專利名稱:無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒及無機磷(磷酸根)的濃度測定方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒,同時本發(fā)明還涉及 測定無機磷(磷酸根)濃度的方法,屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。
背景技術:
人體內磷的87%都存在于骨骼中,血液中的磷和骨骼中的磷保持動態(tài)平 衡,血中鈣、磷濃度之間有一定關系,正常人血鈣升高則血磷降低,反之亦 然。血漿中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍;大約每100毫升血漿轉 磷濃度的乘積為35——40。當二者乘積大于40時,鈣和磷以骨鹽形式沉積 在骨組織,〉70時,可發(fā)生轉移性鈣化。當乘積<35時,則將妨礙骨組織 的鈣化,甚至使骨鹽再溶解,影響成骨作用,引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定,主要受維生素D,甲狀旁腺激素及降鈣素的調節(jié)。
由于人體的磷目前還不能直接測定,所以無機磷的檢測實際上是分析磷 酸鹽陰離子(H2P04", HPO420。常用的方法有磷鉬酸還原法,非還原法, 染料結合法,酶法,同位素稀釋質譜法、原子吸收分光光度法和流動注射分 析法等。決定性方法是同位素稀釋質譜法,WHO推薦的中等實驗室測定無 機磷的常規(guī)方法是比色法。
磷鉬酸還原法又有無蛋白學濾液法和不去蛋白法,后者需在試劑中加入 非離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多,性能比較穩(wěn)定的還原劑有硫酸亞鐵,硫酸亞鐵銨,硫酸肼,米吐爾等。表面活性
劑則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚化 合物,方法簡便,便于自動化。但黃疸,溶血,脂濁血清在340nm有光吸收, 必須做標本空白,否則結果偏高。
酶法測定無機磷是發(fā)展趨勢,其優(yōu)點是無機磷酸鹽化合物在酶作用下的 中性范圍內是穩(wěn)定的,可用于常規(guī)樣品的自動化分析。
發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術,計量/連續(xù) 監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化,得以 測定無機磷(磷酸根)濃度的方法,同時,本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法 的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒,采用該試劑不僅可以在紫外/可見光 分析儀或半、全自動生化分析儀上進行無機磷(磷酸根)濃度測定,而且測 定速度快、準確度高,因而可以得到切實的推廣應用。 本發(fā)明無機磷(磷酸根)濃度測定方法原理如下 腺苷+磷酸根 5核苷酸酶腺苷單磷酸+水 腺苷單磷酸+ 二磷酸+乙酰輔酶A 乙酰輔酶A合成酶
乙酸+腺苷三磷酸+輔酶A 丙酮酸+輔酶八+輔酶丙酮酸脫氫酶 二氧化碳+
乙酰輔酶A十還原型輔酶 這種方法應用5'核苷酸酶(5, Nucleotidase; EC 3丄3.5)酶(偶)聯(lián)乙酰輔酶A合成酶(acetyl-Co A synthetase; EC 6.2.1.1、 EC 6.2.1.3)、丙酮酸脫氫酶 (pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51)酶促反應比色終點法。5'核苷酸酶 酶解無機磷(磷酸根)反應產生腺苷單磷酸,再通過(偶)聯(lián)合乙酰輔酶A 合成酶、丙酮酸脫氫酶的作用,最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原 成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰),從而得以測定還原型輔酶在340nm 處吸光度上升的程度,通過測量340nm處吸光度上升的程度,可以測算無機 磷(磷酸根)的濃度大小。
實驗表明,從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮, 無論是單劑、雙劑還是三劑,如下成分關系的本發(fā)明無機磷(磷酸根)診斷
/測定試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
5'核苷酸酶 10000 U/L
乙酰輔酶A合成酶 12000 U/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
月泉昔 6 mmol/L
二磷酸 12 mmol/L
乙酰輔酶A 8 mmol/L
丙酮酸 16 mmol/L
本發(fā)明的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒可以是單劑,包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、5'核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A、丙酮酸。
試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體
試劑,直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、5,核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶。
輔酶、5,核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷、二磷酸、 乙酰輔酶A、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干 粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、5'核苷酸酶。 輔酶、5,核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷、二磷酸、 乙酰輔酶A、丙酮酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒 可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑,本發(fā)明測定無機磷(磷酸根)濃度的方法,
其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為單試劑,包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3 mmol/L
5'核苷酸酶 10000 U/L
乙酰輔酶A合成酶 12000 U/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
月泉苷 6 mmol/L
二磷酸 12 mmol/L
乙酰輔酶A 8 mmol/L
丙酮酸 16mmol/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,進行冷凍干燥,制成干粉試劑;使用 前,加入純凈水,復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C,反應時間10分鐘,起始吸光度 《0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測無機磷(磷酸根)樣 品與試劑的體積比例為1/25,反應方向為正反應(上升反應),延遲時間大約0分鐘左右,檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應,最終將反應物置于生化分析
儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的程度,從而測算出無機磷(磷酸根)
的濃度大小。
實施例二
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為雙試劑,包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
輔酶
腺苷
二磷酸
乙酰輔酶A
丙酮〗
試劑2
二 f餘
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 5'核苷酸酶 乙酰輔酶A合成酶 丙酮酸脫氫酶
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L 16 mmol/L
100 mmol/L
50 mmol/L
10000U/L
12000U/L
12000U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體雙試劑,可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37匸,反應時間10分鐘,起始吸光度
10《0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測無機磷(磷酸根)樣 品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5,反應方向為正反應(上升反應), 延遲時間大約0分鐘左右,檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應,最終將反應物置于生化分析 儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度,從而測算出無機磷(磷 酸根)的濃度大小。 實施例三
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為三試劑,包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
輔酶
腺苷
二磷酸
乙酰輔酶A
丙酮酸
試劑2
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
乙酰輔酶A合成酶 丙酮酸脫氫酶
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L 16 mmol/L
100 mmol/L
500 mmol/L
12000U/L 12000 U/L
試劑三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
5'核苷酸酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體三試劑,可以直接使用。 測定無機磷(磷酸根)濃度時,在全自動生化分析儀上設定溫度37"C, 反應時間10分鐘,起始吸光度《0.1,測試主波長340nm,測試副波長 405nm,被測無機磷(磷酸根)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5,反應方向為正反應(上升反應),延遲時間大約O分鐘左右,檢測 時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應,最終將反應物置于生化分析 儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的程度,從而測算出無機磷(磷酸根) 的濃度大小。
申請人經過實驗驗證,采用以上發(fā)明內容中記載的其他測定方法均能達 到本發(fā)明的目的,鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同,不另一一例舉。
總之,實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0020;吸 光度時間反應曲線應呈上升曲線直至終點;試劑可測有效(R》0.99)線形 范圍可達15 mmol/L;試劑測試的不準確度,其相對偏差不超過土5 %;試 劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2 %;試劑的靈敏度可達 0.0020 ± 0.0005 AA/mmol/L;試劑在2—8"C下保存,活性可以穩(wěn)定一年; ——本發(fā)明靈敏度高、精確度好,線形范圍寬廣,穩(wěn)定期長,足以便于推廣 應用。
權利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的無機磷(磷酸根)的濃度測定方法,其方法原理如下腺苷+磷酸根 5核苷酸酶 腺苷單磷酸+水腺苷單磷酸+二磷酸+乙酰輔酶A 乙酰輔酶A合成酶乙酸+腺苷三磷酸+輔酶A丙酮酸+輔酶A+輔酶 丙酮酸脫氫酶 二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的程度,測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小測定結果。
2. —種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒,主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑<formula>formula see original document page 2</formula>5'核苷酸酶 乙酰輔酶A合成酶 丙酮酸脫氫酶 腺苷試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍;在此范圍內效果較好,在此 范圍外,試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也 可以配制成液體試劑,直接使用。
3. 根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒,其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、5,核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫 氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A、丙酮酸組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、5,核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫 氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A、丙酮酸組成雙劑試劑;試劑l,由緩 沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A、丙酮酸組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、5'核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶組 成。輔酶、5'核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷、二 磷酸、乙酰輔酶A、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、5'核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫 氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A、丙酮酸組成多劑試劑;試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A、丙酮酸組成;試劑2, 由緩沖液、穩(wěn)定劑、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶組成;試劑3,由緩沖液、穩(wěn)定劑、5'核苷酸酶組成。輔酶、5'核苷酸酶、乙酰輔酶A 合成酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A、丙酮酸在試劑l、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒,其特征在于還包括穩(wěn)定劑1—4000 mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫 酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒,同時本發(fā)明還涉及測定無機磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分,屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷、二磷酸、乙酰輔酶A、丙酮酸、5’核苷酸酶、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑;通過將樣品與試劑按一定的體積比混合,使之發(fā)生一系列的酶促反應,再將反應物置于紫外/可見光分析儀下,檢測主波長340nm處吸光度上升的程度,從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101620102SQ20081012293
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司