專利名稱：分枝桿菌的快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物檢測領域，尤其涉及一種分枝桿菌快速檢測方法。
背景技術：
結核病是由結核分枝桿菌(簡稱結核桿菌)主要經呼吸道傳播引起的
慢性傳染病。全球目前約有20億人感染結核桿菌，中國是22個結核高發(fā) 國家之一，結核病患者的人數具世界第二位。目前有現癥肺結核病人450 萬，其中傳染性肺結核病人150萬，每年新發(fā)生肺結核病人約145萬例。 其中80%的病人在農村。結核分枝桿菌仍然是診斷結核病的"金標準"， 也是藥敏檢測的基礎。傳統(tǒng)的結核藥敏試驗是在羅氏固體培養(yǎng)基上進行 的，藥物按一定的稀釋梯度加入培養(yǎng)基中，將分離培養(yǎng)陽性的細菌接種于 含藥培養(yǎng)基中，觀察分枝桿菌在含藥培養(yǎng)基中的生長情況。由于結核桿 菌生長緩慢，傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)時間通常需要4-6周，不僅費時，且 靈敏度低，更耽誤了病人的合理治療，而不規(guī)范的用藥又加劇了耐藥株的 產生。因此，發(fā)展快速、敏感和簡便的分枝桿菌檢測方法對及時發(fā)現和控 制結核病的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是，針對現有技術的不足，提供一種采用 ATP生物發(fā)光技術以及抗酸染色技術進行快速檢測來初步判斷分枝桿菌 生長情況的方法，從而克服現有技術中的培養(yǎng)速度緩慢的缺點。為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現
步驟一、將取自病人的標本，接種到液體培養(yǎng)基中；
步驟二、取接種有標本的液體培養(yǎng)基至潔凈試管或微孔板內，先加 入分枝桿菌裂解劑，隨后加入熒光素-熒光素酶，通過生物發(fā)光系統(tǒng)檢測 其ATP含量，并以此ATP值設定為初始ATP值；
步驟三、將接種有標本的液體培養(yǎng)基進行分枝桿菌培養(yǎng)，此后每隔 3-5天取樣進行ATP含量檢測，如檢測ATP含量值高于初始ATP值一倍以 上，表明有微生物生長，否則若連續(xù)檢測6周檢測到ATP含量值未高于初 始ATP值一倍以上，則判定為陰性；
步驟四、若步驟三中檢測ATP含量值高于初始ATP值一倍以上，進 一步取樣進行抗酸染色，如抗酸染色呈陽性則判定為分枝桿菌生長。
本發(fā)明的分枝桿菌的快速檢測方法相對于傳統(tǒng)方法有快速、準確、 靈敏度高、經濟、且有利于環(huán)保等方面的優(yōu)點。
具體實施例方式
以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中 未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議 的條件。
本發(fā)明采用ATP生物發(fā)光檢測技術，通過比較初始ATP值和培養(yǎng)一段 時間后所測定的ATP值，加上抗酸染色來初步判斷分枝桿菌生長情況。 1.樣品采集、處理和接種
將病人標本，如懷疑標本有污染時按常規(guī)NALC- NaOH方法進行消化 和去污染處理后，接種到Middlebrook7H9液體培養(yǎng)基中(美國BD公司生產)。
此處病人標本可選自痰液、支氣管肺泡灌洗液、支氣管沖洗液、胃 沖洗液、血液、尿、體液、組織。
此處的標本處理方法為常規(guī)消化和去污染方法，所用試劑為N-乙酰 基-L-半胱氨酸加氫氧化鈉，NaOH占處理液濃度的1%。
2. ATP抽提和ATP檢測
取50-200 ix 1接種有標本的液體培養(yǎng)基至潔凈試管或微孔板內，先加 入同等劑量的分枝桿菌裂解劑以釋放分枝桿菌細胞內的ATP，此處的分枝 桿菌裂解劑含0. 5%-5%的三氯醋酸(TCA)，隨后加入熒光素-熒光素酶， 通過生物發(fā)光系統(tǒng)檢測其ATP含量(以相對光單位RLU來表示)，并以此 ATP值設定為初始ATP值。
此時的熒光素-熒光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)檢測ATP的具體過程為生物 發(fā)光反應需要有ATP和熒光素-熒光素酶，反應中熒光素被氧化并發(fā)出熒 光，該光的強度與被測樣品中的ATP含量成正比，通過高靈敏度檢測儀測 定光的強度進行定量分析即可。
3. 繼續(xù)培養(yǎng)、定期ATP檢測
將步驟1所述接種有標本的液體培養(yǎng)基置于35-37 "C條件下進行分枝 桿菌培養(yǎng)，此后每隔3-5天取50-200 u 1上述液體培養(yǎng)基進行ATP含量檢 測。如檢測值高于初始ATP值一倍以上數值，表明可能有微生物生長；如 連續(xù)檢測6周ATP值無明顯改變，則初步判定為陰性。
4. 抗酸染色
步驟3中若檢測值高于初始ATP值一倍以上，此時取樣進一步進行常規(guī)抗酸染色，如抗酸染色顯陽性則初步判定為分枝桿菌生長。
與現有技術相比，本發(fā)明將快速、敏感的ATP生物發(fā)光技術用于檢 測分枝桿菌在液體培養(yǎng)基中的生長情況，同時結合抗酸染色以初步判定是 否為分枝桿菌生長，使其具有快速、靈敏度高等特點，陽性檢測結果報告 時間通常不超過2-3周。
權利要求
1、一種分枝桿菌快速檢測方法，其特征在于，具有如下步驟步驟一、將取自病人的標本，接種到液體培養(yǎng)基中；步驟二、取接種有標本的液體培養(yǎng)基至潔凈試管或微孔板內，先加入分枝桿菌裂解劑，隨后加入熒光素-熒光素酶，通過生物發(fā)光系統(tǒng)檢測其ATP含量，并以此ATP值設定為初始ATP值；步驟三、將接種有標本的液體培養(yǎng)基進行分枝桿菌培養(yǎng)，此后每隔3-5天取樣進行ATP含量檢測，如檢測ATP含量值高于初始ATP值一倍以上，表明有微生物生長，否則若連續(xù)檢測6周檢測到ATP含量值未高于初始ATP值一倍以上，則判定為陰性；步驟四、若步驟三中檢測ATP含量值高于初始ATP值一倍以上，進一步取樣進行抗酸染色，如抗酸染色呈陽性則判定為分枝桿菌生長。
2、 根據權利要求1所述的分枝桿菌快速檢測方法，其特征在于，步 驟一中還包括如下步驟按常規(guī)NALC- Na0H方法進行消化和去污染處理，所述的NaOH占處理液濃度的1%。
3、 根據權利要求1所述的分枝桿菌快速檢測方法，其特征在于，所 述的病人標本包括痰液、支氣管肺泡灌洗液、支氣管沖洗液、胃沖洗液、 血液、尿、體液以及組織。
4、 根據權利要求l所述的分枝桿菌快速檢測方法，其特征在于，步 驟二中所述的分枝桿菌裂解劑與液體培養(yǎng)基體積相同。
5、 根據權利要求1所述的分枝桿菌快速檢測方法，其特征在于，步 驟二中所述的分枝桿菌裂解劑含0. 5%-5%的三氯醋酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分枝桿菌快速檢測方法，采用ATP生物發(fā)光技術進行檢測，通過比較初始ATP值和培養(yǎng)一段時間后所測定的ATP值，加上抗酸染色來初步判斷分枝桿菌生長情況。與現有技術相比，本發(fā)明將快速、敏感的ATP生物發(fā)光技術用于檢測分枝桿菌在液體培養(yǎng)基中的生長情況，同時結合抗酸染色以初步判定是否為分枝桿菌生長，使其具有快速、靈敏度高等特點，陽性檢測結果報告時間通常不超過2-3周。
文檔編號G01N33/569GK101639479SQ200810043680
公開日2010年2月3日 申請日期2008年7月31日 優(yōu)先權日2008年7月31日
發(fā)明者彭志剛 申請人:上海美全生物科技有限公司