專(zhuān)利名稱(chēng)：基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及基于量子點(diǎn)熒光多酶聯(lián)合檢測(cè)的酶芯片、 基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)酶反應(yīng)底物的酶芯片及基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)酶活性的酶芯片及其上述酶芯片的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在眾多的早期快速檢測(cè)手段中，生物芯片是近年來(lái)發(fā)展最為迅速并被認(rèn)為最有產(chǎn)業(yè)化前景的一種檢測(cè)器件，它具有非常明顯的優(yōu)點(diǎn)，集成、并行、快速檢測(cè)等等。酶芯片是生物芯片的一種，它是通過(guò)酶分子與相應(yīng)底物的結(jié)合反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，因此具有高專(zhuān)一性、低費(fèi)用、操作安全、便于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)槿梭w的各種生理變化很多與酶反應(yīng)相關(guān)，所以酶芯片可以用于多種疾病的檢測(cè)。γ -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(ALP)等酶活性檢測(cè)是血液化驗(yàn)中常有的指標(biāo)，具有很重要的臨床意義。例如Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的主要功能是參與體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝，且廣泛存在于人體各組織及器官中，以腎臟最為豐富，其次是胰肝等處。在膽汁淤積、炎癥等刺激下肝合成GGT增加，因此大多數(shù)肝膽疾病血清GGT活動(dòng)可有不同程度的增加。酒精性肝硬化及膽汁性肝硬化時(shí)，GGT明顯升高，可達(dá)正常的5 10倍。 重型肝炎、晚期肝硬化，由于微粒體破壞、酶合成減少，GGT因而下降。各種原因引起的肝內(nèi)膽汁淤積、肝外膽道梗阻，GGT均明顯增高，可達(dá)400國(guó)際單位/升以上。肝癌時(shí)，由于癌細(xì)胞逆分化，類(lèi)似胚胎期，此酶的生成增加，故血清GGT也呈中度或高度升高，臨床上也常把此酶作為觀察慢性肝炎伴肝硬化病人是否轉(zhuǎn)為肝癌的參考指標(biāo)。乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶，乳酸脫氫酶存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，其中以腎臟含量較高。急性心肌梗塞發(fā)作后，早期血清中LDH活性升高；肝炎、急性肝細(xì)胞損傷及骨骼肌損傷時(shí)LDH都會(huì)升高。 患活動(dòng)性風(fēng)濕性心臟病、急性病毒性心肌炎、溶血性貧血、腎壞死等病LDH也可升高。堿性磷酸酶是一種磷酸單酯酶，廣泛存在于人體組織和體液中，以骨、肝、乳腺、腸粘膜、腎，胎盤(pán)中。阻塞性黃疸、肝硬化、肝壞死，堿性磷酸酶明顯升高(肝細(xì)胞性黃疸則升高不明顯)；原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌時(shí)堿性磷酸酶亦明顯升高，與癌組織中或癌腫周?chē)渭?xì)胞合成堿性磷酸酶增加有關(guān)；其他腫瘤如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、骨細(xì)胞瘤、骨肉瘤等，堿性磷酸酶增高時(shí)，提示可能有肝臟轉(zhuǎn)移。因此Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)的單一或聯(lián)合檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷(S.L.Liang，D.W.Chan，Clinica Chimica Acta 2007，381，93-97)。由于酶反應(yīng)具有很強(qiáng)的專(zhuān)一性，酶蛋白往往較抗體、抗原或基因蛋白等易于獲得且生物活性相對(duì)穩(wěn)定，酶反應(yīng)的底物一般都是小分子的有機(jī)物，容易獲得、價(jià)格便宜，所以構(gòu)建檢測(cè)酶類(lèi)標(biāo)志物的芯片將更為方便和價(jià)廉，易于促進(jìn)重大疾病早期診斷的普及化和家庭化，從而提高重大疾病的治愈率。在生物芯片的檢測(cè)中，通過(guò)熒光標(biāo)記法進(jìn)行檢測(cè)是常用的方法。目前，應(yīng)用最為普遍的熒光物質(zhì)是有機(jī)染料，在大多數(shù)情況下，由于它們的激發(fā)光譜都較窄，所以很難同時(shí)激發(fā)多種組分，而其熒光特征譜又較寬，并且分布不對(duì)稱(chēng)，這給區(qū)分不同物質(zhì)的熒光帶來(lái)麻煩，因此要同時(shí)檢測(cè)多種組分較為困難。有機(jī)染料最嚴(yán)重的缺陷還是光化學(xué)穩(wěn)定性差，光漂白與光解使每個(gè)染料分子能夠發(fā)出的熒光光子平均數(shù)量不多，光解產(chǎn)物又往往會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生殺傷作用。近年來(lái)，量子點(diǎn)由于其特殊的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)，已成為生化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。與有機(jī)熒光染料相比，量子點(diǎn)有以下優(yōu)點(diǎn)(1)熒光發(fā)射比較穩(wěn)定，其發(fā)光壽命可達(dá) ms級(jí)，且不易被光漂白；(2)熒光發(fā)射強(qiáng)度高，譜峰窄，峰形對(duì)稱(chēng)；(3)發(fā)射波長(zhǎng)隨粒徑的增大而有規(guī)律地紅移，改變粒徑就可獲得多色發(fā)光；(4)其激發(fā)譜在吸收閾值以上幾乎是連續(xù)的，有利于多波長(zhǎng)激發(fā)。因而量子點(diǎn)有望取代有機(jī)染料應(yīng)用于生物芯片。目前量子點(diǎn)已被應(yīng)用于生物芯片的組裝(S. Sabella, G. Vecchio, R. Cingolani, R. Rinaldi, P. P. Pompa, Langmuir，2008，24，13266-13269)，曾有報(bào)道組裝利用熒光原理檢測(cè)蛋白激酶的酶芯片 (C. B. Cohen, Ε. C. Dixon, S. Jeong, Τ. Τ. Nikiforov, Analytical Biochemistry, 1999,273, 89-97)，但所用的熒光物質(zhì)是有機(jī)染料。雖然近幾年量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的報(bào)道不斷增多，但用于檢測(cè)酶類(lèi)疾病標(biāo)記物的研究還未見(jiàn)報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片，該酶芯片可單一檢測(cè)或同時(shí)檢測(cè)兩種以上的酶活性和/或酶反應(yīng)底物的濃度。本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片的制備方法，將量子點(diǎn)與酶檢測(cè)體系構(gòu)建在采用掩膜光刻法制作的基片上，以得到所述的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片。本發(fā)明的再一目的是提供基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片的應(yīng)用，利用基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片進(jìn)行多酶的酶活性和/或酶反應(yīng)底物濃度的同時(shí)綜合檢測(cè)。本發(fā)明的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片是在一具有多個(gè)微室的基片上的每個(gè)用于檢測(cè)的微室中裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系，或裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系，或在所述基片上的不同的用于檢測(cè)的微室中分別裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系和由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系。所述的由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系中，水溶性量子點(diǎn)的摩爾濃度為2. 1 X 10_8 6. 5 X 10_4mol/L，酶反應(yīng)底物的摩爾濃度為8 X 10_5 6 X 10_2mol/ L,輔酶的摩爾濃度為O 8 X l(T2mol/L。所述的由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系中，水溶性量子點(diǎn)的摩爾濃度為2. IX IO-8 6. 5Xl(T4mol/L，酶的濃度為1. 2 X IO3 7. 5 X IO4個(gè)活力單位/L，輔酶的摩爾濃度為O 8 X l(T2mol/L。所述的微室是采用掩膜光刻法在基片上形成的(可參照CN200710177651. 8)，優(yōu)選所述的微室是每個(gè)邊長(zhǎng)都為0. 2 50mm的方形微室，所述微室的數(shù)量沒(méi)有限制。所述的微室底部有一層高分子聚合物。所述的高分子聚合物是明膠、黃原膠、交聯(lián)聚丙烯酰胺、瓊脂和卡拉膠所組成的組中的至少一種。所述的基片是石英或玻璃片。
所述的水溶性量子點(diǎn)為現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品，如可參照CN 200810101429. 4公開(kāi)的方法進(jìn)行制備。所述的水溶性量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)位于400 700納米，量子產(chǎn)率大于20%所述的水溶性量子點(diǎn)優(yōu)選是CdTe量子點(diǎn)、CdTe/CdS量子點(diǎn)、CdTe/CdS/ZnS量子點(diǎn)、CdSe/ZnS量子點(diǎn)、ZnTe量子點(diǎn)或ZnSe量子點(diǎn)。所述的酶反應(yīng)底物選自Y-谷氨酰-3-羧基-對(duì)硝基苯胺、雙甘肽、Y-谷氨酰-a 萘胺、Y —谷氨酰對(duì)硝基苯胺、乳酸正丁酯、L-乳酸、丙酮酸、磷酸對(duì)硝基苯、對(duì)硝基酚磷酸二鈉、磷酸苯二鈉、L-丙氨酸、α -酮戊二酸、氯化乙酰膽堿、氯化膽堿、葡萄糖、對(duì)硝基磷酸苯酯、焦磷酸鈉和膽固醇所組成的組中的至少一種。所述的輔酶是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)(NAD+)或其還原態(tài)(NADH)。所述的酶是Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、膽堿酯酶、膽堿氧化酶、 葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶或堿性磷酸酶。本發(fā)明是通過(guò)掩膜光刻技術(shù)制作酶芯片的基片，在所述基片上得到多個(gè)微室，且在每個(gè)用于檢測(cè)的微室中裝載有一個(gè)由水溶性量子點(diǎn)與酶反應(yīng)底物(有時(shí)進(jìn)一步有輔酶) 構(gòu)成的反應(yīng)體系或由水溶性量子點(diǎn)與酶(有時(shí)進(jìn)一步有輔酶)構(gòu)成的反應(yīng)體系，或在所述基片上的不同的用于檢測(cè)的微室中分別裝載有一個(gè)由水溶性量子點(diǎn)與酶反應(yīng)底物(有時(shí)進(jìn)一步有輔酶)構(gòu)成的反應(yīng)體系和由水溶性量子點(diǎn)與酶(有時(shí)進(jìn)一步有輔酶)構(gòu)成的反應(yīng)體系；通過(guò)待檢測(cè)酶與酶反應(yīng)底物的反應(yīng)或通過(guò)酶與待檢測(cè)酶反應(yīng)底物的反應(yīng)，測(cè)定上述反應(yīng)對(duì)水溶性量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)的影響，從而對(duì)待檢測(cè)酶活性和/或?qū)Υ龣z測(cè)酶反應(yīng)底物濃度的高選擇性的定量檢測(cè)。具體是在含有水溶性量子點(diǎn)的反應(yīng)體系中，或進(jìn)一步還含有輔酶的反應(yīng)體系中，加入一定量的待檢測(cè)酶或待檢測(cè)酶反應(yīng)底物。在檢測(cè)酶活性時(shí)，反應(yīng)體系由水溶性量子點(diǎn)與酶反應(yīng)底物構(gòu)成，有時(shí)反應(yīng)體系中還進(jìn)一步含有輔酶，這樣當(dāng)加入待檢測(cè)酶時(shí)，就會(huì)發(fā)生待檢測(cè)酶與酶反應(yīng)底物的反應(yīng)，該反應(yīng)會(huì)使水溶性量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生變化，通過(guò)水溶性量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的變化量來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)酶活性的高選擇性的定量檢測(cè)；在檢測(cè)酶反應(yīng)底物濃度時(shí)，反應(yīng)體系由水溶性量子點(diǎn)與酶構(gòu)成，有時(shí)反應(yīng)體系中還進(jìn)一步含有輔酶，這樣當(dāng)加入待檢測(cè)酶反應(yīng)底物時(shí)，就會(huì)發(fā)生酶與待檢測(cè)酶反應(yīng)底物的反應(yīng)，該反應(yīng)會(huì)使水溶性量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生變化，通過(guò)水溶性量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的變化量來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)酶反應(yīng)底物濃度的高選擇性的定量檢測(cè)。在基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片時(shí)，由于一個(gè)待檢測(cè)體系(待檢測(cè)酶或待測(cè)酶反應(yīng)底物)對(duì)應(yīng)裝載在一個(gè)用于檢測(cè)的微室中，這樣就可以同時(shí)對(duì)多個(gè)待檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)；并且由于待檢測(cè)酶與待測(cè)酶反應(yīng)底物可分別裝載在所述基片上的不同的用于檢測(cè)的微室中，因此可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)酶活性與待測(cè)酶反應(yīng)底物濃度的檢測(cè)。本發(fā)明的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片的制備方法包括以下步驟(1)高分子聚合物溶液的配制將高分子聚合物溶于水溫為40 80°C的水中得到高分子聚合物溶液，高分子聚合物溶液的濃度為0. 5 10wt% ；(2)基片的制作通過(guò)掩膜光刻技術(shù)在作為酶芯片的基片上得到多個(gè)微室(優(yōu)選方形微室的邊長(zhǎng)為0. 2 50mm)；并在每個(gè)微室中注入步驟(1)配制的高分子聚合物溶液， 冷卻到室溫(高分子聚合物溶液冷卻到室溫時(shí)，在微室底部形成一層高分子聚合物層，具有吸水性)；此處所用的高分子聚合物溶液都是在高溫(40 80°C)時(shí)注入，當(dāng)冷卻到室溫時(shí)，在微室底部形成高分子聚合物層，在下述步驟(8)注入溶液后，高分子聚合物就會(huì)吸水溶脹，并不會(huì)溢出。

(3)配制量子點(diǎn)溶液將水溶性量子點(diǎn)分散在磷酸鹽緩沖液中得到量子點(diǎn)溶液， 量子點(diǎn)溶液中的水溶性量子點(diǎn)的摩爾濃度為1. 3X ΙΟ"7 2. 5X 10_3mol/L ；其中優(yōu)選所使用的磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01摩爾/升，pH值為6. 8 ；(4)配制酶反應(yīng)底物溶液將酶反應(yīng)底物溶解在磷酸鹽緩沖液中得到酶反應(yīng)底物溶液，酶反應(yīng)底物溶液中的酶反應(yīng)底物的摩爾濃度為6X 10_4 3X liTmol/L ；其中優(yōu)選所使用的磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01摩爾/升，pH值為6. 8 ；(5)配制酶溶液將酶溶解在磷酸鹽緩沖液中得到酶溶液，酶溶液中的酶的濃度為3. 6X IO4 2. 8X IO6個(gè)活力單位/L ；其中優(yōu)選所使用的磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01 摩爾/升，PH值為6.8;(6)配制輔酶溶液將輔酶溶解在磷酸鹽緩沖液中得到輔酶溶液，輔酶溶液中的輔酶的摩爾濃度為0 5X KT1moVL ；其中優(yōu)選所使用的磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01摩爾/升，PH值為6. 8 ；對(duì)于本發(fā)明的檢測(cè)體系中，特別是對(duì)由水溶性量子點(diǎn)與酶反應(yīng)底物為乳酸正丁酯、L-乳酸或丙酮酸構(gòu)成的反應(yīng)體系中或水溶性量子點(diǎn)與酶為乳酸脫氫酶構(gòu)成的反應(yīng)體系中，需要輔酶；(7)將步驟(3)、步驟(4)和步驟(6)配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液稀釋得到由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系，其中反應(yīng)體系中水溶性量子點(diǎn)的摩爾濃度為2. 1 X 10_8 6. 5 X 10_4mol/L，酶反應(yīng)底物的摩爾濃度為8 X 10_5 6 X 10_2mol/ L,輔酶的摩爾濃度為0 8X 10_2mol/L ；或?qū)⒉襟E(3)、步驟(5)和步驟(6)配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液稀釋得到由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系，其中反應(yīng)體系中水溶性量子點(diǎn)的摩爾濃度為 2. IX Kr8 6. 5Xl(T4mol/L，酶的濃度為1. 2 X IO3 7. 5 X IO4個(gè)活力單位/L，輔酶的摩爾濃度為0 8X 10_2mol/L ；其中優(yōu)選所使用的磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01摩爾/升，pH 值為6. 8 ；(8)將步驟(7)制備得到的由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系加入到步驟(2)制得的基片上的用于檢測(cè)的微室中，組裝得到用于檢測(cè)酶活性的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片；或?qū)⒉襟E(7)制備得到的由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系加入到步驟 (2)制得的基片上的用于檢測(cè)的微室中，組裝得到用于檢測(cè)酶反應(yīng)底物濃度的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片；或?qū)⒉襟E(7)制備得到的由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系，和由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系分別加入到步驟(2)制得的基片上的不同的用于檢測(cè)的微室中，組裝得到用于檢測(cè)酶活性和檢測(cè)酶反應(yīng)底物濃度的基于量子點(diǎn)熒光多酶聯(lián)合檢測(cè)的酶芯片，即基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片。本發(fā)明的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片的應(yīng)用，將待檢測(cè)酶加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中；或?qū)⒋龣z測(cè)酶反應(yīng)底物加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中；或?qū)⒋龣z測(cè)酶加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中，將待檢測(cè)酶反應(yīng)底物加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中；在常溫下反應(yīng)(優(yōu)選反應(yīng)5 30分鐘)；采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)酶芯片，通過(guò)水溶性量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的變化量得到酶芯片的熒光光譜，通過(guò)分析熒光光譜的熒光強(qiáng)度的變化測(cè)得待檢測(cè)酶活性和/或待檢測(cè)酶反應(yīng)底物濃度。本發(fā)明的酶芯片可用于Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、膽堿、葡萄糖、或膽固醇等生理指標(biāo)的檢測(cè)，從而進(jìn)行心血管疾病、糖尿病、肝膽疾病和癌癥等相關(guān)疾病的早期檢測(cè)和診斷。所述的檢測(cè)酶活性時(shí)，將待檢測(cè)酶加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)與酶反應(yīng)底物構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中(有時(shí)反應(yīng)體系中還進(jìn)一步含有輔酶)，通過(guò)水溶性量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的變化量來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)酶活性的高選擇性的定量檢測(cè)。所述的檢測(cè)酶反應(yīng)底物的濃度時(shí)，將待檢測(cè)酶反應(yīng)底物加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)與酶構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中(有時(shí)反應(yīng)體系中還進(jìn)一步含有輔酶)，通過(guò)水溶性量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的變化量來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)酶反應(yīng)底物濃度的高選擇性的定量檢測(cè)。所述的酶活性和酶反應(yīng)底物濃度的同時(shí)檢測(cè)，是將待檢測(cè)酶加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)與酶反應(yīng)底物構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中(有時(shí)反應(yīng)體系中還進(jìn)一步含有輔酶)，將待檢測(cè)酶反應(yīng)底物加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)與酶構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中(有時(shí)反應(yīng)體系中還進(jìn)一步含有輔酶)，通過(guò)水溶性量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的變化量來(lái)分別實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)酶活性和待檢測(cè)酶反應(yīng)底物濃度的高選擇性的定量檢測(cè)。 所述的基片是石英或玻璃片。所述的高分子聚合物是明膠、黃原膠、交聯(lián)聚丙烯酰胺、瓊脂和卡拉膠所組成的組中的至少一種。所述的水溶性量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)位于400 700納米，量子產(chǎn)率大于20%。 所述的水溶性量子點(diǎn)是CdTe量子點(diǎn)、CdTe/CdS量子點(diǎn)、CdTe/CdS/ZnS量子點(diǎn)、CdSe/ZnS量子點(diǎn)、ZnTe量子點(diǎn)或ZnSe量子點(diǎn)。所述的酶反應(yīng)底物選自Y _谷氨酰-3-羧基_對(duì)硝基苯胺、雙甘肽、Y -谷氨酰_a 萘胺、Y —谷氨酰對(duì)硝基苯胺、乳酸正丁酯、L-乳酸、丙酮酸、磷酸對(duì)硝基苯、對(duì)硝基酚磷酸二鈉、磷酸苯二鈉、L-丙氨酸、α -酮戊二酸、氯化乙酰膽堿、氯化膽堿、葡萄糖、對(duì)硝基磷酸苯酯、焦磷酸鈉和膽固醇所組成的組中的至少一種。所述的輔酶是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)(NAD+)或其還原態(tài)(NADH)。所述的酶是γ -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、膽堿酯酶、膽堿氧化酶、 葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶或堿性磷酸酶。本發(fā)明的基于量子點(diǎn)熒光 檢測(cè)的酶芯片可用于相關(guān)的單一或多種生理酶活性和生理指標(biāo)的檢測(cè)，從而進(jìn)行心血管疾病，糖尿病，肝膽疾病和癌癥等相關(guān)疾病的早期檢測(cè)和診斷。本發(fā)明的酶芯片在使用時(shí)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、成本低。本發(fā)明的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片及其制備方法，其檢測(cè)原理及優(yōu)勢(shì)如下1.本發(fā)明使用的水溶性量子點(diǎn)是采用一種快速、簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保、可連續(xù)化生產(chǎn)的新方法合成的。與有機(jī) 相量子點(diǎn)相比，這種水溶性量子點(diǎn)與酶分子具有更好的生物相容性和親和性，更適用于生化檢測(cè)。2.本發(fā)明使用的水溶性量子點(diǎn)表面具有一定的化學(xué)活性基團(tuán)，當(dāng)待檢測(cè)酶與酶反應(yīng)底物或酶與待檢測(cè)酶反應(yīng)底物反應(yīng)發(fā)生時(shí)，產(chǎn)生的化學(xué)價(jià)鍵變化會(huì)對(duì)水溶性量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)產(chǎn)生擾動(dòng)，而這種擾動(dòng)與發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)的量有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而可以實(shí)現(xiàn)高選擇性的定量檢測(cè)。3.本發(fā)明通過(guò)水溶性量子點(diǎn)熒光變化對(duì)疾病標(biāo)志物酶進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷。熒光檢測(cè)具有信息容量大、響應(yīng)速度快、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、光學(xué)抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于質(zhì)譜、顯微鏡、電化學(xué)工作站等檢測(cè)設(shè)備，更易于實(shí)現(xiàn)設(shè)備的小型化、機(jī)械化、集成化和商品化。酶反應(yīng)具有快速、專(zhuān)一、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。因此通過(guò)熒光變化檢測(cè)酶量，既可以實(shí)現(xiàn)酶生化指標(biāo)快速、靈敏的定性檢測(cè)，也能夠進(jìn)行定量測(cè)定。4.本發(fā)明提供的方法是將水溶性量子點(diǎn)與酶檢測(cè)體系構(gòu)建在采用掩膜光刻法制作的基片上。由于水溶性量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)可以通過(guò)水溶性量子點(diǎn)粒徑的改變而發(fā)生變化。因此通過(guò)將不同發(fā)射波長(zhǎng)的水溶性量子點(diǎn)與不同的酶反應(yīng)體系結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多種酶的同時(shí)、快速、便捷的檢測(cè)。通過(guò)選擇合適的酶標(biāo)志物，進(jìn)行排列組合，可以構(gòu)建同時(shí)檢測(cè)多種疾病的酶芯片，從而提高多種疾病的檢測(cè)效率。


圖1.本發(fā)明實(shí)施例2的酶芯片檢測(cè)乳酸脫氫酶的熒光光譜圖。圖中“U”代表酶的活性單位。圖2.本發(fā)明實(shí)施例2的熒光檢測(cè)的線性擬合圖。圖3.本發(fā)明實(shí)施例3的酶芯片同時(shí)檢測(cè)乳酸脫氫酶和葡萄糖的熒光光譜圖；其中曲線(1)是兩個(gè)微室中分別裝有QD-545和QD-600的酶芯片的熒光光譜圖；曲線(2)是兩個(gè)微室中分別裝有QD-545+NAD++乳酸正丁酯和QD-600+葡萄糖氧化酶的酶芯片的熒光光譜圖；曲線(3)是向曲線(2)中的兩個(gè)微室中分別加入0. 03U乳酸脫氫酶和4. 4mM葡萄糖的酶芯片的熒光光譜圖；曲線⑷是向曲線(2)中的兩個(gè)微室中分別加入3U乳酸脫氫酶和8. 9mM葡萄糖的酶芯片的熒光光譜圖；曲線(5)是向曲線(2)中的兩個(gè)微室中分別加入1. 5U乳酸脫氫酶和2. 2mM葡萄糖的酶芯片的熒光光譜圖；其中“U”代表酶的活性單位。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、碲化鎘量子點(diǎn)的制備(參照CN 200810101429. 4制備)、(1)在去離子水中依次加入硝酸鎘、巰基乙酸，使硝酸鎘與巰基乙酸的摩爾比為 1 50，絡(luò)合反應(yīng)完成后，加入與硝酸鎘等摩爾的碲氫化鈉，得到水溶性量子點(diǎn)的前驅(qū)體溶液，最終鎘離子的濃度為10_5M;
(2)將步驟(1)得到的前驅(qū)體溶液加到超聲霧化器中，經(jīng)過(guò)超聲霧化后，前驅(qū)體溶液以亞微米小液滴的形式存在，得到水溶性量子點(diǎn)的前驅(qū)體溶液的霧滴；(3)通入氮?dú)?，氮?dú)饬髁繛?L/min，將步驟⑵得到的前驅(qū)體溶液的霧滴帶入到溫度穩(wěn)定的反應(yīng)裝置中，前驅(qū)體溶液的霧滴經(jīng)過(guò)加熱(溫度為450°C )反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物由水吸收得到水溶性的碲化鎘量子點(diǎn)，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為569nm，量子產(chǎn)率為50%。2、采用掩膜光刻技術(shù)制作酶芯片的基片(參照CN 200710177651. 8制備)將石英片基材1依次在濃度為的氫氧化鈉水溶液、丙酮或乙醇中，室溫 下分別以3000rpm攪拌5分鐘，水洗3次，干燥；耐溶劑電子紙微杯膠液材料2中低聚物EM7666 (酸改性甲酚醛環(huán)氧丙烯酸酯) (臺(tái)灣長(zhǎng)興化工有限公司)，濃度為10wt%、SB401 (芳香酸甲基丙烯酸半酯)(美國(guó)沙多瑪公司)，濃度為40wt%、CN988(氨基酯/丙烯酸酯)(美國(guó)沙多瑪公司)，濃度為10襯％，單體1，6-己二醇雙丙烯酸酯，濃度為10wt%、雙三羥甲基丙烯四丙烯酸酯，濃度為10wt%， 光引發(fā)劑2_羥基-甲基苯基丙烷-1-酮，濃度為lwt%、2，4，6-三甲基苯甲?；?二苯基氧化膦，濃度為Iwt %，改性劑順丁烯二酸酐，濃度為IOwt %，表面活性劑BYK306(聚醚改性聚二甲基硅氧烷共聚體溶液)(德國(guó)畢克化學(xué)公司)，濃度為lwt%、BYK109(高分子量烷羥基氨基酰胺)(德國(guó)畢克化學(xué)公司)，濃度為Iwt %、CD9050(美國(guó)沙多瑪公司)，濃度為 6wt%，30°C避光攪拌15分鐘；用250 μ m的鋼絲刮刀在石英片基材1上涂覆一層電子紙微杯膠液材料2，80°C預(yù)烤10分鐘，加帶有矩形圖案的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)掩膜3，于1000W高壓汞燈光4 下曝光30秒，然后移去掩膜；以濃度為2wt %的碳酸鈉為主體的顯影液中顯影50秒，用去離子水沖洗3次，80°C烘烤5分鐘，即得與掩膜相同0. 2mm高的微室形貌，微室邊長(zhǎng)20mm。3、采用酶芯片檢測(cè)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的活性(1)明膠溶液的配制將明膠溶于水中得到明膠溶液，明膠的重量百分比濃度為 2%，水溫60°C。在步驟2制作的基片上的每個(gè)微室中注入明膠溶液，冷卻到室溫，在微室底部形成一層明膠凝膠；(2)配制量子點(diǎn)溶液將碲化鎘量子點(diǎn)分散在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH 值為6. 8)中得到碲化鎘量子點(diǎn)溶液，碲化鎘量子點(diǎn)溶液中的碲化鎘量子點(diǎn)的摩爾濃度為 6. 9Xl(T4mol/L ；(3)配制酶反應(yīng)底物溶液將Y _谷氨酰-3-羧基-對(duì)硝基苯胺和雙甘肽分別溶解在0.01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液&!1值為6.8)中，分別得到Y(jié)-谷氨酰-3-羧基-對(duì)硝基苯胺和雙甘肽溶液，Y “谷氨酰-3-羧基-對(duì)硝基苯胺溶液中的Y -谷氨酰-3-羧基-對(duì)硝基苯胺的摩爾濃度為9. 8X 10_3mOl/L，雙甘肽溶液中的雙甘肽的摩爾濃度為3. 8X 10_3mOl/ L；(4)將步驟⑵和步驟(3)配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液(pH值為 6.8)稀釋?zhuān)渲邢♂尯蟮幕旌弦褐械捻诨k量子點(diǎn)的摩爾濃度為3.6X10_7mOl/L， Y “谷氨酰-3-羧基-對(duì)硝基苯胺的摩爾濃度為6. 5X 10_3mOl/L，雙甘肽的摩爾濃度為 2. 5Xl(T3mol/L ；(5)將步驟(4)配制的混合溶液加入到步驟(1)制得的基片微室中，組裝得到基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶芯片；
(6)將待檢測(cè)的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶溶液加入到步驟(5)組裝的酶芯片的微室中，體系常溫下反應(yīng)10分鐘；采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)酶芯片，得到體系的熒光光譜，通過(guò)分析熒光光譜的熒光強(qiáng)度的變化測(cè)得Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性的數(shù)據(jù)。實(shí)施例2 1、碲化鎘量子點(diǎn)的制備同實(shí)施例1。2、掩膜光刻技術(shù)制作酶芯片的基片同實(shí)施例1，制得的基片微室邊長(zhǎng)為30mm。3、采用酶芯片檢測(cè)乳酸脫氫酶的活性(1)瓊脂溶液的配制將瓊脂溶于水中得到瓊脂溶液，瓊脂的重量百分比濃度為 5%，水溫70°C。在步驟2制作的基片上的每個(gè)微室中注入瓊脂溶液，冷卻到室溫，在微室底部形成一層瓊脂凝膠；(2)配制量子點(diǎn)溶液將碲化鎘量子點(diǎn)分散在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH 值為6. 8)中得到碲化鎘量子點(diǎn)溶液，碲化鎘量子點(diǎn)溶液中的碲化鎘量子點(diǎn)的摩爾濃度為 8. 9Xl(T6mol/L ；(3)配制酶反應(yīng)底物溶液將乳酸正丁酯溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液 (pH值為6. 8)中，使乳酸正丁酯的摩爾濃度為5. 2X10_2mol/L ；(4)配制輔酶溶液將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液&11值為6.8)中，使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)的摩爾濃度為4. 5 X IO-1Hiol/ L；(5)將步驟(2)，步驟(3)和步驟(4)配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液(pH 值為6. 8)稀釋?zhuān)渲邢♂尯蟮幕旌弦褐械捻诨k量子點(diǎn)的摩爾濃度為6.7Xl(Tm0l/L， 乳酸正丁酯的摩爾濃度為2.2X10_3mOl/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)的摩爾濃度為 4. 8Xl(T3mol/L ；(6)將步驟(5)配制的混合溶液加入到步驟(1)制得的基片微室中，組裝得到基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)乳酸脫氫酶活性的酶芯片；(7)將待檢測(cè)的乳酸脫氫酶溶液加入到步驟(6)組裝的酶芯片的微室中，體系常溫下反應(yīng)5分鐘。采用熒光分光光度計(jì)得到體系的熒光光譜，通過(guò)分析熒光光譜的熒光強(qiáng)度的變化測(cè)得乳酸脫氫酶活性數(shù)據(jù)。得到的酶芯片檢測(cè)乳酸脫氫酶的熒光光譜圖見(jiàn)圖1，熒光檢測(cè)的線性擬合圖見(jiàn)圖2。實(shí)施例31、碲化鎘量子點(diǎn)的制備(參照CN 200810101429. 4制備)(1)在去離子水中依次加入硝酸鎘、巰基乙酸，使硝酸鎘與巰基乙酸的摩爾比為 1 3，絡(luò)合反應(yīng)完成后，加入與硝酸鎘等摩爾的碲氫化鈉，得到水溶性量子點(diǎn)的前驅(qū)體溶液，最終鎘離子的濃度為5X10_2M;(2)將步驟(1)得到的前驅(qū)體溶液加到超聲霧化器中，經(jīng)過(guò)超聲霧化后，前驅(qū)體溶液以亞微米小液滴的形式存在，得到水溶性量子點(diǎn)的前驅(qū)體溶液的霧滴；(3)通入氮?dú)?，氮?dú)饬髁繛?L/min，將步驟(2)得到的前驅(qū)體溶液的霧滴帶入到溫度穩(wěn)定的反應(yīng)裝置中，前驅(qū)體溶液的霧滴經(jīng)過(guò)加熱(溫度分別為220°C和280°C )反應(yīng)， 反應(yīng)產(chǎn)物由水吸收得到兩種熒光發(fā)射波長(zhǎng)的水溶性碲化鎘量子點(diǎn)，其中熒光發(fā)射波長(zhǎng)為 545nm表示為QD-545，熒光發(fā)射波長(zhǎng)600nm為表示為QD-600。QD-545的量子產(chǎn)率為30%，QD-600的量子產(chǎn)率為40%2、掩膜光刻技術(shù)制作酶芯片的基片同實(shí)施例1，制得的基片微室邊長(zhǎng)為35mm。3、采用酶芯片同時(shí)檢測(cè)葡萄糖和乳酸脫氫酶的活性(1)明膠溶液的配制將明膠溶于水中得到明膠溶液，明膠的重量百分比濃度為 3%,水溫50°C。在步驟2制作的基片上的每個(gè)微室中注入明膠溶液，冷卻到室溫，在微室底部形成一層明膠凝膠；(2)配制量子點(diǎn)溶液將上述兩種熒光發(fā)射波長(zhǎng)分別為QD-545和QD-600的碲化鎘量子點(diǎn)分別分散在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(PH值為6. 8)中，分別得到兩種碲化鎘量子點(diǎn)溶液，兩種碲化鎘量子點(diǎn)溶液中的碲化鎘量子點(diǎn)的摩爾濃度均為1. 3X10_7mOl/L ；(3)配制酶反應(yīng)底物溶液將乳酸正丁酯溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液 (pH值為6. 8)中，使乳酸正丁酯的摩爾濃度為6. 2X10_3mol/L ；(4)配制酶溶液將葡萄糖氧化酶溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH值為 6. 8)中，使葡萄糖氧化酶的濃度為4. 9 X IO5個(gè)活力單位/L ；(5)配制輔酶溶液將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液&11值為6.8)中，使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)的摩爾濃度為5. 8X10_3mOl/ L；(6)將步驟⑵配制的QD-545、步驟⑶和步驟(5)配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液(PH值為6. 8)稀釋?zhuān)渲?，稀釋后的混合液中的碲化鎘量子點(diǎn)QD-545的摩爾濃度為
2.lX10_8mol/L，乳酸正丁酯的摩爾濃度為8. 2 X 10_4mol/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)的摩爾濃度為7. 4X 10_4mol/L ；(7)將步驟⑵配制的QD-600和步驟(4)配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液(PH值為6.8)稀釋?zhuān)渲邢♂尯蟮幕旌弦褐械捻诨k量子點(diǎn)QD-600的摩爾濃度為
3.IX 10_8mol/L，葡萄糖氧化酶的濃度為8. 6 X IO3個(gè)活力單位/L ；(8)將步驟(6)和步驟(7)配制的兩種混合溶液分別加入到步驟(1)制得基片的兩個(gè)不同微室中，組裝得到基于量子點(diǎn)熒光同時(shí)檢測(cè)乳酸脫氫酶活性和葡萄糖濃度的酶芯片；(9)將待檢測(cè)的乳酸脫氫酶和葡萄糖混合溶液加入到步驟(8)組裝的酶芯片的兩個(gè)微室中，體系常溫下反應(yīng)12分鐘。采用熒光分光光度計(jì)得到體系的熒光光譜，通過(guò)分析熒光光譜的熒光強(qiáng)度的變化測(cè)得待檢測(cè)的乳酸脫氫酶活性和葡萄糖濃度的數(shù)據(jù)。得到的酶芯片檢測(cè)乳酸脫氫酶和葡萄糖的熒光光譜圖見(jiàn)圖3 ；其中曲線(1)是兩個(gè)微室中分別裝有QD-545和QD-600的酶芯片的熒光光譜圖；曲線(2)是兩個(gè)微室中分別裝有QD-545+NAD++乳酸正丁酯和QD-600+葡萄糖氧化酶的酶芯片的熒光光譜圖；曲線(3)是向曲線(2)中的兩個(gè)微室中分別加入0.03U乳酸脫氫酶和4.4mM葡萄糖混合溶液的酶芯片的熒光光譜圖；曲線(4)是向曲線(2)中的兩個(gè)微室中分別加入3U乳酸脫氫酶和8. 9mM葡萄糖混合溶液的酶芯片的熒光光譜圖；曲線(5)是向曲線(2)中的兩個(gè)微室中分別加入1.5U乳酸脫氫酶和2.2mM葡萄糖混合溶液的酶芯片的熒光光譜其中“U”代表酶的活性單位。實(shí)施例4 1、碲化鋅量子點(diǎn)的制備(參照CN 200810101429. 4制備)(1)在去離子水中依次加入乙酸鋅、巰基乙酸，使乙酸鋅與巰基乙酸的摩爾比為 1 20，絡(luò)合反應(yīng)完成后，加入與乙酸鋅等摩爾的碲氫化鈉，得到水溶性量子點(diǎn)的前驅(qū)體溶液，最終鋅離子的濃度為3X10_2M;(2)將步驟(1)得到的前驅(qū)體溶液加到超聲霧化器中，經(jīng)過(guò)超聲霧化后，前驅(qū)體溶液以亞微米小液滴的形式存在，得到水溶性量子點(diǎn)的前驅(qū)體溶液的霧滴；(3)通入氮?dú)?，氮?dú)饬髁繛閘L/min，將步驟⑵得到的驅(qū)體溶液的霧滴帶入到溫度穩(wěn)定的反應(yīng)裝置中，前驅(qū)體溶液的霧滴經(jīng)過(guò)加熱(溫度為110°C )反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物由水吸收得到水溶性的碲化鋅量子點(diǎn)，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為465nm，量子產(chǎn)率為25%。2、掩膜光刻技術(shù)制作酶芯片的基片同實(shí)施例1，制得的基片微室邊長(zhǎng)為8mm。3、采用酶芯片檢測(cè)堿性磷酸酶的活性(1)卡拉膠和交聯(lián)聚丙烯酰胺溶液的配制將卡拉膠和交聯(lián)聚丙烯酰胺溶于水中得到卡拉膠和交聯(lián)聚丙烯酰胺溶液，卡拉膠的重量百分比濃度為7. 5%，交聯(lián)聚丙烯酰胺的重量百分比濃度為2. 5%，水溫80°C。在步驟2制作的基片上的每個(gè)微室中注入卡拉膠和交聯(lián)聚丙烯酰胺溶液，冷卻到室溫，在微室底部形成一層卡拉膠和交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠；(2)配制量子點(diǎn)溶液將碲化鋅量子點(diǎn)分散在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH 值為6. 8)中得到碲化鋅量子點(diǎn)溶液，碲化鋅量子點(diǎn)溶液中的碲化鋅量子點(diǎn)的摩爾濃度為 2. 5Xl(T3mol/L ；(3)配制酶反應(yīng)底物溶液將磷酸苯二鈉溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液 (pH值為6. 8)中，使磷酸苯二鈉的摩爾濃度為3. OXliTmol/L ；(4)將步驟⑵和步驟(3)配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液(pH值為6. 8)稀釋?zhuān)渲邢♂尯蟮幕旌弦褐械捻诨\量子點(diǎn)的摩爾濃度為6. 5X10_4mOl/L，磷酸苯二鈉的摩爾濃度為 6. 0X10_2mol/L ；(5)將步驟(4)配制的混合溶液加入到步驟⑴制得的基片微室中，組裝得到基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)堿性磷酸酯酶活性的酶芯片；(6)將待檢測(cè)的堿性磷酸酶溶液加入到步驟(5)組裝的酶芯片的微室中，體系常溫下反應(yīng)30分鐘。采用熒光分光光度計(jì)得到體系的熒光光譜，通過(guò)分析熒光光譜的熒光強(qiáng)度的變化測(cè)得堿性磷酸酶活性數(shù)據(jù)。實(shí)施例51、碲化鋅量子點(diǎn)的制備同實(shí)施例4。2、掩膜光刻技術(shù)制作酶芯片的基片同實(shí)施例1，制得的基片微室邊長(zhǎng)為0. 5mm。3、采用酶芯片檢測(cè)膽堿酯酶的活性(1)黃原膠溶液的配制將黃原膠溶于水中得到黃原膠溶液，黃原膠的重量百分比濃度為0.6%，水溫65°C。在步驟2制作的基片上的每個(gè)微室中注入黃原膠溶液，冷卻到室溫，在微室底部形成一層黃原膠凝膠；(2)配制量子點(diǎn)溶液將碲化鋅量子點(diǎn)分散在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH 值為6. 8)中得到碲化鋅量子點(diǎn)溶液，碲化鋅量子點(diǎn)溶液中的碲化鋅量子點(diǎn)的摩爾濃度為4. 2Xl(T5mol/L ； (3)配制酶反應(yīng)底物溶液將氯化乙酰膽堿溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液 (pH值為6. 8)中，氯化乙酰膽堿的摩爾濃度為3. 6X 10_3mOl/L ；(4)將步驟⑵和步驟(3)配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液(pH值為6. 8)稀釋?zhuān)渲邢♂尯蟮幕旌弦褐械捻诨\量子點(diǎn)的摩爾濃度為2. 3X10_6mol/L，氯化乙酰膽堿的摩爾濃度為7. 3X10_4mol/L ；(5)將步驟(4)配制的混合溶液加入到步驟⑴制得的基片微室中，組裝得到基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)膽堿酯酶活性的酶芯片；(6)將待檢測(cè)的膽堿酯酶溶液加入到步驟(5)組裝的酶芯片的微室中，體系常溫下反應(yīng)6分鐘。采用熒光分光光度計(jì)得到體系的熒光光譜，通過(guò)分析熒光光譜的熒光強(qiáng)度的變化測(cè)得膽堿酯酶活性數(shù)據(jù)。實(shí)施例61、硒化鋅量子點(diǎn)的制備(參照CN 200810101429. 4制備)(1)在去離子水中依次加入氯化鎘、巰基丙酸，使氯化鎘與巰基丙酸的摩爾比為 1 5，絡(luò)合反應(yīng)完成后，加入與氯化鎘等摩爾的硒氫化鈉，得到水溶性量子點(diǎn)的前驅(qū)體溶液，最終鎘離子的濃度為7 X IO-3M;(2)將步驟(1)得到的前驅(qū)體溶液加到超聲霧化器中，經(jīng)過(guò)超聲霧化后，前驅(qū)體溶液以亞微米小液滴的形式存在，得到水溶性量子點(diǎn)的前驅(qū)體溶液的霧滴；(3)通入氮?dú)猓獨(dú)饬髁繛?L/min，將步驟(2)得到的前驅(qū)體溶液的霧滴帶入到溫度穩(wěn)定的反應(yīng)裝置中，前驅(qū)體溶液的霧滴經(jīng)過(guò)加熱(溫度為250°C )反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物直接由水吸收得到水溶性的硒化鋅熒光納米顆粒，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為652nm，量子產(chǎn)率為35%。2、掩膜光刻技術(shù)制作酶芯片的基片同實(shí)施例1，制得的基片微室邊長(zhǎng)為50mm。3、采用酶芯片檢測(cè)乳酸脫氫酶的活性(1)卡拉膠溶液的配制將卡拉膠溶于水中得到卡拉膠溶液，卡拉膠的重量百分比濃度為1%，水溫40°C。在步驟2制作的基片上的每個(gè)微室中注入卡拉膠溶液，冷卻到室溫，在微室底部形成一層卡拉膠凝膠；(2)配制量子點(diǎn)溶液將硒化鋅量子點(diǎn)分散在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH 值為6. 8)中得到硒化鋅量子點(diǎn)溶液，硒化鋅量子點(diǎn)溶液中的硒化鋅量子點(diǎn)的摩爾濃度為 1. 8Xl(T4mol/L ；(3)配制酶反應(yīng)底物溶液將丙酮酸溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH值為6. 8)中，使丙酮酸的摩爾濃度為8. 7 X 10_4mol/L ；(4)配制輔酶溶液將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態(tài)溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液&11值為6.8)中，使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態(tài)的摩爾濃度為6.5 X 10_4mol/ L；(5)將步驟⑵、步驟(3)和步驟(4)配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液(pH值為6. 8)稀釋?zhuān)渲邢♂尯蟮幕旌弦褐械奈\的摩爾濃度為4. 8X10_6mOl/L，丙酮酸的摩爾濃度為9. 2X 10_5mol/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態(tài)的摩爾濃度為2. 3X 10_4mol/L ；(6)將步驟(5)配制的混合溶液加入到步驟(1)制得的基片微室中，組裝得到基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)乳酸脫氫酶活性的酶芯片；
(7)將待檢測(cè)的乳酸脫氫酶溶液加入到步驟(5)組裝的酶芯片的微室中，體系常溫下反應(yīng)7分鐘。采用熒光分光光度計(jì)得到體系的熒光光譜，通過(guò)分析熒光光譜的熒光強(qiáng)度的變化測(cè)得乳酸脫氫酶活性的數(shù)據(jù)。實(shí)施例7
1、碲化鎘量子點(diǎn)的制備同實(shí)施例3。2、掩膜光刻技術(shù)制作酶芯片的基片同實(shí)施例1，制得的基片微室邊長(zhǎng)為40mm。3、采用酶芯片同時(shí)檢測(cè)乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶的活性(1)明膠溶液的配制將明膠溶于水中得到明膠溶液，明膠的重量百分比濃度為 6%，水溫45°C。在步驟2制作的基片上的每個(gè)微室中注入明膠溶液，冷卻到室溫，在微室底部形成一層明膠凝膠；(2)配制量子點(diǎn)溶液將上述兩種熒光發(fā)射波長(zhǎng)分別為QD-545和QD-600的兩種碲化鎘量子點(diǎn)分別分散在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(PH值為6. 8)中，分別得到兩種碲化鎘量子點(diǎn)溶液，兩種碲化鎘量子點(diǎn)溶液中的碲化鎘量子點(diǎn)的摩爾濃度都為7. 6 X IO-5Hiol/ L；(3)配制酶反應(yīng)底物溶液將乳酸正丁酯溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(PH值為6.8)中，使乳酸正丁酯的摩爾濃度為6.0X10_4mOl/L。將對(duì)硝基磷酸苯酯溶解在0.01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液&!1值為6.8)中，使對(duì)硝基磷酸苯酯的摩爾濃度為 4. 3Xl(T3mol/L ；(4)配制輔酶溶液將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液&11值為6.8)中，使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)的摩爾濃度為9. 6 X IO-5Hiol/ L；(5)將步驟⑵配制的QD-545、步驟(3)配制的乳酸正丁酯溶液和步驟⑷配制的輔酶溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液(PH值為6. 8)稀釋?zhuān)渲邢♂尯蟮幕旌弦褐械捻诨k量子點(diǎn)QD-545的摩爾濃度為1. 6X10_5mOl/L，乳酸正丁酯的摩爾濃度為8. 0X10_5mOl/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)的摩爾濃度為3. 6X 10_5mOl/L ；(6)將步驟(2)配制的QD-600和步驟(3)配制的對(duì)硝基磷酸苯酯溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液(PH值為6. 8)稀釋?zhuān)渲邢♂尯蟮幕旌弦褐械捻诨k量子點(diǎn)QD-600的摩爾濃度為1. 6X 10_5mol/L，對(duì)硝基磷酸苯酯的摩爾濃度為2. 4X 10_4mol/L ；(7)將步驟(5)和步驟(6)配制的兩種混合溶液分別加入到步驟(1)制得基片的兩個(gè)不同微室中，組裝得到基于量子點(diǎn)熒光同時(shí)檢測(cè)乳酸脫氫酶活性和堿性磷酸酶活性的酶芯片；(8)將待檢測(cè)的乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶混合溶液加入到步驟(7)組裝的酶芯片的兩個(gè)微室中，體系常溫下反應(yīng)20分鐘。采用熒光分光光度計(jì)得到體系的熒光光譜，通過(guò)分析熒光光譜的熒光強(qiáng)度的變化測(cè)得乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶活性的數(shù)據(jù)。實(shí)施例81、硒化鋅量子點(diǎn)的制備同實(shí)施例6。2、掩膜光刻技術(shù)制作酶芯片的基片同實(shí)施例1，制得的基片微室邊長(zhǎng)為45mm。3、采用酶芯片檢測(cè)膽固醇的濃度(1)瓊脂溶液的配制將瓊脂溶于水中得到瓊脂溶液，瓊脂的重量百分比濃度為4%,水溫55°C。在步驟2制作的基片上的每個(gè)微室中注入瓊脂溶液，冷卻到室溫，在微室底部形成一層瓊脂凝膠；(2)配制量子點(diǎn)溶液將硒化鋅量子點(diǎn)分散在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH 值為6. 8)中得到硒化鋅量子點(diǎn)溶液，硒化鋅量子點(diǎn)溶液中的硒化鋅量子點(diǎn)的摩爾濃度為5.7Xl(T4mol/L ；(3)配制酶溶液將膽固醇氧化酶溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH值為
6.8)中，使膽固醇氧化酶的濃度為2. 8 X IO6個(gè)活力單位/L ；(4)將步驟⑵和步驟(3)配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液(pH值為6. 8)稀釋?zhuān)渲邢♂尯蟮幕旌弦褐械奈\的摩爾濃度為4. 3 X 10_5mOl/L，膽固醇氧化酶的濃度為
7.5 X IO4個(gè)活力單位/L ；(5)將步驟(4)配制的混合溶液加入到步驟⑴制得的基片微室中，組裝得到基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)膽固醇濃度的酶芯片；(6)將待檢測(cè)的膽固醇溶液加入到步驟(5)組裝的酶芯片的微室中，體系常溫下反應(yīng)15分鐘。采用熒光分光光度計(jì)得到體系的熒光光譜，通過(guò)分析熒光光譜的熒光強(qiáng)度的變化測(cè)得膽固醇濃度的數(shù)據(jù)。實(shí)施例91、碲化鎘量子點(diǎn)的制備同實(shí)施例1。2、掩膜光刻技術(shù)制作酶芯片的基片同實(shí)施例1，制得的基片微室邊長(zhǎng)為37mm。3、采用酶芯片檢測(cè)丙酮酸的濃度(1)卡拉膠溶液的配制將卡拉膠溶于水中得到卡拉膠溶液，卡拉膠的重量百分比濃度為10%，水溫75°C。在步驟2制作的基片上的每個(gè)微室中注入卡拉膠溶液，冷卻到室溫，在微室底部形成一層卡拉膠凝膠；(2)配制量子點(diǎn)溶液將碲化鎘量子點(diǎn)分散在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH 值為6. 8)中得到碲化鎘量子點(diǎn)溶液，碲化鎘量子點(diǎn)溶液中的碲化鎘量子點(diǎn)的摩爾濃度為 3. 5Xl(T4mol/L ；(3)配制酶溶液將乳酸脫氫酶溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH值為 6. 8)中，使乳酸脫氫酶的濃度為3. 6 X IO4個(gè)活力單位/L ；(4)配制輔酶溶液將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態(tài)溶解在0. 01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液&11值為6.8)中，使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態(tài)的摩爾濃度為7.2 X 10_4mol/ L；(5)將步驟(2)、步驟(3)和步驟(4)配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液(pH 值為6. 8)稀釋?zhuān)渲邢♂尯蟮幕旌弦褐械捻诨k的摩爾濃度為7. 4X10-6mol/L,乳酸脫氫酶的濃度為1.2X IO3個(gè)活力單位/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態(tài)的摩爾濃度為
8.5Xl(T5mol/L ；(6)將步驟(5)配制的混合溶液加入到步驟(1)制得的基片微室中，組裝得到基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)丙酮酸濃度的酶芯片；(7)將待檢測(cè)的丙酮酸溶液加入到步驟(6)組裝的酶芯片的微室中，體系常溫下反應(yīng)25分鐘。采用熒光分光光度計(jì)得到體系的熒光光譜，通過(guò)分析熒光光譜的熒光強(qiáng)度的變化測(cè)得丙酮酸濃度的數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片，其特征是所述的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片是在一具有多個(gè)微室的基片上的每個(gè)用于檢測(cè)的微室中裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系，或裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系，或在所述基片上的不同的用于檢測(cè)的微室中分別裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系和由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片，其特征是所述的由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系中，水溶性量子點(diǎn)的摩爾濃度為2. 1X10—8 6. 5 X 10_4mol/L，酶反應(yīng)底物的摩爾濃度為8 X 10_5 6 X 10_2mol/L，輔酶的摩爾濃度為O 8Xl(T2mol/L ；所述的由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系中，水溶性量子點(diǎn)的摩爾濃度為2.IX Kr8 6. 5Xl(T4mol/L，酶的濃度為1. 2 X IO3 7. 5 X IO4個(gè)活力單位/L，輔酶的摩爾濃度為 0 8X10_2mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片，其特征是所述的微室底部有一層高分子聚合物；所述的高分子聚合物是明膠、黃原膠、交聯(lián)聚丙烯酰胺、瓊脂和卡拉膠所組成的組中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片，其特征是所述的水溶性量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)位于400 700納米，量子產(chǎn)率大于20%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片，其特征是所述的水溶性量子點(diǎn)是CdTe量子點(diǎn)、CdTe/CdS量子點(diǎn)、CdTe/CdS/ZnS量子點(diǎn)、CdSe/ZnS量子點(diǎn)、ZnTe量子點(diǎn)或ZnSe量子點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片，其特征是所述的酶反應(yīng)底物選自Y-谷氨酰-3-羧基-對(duì)硝基苯胺、雙甘肽、Y-谷氨酰萘胺、Y —谷氨酰對(duì)硝基苯胺、乳酸正丁酯、L-乳酸、丙酮酸、磷酸對(duì)硝基苯、對(duì)硝基酚磷酸二鈉、磷酸苯二鈉、 L-丙氨酸、α-酮戊二酸、氯化乙酰膽堿、氯化膽堿、葡萄糖、對(duì)硝基磷酸苯酯、焦磷酸鈉和膽固醇所組成的組中的至少一種；所述的輔酶是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)或其還原態(tài)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片，其特征是所述的酶是 Y “谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、膽堿酯酶、膽堿氧化酶、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶或堿性磷酸酶。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1 7任意一項(xiàng)所述的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片的制備方法，其特征是，該方法包括以下步驟(1)配制量子點(diǎn)溶液將水溶性量子點(diǎn)分散在磷酸鹽緩沖液中得到量子點(diǎn)溶液，量子點(diǎn)溶液中的水溶性量子點(diǎn)的摩爾濃度為1. 3Χ 10_7 2. 5Χ 10_3mol/L ；(2)配制酶反應(yīng)底物溶液將酶反應(yīng)底物溶解在磷酸鹽緩沖液中得到酶反應(yīng)底物溶液，酶反應(yīng)底物溶液中的酶反應(yīng)底物的摩爾濃度為6X 10_4 3 X IO-1HioVL ；(3)配制酶溶液將酶溶解在磷酸鹽緩沖液中得到酶溶液，酶溶液中的酶的濃度為3.6 X IO4 2. 8 X IO6個(gè)活力單位/L ；(4)配制輔酶溶液將輔酶溶解在磷酸鹽緩沖液中得到輔酶溶液，輔酶溶液中的輔酶的摩爾濃度為O 5 X Kr1IIioVL；(5)將步驟(1)、步驟(2)和步驟⑷配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液稀釋得到由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系，其中反應(yīng)體系中水溶性量子點(diǎn)的摩爾濃度為2. 1 X 10_8 6. 5 X 10_4mol/L，酶反應(yīng)底物的摩爾濃度為8 X 10_5 6 X 10_2mol/L，輔酶的摩爾濃度為O 8X l(T2mol/L ；或?qū)⒉襟E(1)、步驟⑶和步驟⑷配制的溶液混合，加入磷酸鹽緩沖液稀釋得到由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系，其中反應(yīng)體系中水溶性量子點(diǎn)的摩爾濃度為 2. 1X10_8 6. 5X10_4mol/L，酶的濃度為1. 2 X IO3 7. 5 X IO4個(gè)活力單位/L ；輔酶的摩爾濃度為 O 8X10_2mol/L ；(6)將步驟(5)制備得到的由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系加入到基片上的用于檢測(cè)的微室中，組裝得到用于檢測(cè)酶活性的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片；或?qū)⒉襟E(5)制備得到的由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系加入到基片上的用于檢測(cè)的微室中，組裝得到用于檢測(cè)酶反應(yīng)底物濃度的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片；或?qū)⒉襟E(5)制備得到的由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系，和由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系分別加入到基片上的不同的用于檢測(cè)的微室中，組裝得到用于檢測(cè)酶活性和檢測(cè)酶反應(yīng)底物濃度的基于量子點(diǎn)熒光多酶聯(lián)合檢測(cè)的酶芯片， 即基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01摩爾/升，PH值為6.8。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1 7任意一項(xiàng)所述的基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片的應(yīng)用，其特征是將待檢測(cè)酶加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中；或?qū)⒋龣z測(cè)酶反應(yīng)底物加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中；或?qū)⒋龣z測(cè)酶加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中，將待檢測(cè)酶反應(yīng)底物加入到基片上多個(gè)微室中的裝載有由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系的微室中；在常溫下反應(yīng)；采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)酶芯片，通過(guò)水溶性量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的變化量得到酶芯片的熒光光譜，通過(guò)分析熒光光譜的熒光強(qiáng)度的變化測(cè)得待檢測(cè)酶活性和/ 或待檢測(cè)酶反應(yīng)底物濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的酶芯片及制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)掩膜光刻技術(shù)制作酶芯片的基片，在該基片上得到多個(gè)微室，且在具有多個(gè)微室的基片上的每個(gè)用于檢測(cè)的微室中裝載有一個(gè)由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系或由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系，或在所述基片上的不同的用于檢測(cè)的微室中分別裝載有一個(gè)由水溶性量子點(diǎn)、酶反應(yīng)底物與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系和由水溶性量子點(diǎn)、酶與輔酶構(gòu)成的反應(yīng)體系。由于待檢測(cè)酶與酶反應(yīng)底物的反應(yīng)或酶與待檢測(cè)酶反應(yīng)底物的反應(yīng)，使得水溶性量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生變化，通過(guò)測(cè)定水溶性量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化的量來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)酶活性和/或待檢測(cè)酶反應(yīng)底物濃度的高選擇性定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/75GK102384902SQ20101026993
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者任湘菱, 唐芳瓊, 楊柳青 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所