專利名稱：白菜霜霉孢子囊的離體繁殖與活性熒光檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護領(lǐng)域中一種專性寄主菌白菜霜霉孢子囊的離體繁殖方法與活性快速 檢測方法。
技術(shù)背景大白菜是人們喜愛的大眾化蔬菜，現(xiàn)占長江中下游大中城市蔬菜復(fù)種面積的30-40%，北 方也大量引種栽培，近年來，東南亞、日、美及歐洲一些國家也廣泛引種，己逐漸成為世界 性蔬菜[侯喜林.不結(jié)球白菜育種研究新進展.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003， 26(4):111-115]。霜霉 病是中國大白菜(份"OT'ca戸fe'"e"^Rupr.)的主要病害之一，該病害是由鞭毛菌亞門，卵菌 綱，霜霉科，白菜霜霉菌(尸era"仍/wraPers. Fr)侵染引起的一種氣傳病害，也是 十字花科蔬菜的重要病害，主要危害白菜、青菜、蘿卜、油菜、甘藍、芥菜等。世界各地均 有發(fā)生，危害嚴重，有時導(dǎo)致絕收[王神云，曹家樹.蕪菁霜霉病離體接種方法初報.江蘇農(nóng)業(yè) 科學(xué),2006， (6): 165-167]。白菜霜霉病從苗期到包心期或種株開花到結(jié)莢期均可發(fā)病，主要危 害子葉、真葉、花及種莢。苗期發(fā)病致子葉或嫩莖變黃枯死，成株期發(fā)病多于葉背面，初生 水浸狀斑點，水浸狀斑點在濕度大或有露水時長出白色霉狀物(似鹽霜狀)或形成多角形病 斑。發(fā)病重時，病斑增多相連，使葉片變黃干枯，受害葉片大多從邊葉外向內(nèi)葉發(fā)展，發(fā)病 重的植株不能包心。采種株的莖頂及花梗染病后，多肥腫畸形，種莢染病也會導(dǎo)致不同程度 的變形，表面生白色霉狀物，結(jié)實不良[李懷方主編.園藝植物病理學(xué)(華南本).北京中國農(nóng) 業(yè)出版社，2001， 127-129;賴傳雅主編.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)(華南本).北京科學(xué)出版社，2003， 359-362]。霜霉病病株率一般20%-30%，重病田可達100%，流行年份可減產(chǎn)50%以上。霜霉 病菌以菌絲體及卵孢子在土壤或病株殘體越夏、越冬，成為初次侵染源，或以孢子囊及游動 孢子借氣流或雨水傳播侵染，而田間植株發(fā)病后，環(huán)境條件適宜時，病部可全日釋放孢子囊， 并浮動于大氣中，通過氣流傳播，造成重復(fù)侵染。[邵小花，陳全慶，張繁琴.大白菜霜霉病與 若干生態(tài)因子的關(guān)系.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，19卯,6(3):78-81]。為了減輕病害的發(fā)生，長期施用農(nóng)藥 不僅污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，也嚴重威脅人們的身體健康，而且白菜霜霉菌具有世代短、 產(chǎn)孢量大的特點，容易產(chǎn)生抗藥性[劉愛媛.鏈霉素對幾種卵菌的抑制作用.植物保護學(xué)報， 2001, 28(3): 254-258]。因此選育和利用抗病品種是防治該病較為經(jīng)濟有效的方法[李明遠.十 字花科蔬菜霜霉病的發(fā)生與防治.當代蔬菜，2004(8): 38-39]。白菜霜霉菌是一種專性寄生菌，只能在活體上成活，目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長，因此大白菜抗病研究和菌種離體繁殖甚為不便[Slusarenko A J, Schlaich N. Downy mildew of 爿ra6/cto戸、//zor//awa caused by場a/qperaMayjpora戸ra礎(chǔ)ca (formerly Pera"cwpora戸ra礎(chǔ)ca). Mo/ecw/ar P/a加尸aAo/ogy， 2003, 4(4): 159-170]，人工接種是抗病育種和對種質(zhì)資源進行抗病 評價以及防治效果評價的重要工具，離體接種法在葡萄、絲瓜、黃瓜霜霉病等病害上都有應(yīng) 用報道[湯鈿.葡萄霜霉病離體接種方法的研究.微生物學(xué)通報，1994, 21(6): 373;謝大森，徐 春香.絲瓜霜霉病菌人工接種技術(shù)研究初報.廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998, 17(3): 254-258;劉西 莉，朱書生，李健強等. 一種黃瓜霜霉病菌菌株的保存方法.專利公開號:CN 1693447A]，但還 沒有關(guān)于大白菜霜霉病離體接種繁殖的相關(guān)報道。崔鐵軍等(1994)發(fā)現(xiàn)向R葵霜霉病的菌絲和孢子囊有自體熒光現(xiàn)象，死亡的菌絲體具 有特征性的自體熒光，活的菌絲體沒有該現(xiàn)象，以及后來在其它霜霉屬真菌上也觀察到此現(xiàn) 象，因此認為霜霉屬真菌在特定波長的光激發(fā)下發(fā)生的自體熒光現(xiàn)象與其活性如菌絲體產(chǎn)孢 活性、孢子囊萌發(fā)活性等具有相關(guān)性。[崔鐵軍等.向日葵霜霉病種子帶菌的熒光檢驗法.1994, 植物病理學(xué)報，24(2): 127-128;商鴻生等.霍爾斯單軸霉的自體熒光現(xiàn)象.1994， 13 (4):317-318]，所以可以將自體熒光現(xiàn)象用來作為霜霉屬真菌孢子囊活性檢測的手段。 發(fā)明內(nèi)容針對上述情況，本發(fā)明的目的是提供簡單、便捷、有效的白菜霜霉孢子囊離體繁殖和活 性快速熒光檢測方法。具體技術(shù)方案如下白菜霜霉孢子囊的離體繁殖與活性熒光檢測方法，該方法包括下列步驟(1) 白菜霜霉孢子囊離體繁殖方法① 接種體的制備，② 離體葉柄接種與培養(yǎng)，③ 孢子囊萌發(fā)的觀察；(2) 白菜霜霉孢子囊活性熒光檢測方法① 孢子囊懸浮液的制備，② 孢子囊自體熒光的觀察，③ 孢子囊活性的確定。 接種體的制備是用用消毒軟毛筆蘸取無菌水將病葉背部霜霉病病斑霉層刷入小燒杯無菌水中，干凈紗布過濾后制備孢子囊懸浮液。離體葉柄接種與培養(yǎng)是用健康白菜中部葉片的葉柄切割成縱向10cm左右橫向4cm左右 的片段，在切口處接種孢子囊懸浮液，然后將其置于15'C生物培養(yǎng)箱黑暗中培養(yǎng)。孢子囊熒光的自體觀察結(jié)果是，如果無自體熒光或熒光極淡，說明孢子囊具有活性，反 之，如果孢子囊發(fā)出亮藍色自體熒光，說明活性喪失。(見圖4、 5)。還包括白菜霜霉孢子囊的離體繁殖與活性熒光檢測方法在繁殖和檢測白菜霜霉方面的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是，提供了一種簡單、便捷、有效的白菜霜霉菌孢 子囊離體繁殖方法，可使孢子囊大量繁殖，獲得大量的新鮮霉菌，同時根據(jù)霜霉屬真菌具有 的自體熒光現(xiàn)象與其活性如菌絲體產(chǎn)孢活性、孢子囊萌發(fā)活性等具有相關(guān)性的原理，提供了 一種快速、簡便的白菜霜霉菌孢子囊活性的熒光檢測方法。本發(fā)明為霜霉菌等專性寄生性很 強的病菌的離體繁殖和孢子囊活性檢測提供了一條新途徑，將為大白菜抗病育種和種質(zhì)資源 抗病評價以及防治效果評價奠定技術(shù)基礎(chǔ)，具有較高的實際利用價值。下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的詳述。


圖l:白菜霜霉孢子囊的萌發(fā)形成單芽管； 圖2:白菜霜霉孢子囊的萌發(fā)形成2個芽管；圖3:白菜霜霉孢子囊的萌發(fā)形成孢囊梗，并以二叉式分枝產(chǎn)生新的孢子囊； 圖4:新鮮白菜霜霉孢子囊熒光觀察； 圖5:死亡白菜霜霉孢子囊自體熒光觀察。
具體實施方式
實施例l:白菜霜霉孢子囊離體繁殖方法(1) 接種體的制備每年十一月份從田間采集新鮮的大白菜霜霉病病葉，用0. 1%升汞水表面消毒，再用無菌水沖洗干凈，置于15'C下消毒光照培養(yǎng)箱中黑暗下保濕培養(yǎng)，待病斑上產(chǎn)生孢子囊后通過顯 微鏡觀察菌絲及孢子囊的形態(tài)從而確定從田間采得的病葉培養(yǎng)后得到的病原菌接種液為白菜 霜霉病菌。用消毒軟毛筆蘸取無菌水將經(jīng)保濕培養(yǎng)的病葉葉背部霜霉病病斑霉層刷入小燒杯 無菌水中，干凈紗布過濾后制備孢子囊懸浮液。(2) 離體葉柄接種與培養(yǎng)取健康無病白菜，剝?nèi)ネ鈱尤~片，用消毒刀片將白菜中部葉片的葉柄切割成縱向為lOcm 左右橫向為4cm左右的片段，用無菌水多次沖洗干凈后放置于鋪有3層吸水紙直徑為18cm 的培養(yǎng)皿中，用毛筆蘸取孢子囊懸浮液將病菌接種于葉柄片段的切口上，在無菌箱中晾干后， 將培養(yǎng)皿置于15'C生物培養(yǎng)箱黑暗中培養(yǎng)。每天進行觀察，7-8天就可以觀察到在切口處或 葉柄背部長出由孢子囊和孢囊梗構(gòu)成的白色霉層。(3)孢子囊萌發(fā)的觀察吸取新鮮孢子囊懸浮液5mL于試管中，輕輕在手掌上拍動數(shù)次，以使孢子囊脫離孢囊梗， 更加分散。因高濃度的孢子囊能產(chǎn)生抑制萌發(fā)的物質(zhì)，故懸浮液濃度為每100X視野中有3-5 個孢子囊即可。將試管放置于l(TC培養(yǎng)箱中光照條件下培養(yǎng)，每隔24小時吸取少量懸浮液， 制片，在顯微鏡下觀察。在l(TC下培養(yǎng)數(shù)小時后就有孢子囊開始萌發(fā)，24小時內(nèi)可達到最高萌發(fā)率。在可見光的 視野中，新鮮孢子囊形態(tài)飽滿，圓形或橢圓形，內(nèi)容物透明均勻，孢子囊以多種形態(tài)進行萌 發(fā)① 孢子囊萌發(fā)形成一個芽管，萌發(fā)形成的芽管的長度最長可達孢子囊直徑的IO倍以上(見 圖1)。② 孢子囊萌發(fā)形成兩個或多個芽管(見圖2)。③ 孢子囊萌發(fā)形成孢囊梗，并以二叉式分枝產(chǎn)生新的孢子囊，二叉式分枝有l(wèi)-4次。新鮮 霉層形成4-5天后，在相對濕度較大的情況下，病組織上的孢子囊可以在孢囊梗著生狀態(tài)下 進行萌發(fā)，在二叉式分枝的末端形成新的孢子囊(見圖3)。實施例2:白菜霜霉孢子囊活性熒光檢測方法(1) 孢子囊懸浮液的制備 待白菜葉柄切口處或葉柄背部長出由孢子囊和孢囊梗構(gòu)成的白色霉層，立即用經(jīng)消毒滅菌的毛筆將新長出的孢子囊刷入無菌水中，獲得白菜霜霉的新鮮孢子囊懸浮液。將保存一年 以上的病葉干標本上的霉層制備成孢子囊懸浮液。(2) 孢子囊自體熒光的觀察吸取少量懸浮液制玻片，用熒光顯微鏡觀察。采用的熒光顯微鏡為OPTON， Axioskop型 落射式熒光顯微鏡，50W超高氣壓汞燈，紫外激發(fā)，阻擋濾光片為02型紫外光激發(fā)的濾光 片組。(3) 孢子囊活性的確定在熒光視野中，新鮮孢子囊無自體熒光或熒光極淡，在目鏡肉眼不易觀察到熒光，在150 萬像素攝像監(jiān)視器上可看見孢子囊輪廓(見圖4)。長期存放的病組織的孢子囊，孢子囊發(fā)出 亮藍色自體熒光，目鏡肉眼和監(jiān)視器屏幕上都可以明顯觀察到(見圖5)。
權(quán)利要求
1、白菜霜霉孢子囊的離體繁殖與活性熒光檢測方法，其特征是，該方法包括下列步驟(1)白菜霜霉孢子囊離體繁殖方法①接種體的制備，②離體葉柄接種與培養(yǎng)，③孢子囊萌發(fā)的觀察；(2)白菜霜霉孢子囊活性熒光檢測方法①孢子囊懸浮液的制備，②孢子囊自體熒光的觀察，③孢子囊活性的確定。
2、 權(quán)利要求l所述的白菜霜霉孢子囊離體繁殖與活性熒光檢測方法，其特征是，用消毒 軟毛筆蘸取無菌水將病葉背部霜霉病病斑霉層刷入小燒杯無菌水中，干凈紗布過濾后制備孢 子囊懸浮液。
3、 權(quán)利要求l所述的白菜霜霉孢子囊離體繁殖與活性熒光檢測方法，其特征是，是用健 康白菜中部葉片的葉柄切割成縱向10cm左右橫向4cm左右的片段，在切口處接種孢子囊懸 浮液，然后將其置于15'C生物培養(yǎng)箱黑暗中培養(yǎng)。
4、 權(quán)利要求l所述的白菜霜霉孢子囊離體繁殖與活性熒光檢測方法，其特征是，孢子囊 熒光的自體觀察結(jié)果是，如果無自體熒光或熒光極淡，說明孢子囊具有活性，反之，如果孢 子囊發(fā)出亮藍色自體熒光，說明活性喪失。
5、 白菜霜霉孢子囊的離體繁殖與活性熒光檢測方法在繁殖和檢測白菜霜霉方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供白菜霜霉孢子囊的離體繁殖與活性熒光檢測方法。屬于菌種繁育和活性檢測領(lǐng)域。該方法將健康白菜中部葉片的葉柄切割成10cm×4cm左右片段，切口處接種孢子囊懸浮液，置于15℃生物培養(yǎng)箱黑暗中培養(yǎng)。熒光顯微鏡觀察白菜霜霉的新鮮孢子囊，如果無自體熒光或熒光極淡，說明孢子囊具有活性，如果發(fā)出亮藍色自體熒光，說明活性喪失。本發(fā)明提供了一種簡單、便捷、有效的白菜霜霉孢子囊離體繁殖方法和一種白菜霜霉孢子囊活性的快速熒光檢測方法，為大白菜抗病育種和種質(zhì)資源抗病評價以及防治效果評價奠定技術(shù)基礎(chǔ)，具有較高實際利用價值。
文檔編號G01N21/76GK101402919SQ20081015176
公開日2009年4月8日 申請日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者劉躍庭, 崔鐵軍, 芳 廖, 羅加鳳, 郭京澤, 黃國明 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心