專利名稱：斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體的組合物，尤其涉及一種斑點(diǎn)金免疫滲濾 法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物，實現(xiàn)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的快速、準(zhǔn)確檢測。
背景技術(shù)：
臨床上自身免疫疾病主要有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、皮肌 炎、多發(fā)性肌炎、系統(tǒng)(多發(fā))性硬化癥、硬皮病等，這些疾病曾被命名為“結(jié)締組織病”，后 來國外和國內(nèi)均將它們歸為風(fēng)濕性疾病。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種較常見的以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為 主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫疾病，其病程長，多反復(fù)，且會造成組織不可逆的損傷，而給患 者造成很大痛苦。該病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)為0.5-1%，中國的發(fā)病率約為0.36%?；?者發(fā)病年齡多在20 50歲，女性多于男性，男女之比為1 3。最近流行病學(xué)統(tǒng)計，類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎有逐年增加的趨勢，其突出的早期臨床表現(xiàn)為對稱性關(guān)節(jié)紅腫熱痛、常見四肢小關(guān) 節(jié)、指間近端關(guān)節(jié)腫脹、掌指、腕、肘和踝等關(guān)節(jié)腫痛及活動困難、晨間關(guān)節(jié)僵硬、午后逐漸 減輕、關(guān)節(jié)外癥狀約有20%患者可出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)；長久不愈的晚期癥狀則有不同程度的關(guān) 節(jié)畸形和強(qiáng)直，以及關(guān)節(jié)功能喪失等現(xiàn)象，還會損傷臟器和多組織器官，造成骨頭缺血性壞 死，對人體消耗大，致殘率高。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因至今尚不十分清楚，且早期臨床表現(xiàn)也不典型。在國 內(nèi)外臨床實踐中，該疾病的常用診斷工具是美國風(fēng)濕學(xué)學(xué)會(American College of Rheumatology, ACR)在 1987 年制定的類風(fēng)濕分類標(biāo)準(zhǔn)(Arthritis Rheum 1988，31， 315-24)，該標(biāo)準(zhǔn)更依賴于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎所表現(xiàn)出的臨床病癥。但是，在該疾病早期，這些臨 床指標(biāo)通常是不易操作的。因此，目前普遍認(rèn)為這一標(biāo)準(zhǔn)不能較好適應(yīng)于早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎的診斷(Arthritis Rheum 2001，44，2485-91 ；Neth J Med 2002，60，383-8)。而目前使用 的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法主要是采用消炎方法，這種方法雖能使得關(guān)節(jié)腫脹(swelling) 和侵蝕(erosive)的程度得以減慢，卻無法使疾病得到治愈。當(dāng)前人們共同的觀點(diǎn)認(rèn)為， 在該疾病早期采用多種方法治療能得到最佳的治療效果(Autoimmunity Reviews 2006，6， 37-41)。由此，具有高專一性(Specificity)和高靈敏度(Sensitivity)的血清學(xué)檢測標(biāo) 記對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在骨關(guān)節(jié)遭受損傷之前的早期診斷就顯得尤為必要(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239—62)。研究發(fā)現(xiàn)一些自身免疫抗體雖然與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病相聯(lián)系，如抗 calpastatin 抗體(Proc Natl Acad Sci USA 1995，92，7267-71)、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體 (anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA)(IntArch Allergy Immunol 1996, 109，201-6)、核抗原抗體(anti-nuclearantigens，ANA) (Scand J Rheumatol 1986,15， 185-92)、抗 II 型膠原抗體(anti-collagen type II) (J Immunol Methods 2001,247, 191-203)和抗葡萄糖 6 磷酸異構(gòu)酶(anti-glucose-6-phosphate isomerase, anti-GPI) (Nat Immunol 2001，2，746-53)等也都能在患有其它自身免疫疾病的病人中，甚至于在健
4康個體中檢測出來(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-62)。其中的某些抗體雖 然能應(yīng)用于風(fēng)濕性疾病的識別，而且篩選這些抗體也有助于疾病監(jiān)測和預(yù)測，但由于其對 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎缺乏專一性，這些抗體中的絕大多數(shù)都很少應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷 (Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷的理想標(biāo)記(Marker)應(yīng)當(dāng)至少滿足4個標(biāo)準(zhǔn)(1)高 靈敏度，能檢測的病人達(dá)到高百分比；(2)高專一性，盡可能地限制錯誤陽性結(jié)果的發(fā)生； (3)能適用于早期診斷；(4)能預(yù)見到某些病人會發(fā)展成侵蝕性疾病(erosive disease) (AutoimmunityReviews 2006，6，37-41 ；MEDICINE 2006，34，441-4)。類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)抗體作為血清學(xué)檢測方法應(yīng)用于ACR標(biāo) 準(zhǔn)中，被公認(rèn)為是IgG分子上Fc結(jié)構(gòu)域的直接抗體。雖然其檢測靈敏度范圍可以達(dá)到 60-80%，但其對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的專一性也比較一般，為60%。此外，RF同樣可以在其 它患有自身免疫疾病的病人中、患有感染性疾病的病人中以及3-5%健康人群中(其中 10-30% 的老年人)檢測到(Ann Rheum Dis 2003，62，261-3)?？笲iP(p68)抗體，抗Sa抗體和抗環(huán)狀胍氨酸化蛋白抗體(APF、AKA、抗fiIaggrin 和抗CCP)則對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有更高的專一性。64%的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人能產(chǎn)生直接針對 BiP的抗體，還有報道稱其對該疾病具有高度的專一性，但目前沒有數(shù)據(jù)支持BiP在預(yù)測類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎方面具有作用，而且這些報道的BiP抗體還需要等待進(jìn)一步通過獨(dú)立的臨床研 究加以確認(rèn)(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。抗Sa抗體是源自于人脾臟和胎盤 的提取物當(dāng)中，分子量為50kDa的蛋白(Internal Medicine 2005，44，1122-6)。另有研究 揭示Sa抗原對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的專一性可以高達(dá)92-99%，但其靈敏度則顯得一般，僅為 30-40% (J Rheumatol 1994，21，1027-33 ;J Rheumatol 1999，26，7-13)。抗核周因子(antiperinuclear factor, APF)首次披露于1964年。經(jīng)研究這些自 身免疫抗體對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有專一性，并能通過以人頰粘膜細(xì)胞為抗原底物的免疫熒光 法間接測得(Ann Rheum Dis 1964，23，302-5)。1979年研究者描述了一種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎專一性角質(zhì)蛋白抗體，它能直接抑制 角質(zhì)層上皮細(xì)胞角質(zhì)化，并將這類抗體的名稱暫定為抗角質(zhì)蛋白抗體(anti-keratin andtibody, AKA) (BMJ 1979，2，97-9)。之后的研究證實，雖然AKA和APF的發(fā)現(xiàn)是互相 獨(dú)立的，但是兩者所直接對應(yīng)的抗原是一致的(J.Clin. Invest 1995，95，2672-9)。許多 研究進(jìn)一步表明AKA和APF具有許多共同的特性，它們均對于RA患者表現(xiàn)出高度的專一 性(Internal Medicine 2005，44，1122-6)。Filaggrin(filamentaggregating protein) 是一種互相交聯(lián)的角蛋白絲狀體，作用是形成非常堅固的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，其也是AKA和 APF 的常見抗原(Clin AppliedImmunol Rev 2004，4，239-62)。其中，APF 的目標(biāo)抗原為 profilaggrin，而 AKA 的抗原為 filaggrin(J Clin Invest 1995，95，2672-9)。雖然AKA和APF對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有專一性，但其缺陷也很突出。這兩種抗體 的檢測靈敏度嚴(yán)重依賴于filaggrin的純化方法。實踐中，由于難以分離得到純的且胍基 含量具有可重復(fù)性的抗原，再加上其檢測手段不簡便，以及熒光免疫檢測過程需要耗費(fèi)較 大的工作量，從而使得實驗室間難以形成標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)致AKA和APF沒有成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢 測的主流方法(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-62)。基于filaggrin和profilaggrin是AKA和APF抗體靶點(diǎn)的知識，人們合成了
5含有瓜氨酸的多肽以檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清中AKA和APF抗體的活性。由于瓜氨酸不 是基本氨基酸而無法在蛋白質(zhì)翻譯中加入，因此通常的方法是通過肽精氨酸脫亞胺酶 (peptidylargnine deiminine, PAD, EC3. 5. 3. 15)催化精氨酸殘基脫氨基得到。根據(jù)這 些事實，一些從filaggrin序列中衍生出來的精氨酸側(cè)鏈經(jīng)修飾的，尤其是含有瓜氨酸的 多肽被合成出來，并用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體的體外檢測(US6，858，438)。在用酶聯(lián)免疫吸 附(Enzyme-Linked immunosorbent Assay, ELISA)方法檢測實驗中，這一方法合成的含有 瓜氨酸直線性多肽能從類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中檢測出抗瓜氨酸肽抗體，在保持高專一性 (大于90%)的情況下，還大大提高了檢測的靈敏度(達(dá)到63%)。實驗還證明，只有含 瓜氨酸的多肽才能實現(xiàn)該反應(yīng)，若將多肽中的瓜氨酸用其它氨基酸代替則完全沒有反應(yīng)發(fā) 生。這些結(jié)果表明，瓜氨酸部分是決定能被AKA和APF抗體識別的抗原決定因子(J Clin Invest 1998，101，273-81)。其它研究者發(fā)現(xiàn)將含有瓜氨酸的直線性多肽通過二硫鍵(S-S鍵)形成環(huán)形結(jié) 構(gòu)的方式能模擬類似轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，從而模仿最初抗原決定簇的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，并可增 加多肽-抗體的親和力(FASEB J 1995,9,37-42 ；Mol Immunol 1985，22，1255-64)。由 此，一種環(huán)狀肽被人工合成出來，其將filaggrin主要表位上的兩個絲氨酸換成半胱 氨酸后，再由二硫鍵環(huán)化形成，即第一代環(huán)瓜氨酸肽(the first generation cyclic citrullinatedpeptide, CCP1) (Internal Medicine 2005，44，1122-6)。研究者將一條由 19個氨基酸殘基組成的瓜氨酸肽中兩個絲氨酸替換為半胱氨酸形成與β -轉(zhuǎn)角具有相似 結(jié)構(gòu)的二硫鍵，得到人工合成CCP，并將CCPl與直線肽的檢測結(jié)果作了比較。結(jié)果顯示， 采用CCPl為抗原的多肽用ELISA法檢測RA患者的抗CCP抗體，靈敏度較用直線性瓜氨酸 肽為抗原有顯著提高，分別為68%和49%，二者專一性相似(Arthritis Rheum 2000,43, 155-63)。穆榮等人在266例RA患者和186例對照者血清中檢測RF和AKA抗體、APF和抗 CCP抗體的方式，評估了抗聚絲蛋白抗體群(anti-filaggrin antibodies,AFAs)與RF聯(lián)合 檢測的意義。由于AKA和APF的敏感性太低，臨床上以RF和抗CCP抗體的聯(lián)合測定更為實 用(北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)2005，37，894)。研究還發(fā)現(xiàn)，通過檢測抗CCP抗體還能作為類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期病人一項重要指標(biāo)，為這類人群的早期防治提供參考(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-6)，其還能預(yù)測侵蝕性疾病(Clin Applied Immunol Rev 2004,4, 239-62)。在含有不同瓜氨酸多肽的反應(yīng)模式中，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清檢測表現(xiàn)出巨大的可變 性。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清/血漿中除了 filaggrin精氨酸殘基被瓜氨酸化外，Sa抗原、 膠原蛋白(I和II型)、組蛋白、髓磷脂堿蛋白、纖維連接蛋白等也出現(xiàn)瓜氨酸化，并產(chǎn)生抗 CCP抗體。深入研究表明，瓜氨酸化的自身抗原中并非所有精氨酸脫氨基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸；已 瓜氨酸化的瓜氨酸也不完全參與形成抗原表位，即產(chǎn)生抗CCP抗體。綜上，抗瓜氨酸抗體 的產(chǎn)生與瓜氨酸密切相關(guān)，并且瓜氨酸的側(cè)翼序列對抗瓜氨酸抗體的產(chǎn)生起重要作用，這 一事實暗示著瓜氨酸殘基的周邊氨基酸對于抗原表位(antigen episode)具有重要作用， 以及抗瓜氨酸化蛋白(如AKA和APF抗體)活性是多克隆反應(yīng)(J Clin Invest 1998， 101,273-81).基于filaggrin的屬性，它被認(rèn)為是模擬瓜氨酸抗原表位的天然庫藏(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239—62)。第二代CCP(CCP2)檢測方法產(chǎn)生于2002年，通過將含有瓜氨酸的多肽庫與類風(fēng)
6濕關(guān)節(jié)炎血清篩選得到與filaggrin無關(guān)的第二代CCP，其具有更有利于抗體檢測的表位 (Report on the 5th Dresden symposium onautoantibodies. Lengerich, Germany :Pabst Science Publishers ；2000. p. 140-5)。將CCPl和CCP2經(jīng)同一組病人測試后表明，CCP2不僅 保持了較高專一性(96% )，而且其分析靈敏度也有顯著的提高(Arm. Rheum. Dis. 2005，64， 1510-2)。許多研究者在最近5年的研究證明，抗含瓜氨酸多肽的測試的靈敏度具有較高的 可變性，范圍在 40% -94% (Clin. ExpRheumatol. 2005, 23 (Suppl39), 569-76 ；Ann. Rheum. Dis.2006，65，845-51)。CCP2在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體體外檢測中得到應(yīng)用說明了在 該領(lǐng)域的檢測抗原的篩選并不需要僅僅依賴filaggrin，也說明與filaggrin不同的結(jié)合 表位能更有利于體外檢測。Bizzaro N 等人(Clin Chem 2007，53，1527-33)和 Lutteri L 等人(Clinica Chimica Acta 2007，386，76-81)分別針對現(xiàn)在市場上使用的第二代和第三代CCP試劑盒 (Kit)進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伊諾瓦診斷(InovaDiagnostics)公司開發(fā)的三種檢測方法 中，其CCP3試劑盒與使用CCP2為抗原的方法相比僅僅略有改善，各自的靈敏度分別為67 % 和64%。相反地，用于抗IgG的CCP3. 0與即能檢測IgG又能檢測IgA的CCP3. 1的檢測方 法相比后發(fā)現(xiàn)，兩者竟然沒有絲毫差別?？梢?，同時檢測IgG和IgA抗體的方法并沒有象看 上去那樣有顯著改進(jìn)。他們的結(jié)論是由于測試的診斷試劑盒靈敏度可能與胍基化精氨酸殘 基的位置和數(shù)量有關(guān)，而專一性則可能受到蛋白質(zhì)或雜多肽序列的影響，因此，對此二者而 言，抗原的種類顯得更為重要。兩者綜合考慮，實驗數(shù)據(jù)表明抗原的制備是決定測定方法優(yōu) 劣的最重要的可變因素。Lutteri L等人(Clinica Chimica Acta 2007，386，76-81)的研究還發(fā)現(xiàn)了抗CCP 的另一個價值，他們指出，IgM-RF是最靈敏的標(biāo)記，能在77. 9%的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中發(fā) 現(xiàn)。必須注意的是，作為ACR標(biāo)準(zhǔn)中的RF，其類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷中靈敏度不能直接與那些沒 有包括在診斷標(biāo)準(zhǔn)中的其它方法相比較。IgM-RF被認(rèn)為在疾病專一性方面略有欠缺。使用 IgM-RF檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，其中有13-19%的人為RF陰性，與之相比，當(dāng)這些患者使用 抗CCP方法檢測時均為陽性。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的遺傳因素會影響瓜氨酸化蛋白的出現(xiàn)和產(chǎn)生，也會影響針對 這些修飾蛋白的抗體產(chǎn)物(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。一系列相關(guān)研 究表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與某些HLA-DR等位基因有密切聯(lián)系，尤其是HLA-DRB1*0401和 HLA-DRB 1*0404 (Cell 1996，85，307-10)。與相應(yīng)的含有精氨酸的多肽相比，將多肽瓜氨 酸化就能與HLA-DRB 1*0401和HLA-DRB 1*0404兩種“袋形”抗原更好地結(jié)合(J India Rheumatol Assoc 2004,12,143-6) 在不同地區(qū)的人群中，這些等位基因也略有不同。 DRB1*0401主要出現(xiàn)在北歐和北美地區(qū)的人群中，有證據(jù)表明該基因與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 所導(dǎo)致的“特大關(guān)節(jié)”表征(extraarticular manifestations)有聯(lián)系，在 DRB1*0401/ DRB1*0404 雜合基因型中尤為突出。DRB1*0403、DRB1*0406 和 DRB1*0407 與 DRB1*0401、 *0404或*0101基因組合后會增加類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情的發(fā)展可能。DRB1*0404與DRB1*0408 只要存在于白色人種中。DRB1*0405很少在北歐人群中，但在亞洲和環(huán)地中海沿岸國家 的人群中極其普遍。DRB1*0101主要存在于北歐和北美人群中。美洲印第安人群中則為 DRB1*1402和*1406(Hum Immuno 2000，61，1254-1261)。雖然這些與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的 基因在各地區(qū)人群中各有不同，但研究發(fā)現(xiàn)在DRBl的第三高度可變區(qū)(HV3)具有共享表位
7(shared epitope, SE)，在 70-74 位氨基酸殘基都為 QKRAA、QRRAA 或RRRAA (ClinicaChimica Acta 2004，350，17-34)。將一群有幾個共享表位基因型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者與具有抗CCP2抗體的患 者比較研究表明，一種共享表位等位基因與抗CCP2抗體的產(chǎn)生具有密切的內(nèi)在聯(lián)系 (Arthritis Rheum 2000,50,2113-21 ；Arthritis ResTher 2004，6，R303-8)。經(jīng)證實，這一 關(guān)聯(lián)是由于MHC分子共享表位β鏈的70-74位氨基酸殘基(Q/R，K/R，R，A，A)形成第4個 錨定袋(P4)，其與電中性或負(fù)電荷氨基酸具有高度親和性(J Immuno 2003，171，538-541)。 當(dāng)帶正電荷精氨酸在PAD酶作用下轉(zhuǎn)換成電中性的瓜氨酸后，得到的翻譯后修飾蛋白/多 肽親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于精氨酸與P4的親和力，并能夠激活⑶4+T細(xì)胞，這些“瓜氨酸特異T細(xì) 胞”可有助于抗瓜氨酸蛋白(多肽)抗體的產(chǎn)生(J Immuno 2003，171，538-541 ；Arthritis Rheuml987,30,1205-13 ；Rheum Dis Clin North Am 1992,18,741-59 ；ArthritisRheum 2005，52，1063-68)。這些結(jié)果表明具有共享表位的DBRl等位基因能激活類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患 者自身免疫反應(yīng)。綜合目前的研究結(jié)果，抗CCP抗體對RA具有較高的專一性，能將RA與其它與RA相 似的疾病相區(qū)分，這類抗體存在于絕大多數(shù)的病人體內(nèi)，在疾病的早期就能檢測到，有助于 對疾病的預(yù)測，能通過簡單的方式加以檢測(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-6)。將CCP肽用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的體外ELISA檢測已得到廣泛研究，也有諸多商業(yè)化 的檢測試劑盒。單次ELISA檢測通常需要較大的樣本數(shù)，檢測所用的時間也較長，其檢測過 程還需要專業(yè)的人員進(jìn)行操作，對醫(yī)療機(jī)構(gòu)的依賴度較大，從而不利于普通病患對病程的 自助監(jiān)測。膠體金金標(biāo)側(cè)向?qū)游龇ㄔ陬愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體檢測中也有應(yīng)用，該方法利用毛 細(xì)現(xiàn)象使檢測樣品依次流過標(biāo)記物、檢測區(qū)和控制區(qū)。由于在整個檢測過程中，待測抗體分 子與標(biāo)記抗體/抗原的結(jié)合始終處于吸附和脫附的過程當(dāng)中，在實際應(yīng)用當(dāng)中，其檢測靈 敏度受到所用檢測膜的影響，不利于產(chǎn)品的大規(guī)模臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組 合物，包括CCP肽組合物、與CCP肽共價結(jié)合的高分子聚合物、微孔濾膜和吸水介質(zhì)，實現(xiàn)對 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的快速、準(zhǔn)確檢測。CCP肽是一種由5-50個氨基酸通過酰胺鍵互相連接，且在不相鄰的兩個氨基酸側(cè) 鏈之間通過共價鍵形成的環(huán)形結(jié)構(gòu)有機(jī)分子。氨基酸為分子結(jié)構(gòu)中同時含有氨基和羧基 的有機(jī)化合物，選自于甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨 酸、天冬氨酸、組氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇 氨酸、半胱氨酸和脯氨酸。CCP肽的序列如美國專利申請2006/0039924A1、中國專利申請 02133648. 2,02824647. 0,200410093354. 1,200510044046. 4 和文獻(xiàn) J. Clin. Invest. 1998， 273-281中所記載的多肽。在所述CCP肽序列當(dāng)中至少有一個精氨酸側(cè)鏈被修飾，修飾的精 氨酸側(cè)鏈具有式I所示的結(jié)構(gòu)，
權(quán)利要求
1.一種斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物，包括CCP肽組合物、 高分子聚合物、微孔濾膜、吸水介質(zhì)和載體介質(zhì)；其中，CCP肽組合物包含CCP肽I和CCP肽 II，且CCP肽I和CCP肽II與高分子聚合物共價或非共價結(jié)合，高分子聚合物通過共價鍵 或非共價鍵結(jié)合于微孔濾膜上；所述的CCP肽I從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xa a3-Xaa4-Arg-Gly-Arg-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Cys-Gly,其中，Xaal 為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ； Xaa5 為 Ser 或 Arg ；Xaa6 為 Arg 或 Leu ；Xaa7 為 Ala 或 Ile ；Xaa8 為 Ala 或 Arg，其中至少 有兩個精氨酸側(cè)鏈被修飾；所述的CCP肽II從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-X aa3-Xaa4-Arg-His-Arg-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Cys-Gly,其中，Xaal 為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ； Xaa5 為 Ser 或 Arg ；Xaa6 為 Arg 或 Leu ；Xaa7 為 Ala 或 Ile ；Xaa8 為 Ala 或 Arg，其中至少 有兩個精氨酸側(cè)鏈被修飾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物，其 特征在于所述精氨酸側(cè)鏈被修飾，修飾的精氨酸側(cè)鏈具有式I所示的結(jié)構(gòu)，
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物，其 特征在于所述精氨酸側(cè)鏈被修飾后，成為瓜氨酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物，其 特征在于所述CCP肽I選自于SEQ ID No 1-118任意一種；所述CCP肽II選自于SEQ ID No 1-118任意一種，且CCP肽I與CCP肽II的序列不相同。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物，其 特征在于所述CCP肽I為SEQ ID No 1 ；所述CCP肽II為SEQID No 118。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物，其 特征在于所述CCP肽I與所述CCP肽組合物的摩爾比比值為0. 1-0. 9。
7.一種斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物，包括CCP肽組合物、 高分子聚合物、微孔濾膜、吸水介質(zhì)和載體介質(zhì)，高分子聚合物通過共價鍵或非共價鍵結(jié)合 于微孔濾膜上；其中，CCP肽組合物包含CCP肽I和CCP肽II，且CCP肽I和CCP肽11均與高分子聚合 物非共價結(jié)合；所述CCP肽I為SEQ ID No :1，所述CCP肽II為SEQ ID No 118 ；所述CCP 肽I與所述CCP肽II的摩爾比比值為1 1。
8.一種斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物，包括CCP肽組合物、 高分子聚合物、微孔濾膜、吸水介質(zhì)和載體介質(zhì)，高分子聚合物通過共價鍵或非共價鍵結(jié)合 于微孔濾膜上；其中，CCP肽組合物包含CCP肽I和CCP肽II，且CCP肽I和CCP肽II均與高分子聚 合物共價結(jié)合；所述CCP肽I為SEQ ID No :1，所述CCP肽II為SEQ ID No 118 ；所述CCP 肽I與所述CCP肽II的摩爾比為1 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一所述的斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組 合物，其特征在于所述微孔濾膜上結(jié)合的CCP肽聚合物含量為50 μ g-300 μ g/cm3。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一所述的斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組 合物，其特征在于所述微孔濾膜上結(jié)合的CCP肽聚合物含量為50 μ g-150 μ g/cm3。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一所述的斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組 合物，其特征在于所述高分子聚合物分子量大于2，OOODa0
12.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一所述的斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組 合物，其特征在于所述高分子聚合物選自于牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、 雞卵清白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、分叉型聚合物、聚賴氨酸、聚乙二醇、親和素或抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一所述的斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組 合物，其特征在于所述CCP肽與高分子聚合物之間的共價鍵選自于酰胺鍵、尿鍵、酯鍵、硫 醚鍵、腙鍵、肟鍵或二硫鍵。
全文摘要
一種斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物，包括CCP肽組合物、高分子聚合物、微孔濾膜、吸水介質(zhì)和載體介質(zhì)，高分子聚合物通過共價或非共價形式結(jié)合于微孔濾膜上。其中，CCP肽組合物包含CCP肽I和CCP肽II，且與高分子聚合物共價或非共價結(jié)合，所述CCP肽I與所述CCP肽組合物的摩爾比比值為0-1。該組合物不僅能夠?qū)崿F(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的快速體外檢測，而且便于患者自助診斷，并為及時了解病情發(fā)展提供參考。
文檔編號G01N33/564GK102004154SQ200910194750
公開日2011年4月6日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者朱紹榮 申請人:上海榮盛生物藥業(yè)有限公司