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用于從生物材料中提取和檢測脂溶性組分的方法

文檔序號:5843956閱讀:337來源:國知局
專利名稱:用于從生物材料中提取和檢測脂溶性組分的方法
用于從生物材料中提取和檢測脂溶性組分的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及分析來自生物材料(尤其是富含脂質(zhì)的食品)的脂溶性組分(尤其是 染料)、富集所述組分并隨后分析的方法。所述方法包括提取和分離步驟和隨后的分析步 驟的組合。
本發(fā)明還涉及用于進行所述方法的分析試劑盒和分析設(shè)備。
根據(jù)本發(fā)明的方法由多個步驟組成。是關(guān)鍵性的并且表征本發(fā)明的必需步驟 為
1.預(yù)處理樣品,去除脂質(zhì)。
2.通過特定的溶劑或溶劑混合物將染料提取進提取混合物中。
3.在最終通過眼睛或光學(xué)增強設(shè)備檢測和定量之前,破壞對氧化敏感的成分例 如類胡蘿卜素。
本發(fā)明的前景是溶解脂溶性組分和生物基質(zhì)之間的復(fù)雜復(fù)合物,提供測定食物 和飼料中的物質(zhì)(在本文下文中也稱作組分)的方法的分析試劑盒和用途。
對本發(fā)明的檢測方法而言,所考慮的脂溶性組分為染料。天然和合成的染料被 用于對不同應(yīng)用的制品進行。它們的作用是給予某些光學(xué)品質(zhì)特性??梢员蝗旧纳?物材料是蛋黃和蛋制品、魚和魚制品、水果和蔬菜汁和/或制劑,以及黃油或其他乳制 品。用于人消耗的生物材料的染色可以通過飼料引入或在加工中引入。
對食物和飼料安全性以及對檢測有毒物質(zhì)或偽造物質(zhì)的提高的要求(特別是在 國際商品貿(mào)易中)需要快速、靈敏和可靠的分析,優(yōu)選地盡可能接近所述制品。因此, 需要由盡可能少的工作步驟組成和/或具有很低的技術(shù)復(fù)雜性的方法。在這種情況下, 期望使用下述方法,所述方法可以在一次性分析試劑盒的基礎(chǔ)上應(yīng)用。
在本文上下文中,提供了例如對用蘇丹紅或其他染料偽造食物和飼料顏色的檢 測。
分析生物材料的現(xiàn)代方法通常包括生物材料成分(constituent)以及組分 (component)的分離(separation)、提取、離析(isolation)和/或富集。這些方法步驟在用于分離干擾或偽造結(jié)果的物質(zhì)的定性和定量分析中均是不可或缺的。
WO 2008/031874公開了分析生物材料成分(尤其是類胡蘿卜素和維生素)的方 法,其特征是用至少一種提取所述成分的有機溶劑處理生物材料,然后通過分光光度計 分析測量所提取的溶液。
從WO 2008/031874開始,本發(fā)明的目的是提供用于從富含脂質(zhì)的生物材料中提 取天然和合成染料(特別是蘇丹染料)的方法,所述方法的選擇性足以將物質(zhì)以相當小的 復(fù)雜性從生物材料(例如絡(luò)合的固體基質(zhì))中溶解,并且需要時能夠借助于一次性分析試 劑盒簡單和快速地應(yīng)用。
權(quán)利要求1中要求保護的方法、權(quán)利要求12中要求保護的用途和權(quán)利要求13中 要求保護的分析試劑盒實現(xiàn)了該目的。
優(yōu)選的實施方案描述于從屬權(quán)利要求中。所有權(quán)利要求的措辭通過引用并入本 說明書中。
根據(jù)本發(fā)明,預(yù)處理、提取和任何隨后的分離以下述方式組合,所述方式使得 可以檢測非常小量的染料。
在本發(fā)明的上下文中,“生物材料”表示從植物或動物獲得的富含脂質(zhì)的食物 和飼料,例如蛋、黃油、全脂奶、奶酪、香腸、油。
在所述方法的一個優(yōu)選的實施方案中,在使用生物材料之前對其進行機械粉碎 和純化的過程。
更有利的是通過振動手工進行提取,尤其是小心地振動以避免溶血。
根據(jù)本發(fā)明必須被解決的問題如下
首先,使用WO 2008/031874中所述方法,生物材料的脂質(zhì)(脂肪)會與染料一 起被提取進有機相中。該脂肪提取會破壞分離,并且檢測極限會顯著提高。因此,脂肪 的提取應(yīng)當被減少或者盡可能完全。
一種可能的解決方案可以是尋找特定的水緩沖液/有機溶劑組合,所述組合允 許選擇性提取染料而不提取脂肪。這種方式的實驗產(chǎn)生分離溶劑體系,允許選擇性提取 蘇丹(I、II、III、IV)和一些類胡蘿卜素,但是幾乎不提取脂肪。這類體系的缺點是低 提取效率(5% -10%),這導(dǎo)致測定的不穩(wěn)定和樣品體積的增加。
另一種可能的解決方法可能是在提取前對富含脂肪的材料(例如蛋黃)進行化學(xué) 處理,從而將脂肪轉(zhuǎn)化為不可提取的形式或者將其破壞。例如,用水/醇KOH處理會將 脂肪轉(zhuǎn)化為脂肪酸的鉀鹽和甘油。該溶液的缺點是使用對使用者不友好并有腐蝕性的 強堿溶劑,并且在處理期間需將混合物振動和加熱若干小時。
根據(jù)本發(fā)明,申請人描述了在提取前使用至少一種脂酶來酶促消化脂肪,這會 導(dǎo)致與化學(xué)處理相同的結(jié)果,但是條件溫和安全,并且更快速。
在本發(fā)明的上下文中,脂酶是一種酶,其催化來自生物材料的油和脂肪中存在 的甘油三酯底物中的酯鍵水解,產(chǎn)生甘油單酯和甘油二酯和游離脂肪酸。本發(fā)明的脂酶 可進一步能夠以高底物特異性降解富含C8到Cw脂肪酸的膳食脂質(zhì)(例如甘油三酯、脂 肪、油)。
其次,為了測定生物材料中的染料,類胡蘿卜素的氧化破壞是必需的。這是 因為染料和類胡蘿卜素在例如色譜分離步驟期間的分離表現(xiàn)或光譜特征方面是非常相似 的。
類胡蘿卜素是具有共軛雙鍵的多不飽和長鏈烴,及其衍生物。歸因于這樣的結(jié) 構(gòu),它們?nèi)菀妆谎趸?,例如被空氣氧或其他溫和的氧化劑例如過氧化物氧化。當雙鍵的 共軛體系被破壞時,吸光度減少,最大吸光度的波長遷移至更短的區(qū)域。
觀察到的結(jié)果是特征性橙黃色的消失。氧化以不同的速度發(fā)生,取決于氧化 劑、介質(zhì)、類胡蘿卜素和氧化劑的濃度、可能干擾氧化劑的其他反應(yīng)性物質(zhì)的濃度。
相反,染料例如蘇丹對氧化過程而言穩(wěn)定得多。因此,用氧化劑處理樣品僅影 響類胡蘿卜素而不影響蘇丹染料。
作為氧化劑,優(yōu)選過氧化物。所使用濃度的過氧化物有效地氧化類胡蘿卜素而 不氧化蘇丹。它們可以以水溶性形式(無機過氧化物,例如壓02、Ii2S2O8)或有機物可 溶性的形式(苯甲?;^氧化物)容易地獲得,所述形式使得易于進行實驗。
在脂酶處理前,完整蛋黃中類胡蘿卜素的氧化由于兩個原因而是有問題的。首先,其需要混合進多得多的氧化劑以達到工作濃度。這歸因于較大的樣品體積和副產(chǎn)物 的過量,所述副產(chǎn)物也經(jīng)歷氧化。第二,必須在添加酶之前去除或中和過量的氧化劑, 否則酶也會同樣被破壞。
處理后在提取前氧化也不是可行的。含尿素的緩沖液是穩(wěn)定過氧化物,其導(dǎo)致 反應(yīng)減緩,甚至在高過氧化物濃度下導(dǎo)致反應(yīng)減緩。
最可行的是在提取后進行類胡蘿卜素的漂白。在這種情況下可以減少過氧化物 的數(shù)量,因為只有類胡蘿卜素消耗過氧化物。大部分其他可氧化的物質(zhì)留在較低的(含 水)緩沖液中。
可以在分離前提取了類胡蘿卜素和蘇丹染料的有機溶劑中進行氧化(溶劑相漂 白),或者可以將氧化材料整合進柱材料中,最后通過在分離后例如在TLC placate上的 氧化破壞類胡蘿卜素(運行后漂白)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中,將類胡蘿卜素漂白與特定的分離步驟組合 是便利的,所述特定的分離步驟在提取之后但是在最終檢測之前(柱相漂白),從而節(jié)省 了分析的時間。為此,申請人選擇將過氧化物固定在分離吸附劑上。
結(jié)果是當分離完成時,微柱上僅出現(xiàn)一條紅色的蘇丹條帶(在樣品中存在蘇丹 的情況下)。該途徑中的檢測極限估計為原始蛋黃中0.5-lppm蘇丹。
在下文中更詳細地描述用于進行所述方法的不同的工藝步驟、分析試劑盒和分 析設(shè)備。
L預(yù)處理
在樣品制備期間添加稀釋溶液的目的不僅是稀釋樣品,而是特別地通過復(fù)雜基 質(zhì)的分散或溶解來為提取做準備。最適地,稀釋溶液以下述方式修飾樣品,所述方式使 得組分可以更容易地、以目標方式和更完全地被提取。在該過程中,例如蛋白質(zhì)與稀釋 溶液組分的相互作用發(fā)揮作用。該作用基于與純凈水相比離子濃度的一般提高,或者基 于特定組分的引入,所述特定組分與基質(zhì)的組分相互作用。這與二硫鍵的溶解、強吸濕 性分子對蛋白質(zhì)的解折疊或與磷酸根的相互作用相關(guān)。在本發(fā)明步驟的上下文中,酶對 復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)的溶解也是可能的。
發(fā)現(xiàn)用某些鹽溶液或緩沖液預(yù)處理,尤其是用不同濃度的尿素溶液預(yù)處理,導(dǎo) 致生物基質(zhì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的可觀改進,從而導(dǎo)致更有效的提取。
水溶性有機組分、洗滌劑、表面活性劑、尤其是非離子表面活性劑或乳化劑的 添加也可以提高提取效率??紤]的添加劑為例如DMSO或DTT?;蛘?,表面活性劑和 洗滌劑可以例如是Pleuronic、Tween。
在生物材料例如蛋、魚肌肉或肝的情況下,當在0.1到8M、優(yōu)選地1到8M、特別是2到4M的濃度范圍內(nèi)使用尿素時,僅僅簡單的搖動或使用旋轉(zhuǎn)手動混合儀和電動奶 起泡機就足夠了。因此,復(fù)雜的提取方法可以被可觀地改進和簡化。
由于脂溶性組分不同的物理化學(xué)特性和生物樣品基質(zhì)中巨大的差異,用于溶解 樣品基質(zhì)的溶劑的各自組成對于隨后的提取而言極為重要。
另外,可根據(jù)使用的生物材料如下描述和/或定義用于樣品制備和/或樣品稀釋 的溶劑
緩沖液,在本發(fā)明的上下文中包括緩沖溶液和/或緩沖體系,即一種物質(zhì)的混合物,添加酸或堿后其pH(氫離子濃度)的改變小于未緩沖體系中的情況。這類緩沖溶 液含有弱酸及其共軛堿(或各自鹽)的混合物。
兩性電解質(zhì)和雙功能分子也可以發(fā)揮緩沖液的作用。決定pH的因素是緩沖對的 比例或質(zhì)子遷移平衡。
緩沖溶液的例子為乙酸/乙酸鹽緩沖液、磷酸緩沖液KH2P04+Na2HP04; Michaelis ‘ s巴比妥-乙酸鹽緩沖液;氨緩沖液NH3+H20+NH4C1 ; HEPES (4- (2-羥乙基)-I-哌嗪乙磺酸)PBS緩沖液;MES (2- (N-嗎啉代)乙磺酸)。
鹽溶液是鹽的溶液,所述鹽是由帶正電的離子(稱作陽離子)和帶負電的離子 (稱作陰離子)組成的。鹽的性質(zhì)可以是有機或無機的。在最窄的含義上,鹽表示氯化 鈉(NaCl,常見的鹽)。在最寬泛的含義上,由陰離子和陽離子組成的所有的化合物被稱 作鹽(如NaCl)。
當帶有分子間相互作用的獨立的(穩(wěn)定)離子存在時,鹽被稱作絡(luò)合鹽。
除了具有一種陽離子的鹽以外,具有兩種不同陽離子的鹽也是已知的。這些鹽 被稱作復(fù)鹽,例如具有一般組成A^MHkSC^hW明礬。一個例子是硫酸鋁鉀十二水合物 (KAl(SO4)2 · 12H20)。
除了所述無機鹽外,還存在有機化合物的鹽。這些鹽的陰離子來自于有機酸。 在本文中重要的是羧酸例如乙酸的鹽,其中許多鹽(稱作乙酸鹽(CH3COCT))是已知的。 例子是檸檬酸鈉和檸檬酸鈣。
在本發(fā)明的上下文中進行復(fù)雜基質(zhì)溶解的有機化合物包括例如尿素。尿素來源 于人和動物的蛋白質(zhì)和氨基酸代謝。尿素因為其較高的水結(jié)合能力而被用作溶解復(fù)雜基 質(zhì)的角質(zhì)軟化劑。將其作為穩(wěn)定劑添加至食物中。在歐盟,作為名稱為E 927b的食物 添加劑,其僅被允許用于不添加糖的口香糖。
根據(jù)本發(fā)明,用至少一種脂酶處理生物材料的樣品,用于在提取前對脂質(zhì)進行 酶促消化。
在一個具體的實施方案中,添加進樣品中的形式的脂酶是定義明確的。定義明 確表示脂酶制劑在蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上至少50%純凈。在其他具體的實施方案中,脂酶制劑至 少60%、70%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%或至少95%純凈??梢酝ㄟ^本領(lǐng) 域已知的任何方法(例如通過SDS-PAGE或通過尺寸排除)來測定純度。
在本發(fā)明上下文中,脂酶表示羧酸酯水解酶EC 3.1.1-,其包括例如以下的活 性EC 3丄1.3三?;视椭?、EC 3丄1.4磷脂酶Al、EC 3丄1.5溶血磷脂酶、EC 3.1.1J6半乳糖脂酶、EC 3.1.1.32磷脂酶Al、EC 3.1.1.73阿魏酸酯酶。EC編號表示來自 NC-IUBMB, Academic Press, SanDiego, California (包括分別在 Eur.J.Biochem.1994, 223,1-5 ; Eur.J.Biochem.1995, 232,1-6 ; Eur.J.Biochem. 1996,237,1-5 ; Eur. J.Biochem.1997, 250,1-6 ;和 Eur.J.Biochem.1999,264,610-650 中的補充)的酶命名 法。該命名法被定期補充和升級;見例如萬維網(wǎng)http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/ enzyme/index.html.
在一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的脂酶是胰腺脂酶或Piccantase,或磷脂酶。
2.提取和分離步驟
作為用于提取和需要時隨后用于分析的有機溶劑,使用極性質(zhì)子溶劑,尤其是
在所述方法的又一個優(yōu)選的實施方案中,使用選自甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙 醇(異丙醇)、丁醇、戊醇、己醇及其混合物的極性質(zhì)子溶劑。優(yōu)選地,在本文中使用乙 醇和/或DMSO的混合物。
在所述方法的又一個優(yōu)選的實施方案中,作為有機溶劑使用至少一種極性非質(zhì) 子溶劑,尤其是酯,優(yōu)選地為乙酸乙酯。
有利地,在根據(jù)本發(fā)明的方法中,除了優(yōu)選的極性質(zhì)子溶劑外,也可以使用極 性非質(zhì)子溶劑。
在本發(fā)明的又一個實施方案中,作為極性非質(zhì)子溶劑使用腈,優(yōu)選地使用乙腈。
在所述方法的又一個實施方案中,作為極性非質(zhì)子溶劑使用酮,優(yōu)選地使用丙酮。
在所述方法的又一個實施方案中,作為極性非質(zhì)子溶劑使用二甲基亞砜和/或 N, N—二甲基甲酰胺。
在所述方法的又一個實施方案中,作為極性非質(zhì)子溶劑使用醚,尤其是二乙醚。
優(yōu)選地,取決于生物材料,使用混合物形式的極性溶劑。
在提取步驟的又一個優(yōu)選的實施方案中,作為溶劑使用至少一種非極性溶劑, 尤其是烷,優(yōu)選地使用C5到C12烷。
在提取步驟的又一個優(yōu)選的實施方案中,作為非極性溶劑使用己烷、庚烷和/ 或辛烷,尤其是使用異辛烷。
在提取步驟的又一個實施方案中,作為非極性溶劑使用芳香族,尤其是使用甲 苯和/或苯。
所述非極性溶劑在根據(jù)本發(fā)明的方法中發(fā)揮提取介質(zhì)的作用,用于提取所述組 分,尤其是用于提取所述親脂性組分。
根據(jù)本發(fā)明,可便利地使用有機溶劑分子的衍生物。溶劑可以是無水、含水、 分支、不分支、環(huán)狀、非環(huán)狀、鹵化或非鹵化的。
在工業(yè)上可以從多種方面進行極性或非極性溶劑的區(qū)分。例如,可以使用化學(xué) 中已知的極性定義或溶劑表現(xiàn)。
另夕卜,在實踐中使用根據(jù)Snyder 或 KelleHSynder, Principles ofabsorption chromatography, Decker, New York, 1986 ; Keller, Analyticalchemistry, Weinheim, 1998,piige 1%)的極性指數(shù),用于將溶劑或溶劑混合物歸類。據(jù)此,極性溶劑或溶劑混 合物表示根據(jù)Snyder具有4到8、尤其是5到7、優(yōu)選地5.5到6.5的極性指數(shù)的溶劑或溶 劑混合物。極性溶劑例如為水,尤其是水性溶液。極性非質(zhì)子溶劑為例如丙酮、乙腈、 乙酸乙酯、二甲基亞砜或N,N-二甲基甲酰胺。極性質(zhì)子溶劑為例如包含具有1到6個 碳原子的烷基片段的醇,例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇(異丙醇)、丁醇、戊醇或己
非極性溶劑或非極性溶劑混合物表示下述溶劑或溶劑混合物,其與參考溶劑或 參考溶劑混合物相比,具有0.3或更低的極性指數(shù)。優(yōu)選極性指數(shù)比參考低0.5,尤其是極性指數(shù)比參考低1,優(yōu)選地比參考低多于2。因此,非極性溶劑或溶劑混合物的極性指 數(shù)根據(jù)Snyder具有5到1、尤其是4到2、優(yōu)選地3.5到2.5的數(shù)值。60%甲醇/40%二氯 甲烷的溶劑混合物根據(jù)Synder具有例如3.1的極性指數(shù)。隨后考慮的非極性溶劑為例如 鹵化的溶劑,例如氯仿、二氯甲烷或四氯化碳。另外,可以提到脂肪族溶劑例如戊烷、 己烷、庚烷或環(huán)己烷。另外,可以提到的非極性溶劑為芳香族溶劑例如甲苯或苯。另外 考慮的是醚,例如二乙醚、叔丁基甲基醚或四氫呋喃。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的又一個優(yōu)選的實施方案中,以溶劑混合物的形式、尤其 是以包含極性和非極性溶劑的溶劑混合物的形式使用提取步驟的溶劑。
優(yōu)選地,極性和非極性溶劑以1 1的比例、尤其是1 2的比例、優(yōu)選地 1 10的比例(極性非極性)使用。
該手段的優(yōu)點是可以產(chǎn)生與生物材料的特性匹配的溶劑混合物。藉此,可以解 決多種分離問題。
在又一個優(yōu)選的實施方案中,用有機溶劑以1 50的比例、尤其是1 10的比 例、優(yōu)選地1 3的比例處理生物材料。
根據(jù)生物材料的特性和有機溶劑的提取能力,可以便利地選擇更大或更小的生 物材料與有機溶劑的比例,并且所述比例尤其取決于隨后的分析。優(yōu)選地,以下述方式 選擇所述比例,所述方式考慮組分分析中的檢測極限或測定極限。
在又一個實施方案中,在0.5bar和5bar之間、尤其是0.8bar和2bar之間的壓強 下進行所述方法。
理論上所述方法可以在期望凝膠形成的溫度和/或壓強范圍中進行。另外,必 須考慮溶劑特性,尤其是熔點、沸點、閃點。根據(jù)本發(fā)明,所述方法在室溫和大氣壓下 進行。
在所述方法的又一個優(yōu)選的實施方案中,將生物材料處理10秒到10分鐘、尤其 是10秒到5分鐘、優(yōu)選地10秒到3分鐘的時間段,用于組分的提取。
優(yōu)選地,在提取前將樣品用稀釋緩沖液預(yù)處理。稀釋比例在1 9 (緩沖液樣 品)和100 1之間,尤其是1 1到50 1之間,優(yōu)選地為10 1。
優(yōu)選地,在用有機溶劑處理之前將生物材料轉(zhuǎn)移進抗溶劑的環(huán)境中。
在又一個實施方案中,作為抗溶劑的環(huán)境,使用具有疏水表面的管,尤其是具 有通過硅烷化使其疏水的表面的管。
在又一個實施方案中,使用具有疏水表面的管,尤其是塑料管,尤其是由聚丙 烯制成的塑料管。
有利地,在根據(jù)本發(fā)明的方法中,可以使用具有疏水表面的管。在玻璃管的情 況下,可以通過將玻璃表面硅烷化,或者通過用氟化氫蝕刻玻璃表面,產(chǎn)生疏水表面。 另外,在根據(jù)本發(fā)明的方法中,也可以使用塑料管,優(yōu)選地由聚丙烯制成的塑料管。也 可能使用復(fù)合材料用于所述管,尤其是被塑料涂覆的管。優(yōu)選地,使用具有下述性質(zhì)的 管,所述性質(zhì)使得它們適用于分光鏡檢查。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中,在提取之后應(yīng)用例如通過色譜方法富集和 分離的步驟。小型化的色譜方法是優(yōu)選的??梢员憷匾韵率龇绞竭x擇提取溶劑的組 成,所述方式使得不發(fā)生例如醇和有機溶劑的混合和/或完全分離。本文中一種合適的溶劑優(yōu)選地是作為非質(zhì)子雙極溶劑的DMSO(二甲基亞砜)和正己烷或異辛烷。在這種 情況下,也可以向加工緩沖液中添加非極性溶劑。因此,提取溶劑可以在隨后的色譜富 集和分離中等同地被用作流動溶劑。在又一個實施方案中,在5°C到60°C范圍內(nèi)、尤其 是10°C到40°C范圍內(nèi)的溫度下進行所述方法。
在所述優(yōu)選的實施方案中,通過與用于提取的溶劑或溶劑混合物相同的溶劑或 溶劑混合物,在固定相上進行富集和分離。
在所述優(yōu)選的實施方案中,要被分離和檢查的親脂性組分在提取步驟后已經(jīng)位 于移動相中。在色譜體系中通過固定相進行富集和/或分離??紤]的色譜體系是薄層色 譜或柱色譜體系??紤]的固定相是硅膠、纖維素、環(huán)糊精、氧化鋁、弗洛里西(florisil) 和由于其物理化學(xué)特性而適用于各種組分的其他物質(zhì)。移動相和固定相的選擇取決于分 離問題。另外,可以通過定向的化學(xué)修飾對材料的表面特性進行修飾。作為脂質(zhì)色譜法 的一個例子,可以提到的是用銀離子對硅膠進行表面處理。然而,其他方法也可以是合 適的。
除了使用均一的固定相外,也可以將固定相組合。該組合可以通過混合多種不 同相進行,或者通過填充柱的逐層結(jié)構(gòu)來進行。通過逐層結(jié)構(gòu)可以實現(xiàn)多種分離和富集 效果。
根據(jù)本發(fā)明,類胡蘿卜素的氧化破壞是必需的,其中作為氧化劑優(yōu)選過氧化 物。
可以通過重力或者通過靠低壓引起移動相移動的其他方法產(chǎn)生壓強增加,用于 移動相的流動。
在所述優(yōu)選的實施方案中,通過將裝有固定相的小型化柱的一個開口放入閉合 的提取單元中產(chǎn)生移動相的流動。這通過刺穿橡膠隔膜或另一種類隔膜來實現(xiàn)。必須定 義刺穿的深度,以避免被提取管底部的非極性溶劑污染,并且標準化有機溶劑的體積使 其能夠流經(jīng)所述柱。這可以通過柱上的間隔區(qū)實現(xiàn),所述間隔區(qū)定義了柱穿刺進入提取 管的深度。其他選項是特定的毛細管個體夾持器(holder),或要被同時處理的特定數(shù)量樣 品的支架。兩種選項的組合也是可能的。毛細管個體夾持器可以發(fā)揮與大儲液器(wast reservoir)同樣好的作用。作為毛細管固定插入的結(jié)果,在恒定的樣品體積和恒定的溶劑 體積下,可以確保柱的開口處于有機提取介質(zhì)中,并且僅使用確定量的溶劑。
經(jīng)由緊挨色譜管的針使用注射器,并且通過注射器泵入約IOml空氣,通過穿孔 建立用于溶劑流動的壓強。該體積取決于提取管的大小和溶劑的體積。移動相借助于產(chǎn) 生的超壓而發(fā)生流動。
另一個空的提取管位于對側(cè),移動相被收集在該提取管中。因此不會污染工作 臺。同樣存在的橡膠隔膜在去除色譜柱后閉合,并且兩個單元均可丟棄,從而檢查者不 與化學(xué)品接觸。在所述優(yōu)選的實施方案中,這通過將毛細管整合在一次性儲液器中來實 現(xiàn),所述儲液器還發(fā)揮間隔區(qū)的作用,用于將毛細管固定在正確的位置和距離上。
經(jīng)富集和/或分離的染料的鑒定通過眼睛直接進行,或者如果涉及具有特征性 固有顏色的物質(zhì)時,通過分光方法進行;或者如果物質(zhì)具有特征性激發(fā)和發(fā)射光譜時通 過熒光進行。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中,氧化劑被固定在分離吸附劑上,例如苯甲?;^氧化物允許在提取之后但是最終檢測之前漂白類胡蘿卜素。
3.分析步驟
本發(fā)明還涉及分析所提取組分的方法。為了分析組分,考慮所有已知的分析技 術(shù)或目前未知的分析技術(shù)。能夠證實,對于進一步的分析而言,例如通過色譜法、尤其 是通過高效液相色譜法(HPLC)分離組分是必需的。便利地,對通過光譜法檢查組分的 分析方法提供上清液??紤]的光譜方法是通過與電磁輻射的相互作用檢查組分的方法, 尤其是NMR、IR、UV-VIS、激光-Raman光譜法。
分析的一個優(yōu)選的實施方案通過分光光度計進行。特別優(yōu)選的是可手工操作的 可移動設(shè)備,使用所述設(shè)備可快速并可靠地進行光度計測量。
4.分析試劑盒和分析裝置
本發(fā)明還涉及含有有機溶劑或溶劑混合物的分析單元,及其用于直接分析所提 取的物質(zhì)的用途。
尤其優(yōu)選的分析單元由兩個獨立的分析試劑盒組成,即預(yù)處理試劑盒和提取試 劑盒,使用所述試劑盒可以在兩個步驟中進行根據(jù)本發(fā)明的方法。例如,在預(yù)處理試劑 盒中破壞和稀釋生物材料。隨后將液體樣品從預(yù)處理試劑盒中轉(zhuǎn)移至提取試劑盒中,隨 后將所述物質(zhì)在其中提取、轉(zhuǎn)移至有機相并直接用分光光度計測量。
在這種情況下兩個試劑盒例如各用一個管形成,所述管由塑料或玻璃組成,并 且根據(jù)要分析的生物材料和物質(zhì)含有緩沖介質(zhì)和/或溶劑。
根據(jù)組分的特性,可例如通過在小型化毛細管上富集和/或分離而在分析前進 一步加工所述組分,所述毛細管裝有分離材料。
在分析方法的又一個優(yōu)選的實施方案中,直接富集并同時分離溶于有機溶劑中 的組分。分離可以使用復(fù)雜的色譜方法例如HPLC或氣相色譜進行,或通過標準或小型 化的柱色譜或薄層色譜法進行。在所述優(yōu)選的實施方案中,在壓強下在小型化的色譜柱 上直接從提取單元中富集組分,并與干擾物質(zhì)分離。富集和分離是一種吸附方法。在這 種情況下,物質(zhì)通過范德華力、偶極-偶極相互作用或氫鍵保留在固定相上。
本發(fā)明以以下實施例和圖表中給出的不同結(jié)果為基礎(chǔ)描述。


圖1 :緩沖液中分級DMSO濃度(總體積的% )和不同尿素濃度(摩爾濃度)對 從蛋黃樣品中提取類胡蘿卜素和蘇丹的效率的影響。
圖2 用于蛋黃的標準提取步驟與分級濃度DMSO影響的比較。
圖3 在小型柱色譜上分離類胡蘿卜素和蘇丹之前用脂酶消化蛋黃脂質(zhì)的影 響。
圖4左圖缺乏脂質(zhì)消化對在TLC上分離類胡蘿卜素和蘇丹的影響。
圖4右圖在TLC上分離類胡蘿卜素和蘇丹之前消化脂質(zhì)的影響。
圖5:不同脂酶對游離脂肪酸從蛋黃脂質(zhì)中釋放的影響。
圖6 用過氧化物漂白溶劑相對通過HPLC測定的類胡蘿卜素去除的影響。
圖7 用過氧化物漂白柱相對小型柱中類胡蘿卜素去除的影響。
圖8 用過氧化物在過運行后漂白對TLC平板上類胡蘿卜素去除的影響。
附圖描述
圖1顯示了 5個不同數(shù)據(jù)集合的簡圖。每個簡圖的特征是提取介質(zhì)中不同濃度的尿素。另外,在每個尿素濃度下DMSO的量從0到100%變化。該圖清楚地顯示,隨 著遞增的DMSO濃度,提取效率被顯著提高。50%和75%之間的數(shù)值可以被認為是最優(yōu) 的。
圖2顯示相似的實驗,但是在這種情況下,尿素的濃度被保持恒定于1M。數(shù)據(jù) 表示為使用異丙醇乙醇正己烷(1:2:6)的溶劑混合物(第6組)時來自蛋黃的類 胡蘿卜素和蘇丹最大提取量的百分比。各介質(zhì)的組成為
1 =水(稀釋溶液);正己烷(提取介質(zhì))
2 = 10% DMSO+1M尿素(稀釋溶液);正己烷(提取介質(zhì))
3 = 25% DMSO+1M尿素(稀釋溶液);正己烷(提取介質(zhì))
4 = 50% DMSO+1M尿素(稀釋溶液);正己烷(提取介質(zhì))
5 = 75% DMSO+1M尿素(稀釋溶液);正己烷(提取介質(zhì))
6 = IM尿素(稀釋溶液);乙醇異丙醇正己烷(V V Vl 2 6)(提 取介質(zhì))
圖3顯示脂酶對小型柱中類胡蘿卜素分離能力的影響。在這種情況下,用脂酶 (Picantase)孵育蛋黃樣品,濃度從1.5到lOOmg/ml樣品遞增。當采用條帶銳度作為標準 時,12到25mg/ml的脂酶濃度是最佳的。
圖4顯示脂酶處理對TLC上類胡蘿卜素和蘇丹分離的影響。TLC平板為Merck 1.05583。洗脫劑為正己烷中10%丙酮。
左側(cè)脂酶處理均未導(dǎo)致嚴重歪曲的條帶,而在右側(cè)條帶是清楚和尖銳的。
圖5顯示作為時間因素,脂酶處理對蛋黃中脂酶消化的影響。用相似濃度 (50mg/ml)的三種不同脂酶孵育蛋黃樣品。根據(jù)游離脂肪酸的釋放測量脂酶的降解。最 終點認為是100%。數(shù)據(jù)顯示在25°C下脂酶能夠消化脂質(zhì)。使用脂酶R8000在60分鐘 后得到最好的結(jié)果。
圖6顯示溶劑相漂白對摻入所示類胡蘿卜素的蛋黃提取物中去除類胡蘿卜素的 結(jié)果。在該實驗中,在分離前向有機提取物(異辛烷)中添加過氧化物。在指定的時間 點通過HPLC測定個體類胡蘿卜素的降解。結(jié)果顯示在60分鐘內(nèi)類胡蘿卜素被過氧化物 完全破壞。然而,摻入的蘇丹水平未受影響。
圖7顯示柱相漂白對小型柱中類胡蘿卜素的去除的影響。在這種情況下,用浸 透過氧化物的材料填充所述柱。用Piccantase A進行脂質(zhì)消化后,將蛋黃類胡蘿卜素和摻 入的蘇丹染料提取進異辛烷中。在柱上分離提取物。結(jié)果顯示類胡蘿卜素在流經(jīng)柱期間 完全被氧化破壞。
圖8顯示運行后漂白對類胡蘿卜素降解的影響。如圖8所示,類胡蘿卜素和摻 入的蘇丹從蛋黃中被提取,然后進行TLC并如圖4所述顯影。之后,用正己烷中的過氧 化物對TLC平板噴霧。結(jié)果顯示類胡蘿卜素在過氧化物處理后數(shù)分鐘內(nèi)被完全去除。
實施例1 從蛋黃中提取并測定蘇丹紅的一般過程
為了改善黃色和提高彩色穩(wěn)定性,染料被添加進多種天然為黃色或紅色的食物 中。盡管天然或等同于天然的類胡蘿卜素是安全的,但是當添加偶氮化合物時存在高水 平的健康風(fēng)險。為此,它們的添加是被禁止的,并且含有這些人工色素的產(chǎn)品必須從市 場上除去??焖?、可靠和靈敏的檢測是該目的所需要的。
這類方法的一個例子在下文中針對蛋黃進行描述。
蛋黃的一大部分由脂質(zhì)組成。有色成分是類胡蘿卜素。在蛋中,類胡蘿卜素葉 黃素、玉米黃素、類胡蘿卜素和角黃素以彼此不同的關(guān)系存在。它們通過飼料進入 蛋黃中。為了強化顏色,進行偶氮化合物類合成染料的飼喂。一個重要的代表是蘇丹 111(紅)。
以下的實施例闡述了從蛋黃中提取和檢測類胡蘿卜素和蘇丹紅的步驟。充分高 濃度DMSO的重要性在圖1和2中展示。
在每種情況下,將Igm蛋黃與4-10倍體積的緩沖溶液或蒸餾水混合,隨后在單 相溶劑或溶劑混合物中在單個步驟中離析。通過HPLC或光譜法測定有機提取物中的類 胡蘿卜素。通過HPLC測定維生素A和Ε。
a)將Ig蛋黃在每種情況下與4ml稀釋劑混合,所述稀釋劑為蒸餾水或者緩沖溶 液(例如0.1M檸檬酸銨緩沖液)。進行劇烈的手動或機械混合。
b)將混合物(通常200到400μ1)裝入注射器中,并通過橡膠隔膜注射進特定的 提取單元中。提取單元含有溶劑(正己烷或異辛烷)或單相溶劑混合物。
c)在又一個步驟中,通過添加緩沖液與DMSO和SDS的混合物(例如5 2比 例的DMSO 0.1% SDS中4Μ尿素)協(xié)助提取。
d)通過劇烈的搖動將脂溶性組分提取進有機提取介質(zhì)中。
e)通過重力進行3分鐘的相分離。
f)可以通過添加體積優(yōu)選地為500 μ 1的高濃度鹽或緩沖溶液,實現(xiàn)相分離的優(yōu) 化。
g)直接在分光光度計中測量上清液。
h)或者取出上清液并借助于HPLC或分光光度法測量組分。借助于HPLC測定 維生素A和維生素E。
i)為了富集和分離,在提取之后進行柱色譜分離。為此,將裝有硅膠(固定相) 的小型色譜柱放入提取管中。為此穿透提取單元的橡膠隔膜并以下述方式放置引入的柱 的較低端,所述方式使其恰好在液相之上。在柱的相對側(cè)安裝收集單元。
j)借助于5-lOml體積的注射器,用針通過隔膜向提取單元中泵入空氣,持續(xù)約 10分鐘。形成超壓,所述超壓導(dǎo)致有機提取介質(zhì)從提取單元經(jīng)過色譜柱(固定相硅膠) 流入收集單元中。在該過程中,發(fā)生類胡蘿卜素和蘇丹紅的富集和分離。
k)通過將含有樣品的柱與具有已知濃度蘇丹紅的柱進行比較,實現(xiàn)濃度的半定 量評估。
1)通過眼睛或光學(xué)信號的數(shù)字化放大進行檢測。類胡蘿卜素和蘇丹紅位于分離 的條帶中(圖3)。
實施例2:從根據(jù)本發(fā)明的蛋黃中提取和檢測蘇丹紅。通過脂酶預(yù)處理改進在 餼譜介質(zhì)上的分離。
在該實驗中,用脂酶處理含有天然類胡蘿卜素和摻入不同的合成蘇丹染料的蛋 樣品,從而以TLC(圖4)和小型柱色譜(圖3)上分離效力的測定為基礎(chǔ)顯示其效力。
a)將Ig蛋黃在每種情況下與4ml稀釋劑混合,所述稀釋劑為蒸餾水或者緩沖溶 液(例如0.1M檸檬酸銨緩沖液)。進行劇烈的手動或機械混合。
b)將200ml混合物用脂酶溶液(0.1M檸檬酸銨緩沖液中PicantaseA、Picantase R8000或胰腺脂酶200ml/ml)孵育。在室溫下孵育不同時間段。如果提高孵育溫度(例 如40°C),則可減少孵育時間。
c)將混合物(通常200到400 μ 1)裝入注射器中,并通過橡膠隔膜注射進特定的 提取單元中。提取單元含有溶劑(正己烷或異辛烷)或單相溶劑混合物。
d)在又一個步驟中,通過添加緩沖液與DMSO和SDS的混合物(例如5 2比 例的DMSO 0.1% SDS中4M尿素)協(xié)助提取。
e)通過劇烈的搖動將脂溶性組分提取進有機提取介質(zhì)中。
f)通過重力進行3分鐘的相分離。
g)可以通過添加體積優(yōu)選地為500 μ 1的高濃度鹽或緩沖溶液,改進或協(xié)助相分 離的優(yōu)化。
h)通過在TLC或小型柱上評價分離來測定脂酶活性的積極影響。
實施例3 =脂酶處理對游離脂肪酸的影響
在該實驗中,用不同的脂酶處理含有天然類胡蘿卜素和摻入不同的合成蘇丹染 料的蛋樣品,從而以測量脂酶誘導(dǎo)的來自甘油三酯和其他脂質(zhì)分解的游離脂肪酸的釋放 為基礎(chǔ),顯示其效力。
a)將Ig蛋黃在每種情況下與4ml稀釋劑混合,所述稀釋劑為蒸餾水或者緩沖溶 液(例如0.1M檸檬酸銨緩沖液)。進行劇烈的手動或機械混合。
b)將200ml混合物用脂酶溶液(0.1M檸檬酸銨緩沖液中PicantaseA、Picantase R8000或胰腺脂酶200ml/ml)孵育。在室溫下孵育不同時間段。如果提高孵育溫度(例 如40°C),則可減少孵育時間。
c)將混合物(通常200到400 μ 1)裝入注射器中,并通過橡膠隔膜注射進特定的 提取單元中。提取單元含有溶劑(正己烷或異辛烷)或單相溶劑混合物。
d)在又一個步驟中,通過添加緩沖液與DMSO和SDS的混合物(例如5 2比 例的DMSO 0.1% SDS中4M尿素)協(xié)助提取。
e)通過劇烈的搖動將脂溶性組分提取進有機提取介質(zhì)中。
f)通過重力進行3分鐘的相分離。
g)可以通過添加體積優(yōu)選地為500 μ 1的高濃度鹽或緩沖溶液,改進或協(xié)助相分 離的優(yōu)化。
h)通過測量時間依賴性的游離脂肪酸增加,測定脂酶活性的效力。
實施例4:通過在有機溶劑中處理,隨后通過氧化劑提取(溶劑相漂白)來去除 類胡蘿卜素
在該實驗中,如實驗2中所述處理樣品。然而,在步驟O中,用過氧化物(約 13mg/ml)來飽和(在20°C下)有機溶劑(例如正己烷或異辛烷)。或者,也可以使用次 氯酸鈉進行該實驗。
為了測定氧化能力,通過HPLC測定類胡蘿卜素的減少和類胡蘿卜素的穩(wěn)定性 (圖 6)。
實施例5 =通過在柱材料中包含過氧化物去除類胡蘿卜素(柱相漂白)
在該實驗中,如實驗4中所述處理樣品。然而,向柱材料中添加氧化化學(xué)品。在這種情況下,類胡蘿卜素在柱材料上分離期間被破壞(圖7)。
通過用苯甲?;^氧化物的正己烷溶液浸漬吸附劑來制備柱材料。將溶液在 20°C下飽和。該浸漬可以在填充毛細管之前或之后完成。在兩種情況下,均真空干燥色 譜材料。
棚列6 :卜胃躺識寸龍TLC科反卜應(yīng)謝氧魏射綠古膀卜 素(運行后漂白)
在該實驗中,如實驗4中所述處理樣品。然而,在分離類胡蘿卜素后通過噴霧 向TLC平板上添加氧化化學(xué)品。
在TLC平板上應(yīng)用如先前實驗中所述從蛋黃中提取的類胡蘿卜素和蘇丹,用于 分離和濃縮。在TLC運行后,用有機過氧化物溶液處理平板。為此將溶液噴霧在平板 上(圖8)。
權(quán)利要求
1.用于從富含脂質(zhì)的生物材料中提取親脂性物質(zhì)例如天然或合成(人造)的脂溶性染 料的方法,所述方法包括預(yù)處理步驟和隨后的提取步驟,所述預(yù)處理步驟發(fā)揮使組分更 容易進行提取的作用,所述提取步驟中所述材料物質(zhì)被提取進有機溶劑中,所述有機溶 劑由于添加水性樣品而將所述材料物質(zhì)分入兩相中,并且所述組分可在所述有機溶劑相 中被檢測到;其中在所述預(yù)處理步驟中,用至少一種酶處理所述樣品從而去除脂質(zhì),并 且其中在最終檢測之前通過氧化破壞對氧化敏感的成分例如類胡蘿卜素。
2.權(quán)利要求1中所述方法,其中所述合成染料為偶氮化合物。
3.權(quán)利要求1或2中所述方法,其中使用的所述生物材料是得自植物或動物的富含脂 質(zhì)的食物或飼料,例如蛋、黃油、全脂奶、奶酪、香腸、油。
4.前述權(quán)利要求中任一項所述方法,其中以特定的稀釋步驟來發(fā)揮預(yù)處理的作用, 需要時,特別是在固體生物材料的情況下,將所述特定的稀釋步驟額外地與破壞步驟組合
5.前述權(quán)利要求中任一項所述方法,所述方法包括用不同濃度的特定鹽溶液或緩沖 溶液來進行預(yù)處理,尤其是用尿素溶液進行。
6.前述權(quán)利要求中任一項所述方法,其中用至少一種用于脂質(zhì)的酶促消化的脂酶 處理所述生物材料的樣品,其中脂酶表示羧酸酯水解酶EC3丄1-,其包括例如以下的 活性EC 3.1丄3三?;视椭浮C 3.L1.4磷脂酶Al、EC 3丄1.5溶血磷脂酶、EC 3丄1.26半乳糖脂酶、EC 3丄1.32磷脂酶Al、EC 3.1丄73阿魏酸酯酶。
7.前述權(quán)利要求中任一項所述方法,其中使用極性質(zhì)子溶劑作為有機溶劑用于提取。
8.權(quán)利要求7中所述方法,其中所述極性質(zhì)子溶劑選自由甲醇、乙醇、1-丙醇、 2_丙醇(異丙醇)、丁醇、戊醇、己醇、DMSO及其混合物組成的組。
9.前述權(quán)利要求中任一項所述方法,其中通過極性非質(zhì)子溶劑增強類胡蘿卜素和蘇 丹的提取。
10.權(quán)利要求9中所述方法,其中所述極性非質(zhì)子溶劑是DMSO。
11.前述權(quán)利要求中任一項所述方法,其中在最終檢測之前通過色譜方法富集所提取 的組分,并且通過用氧化劑處理來破壞干擾最終分析的伴隨物質(zhì),例如對氧化敏感的成 分例如類胡蘿卜素。
12.權(quán)利要求9中所述方法,其中所述氧化劑是過氧化物,優(yōu)選地為無機過氧化物例 如壓02、K2S2O8,或有機過氧化物例如苯甲?;^氧化物。
13.前述權(quán)利要求中任一項所述方法,其中用光譜法、尤其是用比色法、優(yōu)選地用熒 光法分析所提取的物質(zhì)。
14.前述權(quán)利要求中任一項所述方法用于檢測食物和飼料中、優(yōu)選地檢測蛋或含蛋制 品中染料的用途。
15.用于進行前述權(quán)利要求中任一項所述方法的分析裝置,其由預(yù)處理試劑盒和提取 試劑盒組成,其中兩種試劑盒均各自含有上述類型的溶劑和/或溶劑混合物,所述類型 取決于待分析的生物材料和物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于從生物材料中提取和檢測脂溶性組分的方法,尤其是從富含脂質(zhì)的食品中提取、檢測和分析燃料的方法。所述方法包括提取和分離步驟和隨后的分析步驟的組合。本發(fā)明還涉及用于進行所述方法的分析試劑盒和分析設(shè)備。根據(jù)本發(fā)明的方法由多個步驟組成。其中關(guān)鍵性的步驟為1.預(yù)處理樣品,去除脂質(zhì);2.通過特定的溶劑或溶劑混合物將染料提取進提取混合物中;3.在最終通過眼睛或光學(xué)增強設(shè)備檢測和定量之前,破壞對氧化敏感的成分例如類胡蘿卜素。
文檔編號G01N1/40GK102023109SQ20091024655
公開日2011年4月20日 申請日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者弗洛瑞娜·J·斯楚威戈特 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司
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