專利名稱：：鼠疫疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗鼠疫耶爾森氏菌感染的保護(hù)性新疫苗以及這些疫苗的接種方法。本發(fā)明特別提供非腸道吸收的活性疫苗和口服的活性疫苗，這些疫苗能提供抗腺鼠疫和肺鼠疫的保護(hù)作用。特別是通過(guò)這些疫苗在人和動(dòng)物中誘導(dǎo)粘膜免疫。鼠疫耶爾森氏菌是在多種動(dòng)物包括人中引起鼠疫的毒性很強(qiáng)的病原微生物。感染這種微生物有很高的死亡率。研究表明，其強(qiáng)毒性是由染色體和三種質(zhì)粒編碼的多種因素復(fù)雜組合決定的，這些因素包括Lcr基因、溶纖維蛋白酶和莢膜。人類是這種疾病自然周期的一種偶然宿主，腺鼠疫可發(fā)生在被感染蚤叮咬之后，其特征是局部淋巴結(jié)腫大。腺鼠疫的一個(gè)并發(fā)癥是繼發(fā)性肺炎，在這種情況下，疾病很容易通過(guò)空氣中的飛沫在人群中傳播。鼠疫是南北美洲、非洲、中國(guó)和亞洲的一種地方性流行病(見Butler，(1983)《鼠疫和其它耶爾森氏菌感染》；PlenumPress，紐約)。這種疾病的最近暴發(fā)據(jù)信是其第四次世界大流行的一部分，因此很明顯需要為在疫源區(qū)居住或旅行的人們以及操作這種細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室工作人員提供保護(hù)?，F(xiàn)在用于預(yù)防鼠疫的全菌疫苗具有很高的異源性，產(chǎn)生的副作用限制了其廣泛使用(如Meyer等，(1974)《傳染病雜志》(J.InfectDis)第129卷增刊，13-18頁(yè)和85-120頁(yè)；Marshall等，(1974)《傳染病雜志》(J.InfectDis)第129卷增刊，19-25頁(yè))。Cutter疫苗是正在使用的一種鼠疫疫苗，它含有用甲醛滅活的鼠疫桿菌，并通過(guò)肌肉注射進(jìn)行接種。但是非腸道免疫接種，雖然能有效地誘導(dǎo)全身免疫，卻不能有效地誘導(dǎo)粘膜免疫(McGhee等，(1992)《疫苗》(Vaccine)第10卷，75-88頁(yè))，并且有報(bào)導(dǎo)說(shuō)在疫苗接種者中發(fā)現(xiàn)了肺鼠疫病例(Meyer(1970)WHO簡(jiǎn)報(bào)42卷653-666頁(yè))。迄今為止，沒(méi)有任何能夠在粘膜表面產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗獲得報(bào)導(dǎo)。雖然活的EV76減毒疫苗在人體中激發(fā)免疫應(yīng)答的效果值得懷疑(Meyer等，(1974)《傳染病雜志》(J.Infect.Dis.)129卷增刊13-18頁(yè))，但這種疫苗自1939年起就在前蘇聯(lián)進(jìn)行了廣泛的檢測(cè)和使用。人們已發(fā)現(xiàn)EV76在多種動(dòng)物種群中毒性各不相同，而且非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物對(duì)這種菌株的慢性感染非常敏感。在西方，由于其非常嚴(yán)重的副作用和毒性回復(fù)的可能性，這種疫苗被認(rèn)為不適于大規(guī)模免疫接種。兩種已知的鼠疫耶爾森氏菌抗原為鼠疫耶爾森氏菌LcrV(V抗原)和F1抗原，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這兩種抗原都能在動(dòng)物中引起保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明的發(fā)明者在此之前已經(jīng)提供了分別能表達(dá)V抗原和F1抗原的口服活疫苗，它們都能在用103cfu的鼠疫耶爾森氏菌攻菌時(shí)提供良好的保護(hù)作用。這些疫苗是共同未決的專利申請(qǐng)PCT/GB94/02818和GB9404577.0的內(nèi)容。本發(fā)明的發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)只有危險(xiǎn)性難以接受的EV活疫苗顯示能在用109cfu或更多的鼠疫耶爾森氏菌GB菌株攻擊時(shí)提供良好的保護(hù)作用，單獨(dú)的V抗原和F1抗原僅能在用105cfu的鼠疫耶爾森氏菌攻菌時(shí)提供完全的保護(hù)作用，用含有V抗原和F1抗原的組合疫苗接種至少能達(dá)到EV76提供的保護(hù)水平，并且不具備任何妨礙EV疫苗廣泛使用的那些危險(xiǎn)性。更有利的是，他們發(fā)現(xiàn)用于接種的載劑僅是這兩種蛋白組分的簡(jiǎn)單混合物，而不是更復(fù)雜的完整的減毒有機(jī)體。為了提供長(zhǎng)期保護(hù)作用和產(chǎn)生粘膜免疫，他們提供在活的減毒疫苗中含有這兩種抗原組分的優(yōu)選疫苗形式，例如表達(dá)F1和V抗原的AroA和C傷寒沙門氏菌(參考上文提到的共同未決的專利申請(qǐng))；更優(yōu)選的疫苗形式為分別表達(dá)這兩種抗原或表達(dá)包含這兩種抗原的融合蛋白的單個(gè)或雙重突變減毒疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步提供一類微生物，這類微生物攜帶含有F1和V兩種抗原的構(gòu)建物或上文所述共同未決的申請(qǐng)中的質(zhì)粒，包括能轉(zhuǎn)化人或動(dòng)物腸道定居微生物的構(gòu)建物，因此這些微生物能夠表達(dá)分別與F1和V抗原序列相同的蛋白質(zhì)；當(dāng)這類微生物通過(guò)口服或非腸道途徑接種時(shí)，就會(huì)在人或動(dòng)物體中產(chǎn)生抵抗鼠疫耶爾森氏菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答。優(yōu)選的方案是使微生物保持在人或動(dòng)物腸道中定居的能力。特別優(yōu)選的重組DNA、質(zhì)?；蛉嘶騽?dòng)物的腸道定居微生物能夠編碼或表達(dá)鼠疫耶爾森氏菌的完整成熟V蛋白或其保護(hù)性表位，及能夠編碼或表達(dá)鼠疫耶爾森氏菌的完整成熟F1蛋白或其保護(hù)性表位。編碼完整或部分F1抗原的DNA和編碼完整或部分V抗原的DNA可直接用作基因疫苗。特別優(yōu)選的編碼V抗原的重組DNA包含SEQIDNo.1或SEQIDNo.3列出的DNA序列，更優(yōu)選與一個(gè)啟動(dòng)子如lacz或nirβ位于同一閱讀框，并優(yōu)選存在于一個(gè)能在沙門氏菌中復(fù)制與表達(dá)的載體上。特別優(yōu)選的編碼F1抗原的重組DNA包含SEQIDNo.10中列出的DNA序列。SEQIDNo.2和SEQIDNo.4顯示了兩種優(yōu)選V抗原蛋白的氨基酸序列；SEQIDNo.2為V抗原自身的序列，而SEQIDNo.4為在N末端帶有四個(gè)載體決定氨基酸的V抗原序列。SEQ1DNo.11是由SEQIDNo.10編碼的F1蛋白序列。在本發(fā)明的微生物體中使用的優(yōu)選DNA構(gòu)建物允許微生物體進(jìn)行繁殖，用這樣的微生物口服接種能夠誘導(dǎo)腸相關(guān)淋巴組織(GLAT)的局部刺激，并通過(guò)淋巴細(xì)胞在共同粘膜免疫系統(tǒng)中遷移而對(duì)支氣管相關(guān)淋巴組織(BALT)產(chǎn)生繼發(fā)性刺激。通過(guò)這種方式在呼吸道粘膜表面產(chǎn)生分泌型IgA應(yīng)答。用含這種DNA的載體轉(zhuǎn)化或直接用這種DNA插入整合所提供的微生物優(yōu)選為減毒的微生物，更優(yōu)選的是減毒的沙門氏菌。減毒微生物如鼠傷寒沙門氏菌已證明是多種異源抗原的優(yōu)良載體(Curtiss，(1990)；Cardenas和Clements，(1992))。減毒可通過(guò)多種途徑進(jìn)行，例如可以采用aroA和/或aroC突變途徑(見Hosieth等(1981)《自然》(Nature)291卷，238-239頁(yè)；Dougan等(1986)《寄生蟲免疫》(ParasiteImmunol)第9卷，151-160頁(yè)；Chatfield等(1989)《(疫苗》(Vaccine)第7卷，495-498頁(yè))；多重突變?nèi)鏗one等在(1991)《疫苗》(Vaccine)第9卷810-816頁(yè)介紹的aroA和aroC突變體也可以使用。任何合適的符合安全要求的缺陷微生物都可以使用。對(duì)上述微生物以及其它微生物來(lái)說(shuō)，還有多種類似的缺失或突變減毒方法，使它們適合于用本發(fā)明的構(gòu)建物進(jìn)行轉(zhuǎn)化并在動(dòng)物的腸道內(nèi)表達(dá)疫苗蛋白和/或定居，從而用來(lái)治療鼠疫耶爾森氏菌。對(duì)人來(lái)說(shuō)，含有本發(fā)明的構(gòu)建物的疫苗載體放在減毒傷寒沙門氏菌內(nèi)，轉(zhuǎn)化后的微生物用作口服活疫苗中的活性成分。當(dāng)DNA以直接插入微生物DNA的方式轉(zhuǎn)化減毒微生物時(shí)，可能直接整合進(jìn)一個(gè)基因。而當(dāng)換成表達(dá)V蛋白或F1蛋白或其表位片段的質(zhì)粒形式時(shí)，就可能只有V或F1或其片段獲得表達(dá)，或者上述抗原或其片段與一個(gè)前位蛋白或肽段組成融合蛋白進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)選包含另一個(gè)抗原性F1/V組分。這種前位蛋白或肽段可以促使成熟蛋白或肽穿過(guò)細(xì)胞膜外運(yùn)或者是另一個(gè)鼠疫耶爾森氏菌抗原。lcr基因是Price等人從鼠疫耶爾森氏菌KIM菌株中克隆得到的，其核苷酸序列發(fā)表在《細(xì)菌學(xué)雜志》(JBacteriol)(1989)171卷5646-5653頁(yè)。在下面的實(shí)施例中這一序列的信息被用來(lái)設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，用于從鼠疫耶爾森氏菌(菌株GB)中用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增該基因。所設(shè)計(jì)的PCR引物分別與lcrV基因的5’端和3’端兩翼的相應(yīng)序列互補(bǔ)，并且在引物的5’尾端含有一個(gè)限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，使擴(kuò)增的lcrV基因可以直接克隆到一個(gè)質(zhì)粒載體上(5’端PCR引物含有一個(gè)EcoRI位點(diǎn)，而3’端PCR引物含有一個(gè)SacI位點(diǎn))。這兩種限制酶切位點(diǎn)僅用作舉例而不能視為排除其它的限制內(nèi)切酶。在下面的實(shí)施例中，本發(fā)明的構(gòu)建物含有一個(gè)lac啟動(dòng)子，但其它的啟動(dòng)子如巨噬細(xì)胞啟動(dòng)子(nirβ)也可以使用。F1的制備已由Oyston等人(1995)在《感染與免疫》(Infect.Immun.)63卷第2期563頁(yè)中作了詳細(xì)介紹—見564頁(yè)結(jié)果的下面caf1的克隆和表達(dá)。疫苗中抗原組分的劑量可依動(dòng)物個(gè)體的免疫特征而不同。但在對(duì)下面實(shí)施例的小鼠動(dòng)物模型進(jìn)行免疫接種時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)V和F1的每次劑量為10ug時(shí)，按標(biāo)準(zhǔn)的初次免疫和加強(qiáng)免疫程序能夠有效地提供完全的保護(hù)作用?？乖膳c一種傳統(tǒng)的可以藥用的載劑混合，這里沒(méi)有特別的限制。通常將抗原混合到一種水包油乳劑中。疫苗組合物可含有佐劑，福氏不完全佐劑IFA在處理小鼠模型時(shí)特別有效。當(dāng)疫苗以微生物體為基礎(chǔ)時(shí)，所用的載劑可為一種適于非腸道接種特別是腹膜內(nèi)接種的載劑，而不一定是口服載劑。還可用微滴或被囊形式的載劑例如脂質(zhì)體或微囊體進(jìn)行接種，它們可以有效地將組合物運(yùn)送至個(gè)體的呼吸道，從而引發(fā)粘膜免疫應(yīng)答。載劑還可含有延遲釋放系統(tǒng)如氫氧化鋁凝膠。另一種包被方法包含使用聚合結(jié)構(gòu)，特別是線性嵌段共聚物。也可以使用生物降解性聚合物，如含有或不含有羥基乙酸的聚乳酸或嵌段共聚物；它們可包含下列重復(fù)單位(POP-POE)n，其中POP是聚氧丙烯，POE是聚氧乙烯。含有(POP-POE)n的嵌段共聚物特別有用。本發(fā)明的方法、構(gòu)建物、微生物和疫苗將用下面的序列表、圖和實(shí)施例舉例說(shuō)明。由此更進(jìn)一步的實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。圖1是用條圖來(lái)說(shuō)明多組動(dòng)物在用鼠疫耶爾森氏菌攻菌時(shí)的存活率。圖2是用曲線來(lái)說(shuō)明在Balb/c小鼠中肌肉接種BSA后的IgG初次應(yīng)答。序列表SEQIDNo1顯示一個(gè)編碼V抗原并帶有克隆載體pMAL-p2或pMAL-c2六個(gè)堿基的DNA的核苷酸序列及其衍生的氨基酸序列，該DNA在上述載體中克隆時(shí)，5’用序列為GAATTC的EcoRI位點(diǎn)(來(lái)自5’端PCR引物)；3’用序列為GTCGAC的SalI位點(diǎn)(來(lái)自3’端PCR引物)。該DNA1006位的堿基用PCR誘變的方法改變成T，從而產(chǎn)生了第二個(gè)框內(nèi)終止密碼子。氨基酸序列的起始部分是Xa因子切割位點(diǎn)的C末端。SEQIDNo2顯示本發(fā)明的插入DNA片段表達(dá)的多肽的氨基酸序列，并在N末端帶有載體(IE+FS)編碼的四個(gè)額外氨基酸。SEQIDNo3顯示本發(fā)明的第二個(gè)編碼V抗原的DNA核苷酸序列及其衍生的氨基酸序列，該DNA帶有克隆載體pGEX-5X-2的10個(gè)堿基。該DNA在載體中克隆時(shí)，5’用序列為GAATTC的EcoRI位點(diǎn)(GA來(lái)自5’端PCR引物)；3’用序列為GTCGAC的SalI位點(diǎn)(GTCGAC來(lái)自3’端PCR引物)。第1006位的堿基用PCR誘變的方法產(chǎn)生了第二個(gè)框內(nèi)終止密碼子；第16位的堿基由A換成C，產(chǎn)生了一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。氨基酸序列的起始部分是Xa因子切割位點(diǎn)的C末端。SEQIDNo4顯示SEQIDNo3DNA表達(dá)的多肽的氨基酸序列，并在N末端帶有載體(G、I、P和G)編碼的4個(gè)氨基酸。SEQIDNo5顯示用來(lái)產(chǎn)生SEQIDNo1中V抗原編碼DNA的5’端寡核苷酸引物序列。SEQIDNo6顯示用來(lái)產(chǎn)生各實(shí)施例中所用的V抗原編碼DNA的3’端寡核苷酸引物序列。SEQIDNo7顯示與編碼成熟caf1的前21個(gè)堿基相對(duì)應(yīng)并在5’端帶有一個(gè)SacI位點(diǎn)的PCR寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNo8顯示與編碼caf1終止密碼子下游“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的序列相對(duì)應(yīng)并在5’端帶有SacI和AccI位點(diǎn)的PCR寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNo9顯示與第一個(gè)寡核苷酸的末端至下游107個(gè)堿基的caf1基因內(nèi)部終止區(qū)域相對(duì)應(yīng)的PCR寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNo10顯示pFGAL2a構(gòu)建物的核苷酸序列，這個(gè)序列顯示了載體上β-半乳糖苷酶的前幾個(gè)堿基與去掉信號(hào)肽序列的caf1相融合，并在5’端含有一個(gè)SacI限制酶切位點(diǎn)；這個(gè)序列一直顯示到caf1的AACC3’端并附帶了一些載體堿基。SEQIDNo11顯示pFGAI2a編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。這一序列可前導(dǎo)有Met、Thr、Met、Ile、Thr、Asn。SEQIDNo12是用于擴(kuò)增F1操縱子的引物FIOU2的序列。SEQIDNo13是用于擴(kuò)增F1操縱子的引物M4D的序列。SEQIDNo14是用于擴(kuò)增F1操縱子的引物M3U的序列。SEQIDNo15是用于擴(kuò)增F1操縱子的引物FIOD2的序列。SEQIDNo16是一個(gè)編碼F1-V融合蛋白的DNA片段的核苷酸序列及由其推導(dǎo)的氨基酸序列。在該DNA片段的5’端有一個(gè)SacI克隆位點(diǎn)，在其3’端有一個(gè)HindIII克隆位點(diǎn)?？寺〉牟迦肫魏幸欢?52-472序列，其堿基來(lái)源于PCR引物(鼠疫耶爾森氏菌DNA中不含這段序列)。SEQIDNo17是SEQIDNo16的氨基酸序列。SEQIDNo18是引物5’FAB2的序列，該引物用于擴(kuò)增含有信號(hào)序列的F1操縱子。SEQIDNo19是引物3’FBAM的序列，該引物用于擴(kuò)增含有信號(hào)序列的F1操縱子。SEQIDNo20是用SEQIDNo18和SEQIDNo19中引物擴(kuò)增得到的含有信號(hào)序列的F1抗原的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDNo21是SEQIDNo20的氨基酸序列。SEQIDNo22是包括一個(gè)六氨基酸連接區(qū)域的F1/V融合蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列。其中1522位的T是由G修飾而成，從而產(chǎn)生了第二個(gè)框內(nèi)終止密碼子。SEQIDNo23是SEQIDNo22的氨基酸序列。SEQIDNo22中所說(shuō)的連接區(qū)域位于171-176位氨基酸(SEQIDNo22的523-540位堿基)。SEQIDNo24顯示用于產(chǎn)生SEQIDNo3中V抗原編碼DNA的一個(gè)5’端寡核苷酸引物序列。實(shí)施例克隆SEQIDNo3材料與方法用于制備培養(yǎng)基的材料獲自O(shè)xoid公司和Difco實(shí)驗(yàn)室。DNA操作所用的酶獲自BoehringerMannheimUK公司，并按產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行操作。其它的化學(xué)藥品和生物化學(xué)藥品除非另行說(shuō)明都獲自Sigma化學(xué)公司。特異性的兔多克隆抗V血清和鼠抗GST血清分別由RBrubaker博士(密執(zhí)安州立大學(xué)微生物系)和EDWilliamson博士(化學(xué)和生物防御局)提供。菌株及培養(yǎng)鼠疫耶爾森氏菌GB在液體培養(yǎng)基中28℃通氣培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基(PH6.8)每升含有15g蛋白胨、2.5g肝臟水解物、5g酵母抽提物和5gNaCl，并補(bǔ)加80ml0.25％用0.1MNaOH溶解的氯化血紅素(血肉汁)。大腸桿菌JM109按Sambrook等在《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中介紹的方法培養(yǎng)與保存。重組V蛋白和F1蛋白的制備DNA操作，從鼠疫耶爾森氏菌中分離染色體DNA按Marmur的方法進(jìn)行。重組V抗原的制備編碼V抗原的基因(lcrV)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從鼠疫耶爾森氏菌DNA中擴(kuò)增，所用的引物濃度為125pmol并與該基因5’端和3’端序列同源(見Price等(1989)《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol)171卷5646-5653頁(yè))。5’引物(V/5’EGATCGAATTCGAGCCTACGAACAA)和3’引物GGATCGTCGACTTACATAATTACCTCGTGTCA)的序列分別還含有編碼EcoRI和SalI限制酶切位點(diǎn)的5’區(qū)域。另外，對(duì)發(fā)表的lcrV序列(Price等，1989)的兩個(gè)核苷酸進(jìn)行了改變，使EcoRI酶切位點(diǎn)完整并使擴(kuò)增的基因編碼一個(gè)額外的終止密碼子(TAA)。PCR引物用DNA合成儀(392AppliedBiosystems)制備。經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(95℃、20秒；45℃、20秒；72℃、30秒Perkin9600GeneAmpPCRSymtem)獲得了一個(gè)DNA片段。將片段純化，用EcoRI和SalI消化，并與適當(dāng)消化的pGEX-5X-2質(zhì)粒連接，然后電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中(見Sambrook等1989)。用30聚體引物(5’核苷酸位于54和794位，見Price等1989)通過(guò)PCR鑒定到了一個(gè)帶有重組質(zhì)粒(pVG100)的克隆，還擴(kuò)增到lcrV的一個(gè)內(nèi)部片段。rV在大腸桿菌中的表達(dá)。大腸桿菌JM109/pVG100在含有100μgml-1的氨芐青霉素的LB中37℃培養(yǎng)至光吸收值(600nm)為0.3。然后在培養(yǎng)物中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。細(xì)菌的全細(xì)胞裂解物按Sambrook等介紹的方法制備，GST/V融合蛋白的表達(dá)用10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(Mini-ProteanII，BioRad)電泳后考馬斯亮藍(lán)R250染色和Western印跡法(見Sambrook等)進(jìn)行檢測(cè)。Western印跡使用的探針為1/4000稀釋的兔抗V血清或1/1000稀釋的鼠抗GST血清，蛋白條帶用膠體金標(biāo)記的二抗進(jìn)行顯色(AuroprobeBlplus，Cambio)。體外GST/V表達(dá)的定量。含有pVG100或pGEX-5X-2的大腸桿菌JM109如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的培養(yǎng)物中各取若干份樣品，每份均為1ml，接種在含有氨芐青霉素的L-瓊脂中，測(cè)定活細(xì)胞數(shù)量。另取1ml培養(yǎng)物離心收集細(xì)胞，并用1ml的磷酸鹽緩沖液(PBS)重新懸浮。將重新懸浮的細(xì)胞在-20℃冷凍1小時(shí)，融化后在冰浴中超聲破碎，超聲破碎時(shí)溫度應(yīng)低于10℃，共進(jìn)行3×30秒(XL2015型超聲儀，3.2mmMicrotipprobe；HeatSystemInc.)。在微量滴定板中用PBS對(duì)超聲物和一個(gè)rV標(biāo)準(zhǔn)溶液(5μgml-1)作梯度稀釋并4℃包被過(guò)夜。每次超聲產(chǎn)物中GST/V融合蛋白的量以兔抗V血清作一抗用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA進(jìn)行測(cè)定?？贵w溫育在含1％脫脂奶粉的PBS中。大腸桿菌rV的純化。JM109/pVG100按上面所述的方法用5×100ml體積的LB進(jìn)行培養(yǎng)。離心收集細(xì)胞，并用3ml磷酸鹽緩沖液(PBS)重新懸浮。加入80ul溶菌酶(10mgml-1)，22℃溫育10分鐘。在細(xì)胞懸浮物中加入TritonX-100至終濃度為1％，并將其冷凍(-20℃)，融化后在冰上用70％的功率超聲破碎3×30秒(XL2015型超聲儀)。細(xì)胞裂解物離心，用PBS將上清調(diào)整至30ml，并與5ml的谷胱甘肽Sepaharose4B(PharmaciaBiotech)混合，谷胱甘肽Sepaharose4B在使用前用PBS+0.1％TritonX-100洗滌三次?；旌衔镌?℃攪拌18小時(shí)，離心并用100mlPBS洗滌兩次。然后調(diào)成50％的懸液裝入層析柱(Poly-Prep；Bio-rad)。GST/V融合蛋白用10ml含5mM還原性谷胱甘肽(PharmaciaBiotech)的50mMTrispH8.0洗脫。用PBS透析后，融合蛋白用Xa因子(BoehringerMannheimUK公司)按產(chǎn)品說(shuō)明在22℃切割18小時(shí)。按上面介紹的方法用親和層析方法將切割下來(lái)的GST和未切割的多余GST/V從溶液中去除，剩下的即為純化的重組V(rV)。用rV免疫接種。本試驗(yàn)使用特殊無(wú)菌條件下飼養(yǎng)的6周齡雌性Balb/c小鼠(Charles.RiverLaboratories，Margate，Kent，UK)。16只一組的小鼠用腹膜內(nèi)注射法(i.p.)進(jìn)行初次免疫，免疫劑量為0.2ml，其中含有10.13ug的rV抗原并與福氏不完全佐劑(IFA)一起溶于1∶1油包水乳劑中。在第14天和第34天，按上述劑量對(duì)每只小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在第64天，取6只小鼠處死，取出其組織按下面的方法做免疫學(xué)分析。剩下的小鼠用鼠疫耶爾森氏菌進(jìn)行攻菌。含16只同齡小鼠的非處理對(duì)照組按相同的方法分組進(jìn)行組織取樣和攻菌。在后面測(cè)定對(duì)高劑量鼠疫耶爾森氏菌攻菌的保護(hù)程度的試驗(yàn)中，使用含5或6只小鼠的rV免疫組和對(duì)照組。血清抗體滴度的測(cè)定。用心臟穿刺采血法從用0.1ml含6mgDomitor(NordenLaboratories)和27ugKetalar(Parke-Davies)的混合物腹膜麻醉的小鼠中采集血樣。集中血樣并分離血清。血清抗體滴度用一種改進(jìn)的ELISA法(Willamson和Tiball，(1993)《疫苗》(Vaccine)11卷1253-1258頁(yè))進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將rV(5μgml-1的PBS溶液)包被在微量滴定板中，待測(cè)血清在板上做梯度倍比稀釋。結(jié)合的抗體用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠多價(jià)抗體結(jié)合物進(jìn)行檢測(cè)。特異性抗體的滴度用減去非特異性對(duì)照血清的光吸收值后吸收值仍大于0.1單位的血清的最大稀釋度來(lái)估算。從脾臟中分離純化的T細(xì)胞?；旌掀⒓?xì)胞的粗制懸液用脾臟在細(xì)線篩上輕輕碾磨進(jìn)行制備。用2ml的組織培養(yǎng)液(含20mM的L-谷氨酰胺，105U1-1青霉素和100mgl-1鏈霉素的DMEM)從脾被膜組織和結(jié)締組織中洗出細(xì)胞。在Ficoll-Hypaque(淋巴細(xì)胞分離液，ICNFLOW)中密度梯度離心分離脾細(xì)胞懸液中的混合淋巴細(xì)胞群體。用吖啶橙(0.0003％w/v)和溴化乙啶(0.001％w/v)染色測(cè)定制備物中活細(xì)胞的百分比?；旌狭馨图?xì)胞與羊抗鼠IgG包被的Dynabeads(M450，DynalUK)按1∶3的比例混合，在4℃保溫30分鐘。與Dynabead連接的B細(xì)胞用磁力分離的方法去除，剩下的T細(xì)胞按接種到微量滴定板上所需的細(xì)胞濃度用補(bǔ)加有抗生素和10％v/v胎牛血清(FCS)的DMEM懸浮。抗rV脾細(xì)胞粗制備物和純化T細(xì)胞的體外增殖。在微量滴定板的小孔中用DMEM對(duì)rV和伴刀豆球蛋白A(陽(yáng)性對(duì)照)做倍比稀釋(范圍為0-50μgml-1)，每孔中剩余0.1ml。陰性對(duì)照僅含0.1ml的DMEM。將等體積的脾細(xì)胞粗制備物或純化T細(xì)胞懸液按最小濃度為5×104個(gè)細(xì)胞接種到每個(gè)小孔中，37℃(5％CO2)溫育72小時(shí)。在每孔中加入30ul含1uCiH3胸腺嘧啶(甲基[3H]胸腺嘧啶S.A.74GBqmmol-1；Amersham)并補(bǔ)加有10％FCS的DMEM，繼續(xù)溫育24小時(shí)。小孔中的內(nèi)容物用細(xì)胞收集器(Titertek)收集到玻璃纖維濾膜上，將對(duì)應(yīng)于每個(gè)小孔的園盤從濾膜墊上打孔取出，加到1.5ml閃爍液(Cyoscint，ICNBiomedicalsInc.)中測(cè)定細(xì)胞中H3胸腺嘧啶的摻入。細(xì)胞刺激指數(shù)可用四次重復(fù)試驗(yàn)的平均cpm(刺激后)/平均cpm(陰性對(duì)照)進(jìn)行計(jì)算。重組F1抗原的制備?？寺af1DNA用Marmur等(1961)在《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)第3卷208-218頁(yè)介紹的方法從鼠疫耶爾森氏菌中分離。用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從中擴(kuò)增到一段編碼cafl的開放閱讀框但缺少信號(hào)序列的DNA片段。PCR中所用的寡核苷酸用Beckman200ADNA合成儀制備。pFGAL2a的構(gòu)建。寡核苷酸GATCGAGCTCGGCAGATTTAACTGCAAGCACC(SEQIDNo7)根據(jù)cafl中緊接信號(hào)肽編碼序列的前21個(gè)堿基進(jìn)行合成，并在5’端含有一個(gè)編碼SacI位點(diǎn)的額外區(qū)域，互補(bǔ)寡核苷酸CAGGTCGAGCTCGTCGACGGTTAGGCTCAAAGTAG(SEQIDNo8)對(duì)應(yīng)于編碼caf1終止密碼子下游推測(cè)“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的序列，并在5’端加上了一個(gè)編碼SacI和AccI位點(diǎn)的區(qū)域。經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(95℃、15秒；50℃、15秒；72℃、30秒，使用PerkinElmer9600GeneAmpPCRSystem)獲得了一個(gè)DNA片段。將片段純化，用SacI和AccI消化，與同樣消化的pUC18質(zhì)粒連接，然后電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中。電穿孔用BioradGenePulser進(jìn)行，使用0.2cm的樣品杯，反應(yīng)條件為1.25kV、25μF、800Ohms，持續(xù)時(shí)間為20。用PCR的方法鑒定了一個(gè)含有caf1克隆基因的pFGAL2a菌落，PCR所用的寡核苷酸探針為TGGTACGCTTACTCTTGGCGGCTAT(SEQIDNo9)，這一序列與caf1基因上從已鑒定的信號(hào)序列切割位點(diǎn)(見Galyov等(1990))開始第128-153位核苷酸的內(nèi)部序列和SEQIDNO2一致。攜帶pFGL2a并表達(dá)F1的大腸桿菌在含有1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB肉湯中37℃振蕩培養(yǎng)18小時(shí)。細(xì)菌的全細(xì)胞裂解物、周質(zhì)和胞漿按Sambrook等(1989)介紹的方法制備。SDS-PAGE和Western印跡SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和Western印跡按Hunter等(1993)在《感染與免疫》(Infec.Immun.)61卷3958-3965頁(yè)中介紹的方法進(jìn)行。印跡所用的探針是用滅活的鼠疫耶爾森氏菌(37℃培養(yǎng)的EV76菌株)在綿羊(B283)中制備的多克隆抗血清，結(jié)合的抗體用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗綿羊IgG(Sigma)進(jìn)行檢測(cè)。組合V/F1疫苗的實(shí)施例1和實(shí)施例2比較實(shí)施例用鼠疫耶爾森氏菌(GB)菌株攻菌時(shí)疫苗對(duì)小鼠死亡率的影響動(dòng)物Barrierbred6周齡雌性無(wú)菌Balb/c小鼠獲自Charles-RiverLaboratories，Margate，Kent，UK，在下面各實(shí)施例中全部使用這種小鼠。免疫接種5或6只小鼠分為一組按下述方法進(jìn)行免疫接種。比較疫苗EV76共50只小鼠在免疫程序的第0天接受單一的初次皮下接種(s.c.)，接種劑量為總體積100ul的EV76活疫苗。比較疫苗CutterUSP疫苗另取50只小鼠接受劑量為100ulCutter疫苗的初次免疫接種，接種方式為肌肉接種(i.m.)，這一劑量相當(dāng)于人接種劑量的0.2，并含大約2×108甲醛滅活的鼠疫桿菌。在初次接種后的第16天對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行相同劑量的加強(qiáng)免疫。F1和V疫苗對(duì)一組62只小鼠腹膜(i.p)接種初次免疫劑量的重組V抗原或F1抗原，上述抗原溶解在1∶1油包水乳劑中并含有福氏不完全佐劑(IFA；Sigma)。兩種抗原的初次免疫劑量均為10ug，接種乳劑的總體積為0.1ml。免疫動(dòng)物在初次接種后的第14天(V和F1實(shí)驗(yàn)組)和第28天(所有F1實(shí)驗(yàn)組和含12只動(dòng)物的V亞組)用相同的抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫。另取一組12只小鼠分別在第0、14和28天進(jìn)行初次免疫和加強(qiáng)免疫，免疫劑量為10ugF1抗原和10ugV抗原，兩種抗原組合在含有IFA的1∶1油包水乳劑的水相中(終體積為每只小鼠0.1ml)。在免疫過(guò)程的第50天，從每個(gè)處理組中隨機(jī)取6只小鼠做脾細(xì)胞應(yīng)答分析。剩下的動(dòng)物用鼠疫耶爾森氏菌進(jìn)行攻菌。沒(méi)有進(jìn)行處理的同齡小鼠對(duì)照組也進(jìn)行相同的劃分。多倍LD攻菌來(lái)確定保護(hù)的極限將免疫小鼠和未處理的對(duì)照小鼠分為5或6只一組，用鼠疫耶爾森氏菌GB菌株經(jīng)皮下途徑進(jìn)行攻菌，攻菌劑量的范圍為20至2×109活菌數(shù)。密切觀察小鼠在攻菌后14天內(nèi)的癥狀發(fā)展，并仔細(xì)記錄死亡的確切時(shí)間。對(duì)攻菌后的死亡小鼠進(jìn)行尸檢，取血涂片、肝和脾進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分析。對(duì)照和試驗(yàn)動(dòng)物的攻菌結(jié)果列于下表1；兩組結(jié)果分別對(duì)應(yīng)于兩輪實(shí)驗(yàn)和各自的對(duì)照。從下面的結(jié)果可明顯看出，V抗原比Cutter疫苗有效得多，雖然不如EV76有效，但當(dāng)它與效果稍差一些的F1抗原組合應(yīng)用時(shí)，其效果與EV76相當(dāng)并且沒(méi)有副作用。表1*＝實(shí)施例1**＝實(shí)施例2實(shí)施例3用于口服疫苗的減毒沙門氏菌的制備在鼠傷寒沙門氏菌和傷寒沙門氏菌中表達(dá)重組V抗原。擴(kuò)增后的lcrV基因克隆到三種不同的質(zhì)粒載體中pMAL-p2一個(gè)設(shè)計(jì)用于使克隆基因與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)形成融合產(chǎn)物的載體。MBP的C末端與V抗原的N末端融合。表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白分泌到周質(zhì)中。含V抗原DNA序列的載體被命名為pVMP100。pMAL-c2一個(gè)與pMAL-p2類似的載體，差別在于MBP-V抗原融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。這一重組質(zhì)粒被命名為pMVC100。pGEX-5X-2一個(gè)設(shè)計(jì)用于以谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白形式表達(dá)克隆基因的載體。GST的C末端與V抗原的N末端融合，融合蛋白表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中。這一重組質(zhì)粒被命名為pVG100。上述三種質(zhì)粒均含有Ptac啟動(dòng)子和lacIQ基因，后者在大腸桿菌中編碼能關(guān)閉Ptac轉(zhuǎn)錄起始的lac抑制物，IPTG可解除這種抑制作用。這三種質(zhì)粒均含有來(lái)自pBR322的復(fù)制起點(diǎn)，因而能在細(xì)菌中低拷貝復(fù)制。上述三種質(zhì)粒都用電穿孔的方法轉(zhuǎn)到鼠傷寒沙門氏菌SL3261菌株中，該菌株為一株減毒菌株，廣泛用作表達(dá)外源抗原的活疫苗載體。SL3261的aroA基因有特異性缺失，使其生長(zhǎng)依賴于特定的芳香族化合物(見Hosieth等)。為制備適用于人體的疫苗，用電穿孔的方法將載體轉(zhuǎn)入減毒的傷寒沙門氏菌中。用特異性抗V抗原多克隆抗血清作探針對(duì)鼠傷寒沙門氏菌培養(yǎng)物做western印跡，結(jié)果顯示，所有重組質(zhì)粒均表達(dá)V抗原。該抗血清由密執(zhí)安州立大學(xué)微生物系(Eastlansing，MI48824-1101，USA)的RBrubaker提供。重組鼠傷寒沙門氏菌按5×107cfu/劑經(jīng)靜脈接種到小鼠中，結(jié)果顯示該菌能高水平定居于肝臟和脾臟；每個(gè)器官可回收8×106到5×108cfu的細(xì)菌?；厥占?xì)菌大多數(shù)仍具有氨芐青霉素抗性，這表明細(xì)菌保留有重組質(zhì)粒。在鼠傷寒沙門氏菌中表達(dá)F1抗原質(zhì)粒pFGAL2a用Sambrook等人(Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(MolecularCloning；aLaboratoryManual)第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約)介紹的通用技術(shù)分離。純化好的質(zhì)粒用電穿孔的方法轉(zhuǎn)入鼠傷寒沙門氏菌LB5010(限制-，修飾+)中，然后從LB5010中分離甲基化的pFGAL2a，并電穿孔到鼠傷寒沙門氏菌SL3261(aroA-)中。制備周質(zhì)部分和胞質(zhì)部分，用前面介紹的方法進(jìn)行SDS-PAGE和Western印跡。構(gòu)建物的穩(wěn)定性5只Balb/c雌性小鼠用靜脈接種的方法接種5×105或5×107cfu保存于200ul磷酸鹽緩沖液并攜帶pFGAL2a的鼠傷寒沙門氏菌。對(duì)照小鼠按相似的方法接種攜帶不含插入片段的pUC18的鼠傷寒沙門氏菌。7天后用斷頸椎法將小鼠處死，取出肝臟和脾。將取出的器官在10ml的磷酸鹽緩沖液中用stomacher設(shè)置到最大勻漿2分鐘，勻漿物用磷酸鹽緩沖液做梯度稀釋并涂布到L瓊脂平板或含55μgml-1氨芐青霉素的L瓊脂平板上。F1操縱子的構(gòu)建用PCR方法一次性擴(kuò)增完整的F1操縱子沒(méi)有獲得成功。因此設(shè)計(jì)了一個(gè)構(gòu)建策略，用PCR方法從鼠疫耶爾森氏菌MP6菌株的模板DNA中擴(kuò)增了兩個(gè)不連續(xù)的大小分別為336kb和1.89kb的片段，所用的引物對(duì)分別為(A)SEQIDNo12和SEQIDNo13序列和(B)SEQIDNo14和SEQIDNo15序列。模板DNA使用未經(jīng)CsCl2純化的按Marmur方法制備的DNA抽提物。PCR所用的條件為96℃30秒、57℃30秒和72℃1分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。兩個(gè)片段用Nhel消化后連接。融合后的片段編碼全長(zhǎng)的操縱子(5.25kb)，將此融合片段用EcoRI和SalI消化后克隆到多種載體上。當(dāng)這一片段克隆到pBR322上并在大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌LB5010或SL3261中表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒不穩(wěn)定。為解決這個(gè)難題，將操縱子克隆到了一個(gè)低拷貝kmR質(zhì)粒pLG339上。另外還將全長(zhǎng)的F1操縱子用載體pBRD1084插入到鼠傷寒沙門氏菌染色體的AroC基因上。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人SECRETARYOFSTATEFORDEFENCE(ii)發(fā)明名稱疫苗(iii)序列數(shù)24(iv)通訊地址(A)聯(lián)系人SECRETARYOFSTATEFORDEFENCE(B)街道WHITEHALL(C)城市倫敦(D)州倫敦(E)國(guó)家UNITEDKINDOM(GB)(F)郵政編碼SW1A2HB(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，#1.30版(vi)現(xiàn)申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(2)SEQIDNO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1014堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..987(xi)序列表述SEQIDNO1ATTTCAGAATTCATTAGAGCCTACGAACAAAACCCACAACATTTTATT48IleSerGluPheIleArgAlaTyrGluGlnAsnProGlnHisPheIle151015GAGGATCTAGAAAAAGTTAGGGTGGAACAACTTACTGGTCATGGTTCT96GluAspLeuGluLysValArgValGluGlnLeuThrGlyHisGlySer202530TCAGTTTTAGAAGAATTGGTTCAGTTAGTCAAAGATAAAAATATAGAT144SerValLeuGluGluLeuValGlnLeuValLysAspLysAsnIleAsp354045ATTTCCATTAAATATGATCCCAGAAAAGATTCGGAGGTTTTTGCCAAT192IleSerIleLysTyrAspProArgLysAspSerGluValPheAlaAsn505560AGAGTAATTACTGATGATATCGAATTGCTCAAGAAAATCCTAGCTTAT240ArgValIleThrAspAspIleGluLeuLeuLysLysIleLeuAlaTyr65707580TTTCTACCCGAGGATGCCATTCTTAAAGGCGGTCATTATGACAACCAA288PheLeuProGluAspAlaIleLeuLysGlyGlyHisTyrAspAsnGln859095CTGCAAAATGGCATCAAGCGAGTAAAAGAGTTCCTTGAATCATCGCCG336LeuGlnAsnGlyIleLysArgValLysGluPheLeuGluSerSerPro100105110AATACACAATGGGAATTGCGGGCGTTCATGGCAGTAATGCATTTCTCT384AsnThrGlnTrpGluLeuArgAlaPheMetAlaValMetHisPheSer115120125TTAACCGCCGATCGTATCGATGATGATATTTTGAAAGTGATTGTTGAT432LeuThrAlaAspArgIleAspAspAspIleLeuLysValIleValAsp130135140TCAATGAATCATCATGGTGATGCCCGTAGCAAGTTGCGTGAAGAATTA480SerMetAsnHisHisGlyAspAlaArgSerLysLeuArgGluGluLeu145150155160GCTGAGCTTACCGCCGAATTAAAGATTTATTCAGTTATTCAAGCCGAA528AlaGluLeuThrAlaGluLeuLysIleTyrSerValIleGlnAlaGlu165170175ATTAATAAGCATCTGTCTAGTAGTGGCACCATAAATATCCATGATAAA576IleAsnLysHisLeuSerSerSerGlyThrIleAsnIleHisAspLys180185190TCCATTAATCTCATGGATAAAAATTTATATGGTTATACAGATGAAGAG624SerIleAsnLeuMetAspLysAsnLeuTyrGlyTyrThrAspGluGlu195200205ATTTTTAAAGCCAGCGCAGAGTACAAAATTCTCGAGAAAATGCCTCAA672IlePheLysAlaSerAlaGluTyrLysIleLeuGluLysMetProGln210215220ACCACCATTCAGGTGGATGGGAGCGAGAAAAAAATAGTCTCGATAAAG720ThrThrIleGlnValAspGlySerGluLysLysIleValSerIleLys225230235240GACTTTCTTGGAAGTGAGAATAAAAGAACCGGGGCGTTGGGTAATCTG768AspPheLeuGlySerGluAsnLysArgThrGlyAlaLeuGlyAsnLeu245250255AAAAACTCATACTCTTATAATAAAGATAATAATGAATTATCTCACTTT816LysAsnSerTyrSerTyrAsnLysAspAsnAsnGluLeuSerHisPhe260265270GCCACCACCTGCICGGATAAGTCCAGGCCGCTCAACGACTTGGTTAGC864AlaThrThrCysSerAspLysSerArgProLeuAsnAspLeuValSer275280285CAAAAAACAACTCAGCTGTCTGATATTACATCACGTTTTAATTCAGCT912GlnLysThrThrGlnLeuSerAspIleThrSerArgPheAsnSerAla290295300ATTGAAGCACTGAACCGTTTCATTCAGAAATATGATTCAGTGATGCAA960IleGluAlaLeuAsnArgPheIleGlnLysTyrAspSerValMetGln305310315320CGTCTGCTAGATGACACGTCTGGTAAATGACACGAGGTAATTATGTA1007ArgLeuLeuAspAspThrSerGlyLys325AGTCGAC1014(2)SEQIDNO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度329個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列表述SEQIDNO2IleSerGluPheIleArgAlaTyrGluGlnAsnProGlnHisPheIle151015GluAspLeuGluLysValArgValGluGlnLeuThrGlyHisGlySer202530SerValLeuGluGluLeuValGlnLeuValLysAspLysAsnIleAsp354045IleSerIleLysTyrAspProArgLysAspSerGluValPheAlaAsn505560ArgValIleThrAspAspIleGluLeuLeuLysLysIleLeuAlaTyr65707580PheLeuProGluAspAlaIleLeuLysGlyGlyHisTyrAspAsnGln859095LeuGlnAsnGlyIleLysArgValLysGluPheLeuGluSerSerPro100105110AsnThrGlnTrpGluLeuArgAlaPheMetAlaValMetHisPheSer115120125LeuThrAlaAspArgIleAspAspAspIleLeuLysValIleValAsp130135140SerMetAsnHisHisGlyAspAlaArgSerLysLeuArgGluGluLeu145150155160AlaGluLeuThrAlaGluLeuLysIleTyrSerValIleGlnAlaGlu165170175IleAsnLysHisLeuSerSerSerGlyThrIleAsnIleHisAspLys180185190SerIleAsnLeuMetAspLysAsnLeuTyrGlyTyrThrAspGluGlu195200205IlePheLysAlaSerAlaGluTyrLysIleLeuGluLysMetProGln210215220ThrThrIleGlnValAspGlySerGluLysLysIleValSerIleLys225230235240AspPheLeuGlySerGluAsnLysArgThrGlyAlaLeuGlyAsnLeu245250255LysAsnSerTyrSerTyrAsnLysAspAsnAsnGluLeuSerHisPhe260265270AlaThrThrCysSerAspLysSerArgProLeuAsnAspLeuValSer275280285GlnLysThrThrGlnLeuSerAspIleThrSerArgPheAsnSerAla290295300IleGluAlaLeuAsnArgPheIleGlnLysTyrAspSerValMetGln305310315320ArgLeuLeuAspAspThrSerGlyLys325(2)SEQIDNO3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1014堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..987(xi)序列表述SEQIDNO3GGGATCCCCGGAATTCGAGCCTACGAACAAAACCCACAACATTTTATT48GlyIleProGlyIleArgAlaTyrGluGlnAsnProGlnHisPheIle151015GAGGATCTAGAAAAAGTTAGGGTGGAACAACTTACTGGTCATGGTTCT96GluAspLeuGluLysValArgValGluGlnLeuThrGlyHisGlySer202530TCAGTTTTAGAAGAATTGGTTCAGTTAGTCAAAGATAAAAATATAGAT144SerValLeuGluGluLeuValGlnLeuValLysAspLysAsnIleAsp354045ATTTCCATTAAATATGATCCCAGAAAAGATTCGGAGGTTTTTGCCAAT192IleSerIleLysTyrAspProArgLysAspSerGluValPheAlaAsn505560AGAGTAATTACTGATGATATCGAATTGCTCAAGAAAATCCTAGCTTAT240ArgValIleThrAspAspIleGluLeuLeuLysLysIleLeuAlaTyr65707580TTTCTACCCGAGGATGCCATTCTTAAAGGCGGTCATTATGACAACCAA288PheLeuProGluAspAlaIleLeuLysGlyGlyHisTyrAspAsnGln859095CTGCAAAATGGCATCAAGCGAGTAAAAGAGTTCCTTGAATCATCGCCG336LeuGlnAsnGlyIleLysArgValLysGluPheLeuGluSerSerPro100105110AATACACAATGGGAATTGCGGGCGTTCATGGCAGTAATGCATTTCTCT384AsnThrGlnTrpGluLeuArgAlaPheMetAlaValMetHisPheSer115120125TTAACCGCCGATCGTATCGATGATGATATTTTGAAAGTGATTGTTGAT432LeuThrAlaAspArgIleAspAspAspIleLeuLysValIleValAsp130135140TCAATGAATCATCATGGTGATGCCCGTAGCAAGTTGCGTGAAGAATTA480SerMetAsnHisHisGlyAspAlaArgSerLysLeuArgGluGluLeu145150155160GCTGAGCTTACCGCCGAATTAAAGATTTATTCAGTTATTCAAGCCGAA528AlaGluLeuThrAlaGluLeuLysIleTyrSerValIleGlnAlaGlu165170175ATTAATAAGCATCTGTCTAGTAGTGGCACCATAAATATCCATGATAAA576IleAsnLysHisLeuSerSerSerGlyThrIleAsnIleHisAspLys180185190TCCATTAATCTCATGGATAAAAATTTATATGGTTATACAGATGAAGAG624SerIleAsnLeuMetAspLysAsnLeuTyrGlyTyrThrAspGluGlu195200205ATTTTTAAAGCCAGCGCAGAGTACAAAATTCTCGAGAAAATGCCTCAA672IlePheLysAlaSerAlaGluTyrLysIleLeuGluLysMetProGln210215220ACCACCATTCAGGTGGATGGGAGCGAGAAAAAAATAGTCTCGATAAAG720ThrThrIleGlnValAspGlySerGluLysLysIleValSerIleLys225230235240GACTTTCTTGGAAGTGAGAATAAAAGAACCGGGGCGTTGGGTAATCTG768AspPheLeuGlySerGluAsnLysArgThrGlyAlaLeuGlyAsnLeu245250255AAAAACTCATACTCTTATAATAAAGATAATAATGAATTATCTCACTTT816LysAsnSerTyrSerTyrAsnLysAspAsnAsnGluLeuSerHisPhe260265270GCCACCACCTGCTCGGATAAGTCCAGGCCGCTCAACGACTTGGTTAGC864AlaThrThrCysSerAspLysSerArgProLeuAsnAspLeuValSer275280285CAAAAAACAACTCAGCTGTCTGATATTACATCACGTTTTAATTCAGCT912GlnLysThrThrGlnLeuSerAspIleThrSerArgPheAsnSerAla290295300ATTGAAGCACTGAACCGTTTCATTCAGAAATATGATTCAGTGATGCAA960IleGluAlaLeuAsnArgPheIleGlnLysTyrAspSerValMetGln305310315320CGTCTGCTAGATGACACGTCTGGTAAATGACACGAGGTAATTATGTA1007ArgLeuLeuAspAspThrSerGlyLys325AGTCGAC1014(2)SEQIDNO4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度329個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列表述SEQIDNO4GlyIleProGlyIleArgAlaTyrGluGlnAsnProGlnHisPheIle151015GluAspLeuGluLysValArgValGluGlnLeuThrGlyHisGlySer202530SerValLeuGluGluLeuValGlnLeuValLysAspLysAsnIleAsp354045IleSerIleLysTyrAspProArgLysAspSerGluValPheAlaAsn505560ArgValIleThrAspAspIleGluLeuLeuLysLysIleLeuAlaTyr65707580PheLeuProGluAspAlaIleLeuLysGlyGlyHisTyrAspAsnGln859095LeuGlnAsnGlyIleLysArgValLysGluPheLeuGluSerSerPro100105110AsnThrGlnTrpGluLeuArgAlaPheMetAlaValMetHisPheSer115120125LeuThrAlaAspArgIleAspAspAsPIleLeuLysValIleValAsp130135140SerMetAsnHisHisGlyAspAlaArgSerLysLeuArgGluGluLeu145150155160AlaGluLeuThrAlaGluLeuLysIleTyrServalIleGlnAlaGlu165170175IleAsnLysHisLeuSerSerSerGlyThrIleAsnIleHisAspLys180185190SerIleAsnLeuMetAspLysAsnLeuTyrGlyTyrThrAspGluGlu195200205IlePheLysAlaSerAlaGluTyrLysIleLeuGluLysMetProGln210215220ThrThrIleGlnValAspGlySerGluLysLysIleValSerIleLys225230235240AspPheLeuGlySerGluAsnLysArgThrGlyAlaLeuGlyAsnLeu245250255LysAsnSerTyrSerTyrAsnLysAspAsnAsnGluLeuSerHisPhe260265270AlaThrThrCysSerAspLysSerArgProLeuAsnAspLeuValSer275280285GlnLysThrThrGlnLeuSerAspIleThrSerArgPheAsnSerAla290295300IleGluAlaLeuAsnArgPheIleGlnLysTyrAspSerValMetGln305310315320ArgLeuLeuAspAspThrSerGlyLys325(2)SEQIDNO5信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(xi)序列表述SEQIDNO5GATCGAATTCATTAGAGCCTACGAACAA(2)SEQIDNO6信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(xi)序列表述SEQIDNO6GGATCGTCGACTTACATAATTACCTCGTGTCA(2)SEQIDNO7信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(xi)序列表述SEQIDNO7GATCGAGCTCGGCAGATTTAACTGCAAGCACC(2)SEQIDNO8信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(xi)序列表述SEQIDNO8CAGGTCGAGCTCGTCGACGGTTAGGCTCAAAGTAG(2)SEQIDNO9信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(xi)序列表述SEQIDNO9TGGTACGCTTACTCTTGGCGGCTAT(2)SEQIDNO10信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度541堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置2..454(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵miscrecomb(B)位置1..6(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵miscrecomb(B)位置1..6(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵miscrecomb(B)位置536..541(xi)序列表述SEQIDNO10GAGCTCGGCAGATTTAACTGCAAGCACCACTGCAACGGCAACTCTT46SerSerAlaAspLeuThrAlaSerThrThrAlaThrAlaThrLeu151015GTTGAACCAGCCCGCATCACTATTACATATAAGGAAGGCGCTCCAATT94ValGluProAlaArgIleThrIleThrTyrLysGluGlyAlaProIle202530ACAATTATGGACAATGGAAACATCGATACAGAATTACTTGTTGGTACG142ThrIleMetAspAsnGlyAsnIleAspThrGluLeuLeuValGlyThr354045CTTACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACCACTAGCACATCTGTTAAC190LeuThrLeuGlyGlyTyrLysThrGlyThrThrSerThrSerValAsn505560TTTACAGATGCCGCGGGTGATCCCATGTACTTAACATTTACTTCTCAG238PheThrAspAlaAlaGlyAspProMetTyrLeuThrPheThrSerGln657075GATGGAAATAACCACCAATTCACTACAAAAGTGATTGGCAAGGATTCT286AspGlyAsnAsnHisGlnPheThrThrLysValIleGlyLysAspSer80859095AGAGATTTTGATATCTCTCCTAAGGTAAACGGTGAGAACCTTGTGGGG334ArgAspPheAspIleSerProLysValAsnGlyGluAsnLeuValGly100105110GATGACGTCGTCTTGGCTACGGGCAGCCAGGATTTCTTTGTTCGCTCA382AspAspValValLeuAlaThrGlySerGlnAspPhePheValArgSer115120125ATTGGTTCCAAAGGCGGTAAACTTGCAGCAGGTAAATACACTGATGCT430IleGlySerLysGlyGlyLysLeuAlaAlaGlyLysTyrThrAspAla130135140GTAACCGTAACCGTATCTAACCAATAATCCATATAGATAATAGATAAAGGAGGG484ValThrValThrValSerAsnGln145150CTATTATGCCCTCCTTTAATATTTATGAATTATCCTACTTTGAGCCTAACCGTCGAC541(2)SEQIDNO11信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度151個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列表述SEQIDNO11SerSerAlaAspLeuThrAlaSerThrThrAlaThrAlaThrLeuVal151015GluProAlaArgIleThrIleThrTyrLysGluGlyAlaProIleThr202530IleMetAspAsnGlyAsnIleAspThrGluLeuLeuValGlyThrLeu354045ThrLeuGlyGlyTyrLysThrGlyThrThrSerThrSerValAsnPhe505560ThrAspAlaAlaGlyAspProMetTyrLeuThrPheThrSerGlnAsp65707580GlyAsnAsnHisGlnPheThrThrLysValIleGlyLysAspSerArg859095AspPheAspIleSerProLysValAsnGlyGluAsnLeuValGlyAsp100105110AspValValLeuAlaThrGlySerGlnAspPhePheValArgSerIle115120125GlySerLysGlyGlyLysLeuAlaAlaGlyLysTyrThrAspAlaVal130135140ThrValThrValSerAsnGln145150(2)SEQIDNO12信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(xi)序列表述SEQIDNO12TCGCCCGGGAATTCCGAACATAAATCGGTTCAGTGGCC(2)SEQIDNO13信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(xi)序列表述SEQIDNO13GGCGTATTCCTCGCTAGCAATGTTTAACG(2)SEQIDNO14信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(xi)序列表述SEQIDNO14ATCGTTAAACATTGCTAGCGAGGAATACGCC(2)SEQIDNO15信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(xi)序列表述SEQIDNO15GATAGATCTGTCGACTGAACCTATTATATTGCTTCGCGC(2)SEQIDNO16信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1462堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置8..1447(xi)序列表述SEQIDNO16GAGCTCGGCAGATTTAACTGCAAGCACCACTGCAACGGCAACTCTTGTT49AlaAspLeuThrAlaSerThrThrAlaThrAlaThrLeuVal1510GAACCAGCCCGCATCACTCTTACATATAAGGAAGGCGCTCCAATTACA97GluProAlaArgIleThrLeuThrTyrLysGluGlyAlaProIleThr15202530ATTATGGACAATGGAAACATCGATACAGAATTACTTGTTGGTACGCTT145IleMetAspAsnGlyAsnIleAspThrGluLeuLeuValGlyThrLeu354045ACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACCACTAGCACATCTGTTAACTTT193ThrLeuGlyGlyTyrLysThrGlyThrThrSerThrSerValAsrPhe505560ACAGATGCCGCGGGTGATCCCATGTACTTAACATTTACTTCTCAGGAT241ThrAspAlaAlaGlyAspProMetTyrLeuThrPheThrSerGlnAsp657075GGAAATAACCACCAATTCACTACAAAAGTGATTGGCAAGGATTCTAGA289GlyAsnAsnHisGlnPheThrThrLysValIleGlyLysAspSerArg808590GATTTTGATATCTCTCCTAAGGTAAACGGTGAGAACCTTGTGGGGGAT337AspPheAspIleSerProLysValAsnGlyGluAsnLeuValGlyAsp95100105110GACGTCGTCTTGGCTACGGGCAGCCAGGATTTCTTTGTTCGCTCAATT385AspValValLeuAlaThrGlySerGlnAspPhePheValArgSerIle115120125GGTTCCAAAGGCGGTAAACTTGCAGCAGGTAAATACACTGATGCTGTA433GlySerLysGlyGlyLysLeuAlaAlaGlyLysTyrThrAspAlaVal130135140ACCGTAACCGTATCTAACCAAGGATCCATCGAAGGTCGTATTAGAGCC481ThrValThrValSerAsnGlnGlySerIleGluGlyArgIleArgAla145150155TACGAACAAAACCCACAACATTTTATTGAGGATCTAGAAAAAGTTAGG529TyrGluGlnAsnProGlnHisPheIleGluAspLeuGluLysValArg160165170GTGGAACAACTTACTGGTCATGGTTCTTCAGTTTTAGAAGAATTGGTT577ValGluGlnLeuThrGlyHisGlySerSerValLeuGluGluLeuVal175180185190CAGTTAGTCAAAGATAAAAATATAGATATTTCCATTAAATATGATCCC625GlnLeuValLysAspLysAsnIleAspIleSerIleLysTyrAspPro195200205AGAAAAGATTCGGAGGTTTTTGCCAATAGAGTAATTACTGATGATATC673ArgLysAs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rArgAspPheAspIleSer105110115120CCTAAGGTAAACGGTGAGAACCTTGTGGGGGATGACGTCGTCTTGGCT436ProLysValAsnGlyGluAsnLeuValGlyAspAspValValLeuAla125130135ACGGGCAGCCAGGATTTCTTTGTTCGCTCAATTGGTTCCAAAGGCGGT484ThrGlySerGlnAspPhePheValArgSerIleGlySerLysGlyGly140145150AAACTTGCAGCAGGTAAATACACTGATGCTGTAACCGTAACCGTATCT532LysLeuAlaAlaGlyLysTyrThrAspAlaValThrValThrValSer155160165AACCAAGGATCCATC547AsnGln170(2)SEQIDNO21信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列表述SEQIDNO21MetLysLysIleSerSerValIleAlaIleAlaLeuPheGlyThrIle151015AlaThrAlaAsnAlaAlaAspLeuThrAlaSerThrThrAlaThrAla202530ThrLeuValGluProAlaArgIleThrLeuThrTyrLysGluGlyAla354045ProIleThrIleMetAspAsnGlyAsnIleAspThrGluLeuLeuVal505560GlyThrLeuThrLeuGlyGlyTyrLysThrGlyThrThrSerThrSer65707580ValAsnPheThrAspAlaAlaGlyAspProMetTyrLeuThrPheThr859095SerGlnAspGlyAsnAsnHisGlnPheThrThrLysValIleGlyLys100105110AspSerArgAspPheAspIleSerProLysValAsnGlyGluAsnLeu115120125ValGlyAspAspValValLeuAlaThrGlySerGlnAspPhePheVal130135140ArgSerIleGlySerLysGlyGlyLysLeuAlaAlaGlyLysTyrThr145150155160AspAlaValThrValThrValSerAsnGln165170(2)SEQIDNO22信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1530堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置13..1515(xi)序列表述SEQIDNO22TAGAGGTAATATATGAAAAAAATCAGTTCCGTTATCGCCATTGCATTA48MetLysLysIleSerSerValIleAlaIleAlaLeu1510TTTGGAACTATTGCAACTGCTAATGCGGCAGATTTAACTGCAAGCACC96PheGlyThrIleAlaThrAlaAsnAlaAlaAspLeuThrAlaSerThr152025ACTGCAACGGCAACTCTTGTTGAACCAGCCCGCATCACTCTTACATAT144ThrAlaThrAlaThrLeuValGluProAlaArgIleThrLeuThrTyr303540AAGGAAGGCGCTCCAATTACAATTATGGACAATGGAAACATCGATACA192LysGluGlyAlaProIleThrIleMetAspAsnGlyAsnIleAspThr45505560GAATTACTTGTTGGTACGCTTACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACC240GluLeuLeuValGlyThrLeuThrLeuGlyGlyTyrLysThrGlyThr657075ACTAGCACATCTGTTAACTTTACAGATGCCGCGGGTGATCCCATGTAC288ThrSerThrSerValAsnPheThrAspAlaAlaGlyAspProMetTyr808590TTAACATTTACTTCTCAGGATGGAAATAACCACCAATTCACTACAAAA336LeuThrPheThrSerGlnAspGlyAsnAsnHisGlnPheThrThrLys95100105GTGATTGGCAAGGATTCTAGAGATTTTGATATCTCTCCTAAGGTAAAC384ValIleGlyLysAspSerArgAspPheAspIleSerProLysValAsn110115120GGTGAGAACCTTGTGGGGGATGACGTCGTCTTGGCTACGGGCAGCCAG432GlyGluAsnLeuValGlyAspAspValValLeuAlaThrGlySerGln125130135140GATTTCTTTGTTCGCTCAATTGGTTCCAAAGGCGGTAAACTTGCAGCA480AspPhePheValArgSerIleGlySerLysGlyGlyLysLeuAlaAla145150155GGTAAATACACTGATGCTGTAACCGTAACCGTATCTAACCAAGGATCC528GlyLysTyrThrAspAlaValThrValThrValSerAsnGlnGlySer160165170ATCGAAGGTCGTATTAGAGCCTACGAACAAAACCCACAACATTTTATT576IleGluGlyArgIleArgAlaTyrGluGlnAsnProGlnHisPheIle175180185GAGGATCTAGAAAAAGTTAGGGTGGAACAACTTACTGGTCATGGTTCT624GluAspLeuGluLysValArgValGluGlnLeuThrGlyHisGlySer190195200TCAGTTTTAGAAGAATTGGTTCAGTTAGTCAAAGATAAAAATATAGAT672SerValLeuGluGluLeuValGlnLeuValLysAspLysAsnIleAsp205210215220ATTTCCATTAAATATGATCCCAGAAAAGATTCGGAGGTTTTTGCCAAT720IleSerIleLysTyrAspProArgLysAspSerGluValPheAlaAsn225230235AGAGTAATTACTGATGATATCGAATTGCTCAAGAAAATCCTAGCTTAT768ArgValIleThrAspAspIleGluLeuLeuLysLysIleLeuAlaTyr240245250TTTCTACCCGAGGATGCCATTCTTAAAGGCGGTCATTATGACAACCAA815PheLeuProGluAspAlaIleLeuLysGlyGlyHisTyrAspAsnGln255260265CTGCAAAATGGCATCAAGCGAGTAAAAGAGTTCCTTGAATCATCGCCG864LeuGlnAsnGlyIleLysArgValLysGluPheLeuGluSerSerPro270275280AATACACAATGGGAATTGCGGGCGTTCATGGCAGTAATGCATTTCTCT912AsnThrGlnTrpGluLeuArgAlaPheMetAlaValMetHisPheSer285290295300TTAACCGCCGATCGTATCGATGATGATATTTTGAAAGTGATTGTTGAT960LeuThrAlaAspArgIleAspAspAspIleLeuLysValIleValAsp305310315TCAATGAATCATCATGGTGATGCCCGTAGCAAGTTGCGTGAAGAATTA1008SerMetAsnHisHisGlyAspAlaArgSerLysLeuArgGluGluLeu320325330GCTGAGCTTACCGCCGAATTAAAGATTTATTCAGTTATTCAAGCCGAA1056AlaGluLeuThrAlaGluLeuLysIleTyrSerValIleGlnAlaGlu335340345ATTAATAAGCATCTGTCTAGTAGTGGCACCATAAATATCCATGATAAA1104IleAsnLysHisLeuSerSerSerGlyThrIleAsnIleHisAspLys350355360TCCATTAATCTCATGGATAAAAATTTATATGGTTATACAGATGAAGAG1152SerIleAsnLeuMetAspLysAsnLeuTyrGlyTyrThrAspGluGlu365370375380ATTTTTAAAGCCAGCGCAGAGTACAAAATTCTCGAGAAAATGCCTCAA1200IlePheLysAlaSerAlaGluTyrLysIleLeuGluLysMetProGln385390395ACCACCATTCAGGTGGATGGGAGCGAGAAAAAAATAGTCTCGATAAAG1248ThrThrIleGlnValAspGlySerGluLysLysIleValSerIleLys400405410GACTTTCTTGGAAGTGAGAATAAAAGAACCGGGGCGTTGGGTAATCTG1296AspPheLeuGlySerGluAsnLysArgThrGlyAlaLeuGlyAsnLeu415420425AAAAACTCATACTCTTATAATAAAGATAATAATGAATTATCTCACTTT1344LysAsnSerTyrSerTyrAsnLysAspAsnAsnGluLeuSerHisPhe430435440GCCACCACCTGCTCGGATAAGTCCAGGCCGCTCAACGACTTGGTTAGC1392AlaThrThrCysSerAspLysSerArgProLeuAsnAspLeuValSer445450455460CAAAAAACTCAGCATCTGTCTGATATTACATCACGTTTTAATTCAGCT1440GlnLysThrThrGlnLeuSerAspIleThrSerArgPheAsnSerAla465470475ATTGAAGCACTGAACCGTTTCATTCAGAAATATGATTCAGTGATGCAA1488IleGluAlaLeuAsnArgPheIleGlnLysTyrAspSerValMetGln480485490CGTCTGCTAGATGACACGTCTGGTAAATGACACTAGAAGCTT1530ArgLeuLeuAspAspThrSerGlyLys495500(2)SEQIDNO23信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度501個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列表述SEQIDNO23MetLysLysIleSerSerValIleAlaIleAlaLeuPheGlyThrIle151015AlaThrAlaAsnAlaAlaAspLeuThrAlaSerThrThrAlaThrAla202530ThrLeuValGluProAlaArgIleThrLeuThrTyrLysGluGlyAla354045ProIleThrIleMetAspAsnGlyAsnIleAspThrGluLeuLeuVal505560GlyThrLeuThrLeuGlyGlyTyrLysThrGlyThrThrSerThrSer65707580ValAsnPheThrAspAlaAlaGlyAspProMetTyrLeuThrPheThr859095SerGlnAspGlyAsnAsnHisGlnPheThrThrLysValIleGlyLys100105110AspSerArgAspPheAspIleSerProLysValAsnGlyGluAsnLeu115120125ValGlyAspAspValValLeuAlaThrGlySerGlnAspPhePheVal130135140ArgSerIleGlySerLysGlyGlyLysLeuAlaAlaGlyLysTyrThr145150155160AspAlaValThrValThrValSerAsnGlnGlySerIleGluGlyArg165170175IleArgAlaTyrGluGlnAsnProGlnHisPheIleGluAspLeuGlu180185190LysValArgValGluGlnLeuThrGlyHisGlySerSerValLeuGlu195200205GluLeuValGlnLeuValLysAspLysAsnIleAspIleSerIleLys210215220TyrAspProArgLysAspSerGluValPheAlaAsnArgValIleThr225230235240AspAspIleGluLeuLeuLysLysIleLeuAlaTyrPheLeuProGlu245250255AspAlaIleLeuLysGlyGlyHisTyrAspAsnGlnLeuGlnAsnGly260265270IleLysArgValLysGluPheLeuGluSerSerProAsnThrGlnTrp275280285GluLeuArgAlaPheMetAlaValMetHisPheSerLeuThrAlaAsp290295300ArgIleAspAspAspIleLeuLysValIleValAspSerMetAsnHis305310315320HisGlyAspAlaArgSerLysLeuArgGluGluLeuAlaGluLeuThr325330335AlaGluLeuLysIleTyrSerValIleGlnAlaGluIleAsnLysHis340345350LeuSerSerSerGlyThrIleAsnIleHisAspLysSerIleAsnLeu355360365MetAspLysAsnLeuTyrGlyTyrThrAspGluGluIlePheLysAla370375380SerAlaGluTyrLysIleLeuGluLysMetProGlnThrThrIleGln385390395400ValAspGlySerGluLysLysIleValSerIleLysAspPheLeuGly405410415SerGluAsnLysArgThrGlyAlaLeuGlyAsnLeuLysAsnSerTyr420425430SerTyrAsnLysAspAsnAsnGluLeuSerHisPheAlaThrThrCys435440445SerAspLysSerArgProLeuAsnAspLeuValSerGlnLysThrThr450455460GlnLeuSerAspIleThrSerArgPheAsnSerAlaIleGluAlaLeu465470475480AsnArgPheIleGlnLysTyrAspSerValMetGlnArgLeuLeuAsp485490495AspThrSerGlyLys500(2)SEQIDNO24信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)生物鼠疫耶爾森氏菌(xi)序列表述SEQIDNO24GATCGAATTCGAGCCTACGAACAA正如本申請(qǐng)前面所討論的，F(xiàn)1抗原和V抗原可以用微囊體包被。V抗原和F1抗原可以單獨(dú)用微囊體包被，然后將組合的微囊體亞單位用于免疫接種。本發(fā)明的發(fā)明者認(rèn)為，組合的微囊體亞單位所提供的保護(hù)作用要優(yōu)于現(xiàn)有的鼠疫疫苗，而且微囊體亞單位在組合后還可增強(qiáng)其效果。組合微囊體亞單位的保護(hù)效果還能進(jìn)一步用與佐劑如霍亂毒素B亞單位(CTB)同時(shí)接種來(lái)加強(qiáng)。亞單位疫苗在微囊體包被后能延長(zhǎng)疫苗在體內(nèi)的釋放，并能口服、經(jīng)鼻腔或吸入給藥而發(fā)揮作用。組合V抗原和F1抗原亞單位疫苗的微囊體包被將在下面介紹。同時(shí)還將證明這種配方能同時(shí)誘導(dǎo)抵抗鼠疫的粘膜免疫和全身免疫。亞單位的微囊體包被用溶劑蒸發(fā)技術(shù)在PLA2000中進(jìn)行。按下面的方法用微囊體包被的亞單位進(jìn)行免疫接種。對(duì)一組21只小鼠用25ug的V抗原或F1抗原進(jìn)行初次免疫，抗原結(jié)合在微球體上并懸浮于PBS，接種方式為腹膜內(nèi)(i.p.)注射。另外一組21只小鼠接受含F(xiàn)1抗原和V抗原各25ug的組合物，兩種抗原均結(jié)合在微球體上。每個(gè)25ug劑量的F1抗原結(jié)合在5.42mg微球體中，而25ug的V抗原則結(jié)合2.08mg微球體。所需數(shù)量的微球體懸浮在PBS中，每只小鼠注射100ul。所有的動(dòng)物在第14天和第28天用合適的相應(yīng)抗原加強(qiáng)免疫。另取兩個(gè)21只小鼠的動(dòng)物組進(jìn)行初次免疫，并在第14天和第28天加強(qiáng)免疫，免疫途徑均為腹膜內(nèi)注射。免疫所用的抗原為10ug的F1和10ug的V，兩種抗原溶解在含25％(v/v)氫氧化鋁凝膠(氫氧化鋁凝膠1.3％，Superfos.丹麥)的PBS懸液的水相中。所選動(dòng)物組在每次免疫時(shí)，還另外接種10ug溶于載劑的CTB(Sigma，Poole)。含21只小鼠的各對(duì)照組只接受單一的氫氧化鋁凝膠(100ul的25％溶液)或CTB(100ul含10ugCTB的PBS)，或者不進(jìn)行處理。為比較用游離的或微囊體包被的組合亞單位疫苗免疫接種與用Greer疫苗(購(gòu)自Greer實(shí)驗(yàn)室)免疫接種的保護(hù)效果，用鼠疫耶爾森氏菌毒株對(duì)動(dòng)物經(jīng)皮下進(jìn)行攻菌。用Greer疫苗接種的動(dòng)物，在用2×105cfu鼠疫耶爾森氏菌攻菌時(shí)有60％的存活率(圖1)。而在用組合的F1+V微囊體免疫接種的動(dòng)物(第1組)中，用同樣的菌數(shù)攻菌有80％的存活率，在第2組動(dòng)物(μV+μF1+10ugCTB)中則有100％的存活率。因此組合的微囊體配方能夠抵抗毒性鼠疫耶爾森氏菌并且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)副作用。處理組概括如下組處理125ug微囊體包被的F1(μF1)+25ug微囊體包被的V(μV)i.p.225ugμF1+25ugμV+10ugCTBi.p.325ugμF1i.p.425uVi.p.525ugF1+25ugV混合于氫氧化鋁凝膠中i.p.6Greer0.1mli.m也可用嵌段共聚物進(jìn)行微囊體包被。在下面的實(shí)驗(yàn)中，使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白抗原BSA。微球體的制備和分析如下。攜帶有蛋白的微球體用稍作修改的水/油溶劑蒸發(fā)技術(shù)程序(詳見R.L.Hunter和B.Bennet，《免疫學(xué)雜志》133卷第六期，3167-3175頁(yè)，(1984))進(jìn)行制備。聚合物(聚-D-乳酸；Resomer206，BochringerIngelheim，德國(guó)；125或250mg)溶解在丙酮(22.5ml)中，并含有標(biāo)準(zhǔn)蛋白(抗原)BSA(理論攜帶量為15-25％)和獲自Zeneca的0.11％w/v的PluronicL101(或0.09％w/v的L121)。探針超聲10秒，然后加入水相(22.5ml)，100rpm混合5分鐘，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直到有機(jī)溶劑全部去除。剩下的膠體物質(zhì)洗滌后冷凍干燥。微球體的平均直徑為大約1um(MalvernMastersizer測(cè)定)，在這種條件下制備可攜帶大約0.5-1％的蛋白。制備的微球體的外部形態(tài)用掃描電鏡(SEM)進(jìn)行分析。表面特征用Z電位和疏水性進(jìn)行描述。疏水性測(cè)量微球體的疏水性用H.O.Alpar和A.J.Almeida報(bào)導(dǎo)的(H.O.Alpar和A.J.Almeida，《歐洲藥物和生物藥物雜志》40卷，第4期，198-202頁(yè)(1994))疏水相互作用層析(HIC)進(jìn)行測(cè)定。微球體在修飾有疏水殘基的瓊脂糖梯度中進(jìn)行洗脫，辛基瓊脂糖上滯留的微球體作為疏水性指標(biāo)。免疫接種設(shè)計(jì)了一個(gè)試驗(yàn)來(lái)研究不同微球體種類和表面特征在免疫應(yīng)答上的差別。給雌性Balb/c小鼠(每組5只)肌肉注射單一劑量的用Pluronic微球體包被的BSA，或者注射100ul單獨(dú)或含有表面活性劑的BSA。對(duì)照組小鼠接受相同劑量的抗原，抗原用含PVA作為乳劑穩(wěn)定劑的微球體包被。在兩個(gè)月中定期采集尾靜脈血樣，用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)分析樣品血清中的抗BSA抗體。結(jié)果繪制在圖2中。與PVA配方相比，含有PluronicL101和L121使微球體表面具有更高的疏水性(在辛基瓊脂糖層析柱中70％滯留而30％乳膠對(duì)照為95％滯留)。疏水性表面有利于巨噬細(xì)胞作用和攝取，因而更可能介導(dǎo)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。圖2顯示不同的BSA配方所誘導(dǎo)的不同免疫應(yīng)答效果。用PluronicL101制備的樣品產(chǎn)生的血漿抗BSA抗體滴度比用PVA制備的樣品要高。用PluronicL121制備的樣品在用少量抗原(1ug)誘導(dǎo)初次抗體應(yīng)答時(shí)稍弱于PVA微球體。PluronicL101制備物產(chǎn)生的血清IgG水平明顯高于其它制備物，這可能部分歸因于其具有較高的表面疏水性。本申請(qǐng)前面已經(jīng)提到過(guò)，編碼完整或部分F1抗原的DNA以及編碼完整或部分V抗原的DNA可直接用作基因疫苗。操作方法如下。1/編碼鼠疫耶爾森氏菌F1和V的DNA用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從鼠疫耶爾森氏菌基因組的特定區(qū)域擴(kuò)增而來(lái)，或從前面構(gòu)建的質(zhì)?？寺≈羞M(jìn)行分離。例如，編碼V的DNA可為I.D.no3序列。2/F1和V基因克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體質(zhì)粒上，使它們位于一個(gè)真核啟動(dòng)子的下游。合適的質(zhì)粒包括pCMVβ(購(gòu)自Clontech)，該質(zhì)粒含有巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子。F1和V可單獨(dú)克隆也可組合在一起克隆，還可與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶或真核信號(hào)序列這樣一些基因融合克隆。與上述基因融合克隆可使表達(dá)的蛋白產(chǎn)物穩(wěn)定并有利于從哺乳細(xì)胞中分泌。3/重組質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增，純化后的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物模型和免疫接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，免疫途徑包括肌肉內(nèi)注射、皮內(nèi)注射和吸入途徑。實(shí)施例1為構(gòu)建一個(gè)表達(dá)V抗原的DNA疫苗，載體質(zhì)粒pCMV用限制性內(nèi)切酶Not1消化以去除LacZ基因的編碼序列。消化后的質(zhì)粒用Klenow酶處理，產(chǎn)生平末端的載體DNA。從重組質(zhì)粒pVG100中分離含有V抗原和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合蛋白編碼序列的ssp1限制酶切片段，并與載體DNA連接。這里所用的V序列為實(shí)例SeqIDNo3中介紹的序列。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NovaBlue中，提純后的質(zhì)粒用肌肉注射法接種給Balb/c小鼠。在接種動(dòng)物血清中檢測(cè)到了針對(duì)V抗原的免疫球蛋白應(yīng)答。實(shí)施例2為構(gòu)建一個(gè)表達(dá)F1抗原的DNA疫苗，設(shè)計(jì)PCR引物來(lái)擴(kuò)增全長(zhǎng)的caf1開放閱讀框。這一閱讀框編碼F1和引導(dǎo)蛋白從細(xì)菌細(xì)胞中分泌的信號(hào)肽。所用的PCR引物在其5’端帶有含限制酶識(shí)別位點(diǎn)的“尾巴”，使擴(kuò)增產(chǎn)物能直接插入到載體質(zhì)粒中。PCR引物5’FAB2和3’FBAM的序列分別見SeqIDNo18和SeqIDNo19。使用5’FAB2和3’FBAM擴(kuò)增得到一個(gè)PCR片段，這個(gè)PCR片段的序列見SeqIDno20。用限制內(nèi)切酶NheI和BamHI消化這一PCR片段，并克隆到用相同酶消化的pBKCMV質(zhì)粒中。所得到的重組質(zhì)粒pF1AB轉(zhuǎn)化大腸桿菌NovaBlue，提純后的質(zhì)粒用肌肉注射法接種到Balb/c小鼠中。在接種動(dòng)物中檢測(cè)到了針對(duì)F1的免疫球蛋白應(yīng)答。實(shí)施例3為構(gòu)建同時(shí)表達(dá)F1和V的DNA疫苗，將V抗原編碼序列插入到實(shí)施例2中介紹的表達(dá)F1的DNA疫苗中。在F1和V的編碼序列之間有一個(gè)編碼6個(gè)氨基酸的連接區(qū)，使兩種蛋白都能獨(dú)立形成各自的構(gòu)型。編碼連接區(qū)-V的序列用BamHI和HindIII消化重組質(zhì)粒placFV6來(lái)獲得，將編碼連接區(qū)-V的序列與用相同酶切的質(zhì)粒pFIAB連接。所得到的質(zhì)粒pFVAB轉(zhuǎn)化大腸桿菌NovaBlue。將質(zhì)粒提純以備后用。融合的F1/V序列和推導(dǎo)的氨基酸序列見SeqIDNo22。下面介紹含F(xiàn)1和V抗原的融合蛋白的實(shí)施例。酶和試劑用于制備培養(yǎng)基的材料獲自O(shè)xoid公司和Difco實(shí)驗(yàn)室。DNA操作所用的酶獲自BoehringerMannheimUK公司，并按產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行操作。其它的化學(xué)藥品和生物化學(xué)藥品除非另行說(shuō)明都獲自Sigma化學(xué)公司。特異性的兔多克隆抗V血清由RBrubaker博士(密執(zhí)安州立大學(xué)微生物系)提供。鼠抗F1IgA單克隆抗體(Mab)F13G8-1獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。菌株及培養(yǎng)鼠疫耶爾森氏菌GB在液體培養(yǎng)基中28℃通氣培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基(pH6.8)每升含有15g蛋白胨、2.5g肝臟水解物，5g酵母抽提物和5gNaCl，并補(bǔ)加80ml0.25％用0.1M的NaOH溶解的氯化血紅素(血肉汁)。大腸桿菌JM109按Sambrook等在《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中介紹的方法培養(yǎng)與保存。DNA操作染色體DNA按Marmur(Marmur，J.1961，《分子生物學(xué)雜志》第3卷，208-218頁(yè))的方法從鼠疫耶爾森氏菌中分離。編碼F1抗原(caf1)和V抗原(lcrV)的基因用PCR的方法從鼠疫耶爾森氏菌DNA中擴(kuò)增(Galyov，E.E.等，1990，F(xiàn)EBSLett277卷，230-232頁(yè)；PriceSB等，1989，《細(xì)菌學(xué)雜志》171卷，5646-5653頁(yè))，所用的引物濃度為125pmol并分別與各基因的5’端和3’端序列同源。但對(duì)caf1來(lái)說(shuō)，只能擴(kuò)增到編碼成熟F1抗原的區(qū)域。F15’引物的序列為(F/5’BGATCGAGCTCGGCAGATTTAACTGCAAGCACC)。F13’引物序列為(Flink/3’AGCATGGATCCTTGGTTAGATACGGTTACGGT)。V5’引物序列為(Vlink/5’AATGGATCCATCGAAGGTCGTATTAGAGCCTACGAACAA)。V3’引物序列為(VG/3’AGCATAAGCTTCTA★GTGTCATTTACCAGACGT)。上述引物分別在5’尾端含有SacI、BamHI和BamHI、HindIII限制酶切位點(diǎn)。另外，核苷酸A★與發(fā)表的lcrV基因(PriceSB等，1989，《細(xì)菌學(xué)雜志》171卷5646-5653頁(yè))不同，使擴(kuò)增后的DNA擁有一個(gè)額外的終止密碼子(TAA)。引物Vlink/5’A尾端還含有編碼Xa因子切割序列Ile-Glu-Gly-Arg的核苷酸。上述PCR引物用DNA合成儀(392型AppliedBiosystems)制備。經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)(95℃，20s；45℃，20s；72℃，30s；9600型GeneAmpPCRSystem；PerkinElmer)的擴(kuò)增后，回收DNA片段并進(jìn)行純化。所獲得的cafIPCR產(chǎn)物用SacI和BamHI消化，并與相同酶消化的pUC18質(zhì)粒連接，電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中。然后，用BamHI和HindIII消化lcrV-連接區(qū)PCR產(chǎn)物，并與中間質(zhì)粒連接，組成重組質(zhì)粒placFV6。使用30聚體的引物(位于54和794的5’核苷酸，PriceSB等，1989，《細(xì)菌學(xué)雜志》171卷，5646-5653頁(yè))用PCR方法證明其中一個(gè)菌落帶有placFV6，該引物擴(kuò)增到了lcrV基因的一個(gè)內(nèi)部片段。為證實(shí)插入片段的核苷酸序列，依照caf1和lcrV的基因設(shè)計(jì)引物對(duì)placFV6進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序反應(yīng)使用熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸按自動(dòng)化的Taq聚合酶循環(huán)測(cè)序程序(CATALYSTMolecularBiologyLabstation；AppliedBiosystems)進(jìn)行。反應(yīng)產(chǎn)物用DNA自動(dòng)測(cè)序儀(373A型，AppliedBiosystems)分析?？寺〉娜诤系鞍椎腄NA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列見實(shí)施例1。融合蛋白由6氨基酸連接區(qū)Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg分隔的F1抗原和V抗原組成。該融合蛋白克隆在lac啟動(dòng)子的下游并符合載體編碼的LacZ’片段閱讀框。這樣，完整的融合蛋白在N末端編碼9個(gè)額外的氨基酸(Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser)。并在胞質(zhì)中積累。F1/V融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌JM109/placFV6在含有100μgml-1氨芐青霉素的LB中37℃培養(yǎng)至光吸收值(600nm)為0.3。然后在培養(yǎng)物中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM，并繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。細(xì)菌的全細(xì)胞裂解物按Sambrook等介紹的方法制備(SambrookJ等，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，紐約)，F(xiàn)1/V融合蛋白的表達(dá)用在10-15％的梯度凝膠上做SDS-PAGE(Phastsystem，PharmaciaBiotech)和用Western印跡法(SambrookJ等，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，紐約)進(jìn)行檢測(cè)。Western印跡所用的探針為1/4000稀釋的兔抗V血清或1/250稀釋的F13G8-1單抗，蛋白條帶用膠體金標(biāo)記的二抗(AuroprobeBlplus，Cambio)或結(jié)合有辣根過(guò)氧化物酶的抗鼠IgA二抗(Sigma)進(jìn)行顯色。在JM109/placFV6的裂解物中，以抗V和抗F1血清為探針用Western印跡法檢測(cè)到了一個(gè)分子量約為54.2kDa的融合蛋白。這一產(chǎn)物在對(duì)照J(rèn)M109/pUC18的裂解物中沒(méi)有檢測(cè)到。鼠傷寒沙門氏菌SL3261的電穿孔轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA用Qiaprep試劑盒從JM109/placFV6中提取和純化，并電穿孔進(jìn)鼠傷寒沙門氏菌LB5010(r-m+)中。然后提取修飾好的質(zhì)粒并電穿孔進(jìn)入鼠傷寒沙門氏菌SL3261(aroAhis)中。為在小鼠中進(jìn)行接種，細(xì)菌在含有100μgml-1氨芐青霉素的LB中靜置培養(yǎng)18小時(shí)。洗滌細(xì)菌細(xì)胞并懸浮在含10％甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)中-70℃保藏。在注射前將細(xì)胞懸液化凍并按要求用PBS稀釋。用SL3261/placFV6免疫接種本研究使用無(wú)菌條件下飼養(yǎng)的6周齡雌性Balb/c小鼠(ChalesRiverLaboratoriesMargateKent，UK)。一組19只小鼠在第0天和第14天經(jīng)靜脈(iv)途徑免疫接種0.1ml約含5×106cfu的SL3261/pFV6。為使placFV6在體內(nèi)保留，在每次接種后的5天內(nèi)，還給小鼠皮下(s.c)注射50ul的三水合氨芐青霉素(150mgml-1PenbritininjectablesuspensionPOM；SmithKlineBeechamAnimalHealth)。另取一組15只小鼠在第0天經(jīng)靜脈途徑單用0.1ml約含5×106cfu的SL3261進(jìn)行免疫接種或在第0天和第14天經(jīng)腹膜(ip)途徑用0.1ml氫氧化鋁凝膠吸附的10ugV和10ugF1混合物進(jìn)行免疫接種。一組10只同齡小鼠不作處理用作對(duì)照。在第7天，從接受SL3261/placFV或SL3261的免疫組中各取5只小鼠，處死后取脾臟。將取出的脾臟在5mlPBS中用stomacher(Seward醫(yī)藥公司)勻漿30秒。勻漿物用PBS做梯度稀釋后接種于L瓊脂或含100μgml-1氨芐青霉素的L瓊脂，確定每只脾臟中含有的細(xì)菌數(shù)。鼠傷寒沙門氏菌實(shí)際劑量每只脾臟的平均cfu±sema％重組率L-瓊脂L-氨芐SL3261/placFV63.3×106cfu1030±294380±13537％SL32611.6×107cfu1.85×107±3.57×106a均值的標(biāo)準(zhǔn)誤血清抗體滴度的測(cè)量在第42天，對(duì)SL3261/placFV免疫小鼠做尾靜脈采血并收集。用修改的ELISA法(Williamson，ED和RWTitball，1993，《疫苗》11卷，1253-1258頁(yè))測(cè)量血清中的抗V和抗F1滴度。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將V(5μgml-11PBS溶液)或F1(2μgml-1)包被在微量滴定板上，待測(cè)血清在板上做倍比稀釋。結(jié)合的抗體用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠多價(jià)Ig進(jìn)行檢測(cè)。用減去對(duì)照血清非特異性結(jié)合的光吸收值后，光吸收值仍大于0.1單位的血清的最大稀釋度，來(lái)估計(jì)特異性抗體的滴度。所有實(shí)驗(yàn)小鼠用鼠疫耶爾森氏菌攻菌前的血清抗體滴度也進(jìn)行測(cè)定。在第42天，SL3261/placFV6免疫小鼠的抗V和抗F1滴度分別為1∶5120和1∶2560。鼠疫耶爾森氏菌攻菌在第57天，免疫小鼠和對(duì)照小鼠按5或7只一組編組后進(jìn)行皮下攻菌，攻菌劑量為0.1ml含7.36×102或7.36×104cfu的鼠疫耶爾森氏菌GB菌株。菌株GB分離于一個(gè)鼠疫死亡病人，Balb/c小鼠中皮下接種的半數(shù)致死劑量(MLD)＜1cfu(Russell，P等，1995，《疫苗》13卷，1551-1556頁(yè))。觀察小鼠14天，記錄死亡時(shí)間。盡可能對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物做尸檢，將采集的血樣、肝臟和脾涂布在剛果紅瓊脂上28℃培養(yǎng)48小時(shí)，檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌的存在。*均值的標(biāo)準(zhǔn)誤權(quán)利要求1.一種保護(hù)人或動(dòng)物抵抗鼠疫耶爾森氏菌感染的方法，該方法包括給機(jī)體接種疫苗，所接種的疫苗包括一定形式的鼠疫耶爾森氏菌V抗原和F1抗原或這兩種抗原的保護(hù)性表位，但不是完整的鼠疫耶爾森氏菌細(xì)胞。2.權(quán)利要求1的方法，其中抗原以活疫苗的形式接種。3.權(quán)利要求2的方法，其中活疫苗包括人或動(dòng)物的腸道定居微生物，這些微生物轉(zhuǎn)化有重組DNA使它們能表達(dá)V抗原和F1抗原中的一種或兩者。4.權(quán)利要求3的方法，其中腸道定居微生物轉(zhuǎn)化有重組DNA使它們能表達(dá)包含V抗原和F1抗原的氨基酸序列或這兩種抗原各自的保護(hù)性表位部分的融合蛋白。5.權(quán)利要求3或4的方法，其中DNA包含SEQIDNo1或SEQIDNo3的DNA。6.權(quán)利要求5的方法，其中DNA與lacz或nirβ啟動(dòng)子位于同一個(gè)閱讀框。7.權(quán)利要求3或4的方法，其中DNA包括SEQIDNo10的DNA。8.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中疫苗包括分離和/或純化的重組V和F1抗原。9.權(quán)利要求8的方法，其中抗原用一種可以藥用的載劑提供。10.權(quán)利要求9的方法，其中載劑可制備成水包油乳劑。11.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中疫苗含有一種佐劑。12.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中疫苗接種后能誘導(dǎo)腸相關(guān)淋巴組織(GLAT)的局部刺激，并通過(guò)淋巴細(xì)胞在共同粘膜免疫系統(tǒng)中遷移對(duì)支氣管相關(guān)淋巴系統(tǒng)(BALT)產(chǎn)生繼發(fā)性刺激，使呼吸系統(tǒng)粘膜表面有分泌型IgA應(yīng)答。13.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中疫苗的形式為微滴或被囊。14.權(quán)利要求13的方法，其中被囊為能有效地將組合物運(yùn)送至個(gè)體呼吸道以引起粘膜免疫應(yīng)答的脂質(zhì)體或微囊體。15.一種疫苗組合物，包含一定形式的鼠疫耶爾森氏菌V抗原和鼠疫耶爾森氏菌F1抗原，或這兩種抗體的保護(hù)性表位，但不是完整的鼠疫耶爾森氏菌細(xì)胞。16.權(quán)利要求15的疫苗，其特征在于它是一種活疫苗。17.權(quán)利要求16的疫苗，其中活疫苗包括人或動(dòng)物的腸道定居微生物，這些微生物轉(zhuǎn)化有重組DNA使它們能表達(dá)V抗原和F1抗原中的一種或兩者。18.權(quán)利要求17的疫苗，其中腸道定居微生物轉(zhuǎn)化有重組DNA使它們能表達(dá)包含V抗原和F1抗原的氨基酸序列或這兩種抗原各自的保護(hù)性表位部分的融合蛋白。19.權(quán)利要求17或18的疫苗，其中DNA包括SEQIDNo1或SEQIDNo3的DNA。20.權(quán)利要求19的疫苗，其中DNA與lacz或nirβ啟動(dòng)子位于同一個(gè)閱讀框內(nèi)。21.權(quán)利要求17或18的方法，其中DNA包括SEQIDNo10的DNA。22.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的疫苗，其中疫苗包括分離和/或純化的重組V和F1抗原。23.權(quán)利要求22的疫苗，其中抗原用一種可以藥用的載劑提供。24.權(quán)利要求23的疫苗，其中載劑可制備成水包油乳劑。25.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的疫苗，其中疫苗的特征是含有一種佐劑。26.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的疫苗，其中疫苗的特征是其形式為微滴或被囊。27.權(quán)利要求26的疫苗，其中被囊為能有效地將組合物運(yùn)送至個(gè)體呼吸道以引起粘膜免疫應(yīng)答的脂質(zhì)體或微囊體。28.權(quán)利要求26的疫苗，其中被囊為嵌段共聚合物。29.權(quán)利要求26的疫苗，其中被囊包含生物降解性聚合物。30.權(quán)利要求29的疫苗，其中生物降解性聚合物為聚乳酸。31.權(quán)利要求30的疫苗，其中還含有羥基乙酸。32.權(quán)利要求30的疫苗，其中還含有嵌段共聚合物。33.權(quán)利要求28或32的疫苗，其中嵌段共聚合物含有(POP-POE)n重復(fù)單位。34.權(quán)利要求5的方法，其中DNA與一個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子位于同一閱讀框。35.權(quán)利要求34的方法，其中體內(nèi)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自HtrA、nirβ、OmpR、OmpC和PhoP。36.權(quán)利要求5的方法，其中DNA與一個(gè)組成型啟動(dòng)子位于同一閱讀框。37.權(quán)利要求36的方法，其中組成型啟動(dòng)子是Osmz或lacz。38.權(quán)利要求3或4的方法，其中DNA包括SEQIDNo7、8或9的DNA。39.權(quán)利要求3或4的方法，其中DNA包括SEQIDNo16的DNA。40.權(quán)利要求3或4的方法，其中疫苗包括SEQIDNo1、3或10的DNA的任何一個(gè)。41.權(quán)利要求4的方法，其中DNA包括SEQIDNo20或22的DNA。42.權(quán)利要求41的方法，其中DNA位于一個(gè)真核啟動(dòng)子的下游。43.權(quán)利要求42的方法，其中真核啟動(dòng)子是一個(gè)CMV立即早期啟動(dòng)子。44.權(quán)利要求9的方法，其中載劑是水。45.權(quán)利要求17或18的疫苗，其中DNA包括序列7、8、9、10或16的DNA之一。46.權(quán)利要求19或45的疫苗，其中DNA與一個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子位于同一閱讀框，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自htrA、nirB、ompR、ompC和phoP。47.權(quán)利要求19或45的疫苗，其中DNA與一個(gè)選自O(shè)smz或lacz的組成型啟動(dòng)子位于同一閱讀框內(nèi)。48.權(quán)利要求19或45的疫苗，其中DNA位于一個(gè)真核啟動(dòng)子的下游。49.權(quán)利要求48的疫苗，其中DNA包含SEQIDNo22或20的DNA。50.權(quán)利要求23的疫苗，其中載劑是水。全文摘要本發(fā)明提供一種保護(hù)人或動(dòng)物免受鼠疫耶爾森氏菌侵害的方法,該方法包括給機(jī)體接種疫苗,接種的疫苗包括一定形式的鼠疫耶爾森氏菌V抗原、F文檔編號(hào)C07K14/195GK1184505SQ96193850公開日1998年6月10日申請(qǐng)日期1996年3月13日優(yōu)先權(quán)日1995年3月13日發(fā)明者R·W·蒂巴爾,E·D·維利爾姆森,S·E·C·萊里,P·C·F·奧斯頓,A·M·奔內(nèi)特申請(qǐng)人:英國(guó)國(guó)防部