專利名稱：耶爾森氏鼠疫桿菌Caf1M蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耶爾森氏鼠疫桿菌CaflM蛋白的應(yīng)用，具體是涉及CaflM 蛋白在制備鼠疫檢測和/或診斷制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鼠疫(Plague)是由耶爾森氏鼠疫桿菌(Yersinia pestis)引起的自然疫 源性烈性傳染病，是一個(gè)古老卻迄今仍嚴(yán)重威脅人類的傳染病，其席巻全 球的三次大流行，奪走了數(shù)億人們的生命。近年來，世界鼠疫疫情呈上升 趨勢，世界衛(wèi)生組織己將鼠疫列為重新抬頭的傳染病，因此鼠疫的威脅依 然存在， 一旦暴發(fā)，那將是人類的災(zāi)難。
鼠疫免疫檢測是鼠疫防治工作中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其在鼠疫的發(fā)現(xiàn)、 疫區(qū)處理及臨床診斷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用?；仡櫴笠呙庖邫z測的歷史， 主線是圍繞F1抗原的歷史。Fl抗原是由耶爾森氏鼠疫桿菌pMTl質(zhì)粒上 cafl基因編碼的一種莢膜蛋白。
長期以來，F(xiàn)l抗原被認(rèn)為是鼠疫桿菌的特異性抗原，基于F1的檢測抗 體的方法被認(rèn)為是較可信的鼠疫檢測和診斷方法。然而，2003年，在正常 的自然人群中發(fā)現(xiàn)了F1抗體陽性者，其中最高滴度的F1抗體為1: 2560， 對以Fl抗原為基礎(chǔ)的檢測鼠疫抗體的方法提出了挑戰(zhàn)。自然人群Fl抗體陽性血清的發(fā)現(xiàn)，是F1抗原的一種交叉反應(yīng)(或位點(diǎn)交叉反應(yīng))，還是真 正鼠疫感染而引起的，都迫切需要一種鼠疫其它組分進(jìn)行檢測和診斷。
另一方面，自然界已發(fā)現(xiàn)存在天然缺失F1抗原的鼠疫菌株，現(xiàn)行方法 針對于單一F1檢測的方法就有漏診的可能性。加之，F(xiàn)l抗原是一種溫度調(diào) 控表達(dá)抗原，在37'C時(shí)大量表達(dá)，而在28'C時(shí)不予表達(dá)或微量表達(dá)，這也 限制了它的應(yīng)用研究范圍。蚤作為鼠疫的一種主要傳播媒介，其體溫度是 28°C，在此溫度下Fl抗原幾乎不表達(dá)，因此現(xiàn)有的基于F1的檢測和診斷 方法不能用于蚤體的檢測；在鼠疫的檢測中，自然界的標(biāo)本中，尤其在尸 體標(biāo)本上，其溫度不可能在37'C，這也解釋了在一些檢測中，從鼠體上分 離到了鼠疫菌，而IHA等免疫學(xué)方法呈陰性的現(xiàn)象。因此，發(fā)展除F1抗原 外的檢測和診斷技術(shù)稱為必要，將是鼠疫防治工作中的一個(gè)重要課題。
CaflM蛋白是鼠疫Fl抗原的伴侶蛋白，也為鼠疫pMTl質(zhì)粒編碼。編 碼CaflM蛋白的基因(NCBI: NC—003134(82567..83343) (Yersinia pestis C092))序列及所編碼的CaflM蛋白(Swiss-Prot:P26926)序列請參見SEQ ID No: l與SEQ ID No: 2所示。CaflM蛋白屬于非ATP依賴的周質(zhì)伴侶 家族，該家族蛋白在革蘭氏病原體中與外膜一起裝配并分泌纖維樣粘附物。 它幫助折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)鼠疫F1莢膜的Cafl亞單位。在周質(zhì)中，CaflM依靠給 活化的Cafl加上大量的疏水表面阻止亞單位聚集(Anton V. Zavialov and Stefan D. Knight A novel self-capping mechanism controls aggregation of periplasmic chaperone CaflM, Molecular Microbiology (2007) 64(1)， 153-164)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種除Fl抗原外的檢測和/或診斷鼠疫的 方法，以輔助檢測和/或診斷鼠疫。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種除Fl抗原外的檢測和/或診斷鼠疫的候選抗原。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述的除Fl抗原外的檢測和/或診斷鼠疫 的候選抗原的應(yīng)用，及所述候選抗原的制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種以所述候選抗原為基礎(chǔ)的檢測和/或診 斷制劑。
本發(fā)明通過免疫蛋白組學(xué)，首先尋找并確定了 20多種候選診斷蛋白進(jìn) 行克隆表達(dá)，然后通過對這20余種重組蛋白進(jìn)一步分析鑒定(參見實(shí)施例 1)，發(fā)現(xiàn)CalM蛋白對正常兔血清及鼠疫全菌免疫兔血清的反應(yīng)存在明顯 差別，從而提出CalM蛋白是一種具有潛在診斷價(jià)值的蛋白，可以作為除 Fl抗原外的檢測和/或診斷鼠疫的候選抗原。
從而， 一方面，本發(fā)明提供了耶爾森氏鼠疫桿菌CaflM蛋白的新應(yīng) 用，更具體地說，本發(fā)明提供了耶爾森氏鼠疫桿菌CaflM蛋白在制備鼠 疫檢測和/或診斷制劑中的應(yīng)用。所述的檢測和/或診斷鼠疫包括輔助檢測和 /或診斷鼠疫。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述CaflM蛋白為帶有或未帶有標(biāo)簽的 下述蛋白
(a) 如SEQ ID No: 2至少第21 258位所示的氨基酸序列組成的蛋 白；或
(b) 在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸且與(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白。
本發(fā)明所述的CaflM蛋白優(yōu)選為去除全部或部分信號肽的CaflM蛋 白，例如，其氨基酸序列為如SEQIDNo: 2所示氨基酸序列去除N端10 20位氨基酸后的序列；在本發(fā)明的一最優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述CaflM 蛋白為去除了全部信號肽的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No: 2第21 258位所示，共具有238個(gè)氨基酸。
6本發(fā)明中，所述CaflM蛋白編碼基因?yàn)榫幋a所述CaflM蛋白的多核苷 酸序列，優(yōu)選具有如SEQIDNo: 1至少第6I 774位所示的多核苷酸序列。 在本發(fā)明的一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述ca/7M基因?yàn)槿バ盘栯木幋a序列 的ca/7M基因，其編碼序列如SEQIDNo: 1第61 774位所示，該編碼序 列全長714個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施方案，本發(fā)明的CaflM蛋白編碼基因的多核苷 酸序列可以依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，以基因組DNA作為模板，并選取合 適的寡核苷酸引物擴(kuò)增得到。這樣得到的核苷酸可以克隆進(jìn)合適的載體中， 并用DNA分析技術(shù)進(jìn)行序列描述。本發(fā)明的CaflM蛋白可以通過常規(guī)方法 獲得，例如通過轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度 后，用適當(dāng)?shù)姆椒?如溫度變動(dòng)或化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo))誘導(dǎo)啟動(dòng)子，然后繼續(xù)培 養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，可用離心法收集細(xì)胞，并用任何已知的方法，如凍融法、 超聲處理法、溶菌酶溶解法或機(jī)械破碎法破碎細(xì)胞?？梢杂酶鞣N已知的方法 從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的CaflM蛋白，這些方法包括硫酸銨 或乙醇沉淀法、酸萃取法、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維層析法、疏 水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法及高壓液柱層析法。
根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施方案，所述CaflM蛋白為重組CaflM蛋白 (rCaflM)。在本發(fā)明的一更具體的實(shí)施方案中，所述rCaflM是按照以下方 法制備得到的未去除或去除純化標(biāo)簽后的蛋白
設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增" /7M基因，然后克隆進(jìn)載體中，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞， 誘導(dǎo)培養(yǎng)陽性克隆，對誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行收集并純化。
根據(jù)本發(fā)明的一更具體的實(shí)施方案，本發(fā)明在制備重組CaflM蛋白時(shí)， 設(shè)計(jì)了專用于擴(kuò)增cq/7M基因的引物，該引物是針對去信號肽編碼序列的 cq/7M基因的全長(即如SEQIDNo: 1所示多核苷酸序列的第61 774位) 進(jìn)行擴(kuò)增，本發(fā)明的引物具體為
一M-S 5，- CATGCCATGGGCGAACTCTGCTCAACCAGATA -3 ，(參見SEQIDNo: 3所示，下劃線部分序列為A^coI酶切位點(diǎn))， cq/7M-A 5 ，- CCGCTCGAGTAAAGTCACATTTTTGGA ATACA -3 ，
(參見SEQIDNo: 4所示，下劃線部分序列為Wol酶切位點(diǎn))。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在利用所述引物PCR擴(kuò)增cq/7M基因時(shí)，
優(yōu)選的擴(kuò)增條件為
95。C預(yù)變性5min; 95。C變性60s， 58。C退火30s， 72。C延伸40s， 30個(gè) 循環(huán)；72。C延伸5min。
在本發(fā)明的一具體實(shí)施例(參見實(shí)施例2)中，對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了 鑒定，證實(shí)確實(shí)得到了目的o /7M基因全長序列。
根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明接下來采用一步法克隆，直接 將擴(kuò)增產(chǎn)物(目的ca/7M基因序列)與表達(dá)載體連接。所述表達(dá)載體優(yōu)選 為質(zhì)粒pGEX4t-l。 一步法克隆可省去傳統(tǒng)的TC克隆步驟，更節(jié)約時(shí)間和 成本。
經(jīng)上述克隆步驟，本發(fā)明得到了一種重組載體，根據(jù)本發(fā)明的一具體 實(shí)施方案，該重組載體是含有所述ca/7M基因的重組質(zhì)粒，命名為^//^/-pGEX4t-l。
然后，本發(fā)明將所述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到一種轉(zhuǎn)化體。在本 發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)化體是將所述重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌Aco// BL21(DE3)而得到的。實(shí)驗(yàn)證明，該轉(zhuǎn)化體能高效表達(dá)CaflM蛋白(參見 實(shí)施例4)。
本發(fā)明還對轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到的陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以表達(dá)目的 產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為終濃度 0.1 1.0mmol/L的IPTG， 24。C 38。C誘導(dǎo)1 10h。在該誘導(dǎo)條件下，目的 蛋白的表達(dá)量最高。
本發(fā)明在制備rCaflM時(shí)，還進(jìn)一步包括對誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行收集并純 化的步驟。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例(參見實(shí)施例4)中，還對所制備得到的表達(dá)
產(chǎn)物進(jìn)行Western Blot分析，證明利用本發(fā)明的方法得到的rCaflM具有較
好的免疫學(xué)活性，能與鼠疫天然免疫血清有較強(qiáng)反應(yīng)。
另一方面，本發(fā)明還提供了所述的鼠疫檢測和/或診斷制劑，其可以為
任何用于檢測和/或診斷、或者輔助檢測和/或診斷鼠疫的制劑，優(yōu)選為通過 免疫學(xué)方法進(jìn)行抗原抗體測定的制劑。例如，所述鼠疫檢測和/或診斷制劑 可以為檢測試劑、試紙條或試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施方案，所述 檢測和/或診斷制劑包括CalM蛋白。在本發(fā)明的一更具體實(shí)施方案中(參 見實(shí)施例5)，提供了一種噴涂有rCaflM蛋白的NC膜，并對自然人群F1 抗體陽性與陰性人的血清進(jìn)行免疫印跡分析，F(xiàn)l抗體陽性人群中對其反應(yīng) 陽性，而陰性人血清反應(yīng)陰性。
由上述內(nèi)容可知，本發(fā)明同時(shí)還提供了一種rCaflM蛋白及其制備方 法，本發(fā)明同時(shí)還提供了一種針對去信號肽編碼序列鼠疫cq/7M基因設(shè)計(jì) 的特定引物(參見SEQIDNO: 3與SEQIDNO: 4所示)，本發(fā)明還提供了 以該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法以及擴(kuò)增得到的o /7M基因，本發(fā)明還提供 了以所述擴(kuò)增產(chǎn)物制備得到的重組質(zhì)粒cq/7M-pGEX4t-l以及將該重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌五.co/ZBL21(DE3)而構(gòu)建得到的轉(zhuǎn)化體BL21-rCaflM。本發(fā)明 中，由于采用去信號肽編碼序列的cq/7M基因進(jìn)行重組CaflM蛋白的表達(dá)， 重組CaflM蛋白具有較好的抗原性，以此純化的重組CaflM蛋白噴制NC 膜或吸附于其他載體材料，通過免疫學(xué)方法進(jìn)行抗原抗體測定。
綜上所述，本發(fā)明首次提出了利用CaflM蛋白進(jìn)行鼠疫輔助檢測和/ 或診斷，為鼠疫的檢測和/或診斷提供了一種新的手段，本發(fā)明的技術(shù)是對 以F1抗原為主的鼠疫檢測和/或診斷的有益補(bǔ)充。


圖1顯示本發(fā)明實(shí)施例1中對鼠疫24個(gè)克隆表達(dá)蛋白的免疫學(xué)評價(jià)結(jié)果。其中，膜a和膜b所噴涂的蛋白相同，膜c和膜d所噴涂的蛋白相同， NC膜上噴涂的蛋白具體如下1: PMT054; 2: YP01293; 3: rFl; 4:蛋 白編號4; 5: YP03842; 6: CaflM; 7: YOPN; 8: YP_pMT054: 9: YP01635; 10: YPO2093; 11: YPMT1.05C; 12: YPO2090; 13:天然F1; 14: YP02174;
15: YPO2301; 16: YP02877; 17: YP03141; 18: YPPCP1.04; 19: F1C;
20: F1N; 21: YPPCP1.06; 22: YP3209; 23: CaflA; 24: YPO0388; 25: YPO3903; 26:天然F1。
圖2為去信號肽編碼序列的cq/7M基因PCR電泳圖。其中，泳道1: 去信號肽編碼序列的cq/7M基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2:分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖3為重組質(zhì)粒cq/7M-pGEX4t-l雙酶切電泳圖。其中，泳道h質(zhì)粒 pGEX4t-l以Wo I單酶切；泳道2:重組質(zhì)粒ca/7M-pGEX4t-l以屈o I單 酶切；泳道3:重組質(zhì)粒ca/LW-pGEX4t-l以iV^oI與^oI雙酶切；泳道4: 分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖4顯示轉(zhuǎn)化體BL21-rCaflM誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果。 其中，泳道a:分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道b:轉(zhuǎn)化體BL21-rCaflM誘導(dǎo)前全菌蛋白； 泳道c:轉(zhuǎn)化體BL21-rCaflM誘導(dǎo)表達(dá)后的全菌蛋白；泳道d:轉(zhuǎn)化體 BL21-rCaflM誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體裂解后沉淀；泳道e:轉(zhuǎn)化體BL21-rCaflM 誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體裂解后上清；泳道f:轉(zhuǎn)化體BL21-rCaflM誘導(dǎo)表達(dá)后的 菌體裂解后上清經(jīng)GST純化柱純化后產(chǎn)物。
圖5顯示純化重組CaflM的免疫印跡分析結(jié)果。其中，NC膜上噴涂 的蛋白具體為①表達(dá)菌裂解上清；②裂解沉淀(以8M尿素溶解)；③純化 后的重組CaflM蛋白；④天然F1抗原。a、 b、 c、 d分別代表進(jìn)行免疫印 跡分析時(shí)所加的血清標(biāo)本具體如下的膜a:免疫印跡時(shí)加的抗體為陽性鼠 疫免疫兔血清；b:免疫印跡時(shí)加的抗體為免疫前兔血清；C:免疫印跡時(shí) 加的抗體為F1陽性人血清；d:免疫印跡時(shí)加的抗體為正常人血清。
圖6顯示重組CaflM蛋白對人群血清的應(yīng)用評價(jià)結(jié)果。其中，所有NC膜上自上而下噴涂物分別為重組CaflM蛋白和天然Fl抗原。上面6條 NC膜進(jìn)行免疫印跡分析時(shí)分別加6份正常人血清，下面6條NC膜進(jìn)行免 疫印跡分析時(shí)分別加6份Fl抗體陽性人血清。
具體實(shí)施例方式
為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實(shí)施例及附圖進(jìn)一步描述本發(fā) 明。實(shí)施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中未注明具體條 件的實(shí)驗(yàn)方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，例如參見Sambrook 等人的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Cold Spring Harbor Lab(CSHL) Press, 2001)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。
實(shí)施例l鼠疫24種重組蛋白的免疫學(xué)評價(jià)
實(shí)驗(yàn)材料
申請人按照所屬領(lǐng)域常規(guī)操作克隆并純化的鼠疫24種重組蛋白，分別 是PMT054, YP01293, rFl，蛋白編號4， YP03842, CaflM, YOPN， YP_pMT054， YP01635, YPO2093, YPMT1.05C, YPO2090, YP02174, YPO2301,YPO2877,YPO3141,YPPCP1.04，F(xiàn)l C端多月太(24aa) ,FIN端多 肽(35aa) , YPPCP1.06， YP3209, CaflA, YPO0388, YPO3903; 天然Fl，購自青海省疾病預(yù)防控制中心地方病預(yù)防控制所； 鼠疫全菌免疫兔血清刮取37'C培養(yǎng)48 h的鼠疫EV76，研磨于生理 鹽水中，定菌濃度至7Xl()ScfU/ml， 56'C水浴1 h滅活備用。初免1 m1/ 只，皮下多點(diǎn)；20天后加強(qiáng)免疫，0.5 ml/只，皮下多點(diǎn)，共加強(qiáng)3次；末 次免疫15天后，采血測定效價(jià)(金標(biāo)法)，效價(jià)達(dá)l: 1000以上的備用。
實(shí)驗(yàn)方法
1. 將上述重組蛋白經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后，分別以1.5mg/ml的濃 度、1^/cm的量噴涂于NC膜(Millipore135)， 37'C干燥過夜。
2. 將上述噴涂有蛋白的NC膜以5%脫脂牛奶封閉過夜。
ii3. 以PBST(pH7.4， 0.01M,含0.1。/。Tween-20)洗膜三次。
4. 分別加正常兔血清及鼠疫全菌免疫兔血清(I:IOO)， 37。C反應(yīng)lh。
5. 以PBST(pH7.4， 0.01M,含0.1。/oTween-20)洗膜三次。
6. 加辣根過氧化物酶標(biāo)記SPA(l:lOOO)， 37。C反應(yīng)lh。
7. 以PBST(pH7.4， O.OIM，含0.1。/oTween-20)洗膜三次。
8. 將膜放入二氨基聯(lián)苯胺(6mg DAB、 lOjil H2O2、PBS(0.01M，pH7.4) 10ml)顯色液中顯色5min左右。
9. 將膜取出，以(121120沖洗，晾干后以掃描儀掃描結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
本實(shí)施例中鼠疫24種重組蛋白的免疫印跡分析結(jié)果請參見圖1，其中， 在免疫印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)，膜a與膜c加的血清為兔正常血清(免疫前血清)，膜b 和膜d加的是鼠疫全菌免疫兔血清(免疫后血清)。從圖中可以看出，其中 rFl(重組Fl抗原)，編號為4的蛋白及CalM蛋白對正常兔血清及鼠疫全菌 免疫兔血清的反應(yīng)存在明顯差別，是具有潛在診斷價(jià)值的蛋白。
實(shí)施例2、鼠疫^/7M基因的獲取 1材料和試劑
鼠疫菌DNA模板28X:培養(yǎng)鼠疫EV76過夜，取少許(接種環(huán)一環(huán))研 磨于裝有l(wèi)ml去離子水的1.5ml離心管；輕輕振蕩混懸，12000rpm離心 lmin(Eppendorf, 54i5D)，棄上清，以lml去離子水重新懸浮，重復(fù)1~2次 該步驟；將重懸好的菌液置于沸水中煮沸5min， 12000rpm離心取上清，即 為鼠疫DNA模板；
PCR相關(guān)試劑(其中Taq酶使用高保真的Ex Taq酶(TaKaRa));
超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN，離心柱型，目錄號DP203)。
2制備方法
2.1引物設(shè)計(jì)
根據(jù)耶爾森氏鼠疫桿菌(Yersinia pestis) cq/7M基因序列(NCBI:NC_003134(Yersinia pestis C092))，并去除其信號序歹U(如SEQ ID No: 1 第1 60位所示核苷酸序列)以及終止密碼子(TGA)，(目標(biāo)擴(kuò)增基因核苷 酸序列如SEQIDNo: 1第61 774位所示，共714bp)設(shè)計(jì)5'端正義引物 cq/7M-S和3'端反義引物cq/7Af-A，設(shè)計(jì)的原則首先是cq/7M-S與cq/7M-A 的5，端確定，通過加減3'核苷酸的數(shù)目使之得到較高的評分，同時(shí)注意兩 條引物的Tm值盡量接近；設(shè)計(jì)好后，人工加上酶切位點(diǎn)序列及保護(hù)堿基， 本發(fā)明中，在正義引物引入iVco1酶切位點(diǎn)，在反義引物引入WoI酶切位點(diǎn)，
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物如下
cq/7M-S 5，- CATGCCATGGGCGAACTCTGCTCAACCAGATA -3'
(SEQIDNo: 3，下劃線部分序列為iVcoI酶切位點(diǎn))， 一M-A 5，- CCGCTCGAGTAAAGTCACATTTTTGGA ATACA -3，
(SEQ ID No: 4，下劃線部分序列為AT oI酶切位點(diǎn))。
引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 2.2PCR擴(kuò)增ca/7M基因
應(yīng)用鼠疫菌DNA模版及上述引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增 cq/7Af基因。其中，PCR擴(kuò)增體系為25 nl:10xPCR緩沖液2.5^1，dNTP0.5(jJ， DNA模板1 c"/7M-S、 ca/7M-A引物各0.5 pl (20 |umol/L)， Ex Taq酶 (5U4d) 0.5|xl， d2H20 18.5 |_il。 PCR條件:95'C預(yù)變性5 min; 95。C變性 60s， 58。C退火30s， 72。C延伸40s，共30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5 min。
2.3 PCR產(chǎn)物回收與純化
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為110V恒壓30min， 全自動(dòng)凝膠成像儀拍照。合并上述4管PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以DNA純化試劑盒 進(jìn)行純化，操作按說明書進(jìn)行。
3結(jié)果
去信號肽編碼序列的cq/7M基因PCR電泳結(jié)果如圖2所示，從圖中可 以看出，PCR擴(kuò)增得到接近750bp—個(gè)條帶，與理論片段(733bp)相符。實(shí)施例3、含ca/ ikf基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 1材料及試劑
菌株及質(zhì)粒
表達(dá)質(zhì)粒pGEX4t-l (Novagen);感受態(tài)菌株Eco/z'BL21(DE3)等(天
根生化)。
分子生物學(xué)主要試劑
Ex Taq酶、限制性內(nèi)切酶TVcoI與Wo I (均購自Takara)， T4 DNA連 接酶(promega公司)；超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN，離心柱型， 目錄號DP203);高純度質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN，離心柱型，目錄號 DP104)。液體LB培養(yǎng)基及含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基(含Amp 100|ig/nil)。
2方法
2.1純化PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pGEX4t-l的雙酶切
將實(shí)施例1中得到的純化的ca/7M基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pGEX4t-l 分別用臉ol與屈ol雙酶切，酶切體系為30pl，其中10xK緩沖液3pl， PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒pGEX4t-l 18 jal， Wco I與Wo I各1 [il，力Q d2H20至終體 積30)^1， 37。C金屬浴3h。
2.2連接
將上述PCR酶切產(chǎn)物及pGEX4t-l酶切產(chǎn)物分別用DNA純化試劑盒及 質(zhì)粒小提試劑盒純化，將純化后的酶切cq/7M基因PCR產(chǎn)物與酶切后的質(zhì) 粒pGEX4t-l經(jīng)核酸濃度定量后，按4: 1的摩爾比例混合，加入T4DNA 連接酶(按T4連接酶使用說明進(jìn)行)，22°C 3h進(jìn)行連接反應(yīng)。
2.3轉(zhuǎn)化
① 從深低溫冰箱(-80°C )取出感受態(tài)細(xì)胞，迅速置入碎冰中(0 ~ -5 °C )， 靜置2 5min，使細(xì)胞解凍；
② 取10 )il上述連接反應(yīng)產(chǎn)物加到100 jil宿主菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕用
14吸頭吹打，以混勻內(nèi)容物，然后冰中靜置30min;
③ 從冰中取出后，迅速置入42。C水浴中熱激90s，注意操作要輕；
④ 熱激完成后，快速將管重新放回冰浴中，靜置3 5min;
⑤ 從冰浴中取出，然后向其中加500pl液體LB培養(yǎng)基(最好水浴預(yù)熱 至37T:),混勻后，轉(zhuǎn)移到37t:搖床上，75rpm，溫育45min至lh。
⑥ 取150 200 ^培養(yǎng)液均勻涂于LB固體培養(yǎng)基(含Amp 100 pg/ml) 表面，將平板置于室溫直至液體被吸收后，倒置平皿于37-C溫箱培養(yǎng)過夜。
2.4重組質(zhì)粒cq/7M-pGEX4t-l的鑒定
將長出的克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，具體步驟如下從LB固體培養(yǎng)基 (含Amp 100昭/ml)上選取若干(一般為8至IO個(gè))單菌落，用接種環(huán) 挑取單菌落，提取DNA模板并進(jìn)行針對目標(biāo)基因的PCR檢測(PCR反應(yīng) 液參考實(shí)施例l);做菌落PCR鑒定時(shí)，應(yīng)設(shè)置一個(gè)陽性和陰性對照。
將陽性克隆接種于5 ml含氨芐青霉素(100嗎/ml)的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C， 220 r/min培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，操作按說明 書進(jìn)行。
2.5重組質(zhì)粒cq/7M-pGEX4t-l的酶切鑒定
以質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，即以屈ol 對pGEX4t-l及ca/7M-pGEX4t-l行單酶切，以與Wo I對重組質(zhì)粒 cq/7M-pGEX4t-l進(jìn)行雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。
2.6重組質(zhì)粒ca/7M-pGEX4t-l中ca/7M基因序列測定
將3 5個(gè)酶切正確的cq/7M-pGEX4t-l重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行o /7M 基因序列測定，將序列與參考序列完全正確者進(jìn)行下一步誘導(dǎo)表達(dá)。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
重組質(zhì)粒cq/7M-pGEX4t-l的酶切鑒定結(jié)果請參見圖3，其中，以I 單酶切pGEX4t-l及ca/7M-pGEX4t-l進(jìn)行比對，后者(泳道2)要比前者 (泳道l)分子量大700bp左右，說明后者在質(zhì)粒pGEX4t-l中確有序列插入；以iVa I與^wI雙酶切重組質(zhì)粒cq/7M-pGEX4t-l (泳道3)進(jìn)行比對， 切出了兩個(gè)片段，其中較大片段約5000bp，與質(zhì)粒pGEX4t-l相近，較小 片段約700bp，與目的cq/7Af基因片段大小一致。該電泳圖說明，去信號肽 編碼序列的C"/7M基因已成功地通過與屈o I酶切位點(diǎn)連接于表達(dá)質(zhì) 粒pGEX4t-l中了。 cq/7M-pGEX4t-l重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
實(shí)施例4、重組鼠疫CaflM蛋白的表達(dá)和檢測 1材料與設(shè)備
含有重組質(zhì)粒cq/7M-pGEX4t-l (cq/7M基因序列測定正確)的 BL21， IPTG (1 M/L)，含氨芐青霉素的LB固體及液體培養(yǎng)基(含Amp 100pg/ml)，用于SDS-PAGE的全套試劑及設(shè)備，用于免疫印跡分析的全套 試劑及設(shè)備，溫控?fù)u床等。
鼠疫免疫兔血清刮取37'C培養(yǎng)48 h的鼠疫EV76，研磨于生理鹽水 中，定菌濃度至7X108cfU/ml， 56'C水浴lh滅活備用。初免1 ml/只，皮 下多點(diǎn)；20天后加強(qiáng)免疫，0.5 ml/只，皮下多點(diǎn)，共加強(qiáng)3次；末次免疫 15天后，采血測定效價(jià)(金標(biāo)法)，效價(jià)達(dá)l: 1000以上的備用。
鼠疫病人血清采自青海，血凝效價(jià)l: 160。
正常人血清及正常兔血清正常人血清為采自健康人的血清，沒有鼠 疫感染歷史，且經(jīng)常規(guī)方法檢測鼠疫抗體陰性；正常兔血清采自健康新西 蘭兔。
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)
挑一個(gè)含重組質(zhì)粒cq/7M-pGEX4t-l(插入的ca/7M基因序列測定正確) BL21單克隆，接種于5 ml液體LB培基，37。C振動(dòng)培育3 h左右(菌 液OD600值達(dá)到0.8~1.0時(shí))，向菌液中加入2.5 pl左右的IPTG (1 M/L) (IPTG終濃度為0.5 mmol/L左右)，繼續(xù)37。C振動(dòng)培育4 h左右，取菌液 進(jìn)行如下分析鑒定。2.2用次，每次5min，加入l: 100被試血清(鼠疫免疫兔血清，正常兔血清，鼠 疫病人血清及正常人血清)，室溫溫和搖動(dòng)孵育60 min;取出NC膜用0.1。/。 Tween的TBST沖洗30次，每次5 min，中間換液一次，至1: 2000 二抗 反應(yīng)液(HRP-SPA)(中彬生化)室溫緩搖卯min，洗膜后以二氨基聯(lián)苯胺 (6mgDAB、 10|JH2O2 、 PBS(0.01M， pH7.4)10ml)顯色5min。 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
轉(zhuǎn)化體BL21-rCaflM誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果請參見圖4, 從圖中可以看出，轉(zhuǎn)化體BL21-rCaflM經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可以高效表達(dá)重組 rCaflM抗原(泳道c)，該抗原部分以可溶形式存在，部分以包涵體形成存 在，上清部分經(jīng)GST純化柱純化后得到了較高純度的重組rCaflM蛋白(泳 道f),該重組rCaflM蛋白是與純化標(biāo)簽GST結(jié)合的融合蛋白 (GST-CaflM)，分子量在55KD (標(biāo)簽26KD， CaflM28.751KD)左右。
表達(dá)菌裂解上清、裂解沉淀(以8M尿素溶解)及純化后的重組CaflM 的免疫印跡分析結(jié)果請參見圖5。從該免疫印跡圖可以看出，三者都與鼠疫 免疫兔血清及F1抗體陽性人血清有良好的反應(yīng)，而與正常兔血清及正常人 血清無反應(yīng)。
實(shí)施例5重組CaflM蛋白(rCaflM)對正常人群血清的應(yīng)用評價(jià) 實(shí)驗(yàn)材料
重組CaflM蛋白(純化的GST-CaflM)及天然F1; NC膜(Millipore 135 )。 正常人群血清12份，其中包括選取的Fl抗體陽性血清6份(血凝測定 1: 40以上)，正常人血清6份。
實(shí)驗(yàn)方法
1.將重組CaflM蛋白與天然Fl經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后，分別以 1.5 mg/ml的濃度、1 pl/cm的量噴涂于NC膜(MilHpore 135)， 37X:干燥過夜。2. 將上述噴涂有蛋白的NC膜以5%脫脂牛奶封閉過夜。
3. 以PBST(pH7.4， 0.01M,含0.ly。Tween-20)洗膜三次。
4. 分別被試血清行1:100稀釋，將膜置入血清稀釋液，37t:反應(yīng)1 h。
5. 棄血清稀釋液，以PBST(pH7.4， O.OIM，含0.P/。Tween-20)洗膜三次。
6. 加辣根過氧化物酶標(biāo)記SPA(1: 1000)， 37'C反應(yīng)lh。
7. 以PBST(pH7.4, 0.01M,含0.1。/。Tween-20)洗膜三次。
8. 將膜放入二氨基聯(lián)苯胺(6mgDAB、 1(^1H202、 PBS(0.01M， pH7.4)10ml)顯色液中顯色5min左右。
9. 將膜取出，以d2H20沖洗，晾千后以掃描儀掃描結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
免疫印跡分析請參見圖6所示，其中，所有NC膜上自上而下噴涂物分 別為重組CaflM蛋白和天然Fl抗原。進(jìn)行免疫印跡分析時(shí)，上面6條NC 膜分別加6份正常人血清，下面6條NC膜分別加6份Fl抗體陽性人血清。 從圖中可以看出，重組CaflM蛋白對其中3份Fl抗體陽性人血清有明顯反 應(yīng)(自左到右第3、 4、 6)，另3份F1抗體陽性人血清顯色較弱；而對正常 人血清都只有略微背景顯色。該結(jié)果表明，重組CaflM蛋白可以作為鼠疫的 一種檢測和/或診斷(如輔助撿測和域診斷)用抗原。
長期以來，鼠疫的血清學(xué)診斷是以Fl作為唯一靶點(diǎn)的診斷方式，然而 一旦該檢測受到質(zhì)疑時(shí)(如無臨床癥狀)，急需另一個(gè)診斷靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。 本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)與鼠疫FI抗原分泌相關(guān)的CaflM蛋白也是鼠疫特異的一 種蛋白，且在鼠疫感染兔血清中也發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)抗體存在，本發(fā)明同時(shí)對浙江 Fl抗體陽性及陰性正常人血清進(jìn)行了對比檢測，發(fā)現(xiàn)F1抗體陽性人血清中 或多或少存在著CaflM蛋白抗體，從而支持了浙江Fl抗體陽性系為接觸鼠 疫相關(guān)菌引起的觀點(diǎn)。序列表
〈110〉中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 〈120〉耶爾森氏鼠疫桿菌CaflM蛋白的應(yīng)用
〈130〉 GAI09CN0370C
<160〉 4
〈170〉 Patentln version 3.5
〈210〉 1
〈211> 777
〈212〉 DNA
〈213〉 耶爾森氏鼠疫桿菌(fers2'/7J'a peso's)
〈220〉
〈221〉 CDS
<222〉 (1)..(777)
<400> 1
atg att tta aat aga Met lie Leu Asn Arg 1 5
ctt agt ttt get gcg Leu Ser Phe Ala Ala 20
aaa gag tat ggc gtg Lys Glu Tyr Gly Val 35
gat get get ggc gtt Asp Ala Ala Gly Val 50
gtt etc att cag tct Val Leu lie Gin Ser 65
gag gat cct ttc gtg
tta agt acg tta gga att att act ttc ggc atg 48 Leu Ser Thr Leu Gly lie lie Thr Phe Gly Met 10 15
aac tct get caa cca gat ate aaa ttc gca age % Asn Ser Ala Gin Pro Asp lie Lys Phe Ala Ser 25 30
act ata ggt gag agt agg ate ata tac ccg tta 144 Thr lie Gly Glu Ser Arg lie lie Tyr Pro Leu 40 45
atg gtc teg gtg aaa aac acc caa gat tat ccg 192 Met Val Ser Val Lys Asn Thr Gin Asp Tyr Pro 55 60
鄉(xiāng)ate tac gac gag aait aaa gaa aaa gaa tea 240 Arg lie Ty;rAsp Glu Asn Lys Glu Lys Glu Ser 70 75 80
gtc act ccg cca ttg ttt cga ttg gat get aag 288<image>image see original document page 21</image>〈210〉 2
<211〉 258
<212〉 PRT
〈213〉 耶爾森氏鼠疫桿菌(yersj'm'a peso's)
〈400> 2
Met lie Leu Asn Arg Leu Ser Thr Leu Gly lie lie Thr Phe Gly Met 1 5 10 15
Leu Ser Phe Ala Ala Asn Ser Ala Gin Pro Asp lie Lys Phe Ala Ser 20 25 30
Lys Glu Tyr Gly Val Thr lie Gly Glu Ser Arg lie lie Tyr Pro Leu 35 40 45
Asp Ala Ala Gly Val Met Val Ser Val Lys Asn Thr Gin Asp Tyr Pro 50 55 60
Val Leu lie Gin Ser Arg lie Tyr Asp Glu Asn Lys Glu Lys Glu Ser 65 70 75 80
Glu Asp Pro Phe Val Val Thr Pro Pro Leu Phe Arg Leu Asp Ala匕ys
85 90
95
Gin Gin Asn Ser Leu Arg lie Ala Gin Ala Gly Gly Val Phe Pro Arg
100 105
110
Asp Lys Glu Ser Leu Lys Trp Leu Cys Val Lys Gly lie Pro Pro Lys 115 120 125
Asp Glu Asp lie Trp Val Asp Asp Ala Thr Asn Lys Gin Lys Phe Asn 130 135 140Pro Asp Lys Asp Val Gly Val Phe Val Gin Phe Ala lie Asn Asn Cys
145 150
155 160
lie Lys Leu Leu Val Arg Pro Asn Glu Leu Lys Gly Thr Pro lie Gin
165
170 175
Phe Ala Glu Asn Leu Ser Trp Lys Val Asp Gly Gly Lys Leu lie Ala
180 185
190
Glu Asn Pro Ser Pro Phe Tyr Met Asn lie Gly Glu Leu Thr Phe Gly
195 200
205
Gly Lys Ser lie Pro Ser His Tyr lie Pro Pro Lys Ser Thr Trp Ala 210 215 220
Phe Asp Leu Pro Lys Gly Leu Ala Gly Ala Arg Asn Val Ser Trp Arg 225 230 235 240
:[le lie Asn Asp Gin Gly Gly Leu Asp Arg Leu Tyr Ser Lys Asn Val
245
250 255
Thr Leu
〈210〉 〈211〉 <2i2> 〈213〉
3
32 DNA
人工序列
<220>
〈223> 引物 〈400〉 3
catgccatgg gcgaactctg ctcaaccaga ta<210〉 4
〈211〉 32
〈212〉 DNA
<213〉 人工序列
〈220〉
<223〉 引物
〈400〉 4
ccgctcgagt aaagtcacat ttttggaata ca
權(quán)利要求
1、鼠疫耶爾森氏菌Caf1M蛋白在制備鼠疫檢測和/或診斷制劑中的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中，所述CaflM蛋白為帶有或未帶 有標(biāo)簽的下述蛋白-(a) 如SEQIDNo: 2至少第21 258位所示的氨基酸序列組成的蛋白；或(b) 在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸且與(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中，所述CaflM蛋白為按照以下方 法制備得到的未去除或去除純化標(biāo)簽后的蛋白-設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增cq/7M基因，然后克隆進(jìn)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化宿主細(xì) 胞，誘導(dǎo)培養(yǎng)陽性克隆，對誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行收集并純化。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，所述用于擴(kuò)增ca/7M基因的引 物為ca/7M-S 5 ，國CATG￡￡AI^2GCGAACTCTGCTCAACCAGATA -3 ， c。/7M-A 5 ， - CCGCTCGAGTAAAGTCACATTTTTGGA ATACA -3,。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，所述擴(kuò)增條件為95。C預(yù)變性5min; 95。C變性60s， 58。C退火30s， 72。C延伸40s， 30個(gè) 循環(huán)；72""C延伸5min。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，將擴(kuò)增得到的c"y7M基因與 pGEX4t-l連接，得到重組質(zhì)粒c"/7M-pGEX4t-l，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為 終濃度0.1 1.0mmol/L的IPTG， 24。C 38。C誘導(dǎo)l~10h。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中，所述鼠疫檢測和/或診斷制劑為 通過免疫學(xué)方法進(jìn)行抗原抗體測定的制劑。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述鼠疫檢測和/或診斷制劑為 噴涂有Caf 1M蛋白的NC膜。
10、 一種鼠疫檢測和/或診斷制劑，其包括鼠疫耶爾森氏菌CaflM蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了耶爾森氏鼠疫桿菌Caf1M蛋白的應(yīng)用，具體是耶爾森氏鼠疫桿菌Caf1M蛋白在制備鼠疫檢測和/或診斷制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明同時(shí)還提供了一種鼠疫檢測和/或診斷制劑，其包括耶爾森氏鼠疫桿菌Caf1M蛋白。本發(fā)明還涉及一種重組Caf1M蛋白及其制備方法，以及所述制備過程中所設(shè)計(jì)的引物、及重組載體與轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明為鼠疫的檢測和/或診斷提供了一種新的輔助手段。
文檔編號G01N33/569GK101533024SQ200910083028
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者俞東征, 張建中, 鵬 王, 王海濱, 石國祥, 迪 肖, 源 胡, 飛 趙, 閆笑梅 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所