專利名稱：一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
蟲草酸(cordyc印ic acid)，即甘露醇，是冬蟲夏草等蟲草菌類中藥中的主要活性成分之一，具有利尿、降低顱內(nèi)壓和眼內(nèi)壓、祛痰、鎮(zhèn)咳平喘和清除自由基等多種功效。就冬蟲夏草及其相關(guān)制品中的蟲草酸含量的檢測(cè)方法，目前有多種方法包括容量法、紫外_可見分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)以及毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CZE)等。據(jù)2005年中國(guó)藥典，蟲草酸的含量是采用容量法來(lái)進(jìn)行定量分析。容量法是基于甘露醇的還原性利用氧化劑高碘酸鹽來(lái)滴定和計(jì)算含量，因冬蟲夏草等蟲草菌類生藥或制品中還原性物質(zhì)的干擾，測(cè)量值偏高，因此容量法僅適用于相對(duì)較純的甘露糖制劑。HPLC、 GC與CZE等分析方法需要貴重的設(shè)備、樣品制備和操作復(fù)雜、受外界干擾也大，結(jié)果重現(xiàn)性較差，不適合作為常規(guī)定量分析方法。紫外-可見分光光度法檢測(cè)蟲草酸，方法簡(jiǎn)單、特異性高，許多含羥基的單糖對(duì)其無(wú)明顯干擾，能代表冬蟲夏草等蟲草類生藥或制品中蟲草酸的實(shí)際值而成為常規(guī)定量分析方法。然而，紫外-可見分光光度計(jì)一般最多能同時(shí)測(cè)定3個(gè)樣品，如果每個(gè)檢測(cè)樣品要設(shè)置3個(gè)重復(fù)，則一次只能檢測(cè)一個(gè)樣品。因此對(duì)批量樣品的定量分析因受檢測(cè)系統(tǒng)和人為因素造成誤差，嚴(yán)重影響結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種能同時(shí)大批量測(cè)試樣品且受外界干擾也小的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法。采用簡(jiǎn)單的方法和價(jià)格低廉的設(shè)備實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)大批量蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，適合作為常規(guī)定量分析方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法，該方法是先將蟲草制品按常規(guī)方法制成待檢液；然后將待檢液制成測(cè)試液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)測(cè)試液的吸光度；再將蟲草酸配制成5 7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測(cè)定其吸光度；以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蟲草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立相應(yīng)的蟲草酸濃度與吸光度的線性關(guān)系方程，再把測(cè)試液的吸光度值代入方程獲得測(cè)試液中蟲草酸的含量，然后換算成蟲草制品單位質(zhì)量的百分含量。 上述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法中，所述測(cè)試液按如下步驟制備
a、量取0. 2mL用蟲草制品制備的待檢液放入試管中； b、在測(cè)試液中分別加蒸餾水或去離子水稀釋至20mL，混勻；取lmL作為A品；
c、在A品中加入lmL高碘酸鉀溶液，混勻，在24 26。C放置10分鐘，得B品；
d、在B品中加入2mL 0. 1 %的L-鼠李糖溶液，混勻，得C品； e、在C品中加入4mL新鮮配制的Nash試劑，53。C反應(yīng)15分鐘使其顯色后，快速冷卻至室溫，得測(cè)試液。 f、在按步驟b e制備的過程中，取與待測(cè)液等量的蒸餾水或去離子水制備空白對(duì)照組。 前述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法中，所述吸光度按如下步驟測(cè)定
a、用加樣槍取測(cè)試液組和空白對(duì)照組至酶標(biāo)板，每組三個(gè)復(fù)孔，每孔200ii L ;在412nm波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀分別測(cè)定測(cè)試液和空白對(duì)照的吸光度，計(jì)算三孔測(cè)試液的平均吸光度值A(chǔ)測(cè)和三孔空白對(duì)照的平均吸光度A本貞； b、根據(jù)公式AA= A^-A^貞計(jì)算測(cè)試液中蟲草酸實(shí)際吸光度。
前述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法中，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液按如下步驟制備
a、準(zhǔn)確稱量25mg干燥至恒重的蟲草酸裝入25mL容量瓶中，加蒸餾水或去離子水溶解并稀釋至刻度，混勻，配置成質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液；； b、量取5 7個(gè)間隔為250ii L質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液，分別加入25mL容量瓶中，用蒸餾水或去離子水定容至刻度，分別得5 7個(gè)間隔為10mg/L蟲草酸含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用； c、再取lmL濃度為10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照權(quán)利要求1和2的步驟獲得lOmg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值； d、再分別取lmL b步驟獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按步驟c測(cè)定各濃度標(biāo)準(zhǔn)液相應(yīng)的平均吸光度值。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用酶標(biāo)儀來(lái)進(jìn)行蟲草酸定量分析。首先由于用于酶標(biāo)儀檢測(cè)的樣品載體酶標(biāo)板上的孔數(shù)可多達(dá)數(shù)百個(gè)，即使一個(gè)樣品占用三個(gè)孔，也可同時(shí)檢測(cè)上百個(gè)樣品。如果用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)上百個(gè)樣品，要反復(fù)操作上百次。而操作上百次，儀器和人為因素將給所測(cè)定的數(shù)據(jù)造成很大的系統(tǒng)誤差和偶然誤差，精確度和重復(fù)性差，無(wú)法保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。而本法僅需要進(jìn)行一次測(cè)定，還可通過設(shè)置多個(gè)重復(fù)，減少系統(tǒng)誤差和偶然誤差；第二，酶標(biāo)板中加入樣品時(shí)不易產(chǎn)生氣泡，液面一致，光程短，具有高靈敏度和低檢測(cè)限的優(yōu)點(diǎn)；第三，傳統(tǒng)的紫外-可見分光光度計(jì)是水平光路，而酶標(biāo)儀是垂直光路，全波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)酶標(biāo)儀還可通過設(shè)定參考波長(zhǎng)，有利于減少測(cè)定干擾與電路干擾；第四，本法需要樣品量少。第五，本法適合其它需要紫外-分光光度法檢測(cè)的化合物。本發(fā)明所用的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單實(shí)用，所用設(shè)備價(jià)格低廉，檢測(cè)結(jié)果受外界干擾小穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，適合作為常規(guī)定量分析方法。
說(shuō)明書附圖


圖1是蟲草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但并不作為對(duì)本發(fā)明做任何限制的依據(jù)。 實(shí)施例。 一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法，該方法是先將一定量的蟲草制品按常規(guī)方法制成待檢液；然后將待檢液制成測(cè)試液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)測(cè)試液的吸光度；再將蟲草酸配制成6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測(cè)定其吸光度。 以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)建立蟲草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的值10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L分別對(duì)應(yīng)橫坐標(biāo)上的6個(gè)點(diǎn)，在縱坐標(biāo)上是與標(biāo)準(zhǔn)溶液10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L相對(duì)應(yīng)的6個(gè)吸光度值的點(diǎn)，這樣在坐標(biāo)上獲得6個(gè)點(diǎn)，并繪制一條連接這6個(gè)點(diǎn)的趨勢(shì)線，即反映蟲草酸濃度與吸光度對(duì)應(yīng)關(guān)系的蟲草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。 根據(jù)獲得的蟲草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立相應(yīng)的蟲草酸濃度與吸光度的線性關(guān)系方程
從圖l可見，蟲草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線趨近于一條直線，所以根據(jù)數(shù)學(xué)原理可以建立一個(gè)一元一
次方程方程式如下 x = (A蟲+0. 0005)+0. 007 公式中Aa表示測(cè)試液的吸光度值； X表示測(cè)試液中蟲草酸的含量； 公式中的0. 0005和0. 007由曲線的斜率和截距決定。 再把測(cè)試液的吸光度值代入方程獲得測(cè)試液中蟲草酸的含量，最后乘以蟲草制品待測(cè)液的總量，即獲得該一定量蟲草制品中蟲草酸的總含量，然后換算成蟲草制品單位質(zhì)量的百分含量。 所述的待檢液可按如下方法制備，準(zhǔn)確稱量0.5g干燥至恒重的蟲草制品，加入25% (v/v)乙醇水溶液，料液比為l : 30(w/v)，沸水浴浸提2小時(shí)，過濾后再浸提l次，合并濾液，獲得60mL蟲草待測(cè)液。上述的待檢液制備方法僅是一例，不局限用此方法，不作為對(duì)本發(fā)明做任何限制的依據(jù)。也可以采用其它方法，如用水直接熱提取、超聲提取或微波提取等方法。
上述的測(cè)試液按如下步驟制備 a、量取0. 2mL用蟲草制品制備的待檢液放入試管中； b、在測(cè)試液中分別加蒸餾水或去離子水稀釋至20mL，混勻；取lmL作為A品；
c、在A品中加入lmL高碘酸鉀溶液，混勻，在24_26oC放置10分鐘，得B品；
d、在B品中加入2mL 0. 1 %的L-鼠李糖溶液，混勻，得C品； e、在C品中加入4mL新鮮配制的Nash試劑，53oC反應(yīng)15分鐘使其顯色后，快速冷卻至室溫，得測(cè)試液。 f、在按步驟b e制備的過程中，取與待測(cè)液等量的蒸餾水或去離子水制備空白對(duì)照液。 前述的吸光度按如下步驟測(cè)定 a、用加樣槍取測(cè)試液和空白對(duì)照組至酶標(biāo)板，每組3孔，每孔加200 y L(本例所用的酶標(biāo)板有96個(gè)孔)；在412nm波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀分別測(cè)定測(cè)試液和空白對(duì)照組的吸光度，計(jì)算3孔測(cè)試液的平均吸光度值A(chǔ)M= 0. 1306和3孔空白對(duì)照的的平均吸光度A本底二0.0620 ;b、根據(jù)公式AA= A;則-A本底計(jì)算測(cè)試液中蟲草酸實(shí)際吸光度是0. 0686。
前述的標(biāo)準(zhǔn)溶液按如下步驟制備 a、準(zhǔn)確稱量25mg干燥至恒重的蟲草酸裝入25mL容量瓶中，加蒸餾水或去離子水溶解并稀釋至刻度，混勻，配置成質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液；； b、量取6個(gè)間隔為250ii L(250、500、750、1000、1250、1500ii L)質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液，分別加入25mL容量瓶中，用蒸餾水或去離子水定容至刻度，分別得6個(gè)(10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L)間隔為10mg/L蟲草酸含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用；
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c、再取lmL濃度為10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照權(quán)利要求1和2的步驟獲得lOmg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值； d、再分別取lmL濃度為20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按步 驟c測(cè)定各濃度標(biāo)準(zhǔn)液相應(yīng)的平均吸光度值。 以O(shè). 5g蟲草制品獲得60mL待測(cè)液為例，測(cè)得蟲草制品測(cè)試液的吸光度是0. 0686， 根據(jù)公式計(jì)算蟲草酸含量x等于9. 8492mg/L，根據(jù)0. 2mL待測(cè)液加蒸餾水至20mL，即稀釋 了 100倍，因此，待測(cè)液中的蟲草酸含量為984. 92mg/L，經(jīng)計(jì)算該蟲草制品的蟲草酸含量是 11.82% (w/w)。
權(quán)利要求
一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法，其特征在于該方法是先將蟲草制品按常規(guī)方法制成待檢液；然后將待檢液制成測(cè)試液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)測(cè)試液的吸光度；再將蟲草酸配制成5～7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測(cè)定其吸光度；以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蟲草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立相應(yīng)的蟲草酸濃度與吸光度的線性關(guān)系方程，再把測(cè)試液的吸光度值代入方程獲得測(cè)試液中蟲草酸的含量，然后換算成蟲草制品單位質(zhì)量的百分含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法，其特征在于所述測(cè)試液按如下步驟制備a、 量取0. 2mL用蟲草制品制備的待檢液放入試管中；b、 在測(cè)試液中分別加蒸餾水或去離子水稀釋至20mL，混勻；取lmL作為A品；c、 在A品中加入lmL高碘酸鉀溶液，混勻，在24 26。C放置10分鐘，得B品；d、 在B品中加入2mL 0. 1%的L-鼠李糖溶液，混勻，得C品；e、 在C品中加入4mL新鮮配制的Nash試劑，53。C反應(yīng)15分鐘使其顯色后，快速冷卻至室溫，得測(cè)試液。f、 在按步驟b e制備的過程中，取與待測(cè)液等量的蒸餾水或去離子水制備空白對(duì)照液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法，其特征在于所述吸光度按如下步驟測(cè)定a、 取測(cè)試液組和空白對(duì)照組至酶標(biāo)板，每組三個(gè)復(fù)孔，每孔200 ii L ;在412nm波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀分別測(cè)定測(cè)試液和空白對(duì)照的吸光度，計(jì)算三孔測(cè)試液的平均吸光度值A(chǔ)，'和三孔空白對(duì)照的平均吸光度A^貞b、 根據(jù)公式Aa二 A^-A^貞計(jì)算測(cè)試液中蟲草酸實(shí)際吸光度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)溶液按如下步驟制備a、 準(zhǔn)確稱量25mg干燥至恒重的蟲草酸裝入25mL容量瓶中，加蒸餾水或去離子水溶解并稀釋至刻度，混勻，配置成質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液；；b、 量取5 7個(gè)間隔為250 ii L質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液，分別加入25mL容量瓶中，用蒸餾水或去離子水定容至刻度，分別得5 7個(gè)間隔為10mg/L蟲草酸含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用；c、 再取lmL濃度為10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照權(quán)利要求1和2的步驟獲得10mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值；d、 再分別取lmL b步驟獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按步驟c測(cè)定各濃度標(biāo)準(zhǔn)液相應(yīng)的平均吸光度值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測(cè)方法，該方法是先將蟲草制品按常規(guī)方法制成待檢液；然后將待檢液制成測(cè)試液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)測(cè)試液的吸光度；再將蟲草酸配制成5～7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測(cè)定其吸光度；以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蟲草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立相應(yīng)的蟲草酸濃度與吸光度的線性關(guān)系方程，再把測(cè)試液的吸光度值代入方程獲得測(cè)試液中蟲草酸的含量，然后換算成蟲草制品單位質(zhì)量的百分含量。本發(fā)明采用簡(jiǎn)單的方法和價(jià)格低廉的設(shè)備實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)大批量蟲草制品中蟲草酸含量，減少系統(tǒng)誤差和偶然誤差，檢測(cè)結(jié)果受外界干擾小，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，適合作為常規(guī)定量分析方法。
文檔編號(hào)G01N21/78GK101769872SQ20091030007
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2009年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日
發(fā)明者肖代敏, 肖建輝, 鐘建江, 陳代雄 申請(qǐng)人:遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院