專利名稱：確定人腸道病毒71型總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及到研究人腸道病毒71型的方法。
背景技術(shù)：
人腸道病毒71型(EV71)于1969年首次被分離鑒定，是手足口病的病原體之一。該病毒主要感染5歲以下兒童，主要導(dǎo)致手足口病及皰疹性咽峽炎，少數(shù)情況下的并發(fā)癥包括腦膜炎，肺水腫，出血等，嚴重病例可導(dǎo)致死亡。人腸道病毒71型曾引起世界范圍內(nèi)的多次疾病暴發(fā)流行，上世紀80年代以來，人腸道病毒71型引發(fā)的手足口病在亞太地區(qū)肆虐，引發(fā)了嚴重的嬰幼兒死亡病例。 我國自1981年在上海發(fā)現(xiàn)本病，以后各個省市均有報道。2009年3月全國通過傳染病網(wǎng)絡(luò)直報系統(tǒng)報告的手足口病病例是54713例，死亡31例。從今年年初到4月7號，網(wǎng)絡(luò)直報顯示，全國累計報告手足口病例115618例，其中重癥773例，死亡50例。
人腸道病毒71型多肽鏈全長2，193個氨基酸，在體內(nèi)合成后切割成11個蛋白，包括VP1， VP2， VP3， VP4，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D。 目前較為流行的人腸道病毒71型致病機制為，病毒感染人體后，引起血腦屏障滲透性增加，隨后病毒在腦內(nèi)神經(jīng)元細胞的大量復(fù)制和引發(fā)的細胞損傷，導(dǎo)致了神經(jīng)元性肺水腫和肺水腫，這是嬰幼兒嚴重病例及死亡的主要原因。 但是，同時在小鼠體內(nèi)的比較醫(yī)學(xué)試驗表明，新生鼠的發(fā)病并沒有伴隨病毒在腦組織的大量復(fù)制，對傳統(tǒng)的病毒致病機理認知提出了新的挑戰(zhàn)，確定人腸道病毒71型感染的致病機理，是手足口病治療與預(yù)防的重要前提。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于以上需要，本發(fā)明的主要目的在于提供確定人腸道病毒71型總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域的方法。 為了達到以上目的，本發(fā)明提供的確定人腸道病毒71型總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域的方法，其主要包括以下步驟
a.人腸道病毒71型總蛋白的分割和工程表達 將人腸道病毒71型多肽鏈分割成由22 156個氨基酸組成的多肽，共22個，分
別在大腸桿菌中表達，使用6XHis tag標簽進行純化； b.人腸道病毒71型總蛋白的分割多肽抗原性的確定 將純化的蛋白對實驗動物進行免疫，獲得的抗血清分別與健康成年人和胎兒的腦組織進行免疫組化試驗，鑒定能與正常腦組織發(fā)生交叉反應(yīng)得抗血清，確定了與人體存在強交叉免疫原區(qū)域的人腸道病毒71型多肽；確定了與人體存在弱交叉免疫原區(qū)域的人腸道病毒71型多肽；確定了與人體不存在交叉免疫原區(qū)域的人腸道病毒71型多肽。
上述步驟a中，將EV71病毒的多肽鏈進行順序分割，將2193個氨基酸從N端依次
3分割成22 156個氨基酸構(gòu)成的多肽，共22個，絕大多數(shù)多肽的分子量在10kDa左右；
上述步驟a中，相鄰并且同屬于一個蛋白的兩個多肽之間存在4 19個氨基酸的重疊，避免了抗原決定簇的篩選遺漏； 上述步驟a中，多肽的N端與6XHis tag標簽進行融合表達，因為6XHis tag蛋白標簽不會對多肽的抗原性產(chǎn)生明顯影響，同時有利于多肽的純化；
上述步驟b中，多肽對實驗動物免疫，所述實驗動物包括大鼠，小鼠，兔，猴等；
上述步驟b中，P23?！?23， P646—755， P857—皿2， P1329—144。 4種多肽與人體抗原的交叉反應(yīng)結(jié)果為強陽性，下標數(shù)字表示在多肽在總病毒中多肽鏈上的位置，從N端起始，它們分別屬于人腸道病毒71型中的VP2， VP1，2A，2C蛋白;P卜69， P
324-443， P444-565， P566-665， P 46-876， Pl441-1526，
Pl549-1668， Pl732-1851， Pl952-2071， P2072-2193
IO種多肽與人體抗原的交叉反應(yīng)結(jié)果為弱陽性，它們分別屬于人腸道病毒71型中的VP4， VP3， VP1，3A，3C以及3D蛋白；P7。—159， P14?！?49， P1197—1338，P1649-1731 ， P1843-19515種多肽與人體抗原不存在交叉反應(yīng)，它們分別屬于人腸道病毒71型中的VP2，2C，3C以及3D蛋白。 綜上所述可以得知，EV71抗血清與人體抗原存在交叉免疫反應(yīng)，并且確定了 EV71總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域，據(jù)此將人腸道病毒71型總蛋白的不同片斷分
為3類(1)引發(fā)人體抗原的強交叉免疫原；(2)引發(fā)人體抗原的弱交叉免疫原；(3)與人體
抗原不存在交叉免疫原。因此，本發(fā)明將對人腸道病毒71型疫苗的研制具有指導(dǎo)作用，可以根據(jù)本發(fā)明設(shè)計與人體無交叉反應(yīng)或弱交叉反應(yīng)的手足口病疫苗，其中，人腸道病毒71型總蛋白中與人體抗原不存在交叉免疫原的區(qū)域可以用來設(shè)計疫苗，制備與人體無交叉反應(yīng)的手足口病疫苗。人腸道病毒71型總蛋白中與人體抗原存在弱交叉免疫原的區(qū)域可以用來設(shè)計疫苗，制備與人體弱交叉反應(yīng)的手足口病疫苗。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施方案對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不作對其的限定
實施步驟一 人腸道病毒71型總蛋白的分割和工程表達 分割所依賴的模板為中國安徽省阜陽的人腸道病毒71型分離株，Genbank存儲號為EU703812。該菌株的基因組CDS區(qū)共6582bp，編碼2193個氨基酸，分割多肽的大小控制在100個氨基酸(aa)左右，下限為22aa，上限為156aa，位于同一個蛋白內(nèi)的相鄰兩個多肽間存在4 15aa的重疊，如表1。
表1人腸道病毒71型總蛋白的分割方式
多肽名稱所屬蛋白多肽編碼區(qū)在人腸道病毒71型 基因組編碼區(qū)中的位置
Pl-69VP41-207
P70-159VP2208-477
P"0-249VP2418-747
P230-323VP2688-969
P324-443VP3970-1329
P444-565VP31330-1695
P566-665VP11696-1995
P646-755VP11936-2265
P 46-876VP12236-2628
P857-10122A2569-3036
P013-lll2B3037-3333
Pl112-12012C3334-3603 ，
Pll97-13382C3589-4014
Pi 329-14402C3985-4320
P441-15263A4321-4578
Pl527-15483B4579-4644
Pl549-16683C4645-5004
P聽-17313C4945:5193
P1732-18513D5194-5553
P鵬-19513D5527-5853
Pi 952-20713D5854-6213
P2072-21933D6214-6582 擴增多肽編碼區(qū)的引物兩端添加Ndel和Sacl位點，表達載體使用改造過的pET28a(+)表達載體，該載體經(jīng)過修改后，所表達目的蛋白的N端除6XHis tag蛋白標簽外，不含有多余的氨基酸序列。 構(gòu)建成功的表達載體轉(zhuǎn)入Escherichia coli BL21(DE3)中，用O. 5mM IPTG誘導(dǎo)多肽表達。多肽表達用SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示除P肌Hm，PmH訓(xùn)，P！527—1548三個多肽表達失敗外，其余多肽皆成功表達。
實施步驟二
分割多肽的純化
多肽以不可溶的包涵體形式表達，純化的包涵體使用8M尿素溶解，隨后使用 Novagen公司的Ni-HTA進行親和層析純化，純化后多肽純度達到95%以上。
實施步驟三 確定與人體抗原存在交叉免疫原的多肽 純化后的多肽對ICR小鼠免疫，獲得的抗血清分別與健康成年人和胎兒的腦組織 進行免疫組化試驗，確定人體抗原的交叉免疫原。 抗血清稀釋倍數(shù)為1 : 200，二抗方購自中山公司的HRP標記的山羊抗小鼠的二 抗，顯色底物為DAB，隨后用光學(xué)顯微鏡觀察試驗結(jié)果。結(jié)果表明，與人體抗原的交叉反應(yīng) 為強陽性的包括EV71總病毒，以及P，—323， P646—755， P857—1012 ， P1329—144。4種多肽。與人體抗原
白勺父叉反應(yīng)為弱陽f生白勺包f舌Pi—69， P324—443， P444—565， P566—665， P746—876， Pl441—1526， Pl549—1668， Pl732—1851， Pl952-2071， P2072-2193
IO種多肽。與人體抗原的不存在交叉反應(yīng)的為？7。-159， P14。—249， P
1197-1338，
Pl649-1731 ， Pl843_195l5禾中多月太。 上述結(jié)果顯示，通過人腸道病毒71型總蛋白的分割和工程表達，可以確定病毒中 與人體抗原存在免疫交叉反應(yīng)原的區(qū)域，可以根據(jù)本發(fā)明設(shè)計與人體無交叉反應(yīng)或弱交叉 反應(yīng)的手足口病疫苗。 以上已對本發(fā)明其內(nèi)容作了詳盡說明。對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明原理的前提下對它所做的任何顯而易見的改動，都不會超出本申請所附權(quán)利要求的保 護范圍。
權(quán)利要求
確定人腸道病毒71型總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域的方法，其特征在于，主要包括以下步驟a.人腸道病毒71型總蛋白的分割和工程表達將人腸道病毒71型多肽鏈從N端依次順序分割成由22～156個氨基酸組成的多肽，共22個，分別在大腸桿菌中表達，使用6×His tag標簽進行純化；b.人腸道病毒71型總蛋白的分割多肽抗原性的確定將純化的多肽對實驗動物進行免疫，獲得的抗血清分別與健康成年人和胎兒的腦組織進行免疫組化試驗，鑒定能與正常腦組織發(fā)生交叉反應(yīng)的抗血清，確定了與人體存在強交叉免疫原區(qū)域的人腸道病毒71型多肽；確定了與人體存在弱交叉免疫原區(qū)域的人腸道病毒71型多肽；確定了與人體不存在交叉免疫原區(qū)域的人腸道病毒71型多肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的確定人腸道病毒71型總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域的方法，其特征在于，所述步驟a中，分割產(chǎn)生的22個多肽中，位于同一個蛋白內(nèi)的相鄰多肽間存在4 19個氨基酸的重疊。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的確定人腸道病毒71型總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域的方法，其特征在于，所述步驟b中，多肽對實驗動物免疫，所述實驗動物包括大鼠，小鼠，兔，猴。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的確定人腸道病毒71型總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域的方法，其特征在于，所述步驟b中，引發(fā)人體抗原的強交叉免疫原包括P^—323、P646-755、P85h。12和P1329-144。，其中，所述下標數(shù)字表示在多肽在總病毒中多肽鏈上的位置，從N端起始，它們分別屬于人腸道病毒71型中的VP2， VP1， 2A， 2C蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的確定人腸道病毒71型總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域的方法，其特征在于，所述步驟b中，引發(fā)人體抗原的弱交叉免疫原包括P卜69、 P324—443、P444-565、P566-665、P746-876， Pl441-1526、Pl549-1668、Pl732-1851 、Pl952-2071禾卩 2072-2193，其中，所述下標數(shù)子表不在多肽在總病毒中多肽鏈上的位置，從N端起始，它們分別屬于人腸道病毒71型中的VP4，VP3， VP1，3A，3C以及3D蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的確定人腸道病毒71型總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域的方法，其特征在于，所述步驟b中，與人體抗原不存在交叉免疫原包括P7。—159、P14?！?49、Pu9H、P腳-，、P廳-腿，其中，所述下標數(shù)字表示在多肽在總病毒中多肽鏈上的位置，從N端起始，它們分別屬于人腸道病毒71型中的VP2， 2C， 3C以及3D蛋白。
7. 如權(quán)利要求1所述的確定人腸道病毒71型總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域的方法，用于設(shè)計或制備與人體無交叉反應(yīng)或弱交叉反應(yīng)的手足口病疫苗。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，提供確定人腸道病毒71型(EV71)總蛋白中引發(fā)人體抗原的交叉免疫原區(qū)域的方法，通過分段表達鑒定了人腸道病毒71型總蛋白，并進行各片斷免疫原性和誘導(dǎo)抗體與人體抗原的交叉反應(yīng)，將人腸道病毒71型總蛋白的不同片斷分為3類(1)引發(fā)人體抗原的強交叉免疫原；(2)引發(fā)人體抗原的弱交叉免疫原；(3)與人體抗原不存在交叉免疫原。因此，本發(fā)明將對人腸道病毒71型疫苗的研制具有指導(dǎo)作用，可以根據(jù)本發(fā)明設(shè)計與人體無交叉反應(yīng)或弱交叉反應(yīng)的手足口病疫苗。
文檔編號G01N33/569GK101699291SQ20091009334
公開日2010年4月28日 申請日期2009年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日
發(fā)明者劉江寧, 張連峰, 李萬波, 秦川 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所