本發(fā)明屬于功能性納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有熒光特性的碳量子點(diǎn)的制備方法，特別涉及一種以海藻為碳源制備具有熒光特性的碳量子點(diǎn)細(xì)胞標(biāo)記探針的方法。

背景技術(shù)：

功能性納米材料是近年來發(fā)展非常迅速的一個技術(shù)領(lǐng)域，科學(xué)家們已經(jīng)成功地制備出包括有機(jī)高分子小球、微脂粒、半導(dǎo)體量子點(diǎn)、硅量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)化納米探針、貴金屬納米顆粒、磁性納米小球等等在內(nèi)的多種納米材料，并利用它們的各種優(yōu)異性能開發(fā)出了多種技術(shù)手段，在醫(yī)學(xué)檢測，疾病診斷，能源電池，環(huán)境評估、污染治理等各領(lǐng)域廣為應(yīng)用。

碳量子點(diǎn)是納米材料領(lǐng)域一個新的研究熱點(diǎn)。它是指直徑在2-40納米范圍內(nèi)的碳原子微球。碳量子點(diǎn)在保留碳材料各種優(yōu)良的物理化學(xué)性能的同時，表現(xiàn)出顯著的熒光特性和良好的水相分散性。實(shí)驗(yàn)表明碳量子點(diǎn)可以直接作為一種安全有效的熒光探針，被各種細(xì)胞內(nèi)化從而對這些細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，而表面修飾的碳量子點(diǎn)能夠特異性地標(biāo)記腫瘤細(xì)胞?？傊?，碳量子點(diǎn)在生物檢測以及生物分析等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。

碳量子點(diǎn)的制備方法主要有兩大類，一類是利用高純石墨、炭黑和碳納米管為原料，利用電子束光刻蝕、電化學(xué)氧化、化學(xué)剝離、微波及超聲輔助、氧等離子處理等方法，破壞石墨片層之間的相互作用力，同時在片層內(nèi)形成大量的氧化基團(tuán)，將石墨烯片層切割開得到小尺寸的碳量子點(diǎn)；另外一類是利用檸檬酸和乙二胺等小分子化合物，在一定溫度下進(jìn)行縮合反應(yīng)，生成具有較高分子量的碳量子點(diǎn)。這兩種制備方法的原料都是高純度的化合物，成本較高。并且合成的過程中常常會用到濃硝酸和濃硫酸，反應(yīng)副產(chǎn)物的無害化處理較為復(fù)雜。近年來，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了多種天然有機(jī)物制備碳量子點(diǎn)的方法，如中國專利CN2014108419973公開了一種以雞蛋清為碳源的碳量子點(diǎn)熒光標(biāo)記材料的方法，中國專利CN2012102644112一種光致放光碳量子點(diǎn)的制備方法公開了采用豆?jié){殘?jiān)鼮樵现苽涮剂孔狱c(diǎn)的方法，中國專利2013102199000公開了以植物葉子為原料制備碳量子點(diǎn)的方法，然而這些天然有機(jī)物制備過程中普遍存在產(chǎn)品收率低，如采用豆?jié){殘?jiān)a(chǎn)品收率為5-7.3％，且過程中涉及到硫酸、氫氧化鈉等化學(xué)藥品的使用，不屬于綠色生產(chǎn)工藝，此外這些原材料仍然具有價格較高，來源有限的缺點(diǎn)。

我們國家耕地資源有限，但是擁有廣闊的海洋面積，海藻的產(chǎn)量巨大，能夠作為一種價低量高的生物質(zhì)資源。滸苔是大型天然野生海藻的一種，具有繁殖能力強(qiáng)，環(huán)境適應(yīng)范圍廣的特點(diǎn)。近年來隨著全球氣溫變暖、水體富營養(yǎng)化等一系列環(huán)境因素的改變，海洋滸苔綠潮連續(xù)暴發(fā)。中國黃海最早于2007年便出現(xiàn)滸苔，迄今為止連續(xù)九年爆發(fā)滸苔綠潮災(zāi)害。例如2015年6月在山東沿海海域有較大面積滸苔漂浮，綠潮覆蓋面積約430平方公里，分布面積約35200平方公里(新華網(wǎng)新聞)。大量滸苔漂浮聚集在海面，阻塞了船舶航行的通道。以此同時，滸苔的大量生長增殖以及腐爛分解的過程都需要消耗大量氧氣，對其生長海域其他水生生物的生存構(gòu)成嚴(yán)重威脅。得不到及時清除的滸苔腐爛時發(fā)出惡臭，影響沿海旅游業(yè)發(fā)展。如何對滸苔進(jìn)行無害化處理，將其‘變廢為寶’是我們面臨的一個嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。目前對滸苔的無害化處理主要途徑是將其制成飼料，或者加工食用。

基于以上論述，設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)有效的途徑，將滸苔轉(zhuǎn)化為具有功能性的熒光碳量子點(diǎn)材料，對于滸苔的高附加值無害轉(zhuǎn)化具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有碳量子點(diǎn)合成技術(shù)中的不足，提供一種以海藻為原料制備生產(chǎn)熒光碳量子點(diǎn)并作為細(xì)胞標(biāo)記探針加以應(yīng)用的方法，解決了海藻，特別是滸苔高附加值無害化處理的問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)方案，本發(fā)明涉及的以海藻為碳源的熒光碳量子點(diǎn)的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)清洗海藻原料以去除雜質(zhì)，然后將海藻和水一起粉碎，得到海藻漿料；

(2)將適量海藻漿料放入密封體系中進(jìn)行高溫水熱反應(yīng)并使海藻漿體碳化；

(3)對步驟(2)中碳化產(chǎn)物進(jìn)行后處理以去除不溶物以及大尺寸的組分，得到熒光碳量子點(diǎn)溶液；

(4)將步驟(3)中的熒光碳量子點(diǎn)溶液進(jìn)行冷凍干燥處理，得到熒光碳量子點(diǎn)粉末。

本發(fā)明涉及的海藻為滸苔、海帶、裙帶菜和紫菜中的一種或多種，但不限于這幾種,水優(yōu)選為為純水。

本發(fā)明涉及的滸苔為條滸苔、緣管滸苔、鏟滸苔和扁滸苔中的一種或多種。

本發(fā)明涉及的步驟(1)中將質(zhì)量比(1.5-2.5)：1的海藻和水一起放入組織搗碎機(jī)中粉碎3-10分鐘，得到海藻漿料優(yōu)選海藻和水質(zhì)量比為2：1，粉碎時間為5分鐘。

本發(fā)明涉及的步驟(2)中密封體系為密閉反應(yīng)釜，步驟(2)中的海藻漿料占密閉反應(yīng)釜體積的三分之一，高溫水熱反應(yīng)和碳化過程具體為：在加熱裝置中將密閉反應(yīng)釜升溫至180-200℃，并維持60-90分鐘，為保證熒光碳量子點(diǎn)的產(chǎn)率和質(zhì)量，加熱裝置的溫度波動控制在±5℃。

本發(fā)明涉及的加熱裝置為微波反應(yīng)器、烘箱或馬弗爐中的一種。

本發(fā)明涉及的步驟(3)中的后處理過程為離心、過濾、透析中的一種，但并不限于這幾種。

本發(fā)明所述的離心具體為：將步驟(2)中碳化產(chǎn)物放入離心機(jī)中，在轉(zhuǎn)速5000-12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心處理10-20分鐘，離心上清液為熒光碳量子點(diǎn)溶液，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘,離心時間為15分鐘。

本發(fā)明所述的過濾具體過程為：將步驟(2)中碳化產(chǎn)物通過0.10-0.45μm濾膜處理，濾出液為熒光碳量子點(diǎn)溶液，優(yōu)選為濾膜孔徑為0.22μm。

本發(fā)明所述的過濾具體過程為：將步驟(2)中碳化產(chǎn)物通過截留分子量500Da的透析膜處理除去小分子雜質(zhì)，透析袋內(nèi)部截留溶液為碳量子點(diǎn)溶液。

本發(fā)明涉及的以海藻為碳源的熒光碳量子點(diǎn)用于生物標(biāo)記、重金屬分析、電極復(fù)合材料制備、抗體偶聯(lián)以及復(fù)合光催化劑制備等各個方向。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)有效地將廉價的海藻，特別是滸苔轉(zhuǎn)化為具有熒光特性的納米尺寸的碳量子點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)滸苔的高附加值和無害轉(zhuǎn)化；(2)制備方法工藝簡單、操作性強(qiáng)、成本低、可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的碳量子點(diǎn)的制備,無需使用其他化學(xué)藥品，環(huán)境友好；(3)制備的熒光碳量子點(diǎn)用于生物標(biāo)記、重金屬分析、抗體標(biāo)記和細(xì)胞染色；(4)制備過程中產(chǎn)品收率高；(5)粉碎處理過程有利于海藻中的成分分散在水溶液中提高后續(xù)水熱反應(yīng)和碳化過程的效率。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明涉及的實(shí)施例1熒光碳量子點(diǎn)的透射電鏡表征圖；

圖2為本發(fā)明涉及的實(shí)施例1熒光碳量子點(diǎn)的紫外-可見光吸收譜圖；

圖3為本發(fā)明涉及的實(shí)施例1熒光碳量子點(diǎn)的熒光發(fā)射譜圖；

圖4為本發(fā)明涉及的實(shí)施例1熒光碳量子點(diǎn)對細(xì)胞生長繁殖的影響；

圖5為本發(fā)明涉及的實(shí)施例1濃度500mg/L熒光碳量子點(diǎn)與細(xì)胞共同培養(yǎng)5小時之后的共聚焦顯微鏡成像結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1：

(1)用自來水對滸苔進(jìn)行洗滌，除去表面泥沙等雜質(zhì)，然后用純水進(jìn)行沖洗；

(2)稱取200克步驟(1)處理后的滸苔原料(干重約10克)，按照滸苔和純水的質(zhì)量比為2:1的比例將滸苔和純水混合，放入組織搗碎機(jī)的原料容器，粉碎5分鐘，得到滸苔漿料；

(3)稱取10克步驟(2)得到的滸苔漿料，放入30mL聚四氟水熱反應(yīng)釜并加蓋放入外包套管進(jìn)行密閉；

(4)將裝有滸苔漿料的反應(yīng)釜放入微波反應(yīng)器，設(shè)置溫度為200℃，壓力為20atm,反應(yīng)60分鐘，然后停止加熱；

(5)待反應(yīng)釜的溫度降低到40℃以下，將反應(yīng)釜的蓋子打開，反應(yīng)產(chǎn)物為紅褐色溶液，含有少許黑色的不溶物；

(6)將步驟(5)得到的反應(yīng)產(chǎn)品混合物收集到離心管中，設(shè)定轉(zhuǎn)速10000rpm,離心20分鐘,將離心管上層清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，不溶物沉淀直接丟棄；

(7)將步驟(6)得到的熒光碳量子點(diǎn)溶液進(jìn)行冷凍干燥處理，得到熒光碳量子點(diǎn)粉末,計(jì)算得出熒光量子產(chǎn)率為4.7％，產(chǎn)品收率為9.6％。

對實(shí)施例1制備的碳量子點(diǎn)粉末進(jìn)行測試，結(jié)果如圖1-5所示，從透射電鏡表征圖可以看出制備得到的熒光碳量子點(diǎn)顆粒分散均勻，而且粒徑分布范圍相對較窄，基本在2-6nm范圍內(nèi)，平均顆粒直徑為3.5nm。從紫外-可見光吸收譜圖可以看出熒光碳量子點(diǎn)無明顯的吸收峰。從熒光發(fā)射譜圖可以得出當(dāng)用360nm的激發(fā)光對碳量子點(diǎn)進(jìn)行照射的條件下，熒光碳量子點(diǎn)在400-600nm區(qū)間有很強(qiáng)的熒光發(fā)射，發(fā)射峰在440nm附近。從與細(xì)胞共同培養(yǎng)5小時之后的共聚焦顯微鏡成像結(jié)果可以得出：濃度500ug/mL的滸苔碳量子點(diǎn)對細(xì)胞的生長增殖無明顯影響，可以富集在細(xì)胞質(zhì)的部位對其進(jìn)行熒光標(biāo)記。

實(shí)施例2：

(1)用自來水對滸苔進(jìn)行洗滌，除去表面泥沙等雜質(zhì)，然后用純水進(jìn)行沖洗；

(2)稱取200克步驟(1)處理后的滸苔原料(干重約10克)，按照滸苔和純水的質(zhì)量比為2:1的比例將滸苔和純水混合，放入搗碎杯，利用組織搗碎機(jī)粉碎5分鐘，得到滸苔漿料；

(3)稱取30克步驟(2)得到的滸苔漿料，放入100mL聚四氟水熱反應(yīng)釜并加蓋放入外包金屬套管進(jìn)行密閉；

(4)將裝有滸苔漿料的反應(yīng)釜放入烘箱，設(shè)置溫度為180℃，反應(yīng)90分鐘，反應(yīng)過程中溫度波動控制在±5℃,然后停止加熱；

(5)待反應(yīng)釜的溫度降低到40℃以下，將反應(yīng)釜的蓋子打開，反應(yīng)產(chǎn)物為紅褐色溶液，含有少許黑色的不溶物；

(6)將步驟(5)得到的反應(yīng)產(chǎn)品混合物用裝有0.22μm濾膜的抽濾裝置進(jìn)行過濾處理，收集澄清的濾出液，轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，濾膜收集的不溶物直接丟棄；

(7)將步驟(6)得到的熒光碳量子點(diǎn)溶液進(jìn)行冷凍干燥處理，得到熒光碳量子點(diǎn)粉末。計(jì)算得出熒光量子產(chǎn)率為4.9％，產(chǎn)品收率為7.8％。

實(shí)施例3：

(1)用自來水對滸苔進(jìn)行洗滌，除去表面泥沙等雜質(zhì)，然后用純水進(jìn)行沖洗；

(2)稱取200克步驟(1)處理后的滸苔原料(干重約10克)，按照滸苔和純水的質(zhì)量比為2:1的比例將滸苔和純水混合，放入搗碎杯，利用組織搗碎機(jī)粉碎5分鐘，得到滸苔漿料；

(3)稱取30克步驟(2)得到的滸苔漿料，放入100mL聚四氟水熱反應(yīng)釜并加蓋放入外包金屬套管進(jìn)行密閉；

(4)將裝有滸苔漿料的反應(yīng)釜放入馬弗爐，設(shè)置溫度為200℃，反應(yīng)60分鐘，反應(yīng)過程中溫度波動控制在±5℃,然后停止加熱；

(5)待反應(yīng)釜的溫度降低到40℃以下，將反應(yīng)釜的蓋子打開，反應(yīng)產(chǎn)物為紅褐色溶液，含有少許黑色的不溶物；

(6)將步驟(5)得到的反應(yīng)產(chǎn)品混合物收集分裝到離心管中，設(shè)定轉(zhuǎn)速10000rpm,離心20分鐘,將離心管上層清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，不溶物沉淀直接丟棄；

(7)將步驟(6)得到的熒光碳量子點(diǎn)溶液進(jìn)行冷凍干燥處理，得到熒光碳量子點(diǎn)粉末。計(jì)算得出熒光量子產(chǎn)率為3.8％，產(chǎn)品收率為8.9％。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例4與實(shí)施例1除步驟(1)中選擇的原料為裙帶菜，步驟(2)中裙帶菜和純水的質(zhì)量比為2.5:1，步驟(6)中轉(zhuǎn)速5000rpm，離心10分鐘,其他步驟均相同，制備出熒光碳量子點(diǎn)粉末。

實(shí)施例5：

本實(shí)施例5與實(shí)施例2除其他步驟均相同，除步驟(1)中選擇的原料為紫菜，步驟(2)中紫菜和純水的質(zhì)量比為1.5:1，步驟(6)抽濾裝置中采用0.45μm濾膜，其他步驟均相同，制備出熒光碳量子點(diǎn)粉末。

測試表明，實(shí)施例2-5制備的熒光碳量子點(diǎn)粉末性能與實(shí)施例1制備的的熒光碳量子點(diǎn)粉末性能接近。

對比例1：

本對比例1與實(shí)施例1除步驟(4)反應(yīng)溫度為150℃，反應(yīng)時間為30min時，其他步驟均相同，制備熒光碳量子點(diǎn)粉末,計(jì)算得出熒光量子產(chǎn)率為1.2％，產(chǎn)品收率為2.1％。