專利名稱：同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑(盒)及同型半胱氨酸濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定同型
半胱氨酸濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測(cè)定血漿中同型半胱氨酸的方法有很多種，包括高效液相色譜法(HPLC)、氨基酸 分析儀測(cè)定法、離子色譜法、酶聯(lián)免疫分析法(EIA)、毛細(xì)管氣相色譜_質(zhì)譜，熒光偏振免疫 分析(FPIA)、電化學(xué)法及酶法等等。 1.高效液相色譜法(HPLC):是經(jīng)典的參考方法，但其有操作比較復(fù)雜，試驗(yàn)耗時(shí) 比較長(zhǎng)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異比較大的缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用方面逐漸被酶聯(lián)免疫分析法、熒光偏振分 析法和酶法所取代。高效液相色譜法是先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸 轉(zhuǎn)變成還原形式，然后與熒光劑進(jìn)行衍生生成同型半胱氨酸_熒光物質(zhì)復(fù)合物，將衍生后 的樣品進(jìn)行色譜分析。因色譜固定相對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，因此流動(dòng)相將其洗脫下來 的次序也不同，根據(jù)這一原理將樣品中的不同物質(zhì)分開，以熒光檢測(cè)器檢測(cè)洗脫下同型半 胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，將其與標(biāo)準(zhǔn)品/內(nèi)標(biāo)的比值進(jìn)行比較和計(jì)算，就可以 測(cè)定血總同型半胱氨酸的水平。 2.酶聯(lián)免疫分析法(EIA):是臨床上測(cè)定同型半胱氨酸水平的常用方法，其特點(diǎn) 是操作比較方便、快捷，重復(fù)性好，方法穩(wěn)定可靠。缺點(diǎn)是大部分操作還是手工操作，比較耗 時(shí)等。酶聯(lián)免疫分析法其基本分析原理先使用酶將血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變 成S-腺苷-L-同型半胱氨酸，然后加入酶標(biāo)的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的單克隆或多 克隆抗體，采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的原理，將不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，然后以顯色試 劑和終止試劑分別進(jìn)行顯色和終止，制作出同型半胱氨酸濃度與發(fā)色強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣 品也按相同步驟處理，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。 3.離子色譜法主要用于實(shí)驗(yàn)研究，臨床上較少使用。其基本分析原理是色譜分 析的一種，主要是其固定相采用離子交換物質(zhì)，根據(jù)其對(duì)不同離子的吸附力不同可將同型 半胱氨酸與其它物質(zhì)分開進(jìn)行測(cè)定。 4.毛細(xì)電泳法主要用于實(shí)驗(yàn)研究，有在臨床使用的報(bào)道。其特點(diǎn)與高效液相色 譜方法相似，如其有操作比較復(fù)雜、試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異比較大的缺點(diǎn)?；痉治?原理先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成還原形式，然后與熒光試劑 進(jìn)行衍生生成同型半胱氨酸_熒光物質(zhì)復(fù)合物，將衍生后的樣品進(jìn)行毛細(xì)電泳分析。將樣 品放置于10千伏左右的高壓電場(chǎng)中，因?yàn)楦鞣N物質(zhì)所帶電荷不同，其等電點(diǎn)也不相同，因 此其在電場(chǎng)中的遷移速度也就不同，根據(jù)這一原理可將同型半胱氨酸與樣品中的其它物質(zhì) 分開，再以熒光檢測(cè)器檢測(cè)同型半胱氨酸_熒光物質(zhì)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，將其與標(biāo)準(zhǔn)品/內(nèi) 標(biāo)的比值進(jìn)行比較和計(jì)算，就可以測(cè)定總同型半胱氨酸的水平。
5.熒光偏振法是臨床上測(cè)定同型半胱氨酸水平的比較好的方法，該方法完全自動(dòng)化儀器分析，具有快速、準(zhǔn)確、方便的優(yōu)點(diǎn)。其基本分析原理樣品中游離同型半胱氨酸和 抗單克隆抗體相結(jié)合的同型半胱氨酸的熒光偏振強(qiáng)度不同，將樣品、標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng) 結(jié)合，采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的原理制作出同型半胱氨酸濃度與熒光偏振強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn) 曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。 6.酶法是因應(yīng)市場(chǎng)需求而新開發(fā)出來的測(cè)試方法，目前國(guó)內(nèi)有多項(xiàng)專利申請(qǐng) CN98807531. 8利用同型半胱氨酸酶來測(cè)量樣品中同型半胱氨酸含量；CN200410016789. 6 利用同型半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(E. C. 2. 1. 1. 10)及腺苷同型半胱氨酸酶(E. C. 3. 3. 1. 1)的循
環(huán)擴(kuò)增作用，再加上腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶等，或腺苷 脫氨酶、谷氨酸脫氫酶等顯色反應(yīng)測(cè)定同型半胱氨酸含量；CN200510053210. 8利用L-蛋氨 酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之產(chǎn)生硫化氫后再與瑩光化合物DMPD2HC1作用產(chǎn)生
熒光，該方法使用全自動(dòng)熒光分析儀測(cè)試，具有快速、準(zhǔn)確、方便的優(yōu)點(diǎn)。其基本分析原理 用基因重組酶將同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氫產(chǎn)物再與熒光顯色劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形
成可測(cè)量之熒光化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric
Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)
在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定同型半胱氨酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出
用以實(shí)現(xiàn)該方法的同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見
光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行同型半胱氨酸濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度
高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明同型半胱氨酸濃度測(cè)定方法如下 同型半胱氨酸+水同型半胱氨酸脫巰基酶硫化氫+氨+ a _氧代丁酸氨+過氧化 氫+2-酮戊二酸谷氨酸氧化酶谷氨酸+氧+水谷氨酸+輔酶谷氨酸合成酶谷氨酰胺+2-酮 戊二酸+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用同型半胱氨酸脫硫氫酶(homocysteine desulfhydrase ; EC4. 4. 1. 2)酶(偶)聯(lián)谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase ;EC 1. 4. 3. 7 ;EC 1. 4. 3. 11 ;EC 1. 4. 3. 15)、谷氨酸合成酶(glutamate synthase ;EC 1. 4. 1. 13)酶促反應(yīng)比色終點(diǎn)法。同 型半胱氨酸脫硫氫酶酶解同型半胱氨酸反應(yīng)產(chǎn)生氨，再通過(偶)聯(lián)合谷氨酸氧化酶、谷氨 酸合成酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測(cè)量340nm處 吸光度上升的程度，可以測(cè)算同型半胱氨酸的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑(盒)較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 同型半胱氨酸脫硫氫酶 10000U/L 谷氨酸氧化酶 12000U/L
谷氨酸合成酶 12000U/L 過氧化氫 12mmol/L 2-酮戊二酸 12mmol/L 本發(fā)明的同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、同型半胱氨酸脫硫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、過
氧化氫、2-酮戊二酸。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、2_酮戊二酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸脫硫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶。 輔酶、同型半胱氨酸脫硫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、過氧化氫、2-酮戊二
酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解
后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、2_酮戊二酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸脫硫氫酶。 輔酶、同型半胱氨酸脫硫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、過氧化氫、2-酮戊二酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定同型半胱氨酸濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一 本實(shí)施例的同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 同型半胱氨酸脫硫氫酶 10000U/L 谷氨酸氧化酶 12000U/L 谷氨酸合成酶 12000U/L
過氧化氫 12mmol/L
2-酮戊二酸 12mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測(cè)
試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)同型半胱氨酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反
應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出同型半胱氨酸的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
過氧化氫 12mmol/L
2-酮戊二酸 12mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 同型半胱氨酸脫硫氫酶 10000U/L 谷氨酸氧化酶 12000U/L 谷氨酸合成酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. 1，測(cè)
試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)同型半胱氨酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出同型半胱氨酸的濃度大小。 實(shí)施例三 本實(shí)施例的同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
過氧化氫 12mmol/L
2-酮戊二酸 12mmol/L
試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
谷氨酸氧化酶谷氨酸合成酶試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
同型半胱氨酸脫硫氫酶
500,1/L
12000U/L
12000U/L
100,1/L500,1/L10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定同型半胱氨酸濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)同型半胱氨酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出同型半胱氨酸的濃度大小。
申請(qǐng)人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)600 y mol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過±4%;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)O. 0007±0. 0003AA/iimol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶比色法及酶聯(lián)法的同型半胱氨酸的濃度測(cè)定方法，其方法如下同型半胱氨酸+水 同型半胱氨酸脫巰基酶 硫化氫+氨+α-氧代丁酸氨+過氧化氫+2-酮戊二酸 谷氨酸氧化酶 谷氨酸+氧+水谷氨酸+輔酶 谷氨酸合成酶 谷氨酰胺+2-酮戊二酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，測(cè)算出同型半胱氨酸的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液20-500,1/L穩(wěn)定劑1-4000mmol/L輔酶1 6mmol/L同型半胱氨酸脫硫氫酶1000-80000U/L谷氨酸氧化酶1000-80000U/L谷氨酸合成酶1000-80000U/L過氧化氫1 50mmol/L2_酮戊二酸1 50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、同型半胱氨酸脫硫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、過氧化氫、2_酮戊二酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、同型半胱氨酸脫硫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、過氧化氫、2-酮戊二酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、2-酮戊二酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸脫硫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶組成。輔酶、同型半胱氨酸脫硫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、過氧化氫、2_酮戊二酸在試劑l或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、同型半胱氨酸脫硫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、過氧化氫、2-酮戊二酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、2-酮戊二酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸脫硫氫酶組成。輔酶、同型半胱氨酸脫硫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、過氧化氫、2-酮戊二酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的同型半胱氨酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定同型半胱氨酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、過氧化氫、2-酮戊二酸、同型半胱氨酸脫硫氫酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度，從而測(cè)算出同型半胱氨酸的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101762514SQ20081024421
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司