專利名稱：甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒-9057的制作方法
甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒-905技術領域：
本發(fā)明涉及食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及甘氨酸測定方法及其試齊U盒。
背景技術：
甘氨酸為非人體必需氨基酸。甘氨酸有獨特的甜味，能緩和酸、堿味，掩蓋食品中添加糖精的苦味并增強甜味。人體若攝入甘氨酸的量過多，不僅不能被人體吸收利用，而且會打破人體對氨基酸的吸收平衡而影響其它氨基酸的吸收，導致營養(yǎng)失衡而影響健康。甘氨酸不能被人體利用，只能分解轉化為熱能，這樣會增加肝臟負擔。而分解產(chǎn)物中的含氮化合物要通過尿液排出體外，又會增加腎臟負擔。如果大量、長期食用這類食品，可能造成肝腎損傷。部分含乳飲料企業(yè)為提高產(chǎn)品中蛋白質含量，在生產(chǎn)加工中違規(guī)使用甘氨酸，對青少年及兒童的正常生長發(fā)育很容易帶來不利影響。按照我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》GB2760規(guī)定，甘氨酸在作為食品添加劑只允許在調(diào)味劑與豆奶中使用，且最高限量為每公斤1克，但在含乳飲料中不允許使用。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術問題]本發(fā)明的目的是提供一種甘氨酸的測定方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種甘氨酸測定試劑盒。[技術方案]本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明的方法是一種采用間接酶循環(huán)擴增法(Indirect Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction) 的聯(lián)用技術，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處的吸光度變化測定甘氨酸的方法。本發(fā)明甘氨酸測定方法的的技術原理是根據(jù)下述氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶 (EC 1. 2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51)的系列催化反應完成 甘氨酸+2輔酶氰化氫合成酶氰化氫+ 二氧化碳+2還原型輔酶二氧化碳+乙酸+亞鐵細胞色素bl丙酮酸脫氫酶丙酮酸+高鐵細胞色素bl+水丙酮酸+輔酶A+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶本發(fā)明的方法利用氰化氫合成酶(hydrogen cyanide synthase ；EC 1.4.99.5) 酶(偶)聯(lián)丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase ；EC 1. 2. 2. 2)、另一種丙酮酸脫氫酶 (pyruvate dehydrogenase ；EC 1. 2. 1. 51)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法。氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.2.2)作為作用酶，氰化氫合成酶功能為將甘氨酸酶解產(chǎn)生二氧化碳，丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 2. 2)的酶促作用使二氧化碳產(chǎn)生丙酮酸；丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51) 作為循環(huán)酶丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51)再將丙酮酸再次變回二氧化碳，使二氧化碳不斷地被重復循環(huán)利用。丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 1.51)又作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在 340nm處吸光度上升的速度，這樣可以通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算甘氨酸的濃度大小。本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種甘氨酸的測定方法。該甘氨酸測定方法的步驟如下A、樣品準備A. 1標準樣品的制備將一定量的甘氨酸溶于水或緩沖液中，再將甘氨酸濃度調(diào)整到1毫摩爾/升，得到的溶液作為標準樣品；A. 2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中；A. 3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升；B、試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶 (EC1. 2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 1. 51)、乙酸、亞鐵細胞色素bl與輔酶A，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmo 1 /L、 0.001-7mol/L、0. l_5mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、I-IOOmmol/ LU-lOOmmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數(shù)據(jù)處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到
甘氨酸的含量
權利要求
1.一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的甘氨酸濃度測定方法，其測定的技術原理是根據(jù)下述氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51)的系列催化反應完成甘氨酸+2輔酶氰化氫合成酶氰化氫+ 二氧化碳+2還原型輔酶二氧化碳+乙酸+亞鐵細胞色素bl丙酮酸脫氫酶丙酮酸+高鐵細胞色素bl+水丙酮酸+輔酶A+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶。
2.一種甘氨酸的測定方法，其特征在于該方法的步驟如下 2. 1樣品準備2. 1.1標準樣品的制備將一定量的甘氨酸溶于水或緩沖液中，再將其濃度調(diào)整到1毫摩爾/升； 2. 1.2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升； 2. 2試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC1. 2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 1.51)、乙酸、亞鐵細胞色素bl與輔酶A，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. l-5mmol/ L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-100mmol/L ；2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化；2.6數(shù)據(jù)處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到甘氨酸的含量
3.根據(jù)權利要求1、2所述的測定方法，其特征在于使用全自動生化分析儀測定時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣，然后在下述條件下進行測定測定方法為速率法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甘氨酸樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為正反應，延遲時間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩(wěn)定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、 NAD+ 或 thio-NAD+ 的輔酶。
5.根據(jù)權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于 5. 1所述的試劑溶液配制成如下單劑試劑它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A、氰化氫合成酶、 丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 2. 2)與丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51)組成的； 5. 2所述的試劑溶液配制成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl與輔酶A組成的； 試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.2.2)與丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51)組成的；其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC1. 2. 1. 51)、 乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。5.3所述的試劑配制成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl與輔酶A組成的； 試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.2.2)與丙酮酸脫氫酶 (EC 1. 2. 1. 51)組成的；試劑3，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與氰化氫合成酶組成的； 其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC1. 2. 1. 51)、 乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種甘氨酸測定試劑盒，其特征在于6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們?nèi)芙獾玫骄哂邢率鰸舛确秶目芍苯邮褂玫囊后w試劑緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L輔酶0. l-5mmol/L氰化氫合成酶1000-80000U/L丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 2. 2) 1000-80000U/L 丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51) 1000-80000U/L乙酸l-100mmol/L亞鐵細胞色素bll-100mmol/L輔酶 Al-100mmol/Lo6. 2根據(jù)權利要求6. 1所述的甘氨酸測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L輔酶0.l-5mmol/L乙酸l-100mmol/L亞鐵細胞色素bll-100mmol/L輔酶Al-100mmol/L組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L氰化氫合成酶1000-80000U,丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 2. 2)1000-80000U/丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 1. 51)1000-80000U/6. 3根據(jù)權利要求6. 1所述的甘氨酸測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L輔酶0.l-5mmol/L乙酸l-100mmol/L亞鐵細胞色素bll-100mmol/L輔酶Al-100mmol/L組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 2. 2) 1000-80000U/丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 1. 51) 1000-80000U/組成如下的試劑3 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L氰化氫合成酶1000-80000U/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的甘氨酸含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術原理是依據(jù)氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.2.2)、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.1.51)的系列催化反應完成，本發(fā)明還涉及一種甘氨酸測定試劑盒。本發(fā)明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發(fā)明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用于食品檢驗。
文檔編號G01N33/68GK102298049SQ201010215540
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權日2010年6月25日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司