專利名稱：一種用hplc指紋圖譜鑒別鐵皮石斛真?zhèn)蔚姆椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥材指紋圖譜的建立方法，具體涉及一種HPLC指紋圖譜鑒別鐵皮石斛藥材真?zhèn)蔚姆椒?，為鐵皮石斛的鑒定提供了一種特征性強(qiáng)、準(zhǔn)確簡便的現(xiàn)代鑒定方法，屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛Dendrobi μ m officinale Kimura et MIgo干燥莖。具有益胃生津，滋陰清熱之功效，臨床主要用于治療陰傷津虧，口干煩渴，食少干嘔，病后煩熱，目暗不明等。石斛屬植物是我國重要的傳統(tǒng)中藥材，藥用價(jià)值歷代為人們所推崇，而鐵皮石斛為石斛之上品，因其特殊的生存環(huán)境和卓著的滋補(bǔ)功效而名列“中華九大仙草”之首。由于鐵皮石斛種植難以普及，鐵皮石斛原料產(chǎn)量與市場需求存在一定缺口，部分企業(yè)只能以原料供應(yīng)量來定生產(chǎn)量。在產(chǎn)品生產(chǎn)和質(zhì)量方面鐵皮石斛類原料缺乏科學(xué)、可控性強(qiáng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及檢驗(yàn)檢測手段。而且鐵皮石斛與其近緣的種存在性狀交叉現(xiàn)象，分類區(qū)別比較困難； 其中作為代用品的有齒瓣石斛、細(xì)莖石斛、腫節(jié)石斛等，并且出現(xiàn)了細(xì)葉石仙桃等與鐵皮石斛功效不盡相同的非藥典收載的混淆品。因此鑒定鐵皮石斛及其代用品和偽品，將具有重大的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。目前，以外觀性狀和顯微鑒別石斛原料和以粗多糖為主要指標(biāo)，仍然是石斛類藥材的主要鑒定方法，但由于受到專業(yè)性和經(jīng)驗(yàn)性的限制而難以推廣應(yīng)用，此外對(duì)于特征差異較小的品種、藥材粉末、中成藥的鑒定還存在不足。既難以辨別制成品中是否含有鐵皮石斛成分，又難以測定鐵皮石斛有效成分的含量；特別是各級(jí)質(zhì)量檢測機(jī)構(gòu)缺乏鐵皮石斛專屬性的檢驗(yàn)方法，給魚龍混雜以可乘之機(jī)。鐵皮石斛類產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)和聲稱與內(nèi)在品質(zhì)不一致。一些標(biāo)識(shí)為鐵皮石斛(楓斗)的產(chǎn)品并非鐵皮石斛，而是其它種類的石斛產(chǎn)品，損害了消費(fèi)者利益。而在質(zhì)量控制方面，2010年版《中國藥典》對(duì)鐵皮石斛藥材的質(zhì)量控制仍停留在性狀和糖的含量測定，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能實(shí)現(xiàn)對(duì)鐵皮石斛藥材進(jìn)行全面的質(zhì)量控制，也不利于中藥的現(xiàn)代化和產(chǎn)業(yè)管理的規(guī)范化。針對(duì)以上情況，尋找一種特征性強(qiáng)、準(zhǔn)確簡便的現(xiàn)代鑒定方法，對(duì)于鐵皮石斛藥材的鑒定及其藥材和產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行控制具有十分重要的意義。中藥指紋圖譜法則是借助于色譜、光譜法得到能夠標(biāo)示該中藥材或中成藥特性的特征峰、特征組峰、共有峰的圖譜。中藥指紋圖譜強(qiáng)調(diào)的是作為藥用植物物種的“共同特征性”，體現(xiàn)其兩個(gè)基本屬性“整體性”和“模糊性”，作為一個(gè)整體來考慮而不需要將復(fù)雜的化學(xué)成分逐個(gè)分離出來。整體或部分整體地表征中藥材或中成藥復(fù)雜的中藥化學(xué)信息，通過分析比較不同物種間中藥化學(xué)信息的差異，依靠特征峰、特征組峰、特征相關(guān)峰、以及相對(duì)峰強(qiáng)度等特征來達(dá)到中藥鑒定和鑒別真?zhèn)位虍a(chǎn)地及質(zhì)量控制等目的。因此，在鐵皮石斛有效成分不完全明確的前提下，制定中藥的指紋圖譜對(duì)于有效的控制其質(zhì)量，具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鐵皮石斛藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法，以及由此方法得到的鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并利用相似度判斷鐵皮石斛真?zhèn)?。此發(fā)明對(duì)于鐵皮石斛藥材的鑒定及其藥材和產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有十分重要的意義。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明包括以下步驟(1)供試品的制備將不同石斛藥材干燥，粉碎后過篩，精密稱取藥材粉末，加水或一元醇提取，濃縮到一定體積，有機(jī)溶劑萃取，回收，甲醇定容，微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液；(2)鐵皮石斛藥材HPLC指紋圖譜的建立色譜分離柱為反相C18柱；流動(dòng)相為乙腈 /甲醇-酸水，梯度洗脫；檢測波長270士20nm ；柱溫25 40°C ；在此條件下分析供試品溶液，得到鐵皮石斛藥材指紋圖譜；(3)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立對(duì)20批鐵皮石斛藥材建立HPLC指紋圖譜，通過分析比較，得到鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和鐵皮石斛藥材相似度；(4)以上述相同的步驟測定待測鐵皮石斛樣品和鐵皮石斛偽品/代用品的指紋圖譜；(5)將待測鐵皮石斛樣品和鐵皮石斛偽品/代用品的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，計(jì)算相似度，確定樣品真?zhèn)巍１景l(fā)明所述的步驟⑴的具體過程是1)精密稱取過30 200目篩的鐵皮石斛藥材，按1 20 1 100的比例(以干品計(jì))加提取溶劑提取0. 5 池，提取液減壓回收至一定體積。提取溶劑為水或一元醇或兩種溶劑按一定配比的混合溶劑；石斛藥材是指不同生長年限或不同產(chǎn)地的鮮品、干燥品以及楓斗；提取方式是指回流提取、超聲提取、索式提取、加速溶劑提取和微波提?。?)用等體積的有機(jī)溶劑萃取2 5次，有機(jī)溶劑可以為乙醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇、氯仿等或上述溶劑按一定配比的混合溶劑系統(tǒng)；3)回收有機(jī)溶劑萃取液，甲醇定容，0. 22 μ m或0. 45 μ m濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。本發(fā)明所述的步驟(2)的具體過程是1)流動(dòng)相為乙腈/甲醇-酸水，酸可為有機(jī)酸如甲酸、乙酸或無機(jī)酸如磷酸，濃度為0. 1-0.5%，優(yōu)選甲醇-磷酸，磷酸濃度優(yōu)選0.2%;流動(dòng)相梯度洗脫條件為0min —5min —IOmin — 25min — 45min — 60min — 75min ；甲醇 25 % — 25 % — 30 % — 40 % — 55 % — 70 % —100% ；流速 0. 8-1. 2mL/min ；2)檢測波長 270 士 20nm，優(yōu)選 ^Onm ；3)柱溫是 25 40°C，優(yōu)選 30 。本發(fā)明所述的步驟(3)的具體過程是按照本發(fā)明提供的方法，對(duì)20批鐵皮石斛藥材建立HPLC指紋圖譜，通過分析比較，得到鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和鐵皮石斛藥材相似度，20批鐵皮石斛相似度均在0. 8以上。本發(fā)明所述的步驟(4)和步驟(5)的具體過程是
以上述相同步驟測定鐵皮石斛偽品/代用品(報(bào)春石斛、齒瓣石斛、大包鞘石斛、 疊鞘石斛、兜唇石斛、鉤狀石斛、鼓槌石斛、金釵石斛、晶帽石斛、玫瑰石斛、美花石斛、密花石斛、梳唇石斛、疏花石斛、束花石斛、細(xì)莖石斛、腫節(jié)石斛、馬鞭石斛、重唇石斛、黃花石斛、 霍山石斛、刀葉石斛、廣東石豆蘭、細(xì)葉石仙桃等)指紋圖譜，并與鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，其相似度均在0.6以下。本發(fā)明具有以下顯著的優(yōu)點(diǎn)和用途(1)指紋圖譜的建立，將鐵皮石斛作為一個(gè)整體來對(duì)待，通過指紋圖譜中主要特征峰相對(duì)峰面積或相對(duì)保留時(shí)間的制定，能有效的檢測和控制鐵皮石斛藥材的質(zhì)量，并利用相似度達(dá)到鑒別鐵皮石斛真?zhèn)蔚哪康?，為鐵皮石斛藥材真?zhèn)舞b別提供了一種全新的方法。(2)本發(fā)明具有簡便可行、直觀、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，是一種特征性較強(qiáng)的現(xiàn)代鑒定方法。下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例和圖譜對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。


圖1為本發(fā)明提供的鐵皮石斛藥材的對(duì)照指紋圖譜；圖2為市售鐵皮石斛藥材的指紋圖譜；圖3為齒瓣石斛的指紋圖譜；圖4為腫節(jié)石斛的指紋圖譜；圖5為玫瑰石斛的指紋圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施方式具體如下實(shí)施例一1.儀器與試藥1. 1儀器=Agilent 1200高效液相色譜儀；DAD檢測器。1. 2試藥鐵皮石斛藥材及其偽品或代用品為市售或廠家提供；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。2.鐵皮石斛藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立(1)供試品溶液的制備精密稱取鮮鐵皮石斛藥材10. 0g，剪碎，加200mL水回流提取lh，減壓回收到一定體積，用水飽和正丁醇萃取(20mL*3次)，回收正丁醇，甲醇定容， 0. 22 μ m濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。(2)色譜條件的選擇色譜分離柱為XB-C18 ；流動(dòng)相為乙腈-0. 3%磷酸；采用梯度洗脫方式 Omin — 5min — 12min — 25min — 40min — 60min — 70min ；乙腈 — 10% —15%^ 22%^ 35%^ 45%^ 70% ；流速 1. OmL/min ；檢測波長 ^Onm ；柱溫 30°C ；在此條件下分析供試品溶液，得到鐵皮石斛藥材指紋圖譜。(3)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立將20批鐵皮石斛按照⑴所述方法分別制備成供試品溶液，然后按照( 所述方法分別測定其HPLC指紋圖譜，將這20批鐵皮石斛藥材的指紋圖譜進(jìn)行分析比較，得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜并計(jì)算相似度，相似度均在0. 8以上。
(4)鐵皮石斛偽品/代用品指紋圖譜的建立取鐵皮石斛偽品/代用品(齒瓣石斛、腫節(jié)石斛、細(xì)莖石斛等)按照(1)及( 所述方法及步驟，測定出其指紋圖譜，與鐵皮石斛藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)比，其相似度均在0. 6以下，并且齒瓣石斛、腫節(jié)石斛和玫瑰石斛等在49-50min處還有比較明顯的特征峰(見圖3_5)；因此，根據(jù)指紋圖譜的這些特征和相似度可以鑒別鐵皮石斛真?zhèn)?。?shí)施例二 與實(shí)施例一不同的是鐵皮石斛藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立(1)供試品溶液的制備精密稱取鐵皮石斛楓斗2. 0g，剪碎，加IOOmL水回流提取 1. 5h,減壓回收到一定體積，用乙醚萃取(30ml>2次)，回收乙醚，甲醇定容，0. 22 μ m濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。(2)色譜條件的選擇色譜分離柱為SB-C18 ；流動(dòng)相為甲醇_0. 2%磷酸；采用梯度洗脫方式 Omin — 5min — 12min — 25min — 40min — 60min — 70min ；甲醇 7% — 14% —22% — 30% — 45% — 55% — 78% ；流速 1. OmL/min ；檢測波長 270nm ；柱溫 25°C ；在此條件下分析供試品溶液，得到鐵皮石斛藥材指紋圖譜。實(shí)施例三與實(shí)施例一不同的是鐵皮石斛藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立(1)供試品溶液的制備精密稱取鐵皮石斛藥材粉末1. 0g，加50mL甲醇超聲提取30min，減壓回收到一定體積，用乙酸乙酯萃取(20mL*3次)，回收乙酸乙酯，甲醇定容， 0. 45 μ m濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。(2)色譜條件的選擇色譜分離柱為Xtimate C18 ；流動(dòng)相為甲醇-0. 2%磷酸； 采用梯度洗脫方式 Omin — 5min — IOmin — 25min — 45min — 60min — 75min ；甲醇 25% —25%— 30%^ 40%^ 55%— 70%^ 100% ；；流速 1. OmL/min ；檢測波長 ^Onm ；柱溫 300C ；在此條件下分析供試品溶液，得到鐵皮石斛藥材指紋圖譜。
權(quán)利要求
1.一種用HPLC指紋圖譜鑒別鐵皮石斛真?zhèn)蔚姆椒?，步驟如下(1)供試品的制備將不同石斛藥材干燥，粉碎后過篩，精密稱取藥材粉末，加水或一元醇提取，濃縮到一定體積，有機(jī)溶劑萃取，回收，甲醇定容，微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液；(2)鐵皮石斛藥材HPLC指紋圖譜的建立色譜分離柱為反相G18柱；流動(dòng)相為乙腈/甲醇-酸水，梯度洗脫；檢測波長270士20nm ；柱溫25 40°C ；在此條件下分析供試品溶液， 得到鐵皮石斛藥材指紋圖譜；(3)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立對(duì)20批鐵皮石斛藥材建立了HPLC指紋圖譜，通過分析比較，得到鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和鐵皮石斛藥材相似度；(4)以上述相同的步驟測定待測鐵皮石斛樣品和鐵皮石斛偽品/代用品的指紋圖譜；(5)將待測鐵皮石斛樣品和鐵皮石斛偽品/代用品的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較， 計(jì)算相似度，確定樣品真?zhèn)巍?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用HPLC指紋圖譜鑒別鐵皮石斛真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于步驟⑴所述的1)藥材粉碎后過篩是過30 200目篩；2)精密稱取鐵皮石斛藥材，按1 20 1 100的比例(以干品計(jì))加提取溶劑提取0. 5 池，提取液減壓回收至一定體積；提取溶劑為水或一元醇或兩種溶劑按一定配比的混合溶劑；3)石斛藥材是指不同生長年限或不同產(chǎn)地的鮮品、干燥品及楓斗；4)提取方式是指回流提取、超聲提取、索式提取、加速溶劑提取和微波提取；5)用等體積的有機(jī)溶劑萃取2 5次，有機(jī)溶劑可以為乙醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取、氯仿等或上述溶劑按一定配比的混合溶劑系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用HPLC指紋圖譜鑒別鐵皮石斛真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于步驟⑵所述的1)流動(dòng)相為乙腈/甲醇-酸水，酸可為有機(jī)酸如甲酸、乙酸或無機(jī)酸如磷酸，濃度為 0. 1-0.5%，優(yōu)選甲醇-磷酸，磷酸濃度優(yōu)選0.2% ；2)流動(dòng)相梯度洗脫條件為0min— 5min — IOmin — 25min — 45min — 60min — 75min ； 甲醇 25%— 25%— 30%— 40%— 55%— 70%— 100% ；流速 0. 8-1. 2mL/min ；3)檢測波長270士 20nm，優(yōu)選^Onm ；4)柱溫是25 40°C，優(yōu)選30 ;35°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用HPLC指紋圖譜鑒別鐵皮石斛真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于步驟⑶所述的 按照本發(fā)明提供的方法，對(duì)20批鐵皮石斛藥材建立HPLC指紋圖譜，通過分析比較，得到鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和鐵皮石斛藥材相似度，20批鐵皮石斛相似度均在0. 8以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用HPLC指紋圖譜鑒別鐵皮石斛真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于步驟⑷和步驟(5)所述的鐵皮石斛偽品/代用品指報(bào)春石斛、齒瓣石斛、大包鞘石斛、疊鞘石斛、兜唇石斛、鉤狀石斛、鼓槌石斛、金釵石斛、晶帽石斛、玫瑰石斛、美花石斛、密花石斛、梳唇石斛、疏花石斛、束花石斛、細(xì)莖石斛、腫節(jié)石斛、馬鞭石斛、重唇石斛、黃花石斛、霍山石斛、刀葉石斛、廣東石豆蘭、細(xì)葉石仙桃等，其與鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，其相似度均在0. 6以下。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用HPLC指紋圖譜鑒別鐵皮石斛真?zhèn)蔚姆椒?，包括以下步驟(1)鐵皮石斛HPLC指紋圖譜的建立a.精密稱取鐵皮石斛藥材粉末，加水或一元醇提取，濃縮，有機(jī)溶劑萃取，回收濃縮，定容，過濾，得供試品溶液；b.用高效液相色譜法分析上述供試品溶液，得鐵皮石斛藥材的指紋圖譜。(2)鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立對(duì)20批鐵皮石斛藥材進(jìn)行分析比較，得到了鐵皮石斛標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和鐵皮石斛藥材相似度；相似度均在0.8以上。(3)相同步驟測定鐵皮石斛偽品/代用品的指紋圖譜，并與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，計(jì)算相似度，其相似度均在0.6以下。利用標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和相似度可以有效監(jiān)控鐵皮石斛真?zhèn)魏退幉馁|(zhì)量。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102370891SQ201010255558
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者呂圭源, 周桂芬, 陳素紅, 顏美秋 申請(qǐng)人:浙江中醫(yī)藥大學(xué)