專利名稱：Hla抗體特異性檢測微顆粒及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及免疫檢測試劑盒，特別是一種HLA抗體特異性檢測微顆粒及試劑盒。

背景技術(shù)：
在臨床醫(yī)學(xué)上，一些疾病會(huì)引發(fā)腎臟病變，當(dāng)病人的腎臟疾病發(fā)展到只能依靠透析來維持生命時(shí)，則稱其為終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)。對于終末期腎病病人，腎移植是一種長期有效的治療方法。人們在進(jìn)行器官移植的研究中發(fā)現(xiàn)，與移植有關(guān)的抗原為HLA-I類和-II類抗原，如表1所示，為目前HLA配型中需要做配型檢測五個(gè)HLA基因位點(diǎn)的HLA抗原即HLA-A，-B，-Cw，-DR，-DQ位點(diǎn)的HLA抗原(R.Holdsworth，C.K.Hurley，S.G.E.Marsh，M.Lau，H.J.Noreen，J.H.Kempenich，M.Setterholm and M.Maiers，The HLAdictionary 2008a summary of HLA-A，-B，-C，-DRB1/3/4/5，and-DQB1 alleles and theirassociation with serologically defined HLA-A，-B，-C，-DR，and-DQ antigens，Tissue Antigens(73)，95-170，2009))。
表1HLA抗原表(HLA-A，-B，-Cw，-DR，-DQ位點(diǎn)) 由于輸血和妊娠等原因，在暴露于異體HLA抗原后，病人體液免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生抗HLA抗體。腎移植初步成功的關(guān)鍵取決于受體血液中是否含有HLA抗體以及HLA抗體的特異性，即如果患者血液中沒有可以識(shí)別供者HLA抗原的抗體，則更可能移植成功，因此，為了保證移植腎的存活，移植前對受體進(jìn)行HLA抗體特異性檢測，不僅是絕對必要的，而且有助于快速地找到適合的供體腎。準(zhǔn)確靈敏的抗體檢測分析方法能夠預(yù)測并杜絕腎移植超急性排斥(hyperacute rejection)的發(fā)生，同時(shí)也可以顯著地降低腎移植術(shù)后早期急性排斥(early acuterejection)的發(fā)生。
HLA抗體特異性包括針對單一HLA抗原的抗體和針對交叉反應(yīng)組(cross reactive group，CREG)的抗體。Takemoto等(1994)提出交叉反應(yīng)組配型的概念，即由于某些HLA抗原氨基酸分子結(jié)構(gòu)相近，HLA抗原分子之間具有公共抗原決定簇，可與同一種HLA抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，這些與同一種HLA抗體發(fā)生反應(yīng)的HLA抗原決定簇稱為交叉反應(yīng)組；目前常規(guī)檢測的I類HLA抗原可歸納為9個(gè)交叉反應(yīng)組，如表2所示，摘自(Glenn E.Rodey，“HLA beyondtearsintroduction to human histocompatibility”，the third and fourth chapters，2nd edition，2000)。
表2交叉反應(yīng)組類型及各組所包含的抗原

目前人們普遍基于抗體抗原吸附劑測定(ELISA)或流式點(diǎn)陣儀(Luminex)兩種檢測方法來檢查HLA抗體特異性。目前國外主要使用Luminex xMAP微顆粒外裹人工合成的單一HLA抗原，在流式點(diǎn)陣儀上檢測HLA抗體的特異性。使用人工合成的單一HLA抗原具有兩個(gè)缺點(diǎn)，第一，不同的微顆粒表面人工合成抗原濃度很難保持相同，致使反應(yīng)強(qiáng)度無法一致；第二，人工合成抗原中氨基酸三維折疊形式的細(xì)微改變，可以影響抗體對抗原的識(shí)別，會(huì)減弱抗原抗體反應(yīng)的靈敏性；只有One Lambda公司的FlowPRA Specific試劑是使用天然HLA抗原包被微顆粒并在流式細(xì)胞儀上檢測二抗熒光強(qiáng)度，但是其包括的檢測底物種類即提供HLA抗原的細(xì)胞目錄數(shù)目太少，難以一次性完成HLA抗體特異性檢測，使用者欠靈活性。
發(fā)明申請“HLA抗體特異性檢測方法及細(xì)胞盤與試劑盒”的說明書中公開了一種采用人淋巴細(xì)胞上的天然HLA抗原制備而成的細(xì)胞盤來檢測HLA抗體特異性的方法，其特點(diǎn)是發(fā)明人通過調(diào)整細(xì)胞盤上HLA抗原頻率，使細(xì)胞盤也能夠檢測出具有高PRA值的血清標(biāo)本的HLA抗體特異性，最大限度地克服了抗原重疊現(xiàn)象對HLA檢測的限制，集合了天然抗原的優(yōu)勢和流式細(xì)胞儀的高靈敏檢測特性。由于細(xì)胞盤使用人的淋巴細(xì)胞進(jìn)行抗體檢測，交叉配型也同樣使用人的淋巴細(xì)胞進(jìn)行移植前的最后檢測，二者的檢測結(jié)果的可比性遠(yuǎn)高于其它抗體檢測結(jié)果與交叉配型結(jié)果的可比性，因而經(jīng)過細(xì)胞盤試劑盒檢測、驗(yàn)證的抗體特異性結(jié)果可以直接用于虛擬交叉配型，達(dá)到準(zhǔn)確地指導(dǎo)臨床工作的目的。然而，細(xì)胞盤試劑盒同時(shí)也具有其在制作和使用上的局限性。由于T淋巴細(xì)胞上攜帶I類HLA抗原，B淋巴細(xì)胞上既帶有I類也帶有II類HLA抗原，當(dāng)僅采用T細(xì)胞作為抗原供體時(shí)，細(xì)胞盤試劑盒只能檢測I類抗體，且T細(xì)胞只能來自供體的外周血，而不適宜進(jìn)行人工培養(yǎng)，當(dāng)制作細(xì)胞盤用完一批外周血后，需要由志愿者再次捐獻(xiàn)，因而限制這種方法的推廣應(yīng)用；當(dāng)僅采用B淋巴細(xì)胞作為抗原供體時(shí)，I類HLA抗原與II類HLA抗原會(huì)相互遮蔽反應(yīng)結(jié)果，使人們無法輕易判斷陽性結(jié)果是在哪一類HLA抗原上發(fā)生的；同時(shí)采用T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞作為抗原供體時(shí)，當(dāng)待測血清中無I類HLA抗體時(shí)或者I類HLA抗體水平很低時(shí)能夠檢測出II類HLA抗體特異性，但是仍然無法避免特殊情況下I類HLA抗體對II類HLA抗體的遮蔽作用，同時(shí)也會(huì)被T淋巴細(xì)胞的來源有限而限制這類檢測方法的推廣應(yīng)用。另外，做成的細(xì)胞盤不易運(yùn)輸和保存，使用起來欠靈活。再有，有些病人的血清中可能含有抗自身非HLA抗原的抗體，這些抗自身非HLA抗原的抗體與正常人淋巴細(xì)胞膜上的非HLA抗原蛋白結(jié)合后，會(huì)干擾或者減弱細(xì)胞盤檢測的靈敏性和特異性 PRA，指群體反應(yīng)性抗體，即待測血清與隨機(jī)供體群中每個(gè)供體的HLA抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，呈陽性反應(yīng)的供體數(shù)量與該隨機(jī)供體群內(nèi)個(gè)體總數(shù)的比例。

實(shí)用新型內(nèi)容針對上述抗體檢測領(lǐng)域存在的問題，本實(shí)用新型提供HLA抗體特異性檢測微顆粒及試劑盒，能夠圓滿地完成絕大部分臨床病人標(biāo)本的HLA抗體特異性檢測工作，使用起來方便、靈活，易于運(yùn)輸，能夠同時(shí)分別檢測出I類和II類HLA抗體特異性，且供體細(xì)胞來源為人工培養(yǎng)的B細(xì)胞株，適于推廣使用。
HLA抗體特異性檢測微顆粒，其特征在于載體顆粒表面包被著來源于一個(gè)供體的B淋巴細(xì)胞上的I類或II類HLA抗原。
HLA抗體特異性檢測微顆粒試劑盒，包括外盒、放置于盒內(nèi)的支架和多個(gè)微顆粒管，所述支架上設(shè)置有試劑容器槽，所述微顆粒管放置在試劑容器槽中，其特征在于所述微顆粒管中盛有上述微顆粒，不同微顆粒管中的微顆粒上的HLA抗原不同。
所述試劑盒內(nèi)的微顆粒上的HLA抗原為HLA-A，HLA-B，HLA-Cw，HLA-DR，HLA-DQ位點(diǎn)下的HLA抗原。
所述微顆粒管為96個(gè)，呈陣列式分布。
所述96個(gè)微顆粒管為96孔PCR板。
所述試劑容器槽上還放置有盛裝熒光標(biāo)記二抗的標(biāo)記物管。
所述試劑容器槽上放置有盛裝陽性對照血清的陽性對照管和盛裝陰性對照血清的陰性對照管，所述陽性對照血清的PRA為100％，陰性對照血清的PRA為0％。
本實(shí)用新型一種HLA抗體特異性檢測微顆粒，是在載體顆粒上包被了天然HLA抗原，同一個(gè)微顆粒上只有來自源于一份B細(xì)胞的I類或II類HLA抗原，該微顆粒用于HLA抗體檢測時(shí)，兩類抗原的反應(yīng)結(jié)果分別檢查出來，不會(huì)互相遮蔽；包被抗原的來源為B淋巴細(xì)胞株，B淋巴細(xì)胞可人工培養(yǎng)，因此能為包被微顆粒提供源源不斷的HLA抗原，便于微顆粒的推廣應(yīng)用；由于包被的HLA抗原來源于B淋巴細(xì)胞，需要將I類或II類HLA抗原進(jìn)行分離純化，在HLA抗原分離、純化過程中，同時(shí)也棄除了細(xì)胞膜上非HLA抗原蛋白，使非特異性反應(yīng)大幅度降低，從而提高檢測的靈敏性和特異性。另外微顆粒上只含有HLA抗原蛋白，貯存時(shí)不需要-20℃以下的低溫環(huán)境，在0-10℃環(huán)境貯存即可，利于運(yùn)輸，便于推廣應(yīng)用。再有，微顆粒在檢測中操作方便，人們可以根據(jù)HLA抗體檢測的具體需要選擇包被著不同HLA抗原的多種微顆粒同時(shí)使用，即為人們提供了靈活多樣的底物選擇，且易于定量。
本實(shí)用新型為了使上述微顆粒得以推廣使用，提供一種HLA抗體特異性檢測微顆粒試劑盒，包括外盒、放置于盒內(nèi)的支架和多個(gè)微顆粒管，所述支架上設(shè)置有試劑容器槽，所述微顆粒管放置在試劑容器槽中，其特征在于所述微顆粒管中盛有上述微顆粒，不同微顆粒管中的微顆粒上的HLA抗原不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)HLA抗體特異性檢測的具體情況和需要，使試劑盒盛裝著多種不同的微顆粒和其他檢測中需要用到的試劑，為了運(yùn)輸中保證各種試劑及微顆粒管能放置穩(wěn)妥，在盒內(nèi)設(shè)了支架，各種試劑管或容器放置在支架上相應(yīng)的試劑容器槽中。
為了更進(jìn)一步提高上述微顆粒在檢測HLA抗體特異性中的實(shí)用性，使其可直接用于HLA抗體特異性檢測，本實(shí)用新型優(yōu)選設(shè)置成試劑盒內(nèi)所有微顆粒管中的微顆粒上的HLA抗原為HLA-A，HLA-B，HLA-Cw，HLA-DR，HLA-DQ位點(diǎn)下的HLA抗原。因?yàn)?，在大多?shù)情況下，檢測一份血清的HLA抗體特異性，需要檢測到其全面的HLA抗體特異性，如果提供的檢測底物即HLA抗原的類型不全面，則無法一次獲得血清的全面HLA抗體特異性。因此，本實(shí)用新型優(yōu)選提供可以一次性檢測血清的全面的HLA抗體特異性的試劑盒，試劑盒中的各種微顆粒與待測血清同時(shí)反應(yīng)并通過流式細(xì)胞儀檢測反應(yīng)結(jié)果，對檢查結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析后能夠一次性獲得一份待測血清中I類和II類HLA抗體特異性，提高了本實(shí)用新型微顆粒的實(shí)用性，真正能夠直接用于HLA抗體特異性檢測。
本實(shí)用新型的試劑盒優(yōu)選設(shè)置96個(gè)微顆粒管，微顆粒管呈陣列式排列，便于采用8個(gè)吸頭或者12個(gè)吸頭的移液槍，以提高檢測工作效率；96個(gè)微顆粒管的數(shù)量足以盛裝來自于60個(gè)供體的B淋巴細(xì)胞上的I類HLA抗原，34份B淋巴細(xì)胞的II類HLA抗原和一份陽性對照微顆粒和一份裸粒。全部94種微顆粒足以覆蓋表1所示的五個(gè)基因位點(diǎn)下的HLA抗原。如果可盛裝的微顆粒種類太少即供體份數(shù)太少，則增加了選擇合適供體的難度，若包括太多微顆粒管，則增加了檢測和分析的工作量，檢測效率受到影響。實(shí)際操作時(shí)，從96個(gè)微顆粒管中分別吸取等量微顆粒，移至一個(gè)空白96孔PCR板進(jìn)行抗體標(biāo)記，96種微顆粒能夠在流式細(xì)胞儀上一次完成檢測，使試劑盒的應(yīng)用更便捷。
本實(shí)用新型試劑盒優(yōu)選96孔PCR板代替上述96個(gè)微顆粒管。96孔PCR板為一體結(jié)構(gòu)，放置、移動(dòng)都非常方便穩(wěn)妥。
為了進(jìn)一步提高本實(shí)用新型使用過程中的實(shí)用性和便捷度，優(yōu)選所述試劑容器槽中還放置有標(biāo)記物管，管內(nèi)盛裝有熒光標(biāo)記二抗，熒光標(biāo)記二抗與微顆粒上結(jié)合的HLA抗體結(jié)合，二抗的熒光強(qiáng)度直接反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果。更進(jìn)一步，本實(shí)用新型試劑盒中的試劑容器槽中還放置有陽性對照管和陰性對照管，分別盛裝了PRA值為100％的陽性對照血清和PRA值為0％的陰性對照血清，進(jìn)一步提高試劑盒的使用便捷度。在進(jìn)行HLA抗體檢測時(shí)，陽性對照血清可以檢測微顆粒上包被的HLA抗原是否失效，陰性對照血清可以檢測微顆粒的熒光物本底，同時(shí)也可以檢測其它反應(yīng)試劑是否有污染。
綜上所述，本實(shí)用新型微顆粒及試劑盒的優(yōu)點(diǎn)可概括為1.用于檢測HLA抗體特異性的底物為天然的HLA抗原，但是該抗原的直接來源B細(xì)胞可以人工培養(yǎng)，因此，可為微顆粒的推廣應(yīng)用提供源源不斷的抗原；2.包被在微顆粒上的抗原經(jīng)過分離及純化，在一種微顆粒上只有I類或II類HLA抗原，檢測結(jié)果中兩類抗原的反應(yīng)情況不會(huì)互相遮蔽，且都不受非HLA抗原的干擾，又具備天然抗原的優(yōu)勢，因此能提高檢測的靈敏性和特異性。3.做成的試劑盒促進(jìn)了微顆粒的推廣使用，可根據(jù)檢測需要選擇在試劑盒中盛裝不同種類的HLA抗原的微顆粒，也可是包括表1所示的所有HLA抗原的微顆粒以用于一次性全面檢測待測血清的HLA抗體特異性。4.微顆粒僅僅包含抗原，對于貯存溫度要求不嚴(yán)格，利于微顆粒及其試劑盒的運(yùn)輸和推廣使用。

圖1.本實(shí)用新型HLA抗體特異性檢測微顆粒包被結(jié)構(gòu)示意圖 圖2.本實(shí)用新型試劑盒內(nèi)部俯視示意圖。
圖3.本實(shí)用新型試劑盒中96個(gè)微顆粒管為96孔板的示意圖。
其中1-載體顆粒，2-HLA抗原，3-外盒，4-支架，5-試劑容器槽，6-微顆粒管，7-標(biāo)記物管，8-陽性對照管，9-陰性對照管，10-96孔板。
具體實(shí)施方式
如圖1所示，本實(shí)用新型提供一種HLA抗體特異性檢測微顆粒，其特征在于同一粒載體顆粒1表面包被著來源于一個(gè)供體的B淋巴細(xì)胞上的I類或II類HLA抗原2。由于是在載體顆粒1上包被了天然HLA抗原2，同一個(gè)微顆粒上只有來自源于一份B細(xì)胞的I類或II類HLA抗原，該微顆粒用于HLA抗體檢測時(shí)，兩類HLA抗原2的反應(yīng)結(jié)果分別檢查出來，不會(huì)互相遮蔽；包被HLA抗原2的來源B淋巴細(xì)胞株可人工培養(yǎng)，因此能為包被微顆粒提供源源不斷的HLA抗原2，便于微顆粒的推廣應(yīng)用；由于包被的HLA抗原來源于B淋巴細(xì)胞，需要將I類或II類HLA抗原進(jìn)行分離純化，在HLA抗原分離、純化過程中，同時(shí)也棄除了細(xì)胞膜上非HLA抗原蛋白，使非特異性反應(yīng)大幅度降低，從而提高檢測的靈敏性和特異性。另外微顆粒上只含有HLA抗原蛋白，而不是完整的細(xì)胞，貯存時(shí)不需要-20℃以下的低溫環(huán)境，在0-10℃環(huán)境貯存即可，利于運(yùn)輸，便于推廣應(yīng)用。再有，微顆粒在檢測中操作方便，人們可以根據(jù)HLA抗體檢測的具體需要選擇包被著不同HLA抗原的多種微顆粒同時(shí)使用，即為人們提供了靈活多樣的底物選擇，且易于定量。
如圖2、3所示本實(shí)用新型為了使上述微顆粒得以推廣使用，提供一種HLA抗體特異性檢測微顆粒試劑盒，包括外盒3、放置于盒內(nèi)的支架4和多個(gè)微顆粒管6，所述支架上設(shè)置有試劑容器槽5，所述微顆粒管6放置在試劑容器槽5中，其特征在于所述微顆粒管6中盛有圖1所示的微顆粒，不同微顆粒管6中的微顆粒上的HLA抗原不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)HLA抗體特異性檢測的具體情況和需要，使試劑盒盛裝著多種不同的微顆粒種類和其他檢測中需要用到的試劑。為了運(yùn)輸中保證各種試劑容器及微顆粒管能放置穩(wěn)妥，在盒內(nèi)設(shè)了支架4，各種試劑管或容器放置在支架4上相應(yīng)的試劑容器槽5中。
為了更進(jìn)一步提高如圖1所示的本實(shí)用新型微顆粒在檢測HLA抗體特異性中的實(shí)用性，使其可直接用于檢測得出HLA抗體特異性，本實(shí)用新型優(yōu)選設(shè)置成試劑盒內(nèi)所有微顆粒管6中的微顆粒上的HLA抗原2為HLA-A，HLA-B，HLA-Cw，HLA-DR，HLA-DQ位點(diǎn)下的HLA抗原。因?yàn)椋诖蠖鄶?shù)情況下，檢測一份血清的HLA抗體特異性，需要檢測到其全面的HLA抗體特異性，如果提供的檢測底物即HLA抗原2的類型不全面，則無法一次性獲得血清的全面HLA抗體特異性。因此，本實(shí)用新型優(yōu)選提供可以一次性檢測血清的全面的HLA抗體特異性的試劑盒，試劑盒中的各種微顆粒包被的HLA抗原可以包括表1所示的HLA五個(gè)位點(diǎn)下的所有HLA抗原，這些微顆粒與待測血清同時(shí)反應(yīng)并通過流式細(xì)胞儀檢測反應(yīng)結(jié)果，對檢查結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析后能夠一次性獲得一份待測血清中I類和II類HLA抗體特異性，提高了本實(shí)用新型微顆粒的實(shí)用性，真正能夠直接用于HLA抗體特異性檢測。
如圖3本實(shí)用新型的試劑盒優(yōu)選設(shè)置96個(gè)微顆粒管6，微顆粒管6呈陣列式排列，便于采用8個(gè)吸頭或者12個(gè)吸頭的移液槍，以提高檢測工作效率；96個(gè)微顆粒管6的數(shù)量足以盛裝來自于60個(gè)供體的B淋巴細(xì)胞上的I類HLA抗原，34份B淋巴細(xì)胞的II類HLA抗原和一份陽性對照微顆粒和一份裸粒。全部94種微顆粒足以覆蓋表1所示的五個(gè)基因位點(diǎn)下的HLA抗原。如果可盛裝的微顆粒種類太少即供體份數(shù)太少，則增加了選擇合適供體的難度，若包括太多微顆粒管6，則增加了檢測和分析的工作量，檢測效率受到影響。實(shí)際操作時(shí)，從96個(gè)微顆粒管中分別吸取等量微顆粒，移至一個(gè)空白96孔反應(yīng)板進(jìn)行抗體標(biāo)記反應(yīng)，并在流式細(xì)胞儀上一次完成檢測，使試劑盒的應(yīng)用更便捷。
本實(shí)用新型試劑盒優(yōu)選96孔PCR板10代替上述96個(gè)微顆粒管6。96孔PCR板10為一體結(jié)構(gòu)，放置、移動(dòng)都非常方便穩(wěn)妥。
為了進(jìn)一步提高本實(shí)用新型使用過程中的實(shí)用性和便捷度，優(yōu)選所述試劑容器槽5中還放置有標(biāo)記物管7，管內(nèi)盛裝有熒光標(biāo)記二抗，熒光標(biāo)記二抗與微顆粒上結(jié)合的HLA抗體結(jié)合，二抗的熒光強(qiáng)度直接反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果。
更進(jìn)一步，本實(shí)用新型試劑盒中的試劑容器槽5中還放置有陽性對照管8和陰性對照管9，分別盛裝了PRA值為100％的陽性對照血清和PRA值為0％的陰性對照血清，進(jìn)一步提高試劑盒的使用便捷度。在進(jìn)行HLA抗體檢測時(shí)，陽性對照血清可以檢測微顆粒上包被的HLA抗原是否失效，陰性對照血清可以檢測微顆粒的熒光物本底，同時(shí)也可以檢測其它反應(yīng)試劑是否有污染。
本實(shí)用新型試劑盒的使用方法 I類和II類抗體檢測方法相同，現(xiàn)以I類抗體檢測為例。試劑盒中96種微顆粒分別盛裝在96孔PCR板10的96個(gè)孔中，其中94個(gè)孔中的微顆粒所帶有的HLA抗原包括表1所示的五個(gè)位點(diǎn)下的全部HLA抗原，統(tǒng)計(jì)記錄每個(gè)孔的位置及其代表的HLA抗原類型。其余2個(gè)孔中，一個(gè)孔中的微顆粒為裸粒，表面不帶有任何HLA抗原，另外一個(gè)孔中的微顆粒用于陽性對照。
步驟1.將一個(gè)空白96孔板作為對照板，另一個(gè)96孔板為檢測板。采用12個(gè)吸頭的移液槍(調(diào)為10ul量程)，將本實(shí)用新型試劑盒中96孔PCR板中96種微顆粒分別吸入96孔對照板和檢測板的相同位置的孔中。
步驟2.在對照板和檢測板的一個(gè)孔中加入25ul陽性對照血清，在對照板的其余95個(gè)孔中加入25ul陰性對照血清，在檢測板的其余95個(gè)孔中加入25ul待測血清。
步驟3.對照板和檢測板都避光置于室溫(22℃)培養(yǎng)30分鐘。
步驟4.用微顆粒洗滌緩沖液洗板三次。
步驟5.將標(biāo)記物管中的熒光標(biāo)記二抗加入到對照板和檢測板的每個(gè)反應(yīng)孔中，避光置于室溫(22℃)培養(yǎng)30分鐘。
步驟6.用微顆粒洗滌緩沖液洗板三次。
步驟7.在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)，分別加入100μl微顆粒洗滌緩沖液。
步驟8.將微顆粒從96孔反應(yīng)板轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞儀玻璃管中，繼而用流式細(xì)胞儀測量熒光強(qiáng)度。
步驟9對照板中每種微顆粒的熒光值為該種微顆粒的熒光本底。檢測板中某一種微顆粒的熒光值減去對照板中相同位置的微顆粒的熒光值，便得出該種微顆粒上抗原抗體反應(yīng)的FITC熒光值。裸粒上的熒光值用于調(diào)整各個(gè)微顆粒的熒光本底值。分析計(jì)算待測血清所對應(yīng)的94種微顆粒的熒光值，分別歸類記錄I類和II類HLA抗原的反應(yīng)結(jié)果，通過扣除分析，結(jié)合表2所示的交叉反應(yīng)組，便可找出該份血清的I類抗體特異性，II類抗體特異性可直接通過扣除分析得出。
權(quán)利要求1.HLA抗體特異性檢測微顆粒，其特征在于載體顆粒表面包被著來源于一個(gè)供體的B淋巴細(xì)胞上的I類或II類HLA抗原。
2.HLA抗體特異性檢測微顆粒試劑盒，包括外盒、放置于盒內(nèi)的支架和多個(gè)微顆粒管，所述支架上設(shè)置有試劑容器槽，所述微顆粒管放置在試劑容器槽中，其特征在于所述微顆粒管中盛有權(quán)利要求1所述的HLA抗體特異性檢測微顆粒，不同微顆粒管中的微顆粒上的HLA抗原不同。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的HLA抗體特異性檢測微顆粒試劑盒，其特征在于所述試劑盒內(nèi)的微顆粒上的HLA抗原為HLA-A，HLA-B，HLA-Cw，HLA-DR，HLA-DQ位點(diǎn)下的HLA抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的HLA抗體特異性檢測微顆粒試劑盒，其特征在于所述微顆粒管為96個(gè)，呈陣列式分布。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的HLA抗體特異性檢測微顆粒試劑盒，其特征在于所述96個(gè)微顆粒管為96孔PCR板。
6.根據(jù)權(quán)利要求2～5任一所述的HLA抗體特異性檢測微顆粒試劑盒，其特征在于所述試劑容器槽上還放置有盛裝熒光標(biāo)記二抗的標(biāo)記物管。
7.根據(jù)權(quán)利要求2～5任一所述的HLA抗體特異性檢測微顆粒試劑盒，其特征在于所述試劑容器槽上放置有盛裝陽性對照血清的陽性對照管和盛裝陰性對照血清的陰性對照管，所述陽性對照血清的PRA為100％，陰性對照血清的PRA為0％。
專利摘要本實(shí)用新型“HLA抗體特異性檢測微顆粒及試劑盒”，屬于抗體檢測領(lǐng)域。本實(shí)用新型的微顆粒，其特征在于載體顆粒表面包被著來源于一個(gè)供體的B淋巴細(xì)胞上的I類或II類HLA抗原。可同時(shí)分別檢測到I類和II類HLA抗體特異性，既具備天然抗原的優(yōu)勢，又避免了兩類HLA抗原的反應(yīng)結(jié)果相互遮蔽，HLA抗原的來源為可人工培養(yǎng)的B淋巴細(xì)胞。本實(shí)用新型中，將盛裝各種上述微顆粒的試劑管與其他試劑管裝載在一個(gè)外盒中，外盒中有一個(gè)特定的支架，用于支撐這些試劑管，試劑盒微顆粒上的HLA類型可以包括表1所示的所有HLA抗原，使試劑盒能夠一次性全面檢測到待測血請的HLA抗體特異性。
文檔編號(hào)G01N33/533GK201540289SQ20092024644
公開日2010年8月4日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者才新, 焦守恕 申請人:同昕生物技術(shù)(北京)有限公司