專利名稱：：一種適用于五氯酚殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒，具體地說，涉及一種適用于五氯酚殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：五氯酚用途廣泛，作為農(nóng)藥主要為其鈉鹽，可用作殺菌劑、防腐劑、除草劑，還可作為木材的防腐劑，還有一部分作為溶劑、熱交換工業(yè)生產(chǎn)廢棄物被釋放到自然環(huán)境中。五氯酚具有強(qiáng)大的生物毒性是因?yàn)槠渚哂猩锝馀悸?lián)作用，五氯酚的內(nèi)分泌干擾作用表現(xiàn)在干擾機(jī)體正常的甲狀腺素功能；干擾(模擬)雌激素和睪酮，從而影響人類生育。我國城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)GB18918-2002中規(guī)定，城鎮(zhèn)污水處理廠排放五氯酚污染物濃度不得高于0.5mg丄"，我國GHZB1-1999地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定地表水I、II、III類水域有機(jī)化學(xué)物質(zhì)特定項(xiàng)目五氯酚含量標(biāo)準(zhǔn)值為0.00028mg'L"。常用的五氯酚的檢測方法包括氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC/MS)、薄層色譜法(TLC)、分光光度法(AAS)及上述方法的聯(lián)用方法。應(yīng)用這些理化分析技術(shù)對環(huán)境、生物、食品等樣品中痕量五氯酚殘留進(jìn)行分析，不僅儀器化程度要求較高，并且需要經(jīng)過繁復(fù)的分離、提取、凈化、衍生等前處理過程，分析速度慢、成本高，前處理過程需要使用大量的有機(jī)溶劑，又造成了新的環(huán)境污染。隨著待檢樣品、特別是要求現(xiàn)場快速檢測樣品量的迅速增加，傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析手段難以適應(yīng)要求，因此，迫切需要開發(fā)和應(yīng)用高效率農(nóng)藥殘留快速分析技術(shù)
發(fā)明內(nèi)容(一)要解決的技術(shù)問題針對上述不足，本發(fā)明提供一種具有高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡單的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，用于環(huán)境中五氯酚殘留的批量、快速檢測。(二)技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種五氯酚殘留分析酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，該試劑盒包括包被五氯酚抗原的酶標(biāo)板、濃縮洗滌液、五氯酚標(biāo)準(zhǔn)品、五氯酚特異性抗體、酶標(biāo)記物、底物顯色液、反應(yīng)終止液。其中，五氯酚特異性抗體的制備過程中所用的免疫原是半抗原四氯對羥基苯氧丁酸與載體蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白等常用載體蛋白，優(yōu)選為牛血清白蛋白；所述多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，優(yōu)選為兔源多克隆抗體。其中，包被了包被抗原的酶標(biāo)板的制備過程中，所用的包被抗原是五氯酚的半抗原四氯對羥基苯氧丁酸與卵清蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物，所用包被液可以是0.05MpH9.6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含1%明膠的上述包被液。其中，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)二抗，標(biāo)記酶可以是辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。其中，濃縮洗滌液的配方為每20mL蒸餾水中加入氯化鈉7~9g、磷酸二氫鉀0.1~0.3g、磷酸氫二鈉2~4g、氯化鉀3~6g、吐溫-200.5~3mL。濃縮洗滌液的濃度是正常使用時(shí)的50倍。當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，底物顯色液由A液和B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為12mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液。具體地說，A液配方可為每lOOOmL水中加入過氧化脲lg，10.3g檸檬酸，35.8gNa2HP04'12H20,吐溫-20100pL，pH5;B液配方可為每1000mL蒸餾水中加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)700mg(40rnLDMSO溶解)，10.3g梓檬酸，pH2.4-2.8。當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。本發(fā)明試劑盒的分析原理是當(dāng)酶標(biāo)板預(yù)包被抗原時(shí)，加入待測五氯酚樣品和五氯酚多克隆抗體后，固相包被抗原和待測五氯酚相互竟?fàn)幣c抗體反應(yīng)，由于每個孔中的固相抗原和加入的抗體含量均一致，所以當(dāng)待測的五氯酚濃度高時(shí)，則被結(jié)合在固相抗原上的抗體少，加入的酶標(biāo)二抗與被固定抗體結(jié)合量少，用洗滌液洗滌后加入底物顯色液，顯色反應(yīng)淺，用酶標(biāo)儀檢測的OD值低，表明抑制率高；反之，當(dāng)待測五氯酚濃度低時(shí)，則所測的OD值高，抑制率低。根據(jù)用已知的五氯酚濃度檢測所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以推算出待測五氯酚的濃度。(三)有益效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確靈敏地檢測環(huán)境中的五氯酚殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法。本發(fā)明對解決大批量樣品的五氯酚殘留現(xiàn)場監(jiān)控技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。實(shí)施例l試劑盒操作及結(jié)果計(jì)算待測樣品經(jīng)前處理后，用PBST定容備用。拆開真空包裝袋并取出酶標(biāo)板，在室溫下平衡5分鐘備用。配制0ng.mL—1,0.064ng'mU1,0.32ngTiiL國1,1.6ng*mL_1,8ng'mL國1，40ng'ml/1,200ng'mL-1，1000ng.m1/1的五氯酴標(biāo)準(zhǔn)液，加入50pL標(biāo)樣或處理好的樣品到各孔中，標(biāo)樣和樣品做4個重復(fù)，加入50^iL稀釋的抗體，37'C孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用稀釋好的PBST洗5次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍干；加入按1:1000稀釋好的酶標(biāo)羊抗兔二抗lOO(iL,37匸孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用PBST洗板5次，拍干；取A液和B液等體積混勻，每孔加100iiL，在37'C顯色30分鐘，每孔加入5(^1的終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上測定各孔在波長為450nm處的OD值。將含0ngTnL"標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值減去含最大濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值定為B0，其余孔經(jīng)同樣方法校正后的OD值定為B;以B/B0值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的log值為橫坐標(biāo)，繪制五氯酚標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。根據(jù)曲線的回歸方程可以求出對應(yīng)樣品的濃度，也可以求出五氯酚抑制中濃度IC5Q(B/Bq=50%)及最小檢測限IC2()(B/BQ=80%)。標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的回歸方程為Y=-0.25X+0.049，R2=0.98，此曲線的抑制中濃度為IC50=16ng.mL—1，IC20=0.6ng'mL—1。實(shí)施例2半抗原四氯對羥基苯氧丁酸的合成向250mL圓底三口燒瓶中加入丙酮溶劑約lOOmL,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入3g(12.15mmol)四氯對二苯酚和10g(72.5mmol)碳酸鉀,攪拌使盡量溶解，將1.58g(8.1mmol)4-溴丁酸乙酯溶于少量丙酮中，逐滴加入到反應(yīng)液中，開始加熱回流，大約12h。經(jīng)薄層液相色譜(TLC)檢測，反應(yīng)完全，減壓脫去丙酮溶劑。反應(yīng)物用50mL去離子水溶解，再加入30mL乙酸乙酯，充分振蕩，靜置分層，保留水相。在水相中加入稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至3,用乙酸乙酯50mLx2萃取水相，合并有機(jī)相，有機(jī)相用50mL水洗滌，脫去溶劑，得到粗品對羥基四氯苯氧丁酸乙酯。將制得的粗品對羥基四氯苯氧丁酸乙酯0.5g加入反應(yīng)器中，加入10%的氫氧化鈉溶液lOmL,再加入20mL甲醇溶液，在38'C下加熱回流4h，進(jìn)行脫酯化。經(jīng)TLC檢測反應(yīng)完成后，脫去溶劑，經(jīng)柱層析分離得到目標(biāo)產(chǎn)物。實(shí)施例3五氯酚多克隆抗體制備以活性酯法將半抗原四氯對羥基苯氧丁酸與牛血清白蛋白偶聯(lián)，稱2mg偶聯(lián)物溶于lmL生理鹽水中，和lmL完全弗氏佐劑混合，充分乳化后注射新西蘭大耳白兔大腿，以后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，換用不完全弗氏佐劑與免疫原混合，免疫部位為頸背部皮下，從第三次免疫開始，每次免疫后一周從兔耳靜脈釆血檢測血清效價(jià)。總共免疫5次，最后一次免疫后一周從兔頸動脈釆全血，用35°/。的飽和硫酸銨鹽析法粗提兔抗血清，最后用DE-52陰離子交換層析法進(jìn)一步純化，獲得較純的五氯酚多克隆抗體。DE-52陰離子交換純化抗體(1)DE-52預(yù)處理以lmg粗IgG需5g濕重纖維素計(jì)算，稱適量DE-52加0.5mol/LNaOH浸泡30min,蒸餾水反復(fù)洗至中性；接著用0.5mol/LHCl浸泡30min，蒸餾水反復(fù)洗至中性；再用0.5mol/LNaOH浸泡30min,蒸餾水反復(fù)洗至中性，最后用0.01mol/L、pH7.4的PBS充分平衡過夜。(2)裝柱裝柱前用真空泵抽去DE-52溶液中的氣泡，裝柱過程中不能產(chǎn)生氣泡，上樣前柱床用0.01mol/L、pH7.4的PBS平衡。(3)上樣用46mL的PBS將適量的粗IgG稀釋，然后沿柱臂緩慢加在柱床上表面，待樣品進(jìn)入柱床后開始洗脫。(4)洗脫以0.01mol/L、pH7.4的PBS作洗脫液，流速0.5mL/min,收集第一和第二吸收峰。(5)收集液冷凍干燥，4'C保存。實(shí)施例4酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液(0.05MpH9.6碳酸鈉緩沖液)將五氯酚抗原稀釋成l嗎/mL，每孔加入10(HiL,37。C溫育2h并4。C過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200^iL封閉液，37'C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。實(shí)施例5五氯酚殘留分析酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒的組建本例中，試劑盒包含如下部分(1)包被五氯酚抗原的酶標(biāo)板(2)海綿支架(3)lmg/mL五氯酚標(biāo)準(zhǔn)品(4)五氯酚多克隆抗體(5)辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔抗體(6)濃縮洗滌液配方為氯化鈉8g、磷酸二氫鉀0.28、磷酸氫二鈉3g、氯化鉀5g、吐溫-202mL、蒸餾水20mL。(7)顯色液A液配方過氧化脲lg,10.3g檸檬酸，35.8gNa2HP04'12H20，吐溫-20100(xL，蒸餾水1000mL，pH5。(8)顯色液B液配方四甲基聯(lián)苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g檸檬酸，蒸銅水1000mL,pH2.5。實(shí)施例6試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)使用實(shí)施例5中的試劑盒，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選擇2-氯苯酚、2，5-二氯苯酴、2，4,6-三氯苯酚，2，3,4,6-四氯苯酚、五氯硝基苯、六氯苯、2,4-D、PCBs作為待測物，測得各種物質(zhì)的抑制中濃度(IC50),再用下式計(jì)算抗體對這些物質(zhì)的交叉反應(yīng)性；交叉反應(yīng)率愈小，則抗體對五氯酚的特異性愈強(qiáng)，反之則抗體的特異性差。交叉反應(yīng)(cr%)=1(:5()(五氯酚)/1(:5()(供試物^100%。實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果見表l,釆用間接ELISA法，多克隆抗體對與五氯酚結(jié)構(gòu)類似物存在一定的交叉反應(yīng)，抗血清對五氯酚的特異性很強(qiáng)，對2,3，4,6-四氯苯酚交叉反應(yīng)為5.6%,對結(jié)構(gòu)類似物五氯硝基苯交叉反應(yīng)率較低，為2.5%;對六氯苯交叉反應(yīng)率則更低，為1.8%。而對其它結(jié)構(gòu)相近或相似物質(zhì)則均無明顯的交叉反應(yīng)。說明該試劑盒的特異性好，可保證對樣品中五氯酚殘留測定結(jié)果的可靠性。表1交叉反應(yīng)Table1CrossReactivitiesofIndirectELISAKit<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例7回收試驗(yàn)釆用實(shí)施例5中的試劑盒，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取頤和園昆明湖水100mL三份，往其中添加五氯酚標(biāo)準(zhǔn)品，使樣品中五氯酚終濃度分別為10ng.mU1、5^*1111/1和21^^111/1，用建立的五氯酚伺接竟?fàn)嶦LISA方法和氣相色譜國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法進(jìn)行測定。水樣的回收率在76~114%之間，試劑盒的回收率在允許范圍內(nèi)，符合農(nóng)藥殘留分析對精確度的要求。說明此測定方法是可靠的,可用于五氯酚在水樣中殘留量的分析測定。見表2。表2試劑盒測定結(jié)果與HPLC測定結(jié)果的比較Tab2ComparisonofResultsbetweenIndirectELISAandHPLC<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1.一種適用于五氯酚殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，包括包被五氯酚抗原的酶標(biāo)板、濃縮洗滌液、五氯酚標(biāo)準(zhǔn)品、五氯酚抗體、酶標(biāo)記物、底物顯色液和反應(yīng)終止液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，其中，五氯酚抗體在制備過程中所用的免疫原是半抗原四氯對羥基苯氧丁酸與載體蛋白BSA的偶聯(lián)復(fù)合物；所述五氯酚抗原是半抗原四氯對羥基苯氧丁酸與載體蛋白OVA的偶聯(lián)復(fù)合物。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)二抗。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其中，所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體。5.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，其中，濃縮洗滌液的配方為每20mL蒸餾水中加入氯化鈉7~9g、磷酸二氫鉀0.10.3g、磷酸氫二鈉24g、氯化鉀36g、吐溫-200.53mL。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，其特征在于，當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，底物顯色液包括A液和B液，所述A液為過氧化氫或過氧化脲、所述B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺、終止液為12mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，其中，所述A液配方為每lOOOmL水中加入過氧化脲lg,10.3g檸檬酸，35.8gNa2HP04.12H20,吐溫-20100pL，pH5;所述B液配方為每1000mL蒸餾水中加入四甲基聯(lián)苯胺700mg,10.3g檸檬酸，pH2.4-2.8。8.權(quán)利要求17任一項(xiàng)所述檢測試劑盒在檢測五氯酚殘留中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種適用于五氯酚殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，包括包被了五氯酚抗原的酶標(biāo)板、濃縮洗滌液、五氯酚標(biāo)準(zhǔn)品、五氯酚特異性抗體、酶標(biāo)記物、顯色液、反應(yīng)終止液。檢測已知濃度的五氯酚并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以推算出待測五氯酚的濃度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確靈敏地檢測環(huán)境中的五氯酚殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法。文檔編號G01N33/53GK101526525SQ20081010154公開日2009年9月9日申請日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日發(fā)明者井宏宇,季李,艇許申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)