專(zhuān)利名稱(chēng)：多種小分子化合物的同步間接競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于微球的小分子多殘留熒光免疫檢測(cè)方法，特別是涉及一種以 藻紅蛋白為熒光標(biāo)記物、聚苯乙烯熒光編碼微球?yàn)楣滔噍d體的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)法及使用 的試劑盒。
背景技術(shù)：
食品中的獸藥、農(nóng)藥、添加劑等小分子殘留物問(wèn)題是影響民生的重大問(wèn)題，已成為 國(guó)內(nèi)外廣為關(guān)注的食品安全問(wèn)題之一。目前檢測(cè)常用的方法主要包括微生物法、色譜法 (如高效液相色譜法，HPLC)或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(如液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法，LC-MS)； 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。微生物檢測(cè)法操作簡(jiǎn)單，但檢測(cè)周期長(zhǎng)且結(jié)果誤差較大。色譜法 或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)靈敏度高，結(jié)果可靠，但測(cè)定方法繁瑣、費(fèi)時(shí)，成本高，操作人員需要 經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，難以普及。ELISA法是利用酶標(biāo)記物的競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)方法，近年來(lái)被廣為 用作定性或半定量檢測(cè)的快速篩查方法，在一定程度上縮短了檢測(cè)時(shí)間，但是一次只能檢 測(cè)一種靶標(biāo)物，不利于大量樣品的快速篩選。懸液芯片(又稱(chēng)懸浮芯片、液相芯片)系統(tǒng)是上世紀(jì)90年代中期新興的一種多功 能、高通量的液相分析平臺(tái)，該系統(tǒng)主要基于流式熒光編碼微球?yàn)檩d體和熒光探針進(jìn)行免 疫檢測(cè)，檢測(cè)通量大、靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)同步檢測(cè)多靶標(biāo)，理論上可檢測(cè)100種靶標(biāo)物。該技 術(shù)最先被應(yīng)用在細(xì)胞、基因、抗體、病毒檢測(cè)等基因研究與生物醫(yī)療診斷領(lǐng)域，后來(lái)延伸到 動(dòng)植物中病毒等的檢測(cè)與監(jiān)控。近幾年，人們繼續(xù)拓展該平臺(tái)的應(yīng)用領(lǐng)域，希望能將該項(xiàng)技 術(shù)應(yīng)用到小分子殘留物的檢測(cè)，從而能達(dá)到對(duì)小分子有害殘留物的及時(shí)發(fā)現(xiàn)和監(jiān)控管理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于微球的間接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫檢測(cè)法，實(shí)現(xiàn)用不同的編 碼微球和同一種熒光探針可同時(shí)檢測(cè)同一樣品中多種小分子化合物抗原成分或者同時(shí)檢 測(cè)多個(gè)樣品中的不同種小分子化合物抗原成分。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供了一種在此檢測(cè)方法過(guò)程中使用的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明是以藻紅蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，應(yīng)用于抗原抗體特異性競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的一種熒光 免疫檢測(cè)法，由于微球根據(jù)內(nèi)部包埋熒光染料的比例不同進(jìn)行編碼，選用不同編碼的微球 作為固相載體，連接不同的捕獲抗原，然后進(jìn)行混合，在96孔濾膜板上進(jìn)行反應(yīng)，可以克服 ELISA只能檢測(cè)單一靶標(biāo)物的缺點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)同一樣品中多種待測(cè)小分子抗原，或者在不 同微孔板中檢測(cè)不同樣品中的單種或多種待測(cè)小分子抗原，旨在提高檢測(cè)通量，提高檢測(cè) 速度。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下首先，將合成的蛋白偶聯(lián)抗原作為捕獲抗原包被在聚苯乙烯微球上，形成微 球_捕獲抗原偶聯(lián)物，在96孔濾膜板上，微球-捕獲抗原偶聯(lián)物與待測(cè)物中小分子抗原競(jìng) 爭(zhēng)與檢測(cè)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，其中，與小分子抗原結(jié)合的檢測(cè)抗體經(jīng)洗滌抽濾而被從反應(yīng)體系中去除，而與微球-捕獲抗原偶聯(lián)物反應(yīng)的檢測(cè)抗體與后續(xù)加入的熒光探針(如藻 紅蛋白標(biāo)記的二抗)進(jìn)行特異性結(jié)合形成微球-捕獲抗原-檢測(cè)抗體-二抗-藻紅蛋白熒 光免疫復(fù)合體，經(jīng)儀器檢測(cè)熒光信號(hào)便可完成檢測(cè)過(guò)程。所述的蛋白偶聯(lián)抗原，即捕獲抗原，是指將不具備免疫原性的小分子化合物與大 分子載體蛋白進(jìn)行合成，其中大分子載體蛋白可以是牛血清白蛋白(BSA)，也可以是卵清白 蛋白(OVA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)。
所述微球-捕獲抗原偶聯(lián)物是指使用碳二亞胺法，1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基 碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)活化微球表面的羧基官能團(tuán)，然后 與捕獲抗原上的氨基反應(yīng)，從而以共價(jià)鍵方式形成微球-捕獲抗原偶聯(lián)物。所述檢測(cè)抗體是指抗捕獲抗原也即抗待測(cè)小分子抗原的單克隆抗體或多克隆抗 體，檢測(cè)抗體可與微球-捕獲抗原偶聯(lián)物發(fā)生特異性反應(yīng)，如果體系中有待測(cè)抗原存在則 待測(cè)抗原也會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地與檢測(cè)抗體發(fā)生特異性結(jié)合。所述藻紅蛋白標(biāo)記的二抗是指用藻紅蛋白作為熒光探針標(biāo)記的抗單克隆抗體或 多克隆抗體的二抗。所述微球_捕獲抗原_檢測(cè)抗體_ 二抗-藻紅蛋白熒光免疫復(fù)合體，是指在待測(cè) 抗原與捕獲抗原競(jìng)爭(zhēng)與檢測(cè)抗體發(fā)生反應(yīng)結(jié)束后，加入的藻紅蛋白標(biāo)記的二抗與微球-捕 獲抗原_檢測(cè)抗體復(fù)合物進(jìn)行繼續(xù)特異性反應(yīng)生成的復(fù)合物，而待測(cè)抗原_檢測(cè)抗體復(fù)合 物與藻紅蛋白標(biāo)記的二抗如果發(fā)生反應(yīng)生成的復(fù)合物則會(huì)通過(guò)洗滌而用96孔濾膜板的抽 濾離開(kāi)反應(yīng)體系。所述96孔濾膜板是指框架與常規(guī)酶標(biāo)板一致，板底使用親水性濾膜進(jìn)行替代的 反應(yīng)板，使用的濾膜孔徑小于微球粒徑，未與微球_捕獲抗原結(jié)合的熒光免疫復(fù)合物則可 以透過(guò)濾膜，經(jīng)真空抽濾后從反應(yīng)體系中被去除。所述熒光檢測(cè)是指用懸液芯片或流式分析系統(tǒng)中的兩束熒光，定性區(qū)分不同的編 碼微球從而確定存在的不同的捕獲抗原，定量確定熒光免疫復(fù)合體的熒光強(qiáng)度。通常樣品 中小分子待測(cè)抗原濃度越大，與捕獲抗原競(jìng)爭(zhēng)越多，與檢測(cè)抗體結(jié)合的微球_捕獲抗原復(fù) 合物越少，則測(cè)得的熒光強(qiáng)度值越低。上述的小分子待測(cè)抗原可以是任何一種農(nóng)藥、獸藥、真菌毒素、激素、有害添加物、 食品添加劑等，可以是抗生素如卡那霉素、慶大霉素、頭孢氨芐，可以是對(duì)硫磷、甲胺磷，還 可以是三聚氰胺。使用不同的單克隆抗體或多克隆抗體就可以檢測(cè)不同的相應(yīng)的待測(cè)抗 原。本發(fā)明的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)法，所說(shuō)的懸液芯片或流式分析系統(tǒng)激光光源發(fā)射波 長(zhǎng)為488nm或532nm和635nm。目前，美國(guó)Luminex公司、Bio-Rad公司可提供滿(mǎn)足測(cè)試要 求的檢測(cè)儀器及編碼微球。一種藻紅蛋白為熒光標(biāo)記物、聚苯乙烯微球?yàn)楣滔噍d體的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)法診 斷試劑盒，包括以下試劑(1)基于聚苯乙烯熒光編碼微球包被有捕獲抗原的微球_捕獲抗原偶聯(lián)物；(2)藻紅蛋白標(biāo)記的抗鼠(或抗兔或抗雞等)二抗；(3)檢測(cè)抗體；(4)陽(yáng)性對(duì)照；
(5)陰性對(duì)照；(6)PH 7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液。包被有捕獲抗原的聚苯乙烯熒光微球是幾種捕獲抗原結(jié)合在不同編碼微球的混 合物，檢測(cè)抗體是抗幾種捕獲抗原的單克隆抗體或多克隆抗體的混合物。使用方法將試劑按說(shuō)明書(shū)稀釋后按以下流程操作。
(1)制備熒光免疫復(fù)合體在96孔濾膜板中同時(shí)加入包被有捕獲抗原的聚苯乙烯 熒光編碼微球、待測(cè)樣品和檢測(cè)抗體，37°C避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)后抽濾掉孔內(nèi)反應(yīng)液， 加入藻紅蛋白標(biāo)記的抗鼠(或抗兔或抗雞等)二抗37°C避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，形成微 球_捕獲抗原_檢測(cè)抗體_ 二抗_藻紅蛋白熒光免疫復(fù)合體；(2)熒光強(qiáng)度檢測(cè)用懸液芯片或流式分析系統(tǒng)進(jìn)行激光激發(fā)并檢測(cè)熒光免疫復(fù) 合體的熒光強(qiáng)度。本發(fā)明集中了分子生物學(xué)、免疫學(xué)、激光物理學(xué)、微流體學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等多門(mén)學(xué) 科的優(yōu)勢(shì)。針對(duì)生物樣品檢測(cè)通量大、靈敏度高；可自動(dòng)校正、校驗(yàn)保證和控制樣品間差異、 板間差異、系統(tǒng)間差異；短時(shí)間內(nèi)可完成96個(gè)樣品的檢測(cè)并獲得多達(dá)上萬(wàn)個(gè)分析數(shù)據(jù)；并 且項(xiàng)目檢測(cè)靈活，可自由組合，可以根據(jù)預(yù)期用量大小，選用一定量的某些微球標(biāo)記好相應(yīng) 的捕獲抗原然后混合分裝即可。


圖1間接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫復(fù)合體結(jié)構(gòu)及形成過(guò)程示意圖。圖2基于微球的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫法檢測(cè)慶大霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；圖3基于微球的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫法檢測(cè)萊克多巴胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；圖4基于微球的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫法同步檢測(cè)卡那霉素、慶大霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；圖5基于微球的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫法同步檢測(cè)卡那霉素、慶大霉素、頭孢氨芐的標(biāo)準(zhǔn) 曲線(xiàn)；
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1 慶大霉素的微球間接競(jìng)爭(zhēng)免疫熒光檢測(cè)，包括以下具體的步驟1、微球-捕獲抗原偶聯(lián)取1.25X IO6個(gè)微球?yàn)橐慌危?. 5mL離心管中，使用EDC、sulfo-NHS溶液 在PH6. 2條件下對(duì)微球表面羧基進(jìn)行常溫活化20分鐘，然后將微球置換到磷酸鹽緩沖液 (PBS，0. 01M, PH7. 4)中，加入優(yōu)化量的慶大霉素-BSA偶聯(lián)的捕獲抗原，避光振搖常溫反應(yīng)2 小時(shí)，離心洗掉未結(jié)合的捕獲抗原，用含BSA的PBS重懸，避光振搖常溫反應(yīng)0. 5小時(shí)， 封閉微球表面未與捕獲抗原結(jié)合的剩余位點(diǎn)，最后，用含0. 1% BSA的PBS儲(chǔ)存微球-捕獲 抗原偶聯(lián)物。2、藻紅蛋白-二抗標(biāo)記首先使用琥珀酰亞4-[N-甲基馬來(lái)酸]-1-羧環(huán)己烷(SMCC)還原藻紅蛋白，過(guò)葡 聚糖凝膠柱去除游離的SMCC ；然后使用二硫蘇糖醇(DTT)還原抗體，室溫避光反應(yīng)0. 5小時(shí)，過(guò)過(guò)葡聚糖凝膠柱去除游離的DTT ；最后將抗體按優(yōu)化比例滴加到藻紅蛋白中，室溫避 光反應(yīng)2小時(shí)，用N-乙基馬來(lái)酰亞胺封閉20分鐘，用含0. 05%疊氮化鈉的PBS保存。3、微球_捕獲抗原_檢測(cè)抗體_ 二抗-藻紅蛋白復(fù)合體形成在96孔濾膜板中，同時(shí)加入微球-慶大霉素捕獲抗原偶聯(lián)物、慶大霉素待測(cè)物、慶 大霉素單克隆抗體，37°C避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，抽濾掉板上孔中反應(yīng)液，其中與慶大霉 素待測(cè)物結(jié)合的慶大霉素單克隆抗體隨反應(yīng)液被抽濾掉，與微球_慶大霉素捕獲抗原偶聯(lián) 物結(jié)合的抗慶大霉素單克隆抗體留在孔中；然后加入藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37°C避 光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，二抗與孔中單克隆抗體特異性結(jié)合，形成微球_捕獲抗原_檢測(cè)抗 體-二抗-藻紅蛋白復(fù)合體。4、定量熒光檢測(cè)該檢測(cè)方法的測(cè)定原理是通過(guò)檢測(cè)96孔濾膜板上孔內(nèi)結(jié)合到微球上的捕獲抗 原檢測(cè)抗體_ 二抗-藻紅蛋白免疫復(fù)合體的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)待側(cè)物的檢測(cè)?？膳c標(biāo)準(zhǔn)曲 線(xiàn)對(duì)比求出樣品中的慶大霉素濃度。結(jié)合到微球上的檢測(cè)抗體量不同，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度 不同。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將已知慶大霉素含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成由低到高7種不同濃度，重復(fù) 步驟3的操作，用與待測(cè)樣本相同的方法可以測(cè)定每種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度， 以慶大霉素濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，設(shè)空白對(duì)照時(shí)的平均熒光強(qiáng)度(MFi) SMFIc^MFVMFIqW 比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖2。實(shí)施例2 萊克多巴胺的微球間接競(jìng)爭(zhēng)免疫熒光檢測(cè)，包括以下具體的步驟如同實(shí)施例1的各步操作，不同的是捕獲抗原和檢測(cè)抗體為萊克多巴胺-BSA偶聯(lián) 物和抗萊克多巴胺的單克隆抗體，待檢測(cè)小分子抗原是萊克多巴胺。同樣將含有萊克多巴 胺的待測(cè)樣本加入到反應(yīng)體系中，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比求出樣品中的萊克 多巴胺的濃度。以萊克多巴胺濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，MFVMFItl的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線(xiàn)，見(jiàn)圖3。實(shí)施例3 卡那霉素與慶大霉素同步檢測(cè)的微球間接競(jìng)爭(zhēng)免疫熒光檢測(cè)，包括以下具體的步 驟1、微球-捕獲抗原偶聯(lián)取編碼分別為20、30的微球各1. 25X IO6個(gè)為一批次，在2個(gè)1. 5mL離心管中，使 用EDC、sulfo-NHS溶液在PH6. 2條件下對(duì)微球表面羧基進(jìn)行常溫活化20分鐘，然后將微 球置換到磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01M，PH7.4)中，分別加入優(yōu)化量的卡那霉素-BSA、慶大霉 素-BSA偶聯(lián)的捕獲抗原，避光振搖常溫反應(yīng)2小時(shí)，離心洗掉未結(jié)合的捕獲抗原，用含 BSA的PBS重懸，避光振搖常溫反應(yīng)0.5小時(shí)，封閉微球表面未與捕獲抗原結(jié)合的剩余位點(diǎn)， 最后，用含0. 1% BSA的PBS儲(chǔ)存微球-捕獲抗原偶聯(lián)物。將與編碼20的微球相連的卡那 霉素捕獲抗原和與編碼30的微球相連的慶大霉素捕獲抗原等比例混合，用來(lái)同時(shí)檢測(cè)可 能含有卡那霉素、慶大霉素的待測(cè)樣本。2、藻紅蛋白-二抗標(biāo)記藻紅蛋白標(biāo)記二抗的步驟如同實(shí)施例1的各步操作。3、微球_捕獲抗原_檢測(cè)抗體_ 二抗-藻紅蛋白復(fù)合體形成
在96孔濾膜板中，同時(shí)加入微球20-卡那霉素捕獲抗原與微球30-慶大霉素捕 獲抗原混合物、卡那霉素待測(cè)物和/或慶大霉素待測(cè)物、卡那霉素單克隆抗體與慶大霉素 單克隆抗體混合物，37°C避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，抽濾掉板上孔中反應(yīng)液，與微球20-卡 那霉素捕獲抗原偶聯(lián)物結(jié)合的抗卡那霉素單克隆抗體留在孔中，與微球30-慶大霉素捕獲 抗原偶聯(lián)物結(jié)合的抗慶大霉素單克隆抗體留在孔中；然后加入藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗鼠二 抗，37°C避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，二抗與孔中單克隆抗體特異性結(jié)合，形成微球_捕獲抗 原_檢測(cè)抗體_ 二抗_藻紅蛋白復(fù)合體。4、定量熒光檢測(cè)該檢測(cè)方法的測(cè)定原理是通過(guò)檢測(cè)96孔濾膜板上孔內(nèi)結(jié)合到微球上的捕獲抗 原_檢測(cè)抗體_二抗-藻紅蛋白免疫復(fù)合體的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)待側(cè)物的檢測(cè)?？膳c標(biāo)準(zhǔn)曲 線(xiàn)對(duì)比求出樣品中的卡那霉素或/和慶大霉素濃度。結(jié)合到微球上的檢測(cè)抗體量不同，檢 測(cè)到的熒光強(qiáng)度不同。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將已知卡那霉素和慶大霉素含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成 由低到高7種不同濃度，重復(fù)步驟3的操作，用與待測(cè)樣本相同的方法可以測(cè)定每種濃度的 標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，分別以卡那霉素、慶大霉素濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，MFVMFItl的比 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖4。實(shí)施例4 卡那霉素、慶大霉素、頭孢氨芐同步檢測(cè)的微球間接競(jìng)爭(zhēng)免疫熒光檢測(cè)，包括以下 具體的步驟1、微球-捕獲抗原偶聯(lián)取編碼分別為20、30、40的微球各1. 25 X IO6個(gè)為一批次，在3個(gè)1. 5mL離心管中， 使用EDC、sulfo-NHS溶液在PH6. 2條件下對(duì)微球表面羧基進(jìn)行常溫活化20分鐘，然后將微 球置換到磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01M，PH7.4)中，分別加入優(yōu)化量的卡那霉素-BSA、慶大霉 素-BSA、頭孢氨芐-OVA偶聯(lián)的捕獲抗原，避光振搖常溫反應(yīng)2小時(shí)，離心洗掉未結(jié)合的捕 獲抗原，用含牛血清白蛋白(BSA)的PBS重懸，避光振搖常溫反應(yīng)0.5小時(shí)，封閉微球 表面未與捕獲抗原結(jié)合的剩余位點(diǎn)，最后，用含0. 1% BSA的PBS儲(chǔ)存微球-捕獲抗原偶聯(lián) 物。將與編碼20的微球相連的卡那霉素捕獲抗原、與編碼30的微球相連的慶大霉素捕獲 抗原和與編碼40的微球相連地頭孢氨芐捕獲抗原等比例混合，用來(lái)同時(shí)檢測(cè)可能含有卡 那霉素、慶大霉素、頭孢氨芐的待測(cè)樣本。2、藻紅蛋白-二抗標(biāo)記藻紅蛋白標(biāo)記二抗的步驟如同實(shí)施例1的各步操作。3、微球_捕獲抗原_檢測(cè)抗體_ 二抗-藻紅蛋白復(fù)合體形成在96孔濾膜板中，同時(shí)加入微球20-卡那霉素捕獲抗原、微球30-慶大霉素捕獲 抗原與微球40-頭孢氨芐捕獲抗原混合物，卡那霉素待測(cè)物和/或慶大霉素待測(cè)物和/或 頭孢氨芐待測(cè)物，卡那霉素單克隆抗體、慶大霉素單克隆抗體與頭孢氨芐單克隆抗體混合 物，37°C避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，抽濾掉板上孔中反應(yīng)液，與微球20-卡那霉素捕獲抗原 偶聯(lián)物結(jié)合的抗卡那霉素單克隆抗體留在孔中，與微球30-慶大霉素捕獲抗原偶聯(lián)物結(jié)合 的抗慶大霉素單克隆抗體留在孔中，與微球40-頭孢氨芐捕獲抗原偶聯(lián)物結(jié)合的抗頭孢氨 芐單克隆抗體留在孔中；然后加入藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37°C避光振搖反應(yīng)0. 5-1 小時(shí)，二抗與孔中單克隆抗體特異性結(jié)合，形成微球_捕獲抗原_檢測(cè)抗體_ 二抗_藻紅蛋白復(fù)合體。4、定量熒光檢測(cè)該檢測(cè)方法的測(cè)定原理是通過(guò)檢測(cè)96孔濾膜板上孔內(nèi)結(jié)合到微球上的捕獲抗 原_檢測(cè)抗體_ 二抗-藻紅蛋白免疫復(fù)合體的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)待側(cè)物的檢測(cè)?？膳c標(biāo)準(zhǔn)曲 線(xiàn)對(duì)比求出樣品中的卡那霉素或/和慶大霉素或/和頭孢氨芐濃度。結(jié)合到微球上的檢測(cè) 抗體量不同，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度不同。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將已知卡那霉素、慶大霉素和頭孢氨 芐含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成由低到高7種不同濃度，重 復(fù)步驟3的操作，用與待測(cè)樣本相同的 方法可以測(cè)定每種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，分別以卡那霉素、慶大霉素、頭孢氨芐 濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，MFVMFItl的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖5。實(shí)施例5 慶大霉素的微球間接競(jìng)爭(zhēng)免疫熒光檢測(cè)試劑盒，組成包括(1)包被有慶大霉素捕獲抗原的聚苯乙烯熒光微球；(2)藻紅蛋白標(biāo)記的抗鼠二抗；(3)抗慶大霉素單克隆抗體；(4)陽(yáng)性對(duì)照；(5)陰性對(duì)照；(6)PH 7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液。試劑盒中每個(gè)組分的制備及使用方法、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制同實(shí)施例1。實(shí)施例6 卡那霉素、慶大霉素、頭孢氨芐的微球間接競(jìng)爭(zhēng)免疫熒光檢測(cè)試劑盒，組成包括(1)包被有卡那霉素捕獲抗原的聚苯乙烯熒光微球20、包被有慶大霉素捕獲抗原 的聚苯乙烯熒光微球30、包被有頭孢氨芐捕獲抗原的聚苯乙烯熒光微球40的混合物；(2)藻紅蛋白標(biāo)記的抗鼠二抗；(3)抗卡那霉素單克隆抗體、慶大霉素單克隆抗體、頭孢氨芐單克隆抗體混合物；(4)陽(yáng)性對(duì)照；(5)陰性對(duì)照；(6)PH 7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液。試劑盒中每個(gè)組分的制備及使用方法、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制同實(shí)施例4。
權(quán)利要求
一種基于熒光微球的用于小分子化合物多殘留同步檢測(cè)的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)方法，其特征在于將不具備免疫原性的小分子化合物與大分子載體蛋白反應(yīng)形成捕獲抗原，以具有表面功能基團(tuán)的聚苯乙烯熒光編碼微球作為固相載體，將捕獲抗原以共價(jià)鍵方式包被到聚苯乙烯微球上，形成微球-捕獲抗原偶聯(lián)物，可與待測(cè)小分子化合物抗原競(jìng)爭(zhēng)與檢測(cè)抗體的特異性反應(yīng)，用懸液芯片或流式分析系統(tǒng)對(duì)逐一流過(guò)檢測(cè)區(qū)的微球上所負(fù)載的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比，求出待測(cè)抗原的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于微球-捕獲抗原偶聯(lián)物的形成過(guò)程 是，在96孔濾膜板內(nèi)的微球_捕獲抗原偶聯(lián)物的體系中加入待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體，捕獲抗 原和待測(cè)樣品中的小分子化合物抗原競(jìng)爭(zhēng)與檢測(cè)抗體發(fā)生的特異性反應(yīng)，再通過(guò)二抗與檢 測(cè)抗體的特異性結(jié)合形成基于微球的間接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫復(fù)合體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于基于微球的間接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫復(fù)合 體的形成是以藻紅蛋白作為熒光標(biāo)記物，用藻紅蛋白標(biāo)記二抗，在加入的微球-捕獲抗原 偶聯(lián)物、待測(cè)樣品中小分子化合物抗原與檢測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)完后，加入藻紅蛋白標(biāo)記的二 抗形成微球_捕獲抗原_檢測(cè)抗體_ 二抗_藻紅蛋白的間接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫復(fù)合體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于根據(jù)內(nèi)部包埋熒光染料的比例不同， 對(duì)微球進(jìn)行編碼，不同的編碼微球連接不同的捕獲抗原，加入對(duì)應(yīng)的檢測(cè)抗體，可同時(shí)檢測(cè) 同一樣品中的多種待測(cè)小分子化合物抗原，或者同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品中的不同種待測(cè)小分子 化合物抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的用懸液芯片或流式系統(tǒng)對(duì)逐 一流過(guò)檢測(cè)區(qū)的微球上所負(fù)載的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，是指檢測(cè)系統(tǒng)的兩束激光光源發(fā)射波 長(zhǎng)為488nm或532nm和635nm，一束通過(guò)判定微球內(nèi)包埋的染料比例從而對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性 分析，另一束通過(guò)測(cè)定微球上反應(yīng)連接的熒光探針強(qiáng)度從而對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2、3所述的檢測(cè)方法，其特征在于上述待測(cè)物中的小分子化合 物抗原可以是農(nóng)藥、獸藥、真菌毒素、激素、有害添加物、食品添加劑等；相應(yīng)的檢測(cè)抗體應(yīng) 為特異性抗每種待測(cè)抗原的單或多克隆抗體，使用不同的抗體，就可檢測(cè)不同的相應(yīng)的待 測(cè)小分子化合物抗原。
7.—種在權(quán)力要求1所述的基于熒光微球的小分子化合物多殘留同步檢測(cè)的間接競(jìng) 爭(zhēng)免疫檢測(cè)法診斷試劑盒，其特征在于組成包括(1)基于聚苯乙烯熒光編碼微球包被有捕獲抗原的微球-捕獲抗原偶聯(lián)物；(2)藻紅蛋白標(biāo)記的抗鼠(或抗兔、抗雞等)二抗；(3)檢測(cè)抗體；(4)陽(yáng)性對(duì)照；(5)陰性對(duì)照；(6)PH7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利7所述的試劑盒，其特征在于包被有捕獲抗原的聚苯乙烯熒光編碼微球 是幾種小分子化合物的合成抗原對(duì)應(yīng)連接在不同熒光編碼微球上的混合物，檢測(cè)抗體是抗 幾種抗原的單或多克隆抗體混合物，用該試劑盒同時(shí)檢測(cè)同一樣品中相應(yīng)的幾種小分子化 合物抗原，或者同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品中相應(yīng)的不同小分子化合物抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于熒光編碼微球的同步檢測(cè)多種小分子化合物的間接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫檢測(cè)法及檢測(cè)試劑盒，是以編碼微球作為固相載體，以藻紅蛋白作為熒光標(biāo)記物，用于小分子化合物抗原的競(jìng)爭(zhēng)特異性反應(yīng)的一種液相免疫檢測(cè)法。首先，將捕獲抗原共價(jià)結(jié)合在編碼微球表面，在濾膜板中，經(jīng)捕獲抗原、檢測(cè)抗體、二抗特異性結(jié)合形成微球-捕獲抗原-檢測(cè)抗體-二抗-藻紅蛋白的間接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫復(fù)合體，然后逐一流經(jīng)懸液芯片或流式分析系統(tǒng)的檢測(cè)區(qū)，經(jīng)識(shí)別不同編碼微球并檢測(cè)藻紅蛋白熒光強(qiáng)度完成檢測(cè)。用不同編碼微球連接不同捕獲抗原，可以同步檢測(cè)同一樣本中的多種小分子抗原，也可檢測(cè)不同樣本中的單個(gè)或多個(gè)待測(cè)小分子抗原，具有快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101871937SQ201010202588
公開(kāi)日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者劉天龍, 王燕飛, 鄒明強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院