專利名稱：無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒及無機(jī)磷(磷酸根)濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明 還涉及測(cè)定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè) 定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動(dòng) 態(tài)平衡，血中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血銬升高則血磷降 低，反之亦然。血漿中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每 100毫升血漿鈣磷濃度的乘積為35——40。當(dāng)二者乘積大于40時(shí)，牽丐 和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，>70時(shí)，可發(fā)生轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)化。當(dāng)乘積 <35時(shí)，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用， 引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀 旁腺激素及降f5素的調(diào)節(jié)。
由于人體的磷目前還不能直接測(cè)定，所以無機(jī)磷的檢測(cè)實(shí)際上是分 析磷酸鹽陰離子(H2P04"， HP(V')。常用的方法有磷鉬酸還原法，非 還原法，染料結(jié)合法，酶法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度 法和流動(dòng)注射分析法等。決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦 的中等實(shí)驗(yàn)室測(cè)定無機(jī)磷的常規(guī)方法是比色法。磷鉬酸還原法又有無蛋白學(xué)濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中 加入非離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類 很多，性能比較穩(wěn)定的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米
吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。 磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測(cè)定磷鉬酸雜 聚化合物，方法簡(jiǎn)便，便于自動(dòng)化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm 有光吸收，必須做標(biāo)本空白，否則結(jié)果偏高。
酶法測(cè)定無機(jī)磷是發(fā)展趨勢(shì)，其優(yōu)點(diǎn)是無機(jī)磷酸鹽化合物在酶作用 下的中性范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動(dòng)化分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè) 還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得 以測(cè)定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí) 現(xiàn)該方法的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以 在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行無機(jī)磷(磷酸根) 濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng) 用。
本發(fā)明無機(jī)磷(磷酸根)濃度測(cè)定方法原理如下 腺苷+磷酸根 5核苷酸酶腺苷單磷酸+水 腺苷單磷酸+ 二磷酸+乙酰輔酶A 乙酰輔酶A合成酶
乙酸+腺苷三磷酸+輔酶A乙酸+還原型輔酶醛脫氫酶 乙醛+輔酶+水 乙醛+還原型輔酶酒精脫氫酶 乙醇+輔酶
這種方法應(yīng)用5'核苷酸酶(5， Nucleotidase; EC 3丄3.5)酶(偶)聯(lián) 乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoAsynthetase; EC 6.2.1.1、 EC 6.2.1.3)、 醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase; EC 1.2.1.3、 EC 1.2.1.4、 EC 1.2.1.5)、 酒精脫氫酶(alcohol dehydrogenase; EC 1.1.1.1)酶促反應(yīng)比色法。5， 核苷酸酶酶解無機(jī)磷(磷酸根)反應(yīng)產(chǎn)生腺苷單磷酸，再通過(偶) 聯(lián)合乙酰輔酶A合成酶、醛脫氫酶、酒精脫氫酶的作用，最終將還原 型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收 峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過 測(cè)量340nm處吸光度下降的程度，可以測(cè)算無機(jī)磷(磷酸根)的濃度 大小。醛脫氫酶及酒精脫氫酶可以選擇其中之一即可，但二個(gè)脫氫酶 可以提高靈敏度一倍。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明無機(jī)磷(磷 酸根)診斷/測(cè)定試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
還原型輔酶
0.25 mmol/L
5'核苷酸酶
6000 U/L
乙酰輔酶A合成酶
8000 U/L
醛脫氫酶
10000U/L酒精脫氫酶 10000 U/L
腺苷 8 mmol/L
二磷酸 12 mmol/L
乙酰輔酶A 6 mmol/L
本發(fā)明的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、5'核苷酸酶、乙酰輔酶A合成 酶、醛脫氫酶、酒精脫氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、5'核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、醛脫氫 酶、酒精脫氫酶。 還原型輔酶、5'核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、醛脫氫酶、酒精脫 氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、乙酰輔酶A合成酶、醛脫氫酶、酒精脫
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、5'核苷酸酶。
還原型輔酶、5，核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、醛脫氫酶、酒精脫 氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。試劑盒可以是千粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的 方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
本實(shí)施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括:
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmd/L
穩(wěn)定劑 還原型輔酶 5'核苷酸酶 乙酰輔酶A合成酶
500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 訓(xùn)0 U/L 10000U/L 10000U/L腺苷
8 mmol/L
12 mmol/L
乙酰輔酶A
6 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍千燥，制成千粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37匸，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340mn，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)無機(jī) 磷(磷酸根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下 降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出無機(jī)磷 (磷酸根)的濃度大小。
本實(shí)施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
腺苷
乙酰輔酶A
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 8 mmol/L 12 mmol/L 6 mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 5'核苷酸酶 乙酰輔酶A合成酶 醛脫氫酶、酒精脫氫酶
500 mmol/L
6000 U/L
8000 U/L
10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)無機(jī) 磷(磷酸根)樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)?負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出無機(jī)磷
(磷酸根)的濃度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸—鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
腺苷
乙酰輔酶A
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 8 mmol/L 12 mmol/L 6 mmol/L
ii試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
乙酰輔酶A合成酶 醛脫氫酶
酒精脫氫酶
500 mmol/L 8000 U/L 10000U/L 10000U/L
試劑3
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 5'核苷酸酶
500 mmol/L 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定無機(jī)磷(磷酸根)濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度
37°C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm， 測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)無機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑1、試劑2、試 劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí) 間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出無機(jī)磷 (磷酸根)的濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法 均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不 另一一例舉?？傊瑢?shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化 分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果一一空白試劑吸光度變化(AA)《 0.0020±0.0005;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點(diǎn)；試劑可
測(cè)有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)15 mmol/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度， 其相對(duì)偏差不超過士3 %;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù) (CV) 《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.001 ± 0.0002 AA/mmol/L;試
劑在2—8"C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；~本發(fā)明靈敏度高、精確 度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機(jī)磷(磷酸根)濃度測(cè)定方法，其方法原理如下腺苷+磷酸根 5核苷酸酶 腺苷單磷酸+水腺苷單磷酸+二磷酸+乙酰輔酶A 乙酰輔酶A合成酶乙酸+腺苷三磷酸+輔酶A乙酸+還原型輔酶 醛脫氫酶 乙醛+輔酶+水乙醛+還原型輔酶 酒精脫氫酶 乙醇+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，測(cè)算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2.-種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機(jī)磷(磷酸根)濃度測(cè)定方法， 其方法原理如下.-腺苷+磷酸根5核苷酸酶腺苷單磷酸+水 腺苷單磷酸+ 二磷酸+乙酰輔酶A 乙酰輔酶A合成酶乙酸+腺苷三磷酸+輔酶A 乙酸+還原型輔酶醛脫氫酶 乙醛+輔酶+水 乙醛+還原型輔酶酒精脫氫酶 乙醇+輔酶 將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀 下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，測(cè)算出無機(jī)磷(磷 酸根)的濃度大小測(cè)定結(jié)果。 -種無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶5'核苷酸酶乙酰輔酶A合成酶20~——500 mmol/L4000 mmol/L0.1--0.35 mmol/L1000--■00 U/L1000-1000--80000 U/L-80000 U/L酒精脫氫酶 腺苷 二磷酸 乙輔酶A1000——80000 U/L50 mmol/L50 mmol/L50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好,在此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、5'核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、 醛脫氫酶、酒精脫氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征 在于.-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、5'核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、 醛脫氫酶、酒精脫氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A組成雙劑試齊'J;試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、5'核苷酸酶、乙酰輔 酶A合成酶、醛脫氫酶、酒精脫氫酶組成。還原型輔酶、5'核苷酸 酶、乙酰輔酶A合成酶、醛脫氫酶、酒精脫氫酶、腺苷、二磷酸、 乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征 在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、5，核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、 醛脫氫酶、酒精脫氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A組成多劑試 齊IJ;試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、乙酰輔酶A合成酶、酸脫氫酶、酒精脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、5'核苷 酸酶組成。還原型輔酶、5'核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、醛脫氫 酶、酒精脫氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征 在于還包括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述 穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇 (Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少 一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A、5’核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、醛脫氫酶、酒精脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的程度，從而測(cè)算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101620101SQ20081012293
公開日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司