專利名稱：孕早期唐氏綜合征產(chǎn)前篩查試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于唐氏綜合征產(chǎn)前篩査的試劑盒。
技術(shù)背景-
唐氏綜合征(Down' s syndrome, DS),又稱21三體綜合征或先天愚型，是 人類最常見的一種染色體疾病，也是造成先天智力低下的主要原因，該病的臨床 主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的智力低下，獨特的面部和身體畸形(如寬眼距，低鼻梁，肌 無力，肢體短小及通貫手等)，先天性心臟病，消化道畸形等；按比例計算，其 出生率約占活產(chǎn)新生兒的l/600 l/800;此外，與一般的基因病(如常染色體 顯/隱性遺傳，或性染色體顯/隱性遺傳)不同，DS這類染色體病是偶發(fā)的，每 個孕婦都有一定的危險性，而且一般沒有種族或家族積聚的現(xiàn)象。
唐氏綜合征的患兒多數(shù)壽命較短，生活自理性差，給家庭和社會造成極大的 經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精祌壓力。近年來隨著環(huán)境污染加重，該病有上升的趨勢。目前尚缺 乏有效的治療手段，只有通過產(chǎn)前診斷，終止妊娠，才能達(dá)到優(yōu)生的目的。由于 DS的產(chǎn)前診斷必須依靠侵入性的基因診斷技術(shù)如羊膜腔穿刺取羊水細(xì)胞進(jìn)行遺 傳學(xué)檢查、絨毛活檢等，而侵入性操作可導(dǎo)致1% 2%的流產(chǎn)率，且有羊膜腔束 帶綜合征，截肢損傷等副作用，此外產(chǎn)前診斷技術(shù)要求及所需費用高，而DS的 發(fā)生率畢竟為1.5%左右，因此不可能對每位孕婦都進(jìn)行診斷。所以，這就需要 通過產(chǎn)前篩查來提高產(chǎn)前診斷的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本法發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、靈敏度高、特異性好、無污染的孕早 期唐氏綜合征產(chǎn)前篩查試劑盒。主要解決現(xiàn)有侵入性的基因診斷技術(shù)容易導(dǎo)致流 產(chǎn)的技術(shù)問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下方案實施 一種孕早期唐氏綜合征產(chǎn)前篩查試劑盒，其特征在于試劑盒由PAPP-A (妊娠
相關(guān)血漿蛋白A)包裝盒、fhCGP (游離人絨毛膜促性腺激素l3亞單位)包裝盒，所述PAPP-A包裝盒內(nèi)有PAPP-A校準(zhǔn)品、PAPP-A單克隆抗體包被板條、PAPP-A
銪標(biāo)記物、分析緩沖液、熒光增強液、濃縮洗液、樣本稀釋液、板架組成；所述
fhCGe包裝盒內(nèi)有fhCGe校準(zhǔn)品、fhCG p單克隆抗體包被板條、fhCGe銪標(biāo)記
物、分析緩沖液、熒光增強液、濃縮洗液、板架組成。
所述PAPP-A、 fhCGP單克隆抗體包被板條的制備方法將PAPP-A或fhCGP單 克隆抗體以碳酸鹽緩沖液稀釋適當(dāng)比例后加入微孔板內(nèi)，過夜后洗滌、封 閉、干燥，而后將包被板條裝入鋁箔袋內(nèi)，冷藏備用。 所述PAPP-A、 fhCGe銪標(biāo)記物的制備方法將PAPP-A或fhCGe單克隆抗體 以碳酸鹽緩沖液透析后與DTTA-Eu(Nl-(P-異硫氰基芐基)-二乙三胺四乙 酸銪鈉)以3: 1比例混合，靜置24小時，后經(jīng)S印hacryl S-200(聚丙烯 酰胺葡聚糖S-200)分離柱分離DTTA-Eu與Ab-Eu (銪標(biāo)記抗體)，獲得銪 標(biāo)記過的單克隆抗體。
所述PAPP-A、 fhCGP校準(zhǔn)品的制備方法將PAPP-A濃度為80000 mlU/L溶液以 稀釋液稀釋至10、 40、 200、 800、 2000mIU/L，以0. 5ml裝量凍干即可。將fhCG e濃度為100000ng/mL溶液稀釋成2、 5、 20、 100、 200ng/mL，以0. 5ml裝量凍 干即可。
所述熒光增強液的配制方法，以無水乙醇溶解e-NTA (e-萘酰三氟丙酮)、TOPO (三辛基氧化膦)，再加鄰苯二甲酸氫鉀和三蒸水，40°(:溶解后，加入乙酸、1>".加 x-ioo (壬-(乙二醇)苯辛基醚)，調(diào)ra值至3.2，并定容。
所述使用方法包括以下步驟
fhCGe測定
A. 使用前將濃縮洗液以蒸餾水按1: 25 (體積比)稀釋，加入洗板機洗滌瓶中。
B. 每瓶校準(zhǔn)品中精確加入O. 5ml蒸餾水，輕搖混勻，室溫(+20°C +25°C)放置
30分鐘。
C. 將分析緩沖液、待測樣品、校準(zhǔn)品和所需數(shù)量的微孔反應(yīng)板條平衡至室溫(+20
°C +25°C)。
D. 使用前一小時內(nèi)，根據(jù)所需用量以分析緩沖液將銪標(biāo)記物稀釋50倍。
E. 在微孔底部依次加入lOw 1校準(zhǔn)品(雙孔)或待測樣品。
4F. 將稀釋后的銪標(biāo)記物按200U 1/微孔加入(棄去第一次溶液)。
G. 于室溫(+20°C +25°C)下于慢檔振動60分鐘(士5分鐘)。
H. 以洗液洗滌各板條6次，洗滌后若有少量液體殘留，將板條在干凈無塵的吸水
紙上拍干。
I. 采用干凈的專用取樣頭移取增強液，按200yl/微孔加入(棄去第一次溶液)，
于慢檔振動5分鐘。 J.選擇相應(yīng)程序測量熒光，熒光測量儀將自動處理數(shù)據(jù)并打印分析結(jié)果。
PAPP-A測定
A. 使用前將濃縮洗液以蒸餾水按l: 25 (體積比)稀釋，加入洗板機洗滌瓶中。
B. 每瓶校準(zhǔn)品以及銪標(biāo)記物中精確加入0. 5ml蒸餾水，輕搖混勻，室溫(+20°C
+25°C)放置30分鐘。
C. 將分析緩沖液、待測樣品、校準(zhǔn)品和所需數(shù)量的微孔反應(yīng)板條平衡至室溫(+20
。C +25。C)。
D. 以樣本稀釋液將樣本稀釋5倍，即40u 1樣本+160ii 1樣本稀釋液，充分混勻。
E. 使用前一小時內(nèi)，根據(jù)所需用量以分析緩沖液將銪標(biāo)記物稀釋20倍，g[』在950
y 1分析緩沖液中加入50 y 1銪標(biāo)記物。
F. 在微孔底部依次加入50 y 1校準(zhǔn)品(雙孔)或稀釋后待測樣品。
G. 將稀釋后的銪標(biāo)記物按100y 1/微孔加入(棄去第一次溶液)。
H. 于室溫(+20°C +25°C)下于慢檔振動60分鐘(士5分鐘)。
I. 以洗液洗滌各板條6次，洗滌后若有少量液體殘留，將板條在干凈無塵的吸水
紙上拍干。
J.采用干凈的專用取樣頭移取增強液，按150u 1/微孔加入(棄去第一次溶液)，
于慢檔振動5分鐘。 K.選擇相應(yīng)程序測量熒光，熒光測量儀將自動處理數(shù)據(jù)并打印分析結(jié)果
本發(fā)明試劑盒具有以下優(yōu)點1、 以DTTA-Eu為標(biāo)記物，采用時間分辨熒光檢測的方式，使檢測靈敏度更高；
2、 以PAPP-A、 fhCGe作為孕早期篩査唐氏綜合征的生化指標(biāo)，更早的實現(xiàn)了產(chǎn) 前篩查，為產(chǎn)前診斷提供了更多的時間。
具體實施例方式
一種孕早期唐氏綜合征產(chǎn)前篩查試劑盒，包括PAPP-A包裝盒、fhCGP包裝 盒，所述PAPP-A包裝盒內(nèi)有PAPP-A校準(zhǔn)品、PAPP-A單克隆抗體包被板條、PAPP-A 銪標(biāo)記物、分析緩沖液、熒光增強液、濃縮洗液、樣本稀釋液、板架組成；所述 fhCGP包裝盒內(nèi)有fhCGP校準(zhǔn)品、fhCGP單克隆抗體包被板條、fhCGe銪標(biāo)記 物、分析緩沖液、熒光增強液、濃縮洗液、板架組成。
所述PAPP-A、 fhCGP單克隆抗體包被板條的制備將PAPP-A或fhCGe單克隆 抗體以碳酸鹽緩沖液稀釋適當(dāng)比例后加入微孔板內(nèi)，過夜后洗滌、封閉、 千燥，而后將包被板條裝入鋁箔袋內(nèi)，冷藏備用。
所述PAPP-A、 fhCGP銪標(biāo)記物的制備將PAPP-A或fhCGf3單克隆抗體以碳 酸鹽緩沖液透析后與DTTA-Eu以3: 1比例混合，靜置24小時，后經(jīng) S印hacryl S-200分離柱分離DTTA-Eu與Ab-Eu，獲得銪標(biāo)記過的單克隆 抗體。
所述PAPP-A、 fhCGP校準(zhǔn)品的制備將PAPP-A濃度為80000 mlU/L溶液以稀釋 液稀釋至10、 40、 200、 800、 2000mlU/L，以0. 5ml裝量凍干即可。將fhCG J3濃 度為100000ng/mL溶液稀釋成2、 5、 20、 100、 200ng/mL，以0. 5ml裝量凍干即 可。
所述熒光增強液的配制，以無水乙醇溶解e-NTA 、 TOPO，再加鄰苯二甲酸氫鉀 和三蒸水，4(TC溶解后，加入乙酸、Triton X_100，調(diào)PH值至3.2，并定容。 所述使用方法包括以下歩驟 fhCGP測定
A. 使用前將濃縮洗液以蒸餾水按1 :25 (體積比)稀釋，加入洗板機洗滌瓶中。
B. 每瓶校準(zhǔn)品中精確加入0.5ml蒸餾水，輕搖混勻，室溫(+20°C +25°C)放置
30分鐘。
C. 將分析緩沖液、待測樣品、校準(zhǔn)品和所需數(shù)量的微孔反應(yīng)板條平衡至室溫(+20°C +25°C)。
D. 使用前一小時內(nèi)，根據(jù)所需用量以分析緩沖液將銪標(biāo)記物稀釋50倍。
E. 在微孔底部依次加入IOU 1校準(zhǔn)品(雙孔)或待測樣品。
F. 將稀釋后的銪標(biāo)記物按200y 1/微孔加入(棄去第一次溶液)。
G. 于室溫(+20°C +25°C )下于慢檔振動60分鐘(±5分鐘)。
H. 以洗液洗滌各板條6次，洗滌后若有少量液體殘留，將板條在干凈無塵的吸水
紙上拍干。
I. 采用干凈的專用取樣頭移取增強液，按200yl/微孔加入(棄去第一次溶液)，
于慢檔振動5分鐘。 J.選擇相應(yīng)程序測量熒光，熒光測量儀將自動處理數(shù)據(jù)并打印分析結(jié)果。 PAPP-A測定
A. 使用前將濃縮洗液以蒸餾水按l: 25 (體積比)稀釋，加入洗板機洗滌瓶中。
B. 每瓶校準(zhǔn)品以及銪標(biāo)記物中精確加入0. 5ml蒸餾水，輕搖混勻，室溫(+20°C
+25°C)放置30分鐘。
C. 將分析緩沖液、待測樣品、校準(zhǔn)品和所需數(shù)量的微孔反應(yīng)板條平衡至室溫(+20
。C +25。C)。
D. 以樣本稀釋液將樣本稀釋5倍，即40u 1樣本+160u 1樣本稀釋液，充分混勻。
E. 使用前一小時內(nèi)，根據(jù)所需用量以分析緩沖液將銪標(biāo)記物稀釋20倍，B卩在
950 ti 1分析緩沖液中加入50 u 1銪標(biāo)記物。
F. 在微孔底部依次加入50 y 1校準(zhǔn)品(雙孔)或稀釋后待測樣品。
G. 將稀釋后的銪標(biāo)記物按100" 1/微孔加入(棄去第一次溶液)。
H. 于室溫(+20°C +25°C)下于慢檔振動60分鐘(士5分鐘)。
I. 以洗液洗滌各板條6次，洗漆后若有少量液體殘留，將板條在干凈無塵的吸水
紙上拍干。
J.采用干凈的專用取樣頭移取增強液，按150u 1/微孔加入(棄去第一次溶液)，
于慢檔振動5分鐘。 K.選擇相應(yīng)程序測量熒光，熒光測量儀將自動處理數(shù)據(jù)并打印分析結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種孕早期唐氏綜合征產(chǎn)前篩查試劑盒，其特征是試劑盒由妊娠相關(guān)血漿蛋白A校準(zhǔn)品、妊娠相關(guān)血漿蛋白A單克隆抗體包被板條、妊娠相關(guān)血漿蛋白A銪標(biāo)記物、游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位校準(zhǔn)品、游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位單克隆抗體包被板條、游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位銪標(biāo)記物、分析緩沖液、熒光增強液、濃縮洗液、樣本稀釋液、板架組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求i所述的孕早期唐氏綜合征產(chǎn)前篩查試劑盒，其特征是所述妊娠相關(guān)血漿蛋白a、游離人絨毛膜促性腺激素e亞單位單克隆抗體包被板條的獲得:將妊娠相關(guān)血漿蛋白a或游離人絨毛膜促性腺激素e亞單位單克 隆抗體以碳酸鹽緩沖液稀釋適當(dāng)比例后加入微孔板內(nèi)，過夜后洗滌、封 閉、干燥，而后將包被板條裝入鋁箔袋內(nèi)，冷藏備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的孕早期唐氏綜合征產(chǎn)前篩查試劑盒，其特征是所述妊娠相關(guān)血漿蛋白a、游離人絨毛膜促性腺激素e亞單位銪標(biāo)記物的獲得將妊娠相關(guān)血漿蛋白a或游離人絨毛膜促性腺激素e亞單位單克隆抗體以 碳酸鹽緩沖液透析后與N1-(p-異硫氰基芐基)-二乙三胺四乙酸銪鈉以 適當(dāng)比例混合，靜置 一段時間后經(jīng)聚丙烯酰胺葡聚糖S-200分離柱分離 Nl-(p-異硫氰基芐基)-二乙三胺四乙酸銪鈉與銪標(biāo)記抗體，獲得銪標(biāo)記過的單克隆抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的孕早期唐氏綜合征產(chǎn)前篩查試劑盒，其特征是所述妊娠相關(guān)血漿蛋白a、游離人絨毛膜促性腺激素e亞單位校準(zhǔn)品的獲得分 別將妊娠相關(guān)血漿蛋白a、游離人絨毛膜促性腺激素e亞單位高濃度溶液以稀釋液稀釋至所需濃度，以0. 5ml裝量凍干即可。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的孕早期唐氏綜合征產(chǎn)前篩查試劑盒，其特征是所述 熒光增強液的獲得以無水乙醇溶解e-萘酰三氟丙酮、三辛基氧化膦，再加鄰苯二甲酸氫鉀和三蒸水，4crc溶解后，加入乙酸、壬-(乙二醇)苯辛基醚， 調(diào)ra值至3.2，并定容。
全文摘要
本發(fā)明目的在于提供一種孕早期唐氏綜合征的產(chǎn)前篩查試劑盒，試劑盒由PAPP-A校準(zhǔn)品、PAPP-A單克隆抗體包被板條、銪標(biāo)記PAPP-A單克隆抗體、fhCGβ校準(zhǔn)品、fhCGβ單克隆抗體包被板條、銪標(biāo)記fhCGβ單克隆抗體、分析緩沖液、熒光增強液、濃縮洗液、樣本稀釋液、板架組成，應(yīng)用銪標(biāo)記與時間分辨免疫熒光定量檢測技術(shù)，結(jié)合時間分辨熒光檢測儀，定量檢測血清中的PAPP-A和fhCGβ，采用產(chǎn)前篩查軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，從而得到風(fēng)險率，實現(xiàn)孕早期篩查唐氏綜合征的目的。本發(fā)明適合產(chǎn)前篩查使用。
文檔編號G01N33/74GK101614750SQ20081004355
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者吳馮波, 蔣云霞 申請人:上海新波生物技術(shù)有限公司