專利名稱：沃尼妙林人工抗原及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種沃尼妙林人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
沃尼妙林(Valnemulin)是新一代截短側(cè)耳素(pleuromu. tili n)類半合成抗生 素，屬二萜烯類，是泰妙菌素的同類藥物。現(xiàn)已上市的沃尼妙林原料藥為鹽酸沃尼妙林，化 學名為{[2 ((R) — 2 —氨基一 3—甲基丁酰氨基)一 1，1 一二甲基乙基]巰基}乙酸 (3as,4R, 5S, 6S, 8R, 9R, 9aR, I OR) 一八氫一 5，8 —二羥基一 4,6,9,10 一四甲基一 6 乙烯 基一 3a，9 一丙烷一 3aH —環(huán)戊環(huán)辛烯一 1 (4H) —酮一 8 一酯鹽酸鹽，分子式C31H53CINz 05S，相對分子量601. 30，化學結(jié)構(gòu)式見式(II)。鹽酸沃尼妙林為白色或淡黃色非結(jié)晶性 粉末，有吸濕性；在水、無水乙醇中易溶，在叔丁基甲醚中幾乎不溶；比旋度為+15. 5° +18. 0° ；熔點 174 177°C ；pH 值為 3. 0 6. 0。
<formula>formula see original document page 3</formula>沃尼妙林的作用機理是與病原微生物核糖體上的50s亞基結(jié)合，抑制其蛋白質(zhì)的 合成。Poulsen等研究發(fā)現(xiàn)，沃尼妙林可與病原微生物核糖體23sRNA的ν區(qū)結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)肽 酶在tRNA的CCA —末端的準確定位，從而抑制病原微生物蛋白質(zhì)的合成，致使其死亡。1984年，瑞士 Sandoz公司Bemer等利用截短側(cè)耳素率先合成成功。1999年，瑞 士 Norvatis公司將其做成預混劑，商品名Econor，現(xiàn)已在多個國家上市，主要用于防治畜 禽支原體及腸道螺旋體感染。由于沃尼妙林具有安全、高效、低毒、不易產(chǎn)生耐藥性等特點， 目前許多國家已廣泛使用。雖然，沃尼妙林以其治療效果好、消除快、殘留低、不易產(chǎn)生耐藥 性、毒副作用小、對環(huán)境無污染等特點，得到了世界各國越來越多的關(guān)注。但動物實驗表明 其也可引起一些不良反應(yīng)，此外沃尼妙林可與聚醚離子載體類藥物，如莫能菌素、鹽霉素、 拉沙里菌素、馬杜霉素等相互作用，導致動物出現(xiàn)嚴重的中毒癥狀，甚至死亡。因此其對人 體的健康具有潛在的危害。雖然有研究報道沃尼妙林與其他藥物相比不易產(chǎn)生耐藥性，但 其臨床應(yīng)用時間不長，并不能證明其在長期使用后的結(jié)果。目前，EMEA規(guī)定了沃尼妙林在 豬體內(nèi)的最大殘留限量(MRLs)肝臟，500yg/kg;腎臟，100yg/kg ；肌肉，50yg/kg。目前對沃尼妙林還沒有一種公開發(fā)表，穩(wěn)定可靠的殘留檢測方法，可能是由于沃 尼妙林的最大吸收在近紫外區(qū)，而近紫外區(qū)各種雜質(zhì)的干擾又比較大，這無疑增大了其殘 留檢測的難度，因此，建立一種穩(wěn)定可靠的殘留檢測方法就成了當前亟待解決的問題。免疫化學分析由于其原理為抗原抗體之間的特異性結(jié)合，剛好可避開上述困難，因而具有獨特 的優(yōu)勢。同時免疫分析還具有操作簡便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu)點。影 響免疫化學分析質(zhì)量的根本因素是抗體的特異性與親和性，這些性質(zhì)又決定于免疫抗原分 子的結(jié)構(gòu)，因此免疫抗原的分子設(shè)計與合成就是產(chǎn)生特異性抗體和建立小分子獸藥殘留快 速檢測技術(shù)的最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種沃尼妙林人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供沃尼妙林人工抗原為式I所示化合物；
<formula>formula see original document page 4</formula>
式 I ；式I中，η為1-25的自然數(shù)；K表示載體蛋白。所述化合物中，所述K具體可為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、蘭素蛋白或卵清白 蛋白等，優(yōu)選牛血清白蛋白。所述化合物中，所述η具體可為18。本發(fā)明還保護式I所示化合物的制備方法，包括如下步驟1)將沃尼妙林、載體蛋白共溶于PBS中，得到溶液I;將碳二亞胺(EDC) 溶于水中，得到溶液II ；所述沃尼妙林、所述載體蛋白、所述碳二亞胺的質(zhì)量比為 (10-100) (20-200) (20-200)；2)將溶液II和溶液I混合，15_25°C反應(yīng)1_3小時，得到式I所示化合物。具體來說，所述方法包括如下步驟1)將50mg沃尼妙林、IOOmg載體蛋白共溶于2ml 0. OlM pH7. 4的PBS中，得到溶 液I ；將IOOmg碳二亞胺溶于Iml水中，得到溶液II ；2)將溶液II和溶液I混合，20V反應(yīng)2小時，得到式I所示化合物。所述方法中，所述K具體可為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、蘭素蛋白或卵清白蛋 白等，優(yōu)選牛血清白蛋白。所述方法中，所述η具體可為18。所述方法還包括將步驟2)得到的式I所示化合物進行透析的步驟；所述透析的條件為4°C -20°C、用PBS透析48-96小時，優(yōu)選為4°C、用0. OlM pH7. 4的PBS透析72小時。 所述方法還包括將透析后的所述化合物進行離心取上清的步驟；所述離心的條件 為4°C、5000-8000rmp、20-30 分鐘，優(yōu)選為 4°C、5000rpm、30 分鐘。沃尼妙林可先溶解于PBS溶液中，再加幾滴DMF促溶。具體可以采取逐滴加入的 方式。所述反應(yīng)過程中也可以進行攪拌。所述的化合物可應(yīng)用于制備沃尼妙林抗體，如單克隆抗體。用所述的化合物為免疫原制備得到的單克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述化合物或所述抗體可應(yīng)用于檢測沃尼妙林。本發(fā)明以EDC與載體蛋白的羧基反應(yīng)，生成載體蛋白的活性酯中間產(chǎn)物，然后與 含伯氨基的沃尼妙林發(fā)生反應(yīng)，從而使載體蛋白與沃尼妙林以酰胺鍵相連，得到人工抗原。 將人工抗原免疫動物后產(chǎn)生了針對沃尼妙林的特異性抗體。實驗結(jié)果表明，用本發(fā)明的抗 原免疫動物得到的抗血清的效價可達1 102400，最低檢測限為0.05ng/mL，半抑制濃度為 0. 4ng/mL，產(chǎn)生的抗體的特異性高、靈敏度高、準確度高。本發(fā)明的抗原和/或抗體，可用于 建立競爭酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)，從而用于快速檢測食品中的沃尼妙林殘留，較常規(guī)色譜 法比，具有成本低廉、操作簡單、樣品前處理簡便、方便快捷的特點，還減少由于采用HPLC、 GC檢測而使用的甲醇、乙腈等有機溶劑對環(huán)境的污染，適合于大規(guī)模檢測。本發(fā)明的制備方 法的產(chǎn)率高。因此，本發(fā)明的抗原及抗體及檢測方法具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為沃尼妙林人工抗原的紫外光譜圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例1、沃尼妙林人工抗原的制備和鑒定沃尼妙林購自Sigma Aldrich公司；產(chǎn)品目錄號32971。一、沃尼妙林人工抗原的制備將50mg沃尼妙林(Valnemul in)、IOOmg載體蛋白(牛血清蛋白BSA)共溶于 2ml0. OlM pH7. 4的PBS中，得到溶液I ；稱取碳二亞胺(EDC) lOOmg，溶于Iml水中，得到溶液 II ；將溶液II加入到溶液I中，在20°C的條件下，反應(yīng)2小時，得到反應(yīng)產(chǎn)物(沃尼妙林人 工抗原)。將反應(yīng)產(chǎn)物進行透析，透析的條件為4°C、用0. 01MpH7. 4的PBS透析72小時。 透析后將化合物于4°C、5000-8000rmp離心30分鐘，取上清(沃尼妙林人工抗原)，分裝于 安培瓶中，-20°C保存。二、沃尼妙林人工抗原的鑒定將步驟一保存的上清(沃尼妙林人工抗原)用0. OlM pH7. 4的PBS稀釋，然后進 行紫外(200-400nm)光譜掃描，以lmg/mL的BSA作為對照。紫外(200-400nm)光譜掃描結(jié) 果見圖1，沃尼妙林人工抗原的紫外圖譜與BSA相比發(fā)生了明顯變化，說明沃尼妙林半抗原 與載體蛋白BSA成功偶聯(lián)。沃尼妙林人工抗原(Valnemulin-BSA)為式I所示化合物，沃尼妙林和BSA的偶聯(lián)比為18 1。實施例2、抗血清的制備和特異性鑒定沃尼妙林標準品購自Sigma Aldrich公司；產(chǎn)品目錄號32971。新西蘭大白兔購自北京實驗動物研究中心。HRP-羊抗兔IgG 購自上海銳聰科技發(fā)展有限公司；產(chǎn)品目錄號KT117。一、沃尼妙林抗血清的制備新西蘭大白兔100只，隨機分成實驗組和對照組(每組50只)；實驗組以步驟二 制備的沃尼妙林人工抗原進行免疫，對照組以牛血清蛋白(BSA)進行免疫；每只兔子每次 免疫lmg/mL (以BSA量計)，每兩周免疫一次，共免疫7次；分別在第三次免疫之后7天，第 四次免疫之后7天，第五次免疫之后7天，第六次免疫之后7天，第七次免疫之后7天，每組 取10只兔子耳緣靜脈采血。二、沃尼妙林抗血清的效價測定分別將步驟一采得的血樣制備血清，進行間接競爭ELISA分析(每孔均設(shè)三個復 孔)，具體步驟如下1、包被用包被緩沖液將Valnemulin-OVA (制備方法同Valnemulin-BSA，用OVA 代替BSA)倍比稀釋為系列濃度(1000-100000)，每一濃度包被一行，100 iiL/孔，4°C過夜；2、洗滌與封閉傾去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次3分鐘；每孔加入150 y L 封閉液，37°C恒溫封閉lh，然后洗滌3次，每次3分鐘；3、加樣將50 ii L倍比稀釋的兔血清(1000-100000，)與50 i L沃尼妙林標準液 (1 u g/ml)加到酶標板上37°C反應(yīng)1小時，傾去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次；然后每孔加 入lOOii L HRP-羊抗兔IgG，37°C反應(yīng)1小時，傾去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次；4、顯色測定每孔加入TMB溶液100 y L，37 °C顯色20min，然后每孔加入50 y L 2mol L—^SC^以終止反應(yīng)，最后用酶標儀測定各孔的0D45(lnm值。ELISA分析中空白對照孔中用PBS代替兔血清，作為空白對照；零標準孔中用 PBS代替沃尼秒林標準液，作為陰性對照。實驗組沃尼妙林人工抗原第6次免疫之后獲得了特異性抗體，效價高達 1 102400，其配對包被抗原稀釋倍數(shù)為5000倍；與陰性對照(未加沃尼妙林標準品)相 比，加入沃尼妙林標準品后，吸光值呈明顯的遞減梯度，說明獲得的兔血清能夠特異性地識 別沃尼妙林。對照組BSA免疫組采集的7次免疫血清，測定中均無顯色，說明實驗組產(chǎn)生的抗 體是特異性針對沃尼妙林藥物的。結(jié)果表明，用沃尼妙林人工抗原免疫兔子，可以獲得高效價的抗體，且免疫后得到 的兔血清能夠特異性地識別沃尼妙林。三、沃尼妙林抗血清的最低檢測限和半抑制濃度測定分別將步驟一采得的血樣制備血清，進行如下實驗1、包被用包被緩沖液將Valnemulin-OVA(制備方法同Valnemulin-BSA，用0VA 代替BSA)稀釋5000倍，100 u L/孔，4°C過夜；2、洗滌與封閉傾去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次3分鐘；每孔加入150 y L 封閉液，37°C恒溫封閉lh，然后洗滌3次，每次3分鐘；
3、加樣將50 ii L的兔血清(102400倍稀釋)與50 i L沃尼妙林系列標準液(0、 0. 05,0. 25,1. 25、6. 25、50. 0,250. Ong/mL)加到酶標板上37°C反應(yīng)1小時，傾去孔內(nèi)液體， 用洗滌液洗滌3次；然后每孔加入100 y L HRP-羊抗兔IgG，37°C反應(yīng)1小時，傾去孔內(nèi)液 體，用洗滌液洗滌3次；4、顯色測定每孔加入TMB溶液100 y L，37 °C顯色20min，然后每孔加入50 y L 2mol L—^SC^以終止反應(yīng)，最后用酶標儀測定各孔的0D45(lnm值。用20%抑制濃度作為最低檢測限，測定結(jié)果為0. 05ng/mL,半抑制濃度為0. 4ng/ mL0
權(quán)利要求
式I所示化合物；式I；式I中，n為1-25的自然數(shù)；K表示載體蛋白。F200910237951XC00011.tif
2.根據(jù)權(quán)利1所述的化合物，其特征在于所述K為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、蘭 素蛋白或卵清白蛋白，優(yōu)選牛血清白蛋白；所述η為18。
3.權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，包括如下步驟1)將沃尼妙林、載體蛋白共溶于PBS中，得到溶液I；將碳二亞胺溶于 水中，得到溶液II ；所述沃尼妙林、所述載體蛋白、所述碳二亞胺的質(zhì)量比為 (10-100) (20-200) (20-200)；2)將溶液II和溶液I混合，15-25°C反應(yīng)1-3小時，得到式I所示化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟1)將50mg沃尼妙林、IOOmg載體蛋白共溶于2ml0. OlM pH7. 4的PBS中，得到溶液I ； 將IOOmg碳二亞胺溶于Iml水中，得到溶液II ；2)將溶液II和溶液I混合，20°C反應(yīng)2小時，得到式I所示化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述K為牛血清白蛋白、人血清白蛋 白、蘭素蛋白或卵清白蛋白，優(yōu)選牛血清白蛋白；所述η為18。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括將步驟2)得 到的式I所示化合物進行透析的步驟；所述透析的條件為4°C -20°C、用PBS透析48-96小 時，優(yōu)選為4°C、用0. OlM pH7. 4的PBS透析72小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法還包括將透析后的式I所示化 合物進行離心取上清的步驟；所述離心的條件為4°C、5000-8000rmp離心20-30分鐘，優(yōu)選 為4°C、5000rpm離心30分鐘。
8.權(quán)利要求1或2所述的化合物在制備沃尼妙林抗體中的應(yīng)用。
9.以權(quán)利要求1或2所述的化合物為免疫原制備得到的單克隆抗體。
10.權(quán)利要求1或2所述化合物或權(quán)利要求9所述抗體在檢測沃尼妙林中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種沃尼妙林人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供的沃尼妙林人工抗原為式I所示化合物；式I中，n為1-25的自然數(shù)；K表示載體蛋白。用本發(fā)明的人工抗原免疫新西蘭大白兔，可以得到對沃尼妙林有特異反應(yīng)的抗體。經(jīng)ELISA實驗鑒定，獲得的抗血清效價達到1∶102400。本發(fā)明為沃尼妙林的酶聯(lián)免疫檢測方法中所用檢測試劑的開發(fā)以及制備沃尼妙林的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒提供了廣闊的應(yīng)用和發(fā)展空間。應(yīng)用本發(fā)明的人工抗原得到的抗體進行沃尼秒林的檢測，具有簡便、特異、準確的特點，可以用于動物源性食品中沃尼妙林的快速、高效篩選，為快速檢測沃尼妙林奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。式I
文檔編號G01N33/577GK101812128SQ20091023795
公開日2010年8月25日 申請日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日
發(fā)明者史為民, 吳小平, 張靜, 徐飛, 李娜, 江海洋, 王亞輝, 王戰(zhàn)輝, 米鐵軍 申請人:北京維德維康生物技術(shù)有限公司