)單、靈敏度高、特 異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，具有更加重要的使用價(jià)值。
權(quán)利要求
一種同步檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于包括DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、HSV1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18 T HSV1、HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18 T HSV2和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；熒光定量PCR反應(yīng)液含有單純皰疹病毒I型和II型特異性引物對(duì)和熒光探針；①單純皰疹病毒I型 HSV1正向引物為5′ GACGCCATATCCACCACCTTC 3′，反向引物為5′ TGATGTGCGTCGCGTTGTAC 3′；熒光探針序列為5′ CCACCAACCTGACCGAGTACCCGC 3′；熒光探針5′端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)HEX，3′端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)標(biāo)記Eclipse。②單純皰疹病毒II型 HSV2正向引物為5′ GCTTCCTCATCGCGTACCAG 3′，反向引物為5′ TCCTGCTCCCGCATGTACTC 3′；熒光探針序列為5′ CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG 3′；熒光探針5′端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)標(biāo)記Eclipse。
2.按權(quán)利要求1所述的PCR試劑盒的制備方法，其特征在于包括下列步驟①配制DNA提取液；②配制熒光定量PCR反應(yīng)液；③配制HSVl標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV1和HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2；④配制陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品；⑤配制陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；⑥判斷未知樣本的陰陽(yáng)性。
3.按權(quán)利要求2所述的PCR試劑盒的制備方法，其特征在于步驟③ HSVl標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV1包含的GB基因的核苷酸序列為 GACGCCATATCCACCACCTTCACCACCAACCTGACCGAGTACCCGCTCTCGCGCGTNGACCTGGGGGACTGCATCGGCAAGGACGCCCGCGACGCCATGGACCGCATMTTMGCCCGCAGGTACAACGCGACGCACATMA ； N:G或者T ;M:C或者T。HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2包含的GB基因的核苷酸序列為 GCTTCCTCATCGCGTACCAGCCCCTCCTCAGCAACACGCTCGCCGAGCTGTACGTGCGGGAGTACATGCGGGA GCAGGA。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種同步檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型的熒光定量PCR試劑盒，涉及一種性傳播疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明由DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV1、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；熒光定量PCR反應(yīng)液含有單純皰疹病毒I型和II型特異性引物對(duì)和熒光探針。本發(fā)明特異性好，靈敏度高，定量準(zhǔn)確；檢測(cè)速度快；使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高；可同步檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型；可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣品檢測(cè)。本試劑盒可對(duì)單純皰疹病毒I、II型進(jìn)行快速定性定量檢測(cè)，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101979667SQ201010533949
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者唐景峰, 王業(yè)富, 王維旭, 趙友云 申請(qǐng)人:武漢百泰基因工程有限公司