專利名稱：一種具己糖激酶抑制作用的活性成分的篩選方法
技術領域：
本發(fā)明屬藥物分析領域，涉及中藥材中活性成分的篩選方法，具體涉及一種具己糖激酶抑制作用的中藥活性成分的篩選方法。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命的疑難疾病，是僅次于心臟病的第二殺手。目前，臨床常用的藥物治療方法為化療，然而，化療時常會帶來及其嚴重的副作用。因此，從天然資源中尋找和篩選抗腫瘤的活性成分，開發(fā)有效低毒的藥物，已經(jīng)引起醫(yī)藥工作者的廣泛關注。但是，實踐證實，天然藥材，如中藥材，其成分十分的復雜，為其中的活性成分篩選帶來極大的挑戰(zhàn)。有必要尋找一種快捷、有效的篩選方法。眾所周知，藥效的發(fā)生是通過與靶分子結合而引起的一系列生物效應，這種作用直接影響藥物的分布、排泄、代謝、活性和毒副作用。將中藥提取物與作用靶分子在一定條件下混合，與靶分子具有相互作用的活性成分與之發(fā)生可逆的結合，形成活性分子-靶分子復合物。研究顯示，如果獲得中藥活性成分與多靶點作用前后的信息，就可以揭示出與靶分子結合的活性化合物。例如選擇某活性酶作為靶分子，通過一定的手段測定該靶分子與中藥提取物結合后其底物或產(chǎn)物的量是否發(fā)生變化，則可初步判斷中藥提取物有無活性。己糖激酶(hexokinase，HK)是催化己糖使之磷酸化的酶，在正常組織中表達量很少。它是糖酵解途徑的第一個酶，也是糖酵解途徑的限速酶。己糖激酶在腫瘤組織中表達的量及活性的增加，使得腫瘤組織在缺乏氧的情況下，仍能保證足夠的能源，并且糖酵解的許多中間產(chǎn)物可以被瘤細胞所利用，以合成蛋白質、核酸及脂類等，從而為瘤細胞本身的生長和增生提供了必需的物質基礎。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤具有高糖代謝的特點腫瘤細胞中大約 60%的ATP來源于糖酵解途徑。鑒于己糖激酶對于各種腫瘤細胞活動的重要意義，研究人員合理推測，若能尋找到有效的己糖激酶抑制劑，抑制該酶的活性，則抑制了腫瘤細胞的糖酵解，使腫瘤細胞不能獲得足夠的6-磷酸葡萄糖，ATP無法轉換為ADP為細胞各種活動提供能量，繼而導致腫瘤細胞發(fā)生調亡。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便、快速且經(jīng)濟的中藥材活性的體外篩選方法。具體涉及一種具己糖激酶抑制作用的中藥活性成分的篩選方法。尤其是一種LC-MS法輔助的具己糖激酶抑制作用的活性提取物的篩選方法。本發(fā)明方法基于在糖酵解過程中，己糖激酶催化ATP轉化為ADP的過程，將待篩選藥物或組分加入該反應體系中，以LC-MS法對ATP和ADP進行定量測定，觀察ATP和ADP 的變化情況以評價待篩選藥物或組分是否具有己糖激酶抑制劑的活性，并對其活性進行測定。具體而言，本發(fā)明的一種具己糖激酶抑制作用的中藥活性成分的篩選方法，其特征在于，以ATP為底物的己糖激酶催化反應，通過對ATP以及產(chǎn)物ADP的定量分析，篩選出中藥材中具己糖激酶抑制作用的活性組分，其包括步驟，(1)建立高效液相-質譜聯(lián)用方法(LC-MS)，通過在流動相中添加5mM的醋酸銨，實現(xiàn)對ATP以及產(chǎn)物ADP的檢測及定量分析；本發(fā)明中，對于極性分子ATP的最低定量限為5 μ g/mL。本發(fā)明中，流動相需添加5mM的醋酸銨，以質譜為檢測器，毛細管電壓設置為 3000V，監(jiān)測離子分別是 ATP :m/z 508，ADP :m/z 428。(2)基于LC-MS對ATP進行定量分析，測定以ATP作為底物的己糖激酶活性；(3)對篩選得到的具己糖激酶抑制劑活性的中藥提取物MBZA進行測定及計算。本發(fā)明的一個實施例中，選擇中藥材木鱉子為篩選對象，以LC-MS為手段，測定 ATP作為底物的己糖激酶活性，對木鱉子四種提取物(MBZA，MBZB, MBZC和MBZD)進行己糖激酶抑制劑活性的篩選；所述的中藥材木鱉子已運用在抗腫瘤復方中，藥理證實其具有散結消腫，攻毒療瘡的作用。本發(fā)明基于在糖酵解過程中，己糖激酶催化ATP轉化為ADP的反應，將ATP與中藥提取物在一定條件下混合，以LC-MS方法為手段，分別測定反應前后(加入或不加入中藥提取物)，ATP的變化量及生成ADP的量，用以評價中藥提取物的己糖激酶抑制活性。在LC-MS 法的實施過程中，在流動相中加入5mM醋酸銨，極大地提高了 ATP的質譜信號及對ATP定量的穩(wěn)定性。篩選結果顯示，本發(fā)明的LC-MS法輔助的具己糖激酶抑制作用的活性提取物的篩選方法操作簡單、自動化程度高、靈敏度高且篩選快速。本方法無需進行大批量的動物實驗，相比細胞試驗，本發(fā)明提取物用量少，生化試劑節(jié)省且篩選周期短，對于中藥材中活性組分的篩選和研究有重要意義。本發(fā)明中經(jīng)優(yōu)化的LC-MS中各項實驗參數(shù)對于利用質譜技術測定其它類似性質的生物分子具有很好的參考價值。本發(fā)明方法快速簡便，經(jīng)濟有效，適合中藥材中具己糖激酶活性抑制作用的活性組分的篩選。本發(fā)明方法可用于各種復雜基質中ATP的檢測。
圖1.典型ATP色譜圖，其中，上分別為ATP及空白，下ADP及空白圖2.己糖激酶米氏常數(shù)計算。圖3.木鱉子提取物色譜分離圖。圖4.木鱉子提取物抑制己糖激酶典型色譜圖，圖中，從左到右為ATP、ADP ；各峰表示空白對照組，酶抑制組，酶促反應組。
具體實施例方式實施例1 木鱉子提取物中己糖激酶抑制活性組分的篩選1. LC-MS 法測定 ATP 和 ADP
色譜柱Agilent Extend C—18 (3· 1 X 100mm，3 μ m ;Agilent，Palo Alto, CA, USA)； 流動相5mM乙酸銨(pH7. 5)甲醇=6 4 ；流速0. 3mL/min ；柱溫20°C ；進樣量10 μ L離子源液相色譜-質譜聯(lián)用接口 電噴霧接口(ESI)，正離子模式(positive ion)；干燥氣流速:10mL/min ；干燥氣溫度300°C ；霧化氣壓力30psi (上限60psi)；毛細管電壓:3000V ；質量分析器檢測方式選擇離子監(jiān)測(SIM)；檢測區(qū)間:0-1. 6min ；碎片電壓100V ；監(jiān)測離子ATP，準分子離子峰(m/z 508) ；ADP，準分子離子峰(m/z^8)專屬性如圖1所示，ATP保留時間為1.39分鐘，ADP保留時間為1.40分鐘，與空白色譜圖對比可知，出峰位置無明顯雜質干擾。結果顯示，用本方法定量ATP，專屬性良好。線性范圍在5-60 μ g/mL范圍內，以ATP峰面積Y對ATP的理論濃度X，以l/χ為權重系數(shù)作加權線性回歸，得標準曲線方程為=Y = 3022. 6X+1902. 9(r = 0. 998)。靈敏度本方法對ATP的最低定量限(LLOQ)為5 μ g/mL(S/N彡10)，最低檢測限 (LLOD)為1 μ g/mL(LLOD)。LLOQ的天內及天間精密度分別為3. 95%和11. 36%，準確度分別為 105. 37%和 101. 09%。精密度和準確度配制ATP低、中、高3個濃度質控樣品(12，35，55 μ g/mL)各5份， 進樣分析，并以當天標準曲線計算天內精密度及準確度。依法連續(xù)測定3天，計算天間精密度及準確度。結果顯示(如表1所示)，本方法低、中、高濃度質控樣品，天內及天間精密度均小于10%，準確度在100 士 5%之內。表1 :ATP質控樣品的準確度和精密度
權利要求
1.一種具己糖激酶抑制作用的中藥活性成分的篩選方法，其特征在于，以ATP為底物的己糖激酶催化反應，通過對ATP以及產(chǎn)物ADP的定量分析，篩選出中藥材中具己糖激酶抑制作用的活性組分，其包括步驟(1)建立高效液相-質譜聯(lián)用方法(LC-MS)，在流動相中添加5mM的醋酸銨，對ATP以及產(chǎn)物ADP檢測及定量分析；(2)基于高效液相-質譜聯(lián)用方法對ATP進行定量分析，測定以ATP作為底物的己糖激酶活性；(3)對篩選得到的具己糖激酶抑制劑活性的中藥提取物進行測定及計算。
2.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中對極性分子ATP的最低定量限為 5 μ g/mL0
3.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，流動相添加5mM的醋酸銨， 以質譜為檢測器，毛細管電壓設置為3000V，監(jiān)測離子分別是ATP :m/z 508, ADP :m/z 428。
4.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，對ATP以及產(chǎn)物ADP檢測及定量分析色譜柱Agilent Extend C-18 (3· 1 X 100mm，3 μ m ;Agilent，Palo Alto, CA, USA)；流動相5mM 乙酸銨(pH7. 5)甲醇=6 4 ；流速0. 3mL/min ；柱溫20°C ；進樣量10 μ L ；離子源液相色譜-質譜聯(lián)用接口 電噴霧接口(ESI)，正離子模式(positive ion)； 干燥氣流速10mL/min ；干燥氣溫度300°C ；霧化氣壓力30psi (上限60psi)；毛細管電壓:3000V ；質量分析器檢測方式選擇離子監(jiān)測(SIM)；檢測區(qū)間:0-1. 6min ；碎片電壓 100V ；監(jiān)測離子ATP，準分子離子峰(m/z 508) ；ADP，準分子離子峰(m/z^8)。
5.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，中藥提取物為中藥材木鱉子的四種提取物MBZA，MBZB, MBZC和MBZD。
6.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，對篩選得到的具己糖激酶抑制劑活性的中藥提取物MBZA進行測定及計算。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物分析領域，涉及中藥材中活性成分的篩選方法，具體涉及一種具己糖激酶抑制作用的中藥活性成分的篩選方法。本發(fā)明基于以ATP為底物的己糖激酶催化反應，通過對ATP以及產(chǎn)物ADP的定量分析，篩選出中藥材中具己糖激酶抑制作用的活性組分。本發(fā)明方法快速簡便，經(jīng)濟有效。相比細胞試驗，本發(fā)明提取物用量少，生化試劑節(jié)省且篩選周期短，對于中藥材中活性組分的篩選和研究有重要意義。本發(fā)明中經(jīng)優(yōu)化的LC-MS中各項實驗參數(shù)對于利用質譜技術測定其它類似性質的生物分子具有較好參考價值。
文檔編號G01N30/72GK102335221SQ201010238510
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月26日 優(yōu)先權日2010年7月26日
發(fā)明者潘樂, 郁韻秋 申請人:復旦大學