專利名稱：：一種可定量檢測鼠疫耶爾森菌的蛋白懸浮芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種可定量檢測細(xì)菌的蛋白質(zhì)懸浮芯片及其制備方法，尤其是適合定量檢測和分析鼠疫耶爾森菌(rersf/2iapeso's)的蛋白質(zhì)懸浮芯片。
背景技術(shù)：
：鼠疫耶爾森菌(Fersi'/7/apes〃s)為呈革蘭氏染色陰性、不運(yùn)動、不形成芽孢的^Mf菌，吉母薩、瑞特氏或威森染色呈雙極濃染，能在4-40。C范圍內(nèi)生長，最適生長溫度為28-30°C,最適生長pH值為7.2-7.6，pH的耐受上下極限分別為pH5.0和pH9.6。鼠疫菌由假結(jié)核菌進(jìn)化而來，正處在進(jìn)化的活躍時期，其主要宿主為嚙齒動物，主要通過蚤的叮咬在動物間傳播。偶爾可經(jīng)跳蚤叮咬或接觸帶有鼠疫菌的動物、動物皮毛等引發(fā)人類疾病。患者在被染有鼠疫菌的跳蚤叮咬216天后，出現(xiàn)腺鼠疫的癥狀如發(fā)熱、寒顫、頭痛、虛弱、嘔吐，淋巴結(jié)腫大。原發(fā)性敗血型鼠疫的臨床癥狀與其他G-引起的敗血癥類似，引起病人發(fā)燒、寒顫、頭痛，有少數(shù)患者會由敗血型鼠疫發(fā)展為肺鼠疫。通過呼吸道途徑感染的患者發(fā)生原發(fā)性肺鼠疫，潛伏期為113天，起初象流感癥狀，迅速發(fā)展為肺炎并伴有咳嗽和血痰。腺鼠疫不經(jīng)治療的死亡率約為60%,用抗生素治療后降低到5°/。以下；敗血型鼠疫和肺鼠疫不經(jīng)治療死亡率高達(dá)l00%。鼠疫在歷史上曽經(jīng)引起三次世界范圍的大流行，使人類遭受了深重的災(zāi)難。隨著醫(yī)療衛(wèi)生水平的提高，鼠疫已經(jīng)得到較好的控制。但是，20世紀(jì)90年代以來，世界鼠疫開始活躍，發(fā)病人數(shù)和疫源地面積都有擴(kuò)大的趨勢，2000年世界衛(wèi)生組織(WHO)將鼠疫列為重新抬頭的傳染病。同時，鼠疫菌傳染性強(qiáng)、發(fā)病迅速，是生物戰(zhàn)劑和生物恐怖的重要病原之一。出于公共衛(wèi)生和國家安全的目的，研究和開發(fā)快速、定性、定量檢測傳染病病原體是所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中長期致力追求的目標(biāo)。尤其對于鼠疫菌來說，作為一種烈性傳染病的病原體，能否實現(xiàn)定量檢測至關(guān)重要。目前用于鼠疫菌的實驗室常規(guī)檢測方法有細(xì)菌學(xué)檢測方法、血清學(xué)檢測方法及檢測核酸的分子生物學(xué)方法(Perry,R.D.&Fetherston，J.D.Ke了siuj'apes"s--etiologicagentofplague.ClinMicrobiolRev1997，10(1)，35-66.)。但是，細(xì)菌學(xué)檢測方法、血清學(xué)檢測方法(例如間接血凝方法)及核酸檢測法等現(xiàn)有檢測技術(shù)存在許多缺陷。對于細(xì)菌學(xué)檢測法，細(xì)菌培養(yǎng)耗時較長，不適合對鼠疫菌的快速檢測。莢膜抗原(Fl抗原)是目前公認(rèn)的鼠疫菌種特異性抗原之一，檢測鼠疫菌Fl抗原及其抗體是鼠疫診斷的重要依據(jù)(DrobkovVI,AbdullinJG，DarmovIV.Useoftheenzymeimmunoassayinthelaboratorydiagnosisofplague[J].ZhurnalMikrobiol.Epidemiol.Im,nobiol.1992,16(10):40-42.;WilliamsJE，ArntzenL，TyndalGL,IsaacsonM.ApplicationofenzymeimmunoassayfortheconfirmationofclinicallysuspectplagueinNamibia,1982.Bull.W.H.0.1986，62:745—752.)。羊企測鼠疫菌特異性抗體(Fl抗體)的間接血凝方法(IHA),靈敏度低，特異性差(Williams,J.E.，Arntzen，L.，Robinson,D.M.&etal.Comparisonofpassivehaetnagglutinationandenzyme-linkedimmunosorbentassayforserodiagn()sisofplague.BullWHO1982，60，777-781.)。對于核酸檢測法，盡管采用了PCR技術(shù)對鼠疫菌進(jìn)行檢測和分析(Hinnebusch,J.&Scl濕n,T.G.NewmethodforplaguesurveillanceusingpolymerasechainreactiontodetectKersf;iiape""infleas.JCIinMicrobiol1993,31(6)，1511—1514.;Higgins，J.A.，Ezzell，J"Hinnebusch,B.J.,Shipley,M.，Henchal，E.A.&Ibrahim,M.S.5'nucleasePCRassaytodetectYersiniapestis.JClinMicrobiol1998，36(8)，2284-2288.;Neubauer,H.，Meyer,H.，Prior，J.，Aleksic，S.，Hensel，A.&Splettstosser，W.Acombinationofdifferentpolymerasechainreaction(PCR)assaysforthepresumptiveidentificationofYersiniapestis.JVetMedBInfectDisVetPublicHealth2000，47(8),573-580.)，尤其是實時熒光定量PCR技術(shù)(Herbert,T.，Emil,C.R.,Sascha，A.D.&etal.RapiddetectionofYersiniapestiswithmultiplexreal—timePCRassaysusingfluorescenthybridisationprobes.FEMSImmunolMedMicrobiol20M，％，H7-"6)，特異性高，不容易^L污染，但是現(xiàn)有PCR技術(shù)的方法繁瑣，特別是此類方法包括DNA/RNA的提取和復(fù)雜的操作步驟，而且不能用于非核酸物質(zhì)如蛋白質(zhì)的檢測，因此核酸檢測法具有局限性且不方便。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可定量檢測鼠疫耶爾森菌的蛋白懸浮芯片及其制備方法，適合定量檢測和分析鼠疫耶爾森菌pes"s)。懸浮芯片(suspensionarray)也稱液相芯片(1iquidarray,liquidchip),是20世紀(jì)70年代美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細(xì)胞儀作為檢測平臺，對核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī)模測定。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生IOO種不同比例顏色，作為IOO種獨(dú)特的色彩編號，每顆微球大小約5.5jim,可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標(biāo)記探針的微球與待測物在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后，利用機(jī)器自動將反應(yīng)液吸起并通過一微細(xì)管檢測通道，每次《又允"i午一個微球通過檢測通道。檢測通道中設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)樣"求基質(zhì)中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一道為綠色，激發(fā)報告分子的顏色，記錄信號強(qiáng)弱以檢測待測物的含量。當(dāng)待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標(biāo)的物，則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測到。再通過機(jī)器與計算機(jī)自動統(tǒng)計分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標(biāo)物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數(shù)十種病原。鼠疫菌與其它微生物一樣，菌體具有許多免疫活性物質(zhì)，大部分與其它細(xì)菌并無區(qū)別，其中只有少數(shù)抗原是鼠疫菌所特有的。莢膜抗原(F1抗原)是目前公認(rèn)的鼠疫菌種特異性抗原之一，檢測鼠疫菌Fl抗原及其抗體是鼠疫診斷的重要依據(jù)。Fl抗原是鼠疫菌的莢膜抗原，是鼠疫菌主8要的保護(hù)性抗原，是在37°C條件下鼠疫菌在細(xì)胞壁外形成的一層厚凝膠狀莢膜，具有明顯抗吞噬和活化補(bǔ)體的作用。Fl的抗原性強(qiáng)，特異性高。人或動物感染鼠疫菌后，F(xiàn)l抗原在體內(nèi)高度表達(dá)，尤其是腺鼠疫和肺鼠疫患者的血清中能檢測到高水平的Fl抗原。Fl抗原是鼠疫檢測中最常用的抗原之一，鼠疫菌Fl抗原易于制備標(biāo)準(zhǔn)品，操作簡單，不涉及生物安全問題。鑒于上述理由，本發(fā)明以鼠疫菌作為耶爾森菌屬的模式菌種，以鼠疫菌F1抗原為基礎(chǔ)，制備得到定量檢測鼠疫菌的蛋白質(zhì)懸浮芯片，建立了懸浮芯片定量檢測的技術(shù)平臺，實現(xiàn)了本發(fā)明的以下發(fā)明目的并達(dá)到預(yù)期的技術(shù)效果制備的蛋白質(zhì)懸浮芯片能夠更快速、定量檢測所述病原體，特異性強(qiáng)；蛋白質(zhì)懸浮芯片檢測方法比ELISA方法檢測敏感度高，并且動態(tài)范圍更寬；為所述病原體的定量檢測建立技術(shù)模型，例如鼠疫菌，而且還可以進(jìn)一步將所述蛋白懸浮芯片制備技術(shù)和方法應(yīng)用于其他纟田菌，病毒，毒素等；在此，我們通過定量檢測Fl抗原來優(yōu)化和制備得到蛋白質(zhì)懸浮芯片，并建立了定量檢測技術(shù)平臺體系。本發(fā)明提供一種定量檢測鼠疫耶爾森菌的蛋白質(zhì)懸浮芯片，該懸浮芯片由帶熒光素內(nèi)標(biāo)的聚笨乙烯微球(即編碼微球)構(gòu)成，該微球用可以捕獲相應(yīng)目標(biāo)分子的抗體包被，生物素標(biāo)記用于信號檢測的抗體，親和素化的熒光藻紅蛋白(SA-PE)。本發(fā)明還提供一種所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片的制備方法，該方法包括下列步驟(l)活化編碼微球，(2)用捕獲抗體包被編碼微球并計數(shù)，(3)用生物素標(biāo)記檢測抗體，(4)清洗液清洗，(5)檢測緩沖液本發(fā)明人經(jīng)過大量和深入的研究，對蛋白質(zhì)懸浮芯片及其檢測條件作了實質(zhì)性的優(yōu)化，其具有下列優(yōu)點(diǎn)1、抗體包被量的改進(jìn)抗體的包被量需要以檢測效果進(jìn)行優(yōu)化，本研究中各抗體的包被量自4-50pg始，以2倍、4倍的梯度測試，選擇在8-20pg即可懸浮芯片所需的抗體包被量很低，每孔20-40ng/2500-500G個微球/測試，而傳統(tǒng)免疫學(xué)方法-ELISA的包被量為200ng/孔/測試。2、生物素標(biāo)記的改進(jìn)9標(biāo)記抗體所用的生物素是過量的，過量的值試劑盒中有參考的計算公式。理論上講，在檢測過程中，過量的生物素因未標(biāo)記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗原連接，清洗時被抽濾掉，不會與隨后加入的SA-PE反應(yīng)，不影響檢測。但在實際檢測過程中，偶爾遇到過檢測信號可能降低的現(xiàn)象，因此建議生物素標(biāo)記抗體后，盡量去除多余的生物素。3、檢測的靈敏度及動態(tài)范圍本發(fā)明的懸浮芯片方法與經(jīng)典的免疫學(xué)^f僉測方法---ELISA相比，結(jié)果有著很好的吻合性，但懸浮芯片方法比ELISA靈敏度高兩個數(shù)量級，動態(tài)檢測范圍更寬，跨度為四個數(shù)量級。懸浮芯片方法靈敏度高于免疫學(xué)方法的經(jīng)典標(biāo)準(zhǔn)-ELISA方法，也從對30份樣品的檢測結(jié)果得到印證。本發(fā)明的懸浮芯片方法與上轉(zhuǎn)換磷光免疫層析方法(靈敏度lng/mL)相比(ZhongjiangYan，ZhongqiangYan，LeiZhouetal.RapidquantitativedetectionofFem./7fapesf/sbylateral—flowimmunoassayandup—convertingphosphortechnology—basedbiosensor.SensorsandActuatorsB,2006，119:656-663),也有著更高的靈敏度和動態(tài)檢測范圍。4、方法的特異性鼠疫菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，至少18種抗原，重要的有四種Fl抗原、V-W抗原、外膜蛋白和MT抗原。Fl抗原為莢膜抗原，37。C時產(chǎn)生，具有抗吞噬和活化補(bǔ)體的作用。Fl抗原是一種不耐熱的糖蛋白，IO(TC15分鐘即失去抗原性。本研究以菌體抗原上最接近鼠疫菌的假結(jié)核菌吸收兔抗鼠疫菌多克隆血清，有效的去除了細(xì)菌免疫學(xué)檢測中常出現(xiàn)的非特異現(xiàn)象。以多抗和單抗聯(lián)合組成的雙抗體夾心免疫檢測方法，保證了方法的特異性和敏感性。5、懸浮芯片方法的定量檢測能力本研究建立了基于編碼微球懸浮芯片技術(shù)的雙抗體夾心免疫學(xué)檢測鼠疫菌Fl抗原的方法，并評價了懸浮芯片方法的定量檢測能力。在0.154-4514ng/mL跨度四個數(shù)量級的動態(tài)檢測范圍內(nèi)，懸浮芯片可以實現(xiàn)對樣品的定量檢測。6、樣品的檢測能力本研究評價了懸浮芯片方法對"白色粉末，，等環(huán)境和食品樣品的檢測能力。通過對奶粉、小麥面粉、玉米淀粉、混合型果珍粉末等^t莫擬添加樣品的檢測，初步證實了該方法在檢測可疑污染鼠疫菌等生物威脅因子的"白色粉末"樣品中的實用性。7、建立了開放式病原體懸浮芯片定量檢測模型編碼微球懸浮芯片一個顯著的優(yōu)勢在于建立芯片檢測系統(tǒng)的開放性。在優(yōu)化好檢測一種病原體的芯片后，要增加新的檢測項目，不必重新點(diǎn)制另一張芯片，只需在原有的體系中加入另一種包被新目標(biāo)物抗體的微球及相應(yīng)的生物素化檢測抗體，就形成新的檢測組合。優(yōu)化好緩沖體系，整個檢測系統(tǒng)就可能有很強(qiáng)的包容性，同時檢測細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)毒素等。鼠疫感染后能夠形成牢固的免疫力，再次感染罕見。主要產(chǎn)生針對F1抗原、V-W抗原的抗體等，尤其以F1抗原最為特異。Fl抗原不僅可以作為鼠疫菌感染毒力標(biāo)志，還可區(qū)別于最近緣的同屬假結(jié)核菌感染。因此本研究采用Fl抗原作為檢測抗原，建立了開放式病原體懸浮芯片定量檢r測模型，該模型可以直接用于鼠疫菌的檢測。Fl抗原作為天然提取的蛋白質(zhì)，建立的檢測模型很可能適于毒素等蛋白質(zhì)的檢測。因此，本發(fā)明以鼠疫菌Fl抗原為對象，建立了開放式病原體懸浮芯片定量檢測模型，為研究建立多種類病原體懸浮芯片多重檢測系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片中，所述微球可以選自下面的一種或多種LUMINEX、BI0-RAD、QIAGEN、GENE等多家公司出售的同類微球產(chǎn)品，也可選用同一家公司的不同型號的微球，其中可以使用下面的微J求作為編碼微球171506043BIOPLEXCOUPLINGBEADS#43171506044BIOPLEXCOUPLINGBEADS#44171506045BIOPLEXCOUPLINGBEADS#45171506046BIOPLEXCOUPLINGBEADS#46171506047BIOPLEXCOUPLINGBEADS#47171506048BIOPLEXCOUPLINGBEADS#48171506049BIOPLEXCOUPLINGBEADS#49171506050BIOPLEXCOUPLINGBEADS#5011<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>本發(fā)明采用鼠疫菌Fl抗原，該抗原是提純的天然抗原。用于包被微球的抗體例如是下列一種或多種抗體(1)兔抗鼠疫菌EV76抗體，得自鼠疫菌EV76免疫家兔的血清中，采用正辛酸-飽和硫酸銨提純法得到的總IgG;(2)羊抗鼠疫菌EV76抗體，自鼠疫菌EV76免疫羊的血清中，采用正辛酸-飽和硫酸銨提純法得到的總IgG;(3)兔抗鼠疫菌Fl抗原的抗體，自鼠疫菌Fl抗原免疫家兔的血清中，采用飽和硫酸銨提純法得到的總IgG;(4)鼠抗鼠疫菌Fl抗原的IgG,單抗2F6、5G12、2H12;(5)羊抗鼠抗體，采用飽和硫酸銨提純法得到的總IgG;(6)雞IgG;(7)兔抗雞IgG。圖1表示懸浮芯片檢測鼠疫菌Fl抗原的劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2表示用本申請的懸浮芯片檢測鼠疫菌方法的特異性測試結(jié)果；圖3表示ELISA方法檢測鼠疫菌FlAg的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4表示本發(fā)明的懸浮芯片法和ELISA檢測同批樣品鼠疫菌結(jié)果的比較。具體實施例方式本發(fā)明涉及定量檢測鼠疫菌的蛋白質(zhì)懸浮芯片及其制備方法和檢測方法，下面通過具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不以任何方式受下列實施例的限定。本發(fā)明采用下列緩沖液來制備懸浮芯片并進(jìn)行目標(biāo)物的檢測(1)0.03MPB緩沖液(pH7.2):2.83gNa風(fēng),1.36giC定容至1L。(2)PB:0.OIM磷酸鹽緩沖液,pH7.2。用0.03MPB緩沖液稀釋而成，(3)PBS(pH7.4):NaCl137mmol/L;KC12.7畫1/L;Na2HP0410mmol/L;KH2P042mmol/L。用800mL蒸餾水溶解8gNaCl,0.2gKCl，1.44gNa2HP04和0.2化KH2P04。用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,加水至1L;分裝后在15psi(1.05kg/cm2)高壓蒸汽20min，或過濾除菌，保存于室溫。(4)微球清洗液:PBS(pH7.4)，0.05%TWEEN-20。(5)微球活化緩沖液100mMNaH2P04:3gNaH2P04,5NNaOH1.5mL,定容于250mL,pH6.2。(6)微球包被緩沖液0.05MMES，pH5.0:2,44gMES，5NNaOH0.15raL,定容于250mL。(7)微球保存液PBS-TBN:PBS，0.1%BSA,0.02%TWEEN,0.05%疊氮化物，pH7.4。(8)微球封閉液PBS-BN:PBS,1%BSA，0.05。/。疊氮化物，pH7.4。(9)檢測緩沖液PBS，1°/。BSA,pH7.4。(10)抗體稀釋液0.01咖o/LPB(pH7.2)。(11)微球稀釋液PBS,1%BSA，pH7.4。(12)樣品稀釋液0.01MPB,pH7.2。(13)生物素化抗體稀釋液:PBS-TBN(PBS，0.1%BSA，0.02%TWEEN-20，0.05%NaN3,pH7.4)。(14)SA-PE稀釋液PBS(pH7.4),1%BSA。實施例l、檢測鼠疫菌的蛋白質(zhì)懸浮芯片的制備1、捕獲抗體包被編碼微球首先，本發(fā)明采用的編碼孩i球(Bead，microsphere)可以購自LUMINEX公司的產(chǎn)品，每一種編碼的微球能夠標(biāo)記一種可以捕獲相應(yīng)目標(biāo)分子的抗體，用相應(yīng)抗體包被微球(100iaL含1.25x106個編碼微球)。A、編碼微球的活化取lOOjuL編碼微球到1.5mL離心管中，14000g離心,小心吸出并棄去上清液。加入lOOjaL的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入IOOjuL的微球活化緩沖液，接著先加入10jiL新鮮配置的EDC(50mg/mL),緊接著加入10juL新鮮配置的Sulfo-NHS(50mg/mL),在室溫震搖20min。加入150nL的PBS(pH7.4),震蕩后，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100|uL的PBS(pH7.4)懸浮編碼微球。B、用抗體包浮皮編碼微球取相應(yīng)的抗體5-50mg加入到活化后的編碼微球中,用PBS(pH7.4)定容至500jiL,室溫震搖2小時。14000g離心，小心吸出并棄去上清液。用500/iL的PBS(pH7.4)洗一次，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入250)aL的封閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入500jaL的微球保存液洗滌編碼微球，16000g離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150liL的微球保存液懸浮編碼微球，于4。C避光保存?zhèn)溆?，可放?年。c、包被微球的計數(shù)吸取適量微球，稀釋后，用血球計數(shù)板(O.10mm;1/400mm2)在普通顯微鏡下計數(shù)。根據(jù)公式(每個大格數(shù)x104x稀釋倍數(shù)x體積(mL))計算微球數(shù)量。2、檢測抗體的生物素標(biāo)記化A、生物素的標(biāo)記分別配制好濃度為10mM生物素溶液和2mg/mL的待標(biāo)記抗體溶液，將計算好體積的生物素加入到待標(biāo)記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時)，過柱脫鹽后分裝，-2(TC凍存?zhèn)溆?。B、抗體用量計算14以標(biāo)記2mg/mL的IgG(分子量150，000)1mL溶液為例，需加入lOmM生物素溶液約27ial。計算過程如下2mq!gG'1mmoilgG20mmoiBio5in^….，.1miIgGx~x-^——x-=0.000266mmolBiobn1mlIgG150'000mgIgG1mmolIgG'1.000000L0.000266mmolBiot!nx~——:-^~x-=26.6filBiotinReagentL10mmol結(jié)果判定若陰性對照孔出現(xiàn)很淡藍(lán)色，陽性孔顏色很深，則生物素化抗體可使用；否則，需重新進(jìn)行新一輪抗體的生物素化標(biāo)記。實施例2、懸浮芯片制備條件的改進(jìn)1、微球包被不同抗體及包被量的選擇分別選擇抗鼠疫菌Fl的三種單抗(2F6、5G12、2H12)和三種多抗(兔抗EV76、羊抗EV76、兔抗Fl)，分別以4pg、8pg、10pg、16jig、24pg、40|ig、48pg的量包被100pL編碼為28號的微球。經(jīng)檢測，以4jig、8pg、16|ig的單抗2F6和48pg兔抗EV76以及40pg羊抗EV76包被微球效果不佳，不能滿足包被后檢測的需要；16^g單抗5G12、24jig單抗2H12和16叫兔抗EV76、10pg羊抗EV76以及10pg、40[ig的兔抗Fl包被效果很好，MFI值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2000,顯微鏡下計數(shù)后避光冷藏保存待用。2、生物素化抗體的優(yōu)化分別用氨基活性的生物素(生物素-LC-hydrazide)和羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)標(biāo)記鼠疫菌Fl的單抗和多抗，經(jīng)檢測效果比較，本實驗中SH-反應(yīng)性生物素標(biāo)記單抗檢測效果最好，檢測效果的方法采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法或安裝制造商的產(chǎn)品說明書所述的方法。本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)和深入的試驗，發(fā)現(xiàn)2mg/mL生物素化的抗體以1:50稀釋作為檢測抗體進(jìn)行檢測。比較檢測結(jié)果，生物素化的鼠疫菌Fl單抗2F6、5G12、2H12均獲得高檢測值和低背景值，優(yōu)于多抗的標(biāo)記檢測效果。生物素化后的抗體應(yīng)將游離的生物素除去，否則會導(dǎo)致信號^0生物素化后的抗體用MUHpore柱除鹽后分裝凍存待用。153、懸浮芯片-雙抗夾心法檢測鼠疫菌Fl抗原抗體配對組合用28號微球包被的單抗5G12、2H12和多抗兔抗EV76、羊抗EV76、兔抗Fl-10、兔抗F1-40作為捕獲抗體，生物素標(biāo)記的鼠疫菌Fl單抗2F6、5G12、2H12作為檢測抗體，進(jìn)行了配對組合。為降低成本和抗體配對的工作量，先以高倍1:50稀釋生物素化抗體作為檢測抗體，以遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于檢出限的待檢分析物500ng/mLFl抗原為檢測對象，評價配對組合抗體的檢測結(jié)杲，初步選擇單抗2F6為檢測抗體，兔抗EV76、羊抗EV76、兔抗Fl為捕獲抗體。再用不同濃度的抬r測抗體和高于檢出限的待檢物500pg/mLFl抗原為才企測對象，評價包被微球的三種多抗及其不同濃度包被量下的檢測效果。結(jié)果顯示(見表1),以兔抗EV76為捕獲抗體、單抗2F6為^r測抗體以及兔抗F1為捕獲抗體、單抗2F6為檢測抗體的組合均可，兔抗F1與單抗2F6組合效果最機(jī)佳。選定微球標(biāo)記的兔抗F1為捕獲抗體、生物素標(biāo)記的單抗2F6為檢測抗體的組合作為懸浮芯片檢測鼠疫菌的雙抗體夾心模式。以后的纟企測均以此組合進(jìn)行。表1不同抗體組合及不同檢測抗體濃度檢測鼠疫菌Fl結(jié)果微球包被捕獲抗體檢測物濃度生物素化抗體用量MFI028-兔抗EV76500pg/mL1:501503.5028-羊抗EV76,500pg/mL1:50343.5028-兔抗F1-10500pg/mL1:50666028-兔抗Fl-40500pg/mL1:505066.5028-兔抗EV76500pg/mL1:2002015.5028-羊抗EV76500pg/mL1:200141028-兔抗F1A500pg/mL1:2002954028-兔抗F1B500pg/mL1:2004944.5028-兔抗EV76500pg/mL1:謂2120028-羊抗EV76500pg/mL1:,99028-兔抗F1A500pg/mL1:謂3120.5028-兔抗F1B500pg/mL1:8004979028-兔抗EV76500pg/mL1:3200151816<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注檢測物為鼠疫菌F1抗原，生物素化抗體為2F6單抗。實施例3、樣品的制備和檢測1、待測樣品制備配制系列濃度F1抗原標(biāo)準(zhǔn)品，以繪制樣品檢測劑量-反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線用樣品稀釋液將Fl抗原以4倍梯度稀釋成系列濃度同樣的樣品用于ELISA和懸浮芯片的檢測。2、人工污染"白色粉末"樣品將一定含量的F1抗原依照不同濃度分別摻入奶粉、淀粉、面粉、速溶果珍等粉末樣品，將0.5g粉末加入到5mL樣品稀釋緩沖液中，充分混勻，靜置2小時，讓待測樣品與白色粉末充分吸附。對上述被污染的"白色粉末"樣品進(jìn)行處理，選用棉花、薄濾紙、厚濾紙、G.45，濾膜、G.22,濾膜過濾，以及2G00rpm、5分鐘和1G0Grpm、4分鐘低速離心等方法處理人工添加樣品后的粉末溶液，上清夜進(jìn)行懸浮芯片分析檢測。3、懸浮芯片的檢測采用雙抗體夾心免疫學(xué)檢測模式，檢測過程中全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行。1)每孔加入50jaL含相應(yīng)編碼貧i球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50iaL檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入5G]uL適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50jhL的SA-PE,混勻后室溫避光震搖IO分鐘。用清洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125nL的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取FMI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。上述^r測過程可在30分鐘完成96個樣品中目標(biāo)物的4全測。實施例4、懸浮芯片定量檢測方法的建立1、鼠疫菌F1抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線用包被鼠疫菌Fl抗體的編碼;徵球加入不同濃度的Fl抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與劑量關(guān)系用對數(shù)-對數(shù)曲線繪制，見圖1。X軸代表抗原的濃度(ng/mL),Y軸代表懸浮芯片儀檢測的熒光值(MFI)。每個數(shù)據(jù)代表3次的檢測結(jié)果。不加檢測物時該編碼微球檢測時產(chǎn)生的焚光背景作為空白對照，該孔加入不含檢測樣品的樣品稀釋液。兩束不同波長激光對每個小球進(jìn)行檢測，一束激光檢測小球的色標(biāo)編碼從而區(qū)分小球種類并進(jìn)而確定檢測的是何種分子，另一束激光檢測與配體結(jié)合的目標(biāo)分子上的熒光標(biāo)記進(jìn)行定量，通過計算機(jī)分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，直接給出每一種目標(biāo)分子的量。其中幾個樣品濃度低于檢測的敏感度，高濃度樣品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)。臨界值(Cutoff值)的定義采用空白對照焚光檢測信號MFI均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，即Cutoff值為4FW+3xSD;最低檢出限(L0D值)則為Cutoff值對應(yīng)的檢測物濃度。每個標(biāo)準(zhǔn)曲線最高檢測限是使分析物的濃度達(dá)到飽和。2、確定懸浮芯片檢測鼠疫菌Fl抗原檢測靈敏度和動態(tài)范圍根據(jù)定義的最低檢出限，可判定懸浮芯片檢測Fl抗原的靈敏度為154pg/mL,其MFI均值-Cutoff值=14.63(空白=12.5，S=0.7)。隨著Fl抗原濃度的升高，其對應(yīng)的MFI值也在遞增，當(dāng)Fl抗原濃度超過4514ng/mL時，抗原抗體的免疫反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，MFI值開始進(jìn)入平臺期，說明樣品中的待檢物濃度過高，需要將樣品稀釋后再檢測。可得出懸浮芯片定量檢測Fl抗原的動態(tài)范圍為0.154-4514ng/raL。3、懸浮芯片定量檢測鼠疫菌F1抗原用建立的懸浮芯片方法在不同的濃度范圍內(nèi)檢測溶液中鼠疫菌Fl抗原的含量利用BIO-PLEX提供的軟件根據(jù)MFI值計算其對應(yīng)濃度值，每次做三個平行樣，用其MFI平均值計算檢測濃度值，結(jié)果見表2?？梢?，利用懸浮芯片技術(shù)能夠在較寬的動態(tài)范圍內(nèi)，對鼠疫菌Fl抗原進(jìn)行定量檢測。表2鼠疫菌F1抗原的定量檢出情況編號實際值檢測值MFI標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)(ng/mL)(ng/mL)(%)10.210.2320.00.350.5620.840.8068.80.010.0133.373.63315.56.362.06413.4812.58874.011.311.3553.9155.831901.060.813.216215.63260.362743.87.420.277862.50597.153000.359.041.9783450.004452.373263.8105.713.24注FlAg是提純的天然抗原，凍干粉末稱量后，測OD，定量。實施例5、懸浮芯片的特異性檢測懸浮芯片方法分別對鼠疫菌、假結(jié)核菌、小腸結(jié)腸炎菌、蠟樣芽孢桿菌、覃狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、陰溝腸桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、鮑氏志賀菌、綠膿桿菌、糞鏈球菌、粘質(zhì)沙雷菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、單增李斯特菌等進(jìn)行檢測，僅鼠疫菌為陽性，其余細(xì)菌和蛋白均為陰性(見圖2)。說明建立的鼠疫菌及其F1抗原懸浮芯片檢測方法與其它測試細(xì)菌均不發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異反應(yīng)。圖2中，X軸樣品編號，Y軸MFI。XI:空白；X2:104cfu/mLYPEV76;X3-22:分別為約107cfu/niL假結(jié)核菌，小腸結(jié)腸炎菌，鼠傷寒沙門菌，大腸桿菌，粘質(zhì)沙雷菌，陰溝腸桿菌，弗氏枸櫞酸桿菌，表皮葡20萄球菌，金黃色葡萄球菌，普通變形桿菌，綠膿桿菌，鮑氏志賀菌，肺炎克雷伯菌，糞鏈球菌，產(chǎn)氣腸桿菌，單增李斯特菌，臘樣芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，覃狀芽孢桿菌。實施例6、懸浮芯片與ELISA方法檢測鼠疫菌Fl抗原的比較針對樣品，同時采用本發(fā)明的懸浮芯片檢測方法與ELISA方法進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。表3懸浮芯片和ELISA檢測鼠疫菌結(jié)果的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>繪制ELISA方法檢測鼠疫菌FlAg的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。ELISA方法檢測鼠疫菌FUg的靈敏度為3.37ng/mL，線性檢測范圍3.37-215.63ng/mL。而懸浮芯片檢測鼠疫菌FlAg的靈敏度為0.154ng/mL,動態(tài)檢測范圍0.1544514ng/mL。圖3中橫坐標(biāo)為樣品濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值，均取對數(shù)值。以ELISA方法檢測的OD值為橫坐標(biāo)，懸浮芯片檢測的MFI值為縱坐標(biāo)作圖(見圖4)，實線為各散點(diǎn)的連接線，虛線為添加的趨勢線。對同一組數(shù)據(jù)檢測，兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)0.9279。說明在一定濃度范圍，懸浮芯片方法與ELISA方法檢測結(jié)果有一致性。圖4中橫坐標(biāo)為ELISA方法的吸光度檢測值，縱坐標(biāo)為本發(fā)明方法的熒光檢測值。實施例7、檢測30份鼠疫菌Fl抗原樣品的結(jié)果比較分別用微球懸浮芯片法和ELISA法檢測隨機(jī)配置的樣品溶液30份，檢測結(jié)果見表4。使用配對四格表資料的X卩檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，對于鼠疫菌，兩法的陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=7.11，P<0.01),BIO-PLEX法檢出率較高。表4本發(fā)明的方法和ELISA方法檢測鼠疫菌結(jié)果的比較ELISA合計+一本發(fā)明+13619的方法—01313合計131932本發(fā)明的懸浮芯片方法與經(jīng)典的免疫學(xué)檢測方法-一ELISA相比，結(jié)果有著很好的吻合性，但懸浮芯片方法比ELISA靈敏度高兩個數(shù)量級，動態(tài)檢測范圍更寬，跨度為四個數(shù)量級。懸浮芯片方法靈敏度高于免疫學(xué)方法的經(jīng)典標(biāo)準(zhǔn)-ELISA方法，也從對3G份樣品的檢測結(jié)果得到印證。2權(quán)利要求1、一種定量檢測鼠疫耶爾森菌的蛋白質(zhì)懸浮芯片，其特征在于，所述懸浮芯片由帶熒光素內(nèi)標(biāo)的聚苯乙烯編碼微球構(gòu)成，該微球用可以捕獲相應(yīng)目標(biāo)分子的抗體包被，生物素標(biāo)記所述的抗體，親和素化的熒光藻紅蛋白。2、如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片，其特征在于，所述的包被微球的抗體選自單抗5G12、單抗2H12和兔抗EV76、羊抗EV76和兔抗體中的一種或多種。3、如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片，其特征在于，懸浮芯片所需的抗體包被量為每孔20-40ng/2500-5000個微球/測試。4、如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片，其特征在于，所述生物素化的檢測抗體選自生物素化的鼠疫菌F1單抗2F6、5G12、2H12中的一種或多種。5、如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片，其特征在于，所述生物素化的檢測抗體及其用量可以選自6pg單抗5G12、24pg單抗2H12和16jag兔抗EV76、10pg羊抗EV76以及10jig、40jig的兔抗體中的一種或多種。6、如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片，其特征在于，選定微球標(biāo)記的兔抗F1為捕獲抗體，選自生物素標(biāo)記的單抗2F6作為檢測抗體，用于雙抗體夾心模式的懸浮芯片檢測鼠疫菌。7、如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片，其特征在于，所述編碼微球選自LUMINEX、BI0-RAD、QIAGEN、GENE出售的一種或多種《設(shè)J求產(chǎn)品。8、如權(quán)利要求1-7任一項所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片，其特征在于，所述編碼微球選自171506043B魁EXCOUPLINGBEADS#43171506044BIOPLEXCOUPLINGBEADS#44171506045BIOPLEXCOUPLINGBEADS#45171506046BIOPLEXCOUPLINGBEADS#46171506047BIOPLEXCOUPLINGBEADS#47171506048BIOPLEXCOUPLINGBEADS#48171506049BIOPLEXCOUPLINGBEADS#49171506050BIOPLEXCOUPLINGBEADS#50922400LiquiChipCarboxyBeads(500)922402LiquiChipCarboxyBeadSetA(4X500)922404LiquiChipCarboxyBeadSetB(4X500)922406LiquiChipCarboxyBeadSetC(4X500)922500LiquiChipNi-NTABeads(500)922501UquiChipNi-NTABeadSetA(4X500)922503LiquiChipNi-NTABeadSetB(4X500)922505LiquiChipNi-NTABeadSetC(4X500)922520UquiChipPenta-HisBeads(500)922521LiquiChipPenta-HisBeadSetA(4x500)922523LiquiChipPenta-HisBeadSetB(4x500)922525LiquiChipPenta-HisBeadSetC(4x500)922540LiquiChipActivatedBeads(500)922541LiquiChipActivatedBeadSetA(4x500)922543LiquiChipActivatedBeadSetB(4x500)9、如權(quán)利要求1-7任一項所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片，其特征在于，所述方法中的生物素為羧基活性的生物素。10、一種所述的蛋白質(zhì)懸浮芯片的制備方法，其特征在于，該方法包括下列步驟(l)活化編碼微球，(2)用捕獲抗體包被編碼微球并計數(shù)，(3)用生物素標(biāo)記檢測抗體，(4)清洗液洗滌。11、如權(quán)利要求IO所述的制備方法，其特征在于，所述的包被微球的抗體選自單抗5G12、單抗2H12和兔抗EV76、羊抗EV76和兔抗體中的一種或多種。12、如權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，懸浮芯片所需的抗體包被量為每孔20-40ng/2500-5000個微球/測試。13、如權(quán)利要求IO所述的制備方法，其中所述生物素化的檢測抗體選自生物素化的鼠疫菌F1單抗2F6、5G12、2H12中的一種或多種。14、如權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，所述生物素化的^r測抗體及其用量可以選自6|ig單抗5G12、24pg單抗2H12和16|ig兔抗EV76、10|ig羊抗EV76以及10pg、40pg的兔抗體中的一種或多種。15、如權(quán)利要求1G-14任一項所述的制備方法，其特征在于，所述編碼微球選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>16、如權(quán)利要求1G-14任一項所述的制備方法，其特征在于，所述方法中的生物素為羧基活性的生物素。全文摘要本發(fā)明的目的在于可定量檢測細(xì)菌的蛋白質(zhì)懸浮芯片及其制備方法，尤其是適合定量檢測和分析鼠疫耶爾森菌(Y.pestis)的蛋白質(zhì)懸浮芯片。本發(fā)明的方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、建立了新的檢測模式化平臺、檢測能力好、動態(tài)范圍寬。文檔編號G01N33/68GK101493469SQ200910078820公開日2009年7月29日申請日期2009年3月4日優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日發(fā)明者蕾周,孫肖紅,張曉龍,宇楊,靜王,胡孔新申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院