專利名稱：：蛇毒指紋圖譜的建立方法及其指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蛇毒指紋圖譜的建立方法，以及由該方法所得的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。
背景技術(shù)：
：蛇毒是從各種毒蛇蛇頭毒腺中分泌的一類物質(zhì)，作為毒蛇保護(hù)自己，獵取食物的武器，是世界上最毒的動(dòng)物毒素之一。蛇毒的主要成分是蛋白質(zhì)和多肽，約占干重的90-95%，其中包括多種酶，如磷酸酯酶、精氨酸酯酶、蛋白水解酶、磷脂酶A2、類激肽釋放酶、5-核苷酸酶、L-氨基酸氧化酶及乙酰膽堿酯酶等。3-12種非酶活性蛋白質(zhì)或多肽如神經(jīng)毒素、膜活性肽、舒緩激肽增強(qiáng)肽、出血因子等。這些有活性的成分中很多具有藥理作用和藥用價(jià)值，如蛇毒中的類凝血酶、纖溶酶己在臨床上作為抗栓藥用于血栓病的防治。此外，蛇毒中還含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、脂類、核苷、生物胺類及金屬離子等。蛇毒的成分因蛇的種類、產(chǎn)地、時(shí)間、蛇齡、雌雄、生存環(huán)境等不同而有明顯的不同。蛇毒是人類迄今為止研究與利用最多的動(dòng)物毒素，但其早期研究卻是很艱苦的，主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的分離、純化比較困難。70年代以后，隨著分子生物學(xué)突飛猛進(jìn)地發(fā)展，借助于先進(jìn)的生物技術(shù)手段，才得以對(duì)蛇毒各組分的化學(xué)本質(zhì)進(jìn)行研究，并進(jìn)入以結(jié)構(gòu)與功能為主的分子水平。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，加之對(duì)天然物質(zhì)的重視，對(duì)蛇毒有效成分的研究已相當(dāng)深入，單一組分及其分子生物學(xué)性質(zhì)研究已開始進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的工作，單組分制劑在臨床上已使用多年并取得很確切的療效。全世界現(xiàn)有的蛇類大約有13科、400屬、2700多種，其中四分之一是毒蛇。我國(guó)蛇類資源十分豐富，大約有8科、53屬、219種(包括亞種)。其中毒蛇約50余種，但有劇毒而危害較大的不過(guò)10余種，即金環(huán)蛇、銀環(huán)蛇、眼鏡蛇、眼鏡王蛇、圓斑蝰蛇、草原蝰蛇、蝮蛇、尖吻蝮蛇、竹葉青、烙研究起步較晚，大約是在80年代初，國(guó)內(nèi)先后在廣西、福建、昆明、安徽等成立了研究室，從蝮科、眼鏡科、海蛇科等20多種毒蛇的蛇毒中分離、純化了多種成分。國(guó)內(nèi)現(xiàn)在也開展對(duì)蛇毒成分分子結(jié)構(gòu)與功能方面的研究，但研究規(guī)模與深度和國(guó)外相比，還有一定的差距。蛇毒中的主要成分是蛋白，多肽，及酶類等生物活性物質(zhì)，其本質(zhì)是由氨基酸所組成的蛋白質(zhì)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于蛇毒的研究，大多集中在其中某些具體活性組分，比如降纖酶，纖溶酶，以及一系列神經(jīng)毒性因子等等。而針對(duì)蛇毒整體進(jìn)行的指紋圖譜研究尚未見報(bào)道。90年代以來(lái)韋世秀等利用等速電泳技術(shù)對(duì)眼鏡蛇毒、蝮蛇毒和五步蛇毒進(jìn)行分析鑒別，并對(duì)蛇毒凍干粉與新鮮蛇毒液進(jìn)行對(duì)比研究；還對(duì)蛇毒摻偽品進(jìn)行了鑒定分析，結(jié)果表明不同蛇種、不同產(chǎn)地的蛇毒或蛇毒摻偽品，因其組分、含量各異，表現(xiàn)在等速電泳圖譜上的不一致；而同種蛇毒的凍干粉與新鮮毒液的電泳圖譜幾無(wú)差異。該研究表明應(yīng)用等速電泳技術(shù)對(duì)蛇毒進(jìn)行鑒別分析，將對(duì)蛇毒的質(zhì)量監(jiān)控發(fā)揮重要的作用。雖然該法是一種有效的分析方法，但由于儀器、試劑等方面的限制，在我國(guó)應(yīng)用并不普遍。曹金鴻等用交叉免疫電泳法對(duì)白眉蝮蛇毒、黑眉腹蛇毒、五步蛇毒、竹葉青蛇毒和烙鐵頭蛇毒的鑒別進(jìn)行了研究。由于各種蛇毒共有組分種類不同以及各組分相對(duì)含量的不同，電泳圖譜中沉淀線位置及峰相對(duì)高度比等各不相同，可用于區(qū)分不同的蛇毒。但該方法需要提前準(zhǔn)備相應(yīng)蛇毒的抗血清，具有相當(dāng)?shù)木窒扌?。倉(cāng)公敖等利用雙向免疫電泳法，結(jié)合相應(yīng)蛇毒抗血清，也完成一定的蛇毒鑒定工作。但是，由于以上電泳方法自身重復(fù)性不佳和分辨率低下，已經(jīng)不能適應(yīng)當(dāng)前蛇毒研究的需求。新的分析手段亟需被運(yùn)用到研究中來(lái)。指紋圖譜技術(shù)源于指紋鑒定學(xué)。常用于中藥研究，是一種綜合的、宏觀的和可量化的鑒別手段，用以對(duì)中藥材和中成藥進(jìn)行鑒別真?zhèn)?，評(píng)價(jià)原料藥材、半成品和成品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。其基本屬性是"整體性"和"模糊性"。"整體性"是指完整地比較色譜的特征"面貌"；"模糊性"強(qiáng)調(diào)的是對(duì)照品與待測(cè)樣品指紋圖譜的相似性。毛細(xì)管電泳作為一種日漸成熟的分離方式，具有用樣量少，環(huán)境友好，理論踏板數(shù)高，分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。常可與高效液相色譜(HPLC)互補(bǔ)，作為指紋圖譜的研究手段。目前國(guó)內(nèi)運(yùn)用毛細(xì)管電泳分離的對(duì)象大多局限于小分子，清華大學(xué)張宣等嘗試運(yùn)用微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜的方式針對(duì)蛋白質(zhì)的分離條件進(jìn)行過(guò)初步探討，但尚未見推廣運(yùn)用。為了尋找檢測(cè)分析蛇毒的有效手段，本發(fā)明擬以中藥指紋圖譜的思想為指導(dǎo)，以毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)的相關(guān)技術(shù)方法為基礎(chǔ)，建立蛇毒的指紋圖譜，為蛇毒的鑒別和內(nèi)在質(zhì)量的控制提供更為可靠的依據(jù)。并且為進(jìn)一步研究蛇毒中的其他未知成分提供參考。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有蛇毒檢測(cè)方法的不足而提供一種蛇毒指紋圖譜建立方法，其特點(diǎn)是將蛇毒凍干粉配制成一定濃度的水溶液后，在一定的條件下經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳儀的分離檢測(cè)，獲得蛇毒中各種成分的指紋圖譜。從而能夠?yàn)樯叨镜蔫b別和內(nèi)在質(zhì)量的控制提供可靠的依據(jù)。本發(fā)明的蛇毒指紋圖譜建立方法具體包括下列步驟1)供試品溶液的制備取蛇毒凍干粉，溶于蒸餾水后，混勻，離心，取上清液作為供試品溶液；2)對(duì)照品溶液的制備取纖溶酶對(duì)照品，溶于蒸餾水作為對(duì)照品溶液；3)制作蛇毒指紋圖譜分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，經(jīng)毛細(xì)管電泳儀分離檢測(cè)，其中電泳緩沖液的組成為正辛垸0.6%~1.0%，正丁醇4.5%~8.0%，SDS2.5%~5.0%，和硼砂溶液812mmol/L;然后以相對(duì)遷移時(shí)間和相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定其指紋特征，從而得到蛇毒標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。其中，樣品溶液按照如下步驟制備精密稱取蛇毒15mg，溶解于蒸餾水lml，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得樣品溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。對(duì)照品溶液按如下步驟制備精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；電泳條件為非涂層毛細(xì)管75pmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18°C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH，純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。電泳緩沖液的組成優(yōu)選為正辛烷0.64%,正丁醇4.62%，SDS3.5%，和硼砂溶液10mmol/L。該組成條件下江浙蝮蛇蛇毒分離效果最佳。江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜(CEFP，CapillaryElectrophoresisFingerPrint)的建立1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知9號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)為7666，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。2江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP測(cè)定將11個(gè)不同批次的江浙蝮蛇蛇毒溶解于蒸餾水溶液。在毛細(xì)管電泳儀上分析3次，記錄電泳圖。以相對(duì)遷移時(shí)間和相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定其指紋特征。通過(guò)對(duì)其CEFP比較研究，按電泳峰的共有率f-100X確定共有指紋峰為15個(gè)(見圖1)，f=mi/nX100%，mi為i指紋峰出現(xiàn)的樣品批數(shù)，n為總f比數(shù)。本發(fā)明還提供由上述蛇毒指紋圖譜的建立方法得到的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握，能從色譜的整體特征面貌上把握蛇毒的品種和質(zhì)量情況，可將其作為蛇毒質(zhì)量控制及真?zhèn)舞b別的指標(biāo)之一。圖1是實(shí)施例1條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖2是實(shí)施例2條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖3是實(shí)施例3條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖4是實(shí)施例4條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖5是實(shí)施例5條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖6是實(shí)施例6條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖7是實(shí)施例7條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖8是實(shí)施例8條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖9是實(shí)施例9條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖IO是實(shí)施例IO條件下得到的白眉蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜;圖11是實(shí)施例11條件下得到的五步蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖12是對(duì)比例1條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖13是對(duì)比例2條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜；圖14是對(duì)比例3條件下得到的江浙蝮蛇蛇毒毛細(xì)管電泳指紋圖譜。具體實(shí)施例方式實(shí)施例11供試品溶液和對(duì)照品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18'C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH，純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛烷0.64%，正丁醇4.62%，SDS3.5%，和硼砂溶液10mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知9號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)為7666，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，以遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見表1),江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP見圖1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例21供試品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18。C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH,純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛垸0.6%，正丁醇6.5%，SDS3.5%，和硼砂溶液10mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知9號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)為7308，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，以遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見表2)，江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP見圖2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>811.8397388.060.900.37913.09265271.571.001.001013.80211655.361.050.801116.59119036.851.270.451217.74274817.241.361.041322.4436511.551.710.141424.0563051.251.840.241524.62122556.811.880.46實(shí)施例31供試品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18°C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH,純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛烷1.0%，正丁醇6.5%，SDS3.5%，和硼砂溶液10mmol/;L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知9號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)為6927，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，以遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見表3)，江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP見圖3。17.4518044.160.530.0828.0310586.070.570.0538.1418599.160.570.0848.3347517.280.590.2158.80184081.640.620.82610.16193310.370.720.86712.39116554.730.870.52813.4155974.910.950.25914.17224690.691.001.001015.36133095.001.080.591118.5043785.971.310.191220.34173829.681.440.771324.8049574.591.750.221425.49116095.121.800.521530.8419000.412.180.08實(shí)施例41供試品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195rnn;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18°C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH，純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛垸0.8%，正丁醇4.5%，SDS3.5%，和硼砂溶液峰面積移間分w序峰號(hào)對(duì)面相峰口八對(duì)移間相遷時(shí)1Ommol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知9號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)為7395，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，以遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見表4)，江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP見圖4。表4峰序遷移峰面積相對(duì)相對(duì)號(hào)時(shí)間遷移峰面(分時(shí)間積鐘)16.035696.910.570.0226.1813817.540.580.0436.2311217.740.590.0446.3297172.350.600.3257.0989977.270.670.2968.4059704.180.790.1979.5338590.820.900.1389.64113398.950.910.37.910.61308213.881.001.001011.52191183.121.090.621113.3525306.211.260.081214.7190391.271.390.291317.3046024.511.630.151418.8679524.101.780.261520.05157654.961.890.51實(shí)施例51供試品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18°C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH，純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛垸0.8%,正丁醇8.0%，SDS3.5%，和硼砂溶液10mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知9號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)為8142，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，以遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見表5)，江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP見圖5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>1519.01103287.041.930.69實(shí)施例61供試品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18°C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH，純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛烷0.8%，正丁醇6.5%,SDS2.5%，和硼砂溶液10mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知9號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)為6260，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，以遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見表6)，江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP見圖6。表6_^ijSi~~峰面積K~~~ii~號(hào)時(shí)間遷移峰面(分時(shí)間積鐘)16.857588.740.550.0327.1011591.160.570.0537.6539377.930.610.1747.85172346.950.630.7357.97108143.270.640.4668.97185852.360.720.78710.6543611.900.850.18811.60129906.140.930.55912.47237425.421.001.001013.14144504.051.050.611115.2673662.011.220.311216.97180234.301.360.761320.8455696.731.670.231420.9152210.261.680.221521.54118488.861.730.50實(shí)施例71供試品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75ixmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18°C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LliC1,lmol/LNaOH,純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH,純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛垸0.8%,正丁醇6.5%,SDS5.0%，和硼砂溶液10mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知9號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)16照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)為7243，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，以遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見表7)，江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP見圖7。表7峰序遷移峰面積相對(duì)相對(duì)號(hào)時(shí)間遷移峰面(分時(shí)間積鐘)15.8511858.000.560.0525.9810901.600.570.0536.1331660.840.580.1346.3367770.620.600.2956.9883081.070.660.3568.2660646.550.790.2679.4384178.460.900.3689.8394691.620.940.40910.50236960.951.001.001011.23104745.701.070.441112.9839552.721.240.171214.14148570.641.350.631318.2779876.791.740.341418.8676371.161.800.321519.9164478.831.900.27實(shí)施例81供試品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18°C;進(jìn)樣方式0.5psi,5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH，純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛垸0.8%，正丁醇6.5%，SDS3.5%，和硼砂溶液8mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知9號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)為6982，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，以遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見表8)，江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP見圖8。表8峰序遷移峰面積相對(duì)相對(duì)號(hào)時(shí)間遷移峰面(分時(shí)間積鐘)16.261792.500.550.0026.615545.060.580.0336.7419637.320.590.1046.8584257.110.600.4357.7959245.740.680.3068.9641098.660.790.21710.1218122.680.890.09810.2537117.390.900.19911.40194993.091.001.001012.4684926.671.090.441113.9016471.531.220.081215.7185745.731.380.441320.6769019.951.810.351421.4353679.831.880,281522.7349124.641.990.25實(shí)施例91供試品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18°C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH,純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛烷0.8%，正丁醇6.5%，SDS3.5%，和硼砂溶液12mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知9號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)為7172，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，以遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見表9)，江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP見圖9。表9峰序遷移時(shí)峰面積相對(duì)遷移時(shí)相對(duì)峰面積號(hào)間(分鐘)間16.733247.550.500.0127.0512985.670.520.0337.7954679.000.580.1548.35468745.190.621.26510.38112358.370.770.30610.63169243.480.780.46712.0060915.630.890.16812.17128769.170.900.35913.55371584.091.001.001015,21366806.671.120.991116.63152455.821.230,411219.48272508.461.440.731323.8285384.131.760.231424.44149024.001.800.401525.5342029.331.880.11實(shí)施例101供試品溶液制備取11批白眉蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18°C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH,純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛垸0.64%，正丁醇4.62%，SDS3.5%，和硼砂溶液10mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和白眉蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知8號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)為8729，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。5白眉蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，以遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定白眉蝮蛇蛇毒CEFP(見表10)，白眉蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP見圖10。表10_遷移時(shí)峰面積相對(duì)遷相對(duì)~~號(hào)間(分移時(shí)間峰面鐘)積16.8410032.000.560.0227.0531616.000.580.0737.7139730.000.630.0948.7412145.000.710.0359.4824044.000.770.0569.9943824.000.820.10710.5139781.000.860,09812.24460417.001.001.00913.9566273.001.140.141020.0417055.001.640.041121.50145662.001.760.321222.59110493.001.850.241323,4064982.001.910.14實(shí)施例111供試品溶液制備取11批五步蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取降纖酶對(duì)照品10mg,溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmX35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18°C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH，純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛烷0.64%，正丁醇4.62%，SDS3.5%,和硼砂溶液10mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將降纖酶對(duì)照品溶液和五步蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知9號(hào)峰為降纖酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。測(cè)得降纖酶峰的理論踏板數(shù)為8497，且與相鄰峰分離良好，故選作參照物峰。16.71137171.000.500.5026.8733677.000.520.1237.0073315.000.530.2747.0845084.000.530.1759.5922520.000.720.08611.5525965.000.870.10711.7686235.000.880.32812.89107134.000.970.39913.30272556.001.001.001014.1661602.001.060.231114.6055919.001.100.211218.06520968.001.361.911321.30445229.001.601.631423.47237371.001.760.871525.3664207.001.910.24對(duì)比例11供試品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmx35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18°C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH,純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。5五步蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，以遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定五步蛇蛇毒CEFP(見表11)，五步蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP見圖11。表11—號(hào)峰面積移間分w對(duì)面相峰積對(duì)移間相遷時(shí)3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛烷0.45%，正丁醇3.5%，SDS1.5%,和硼砂溶液6mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知13號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。故選作參照物峰。但測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)僅為2577，與相鄰峰分離不佳。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，測(cè)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見附圖12)。由圖可見各峰分離程度大多不佳，無(wú)法精確測(cè)定各峰的遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積。故該條件不宜用于制定蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP。對(duì)比例21供試品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmx35cm，有效長(zhǎng)度40cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18'C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH,純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH,純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛垸1.2%，正丁醇8.5%，SDS5.5%，和硼砂溶液15mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知16號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。故選作參照物峰。但測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)僅為1569,與相鄰峰分離不佳。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，測(cè)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見附圖13)。由圖可見各峰分離程度大多不佳，無(wú)法精確測(cè)定各峰的遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積。故該條件不宜用于制定蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP。對(duì)比例31供試品溶液制備取11批江浙蝮蛇蛇毒各15mg混勻，溶解于蒸餾水10ml中，超聲震蕩混勻后，高速離心(10000rpm，10min)，取上清液，即得供試品溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml作為對(duì)照品溶液；2電泳條件非涂層毛細(xì)管75pmx35cm，有效長(zhǎng)度25cm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;運(yùn)行電壓15kV;毛細(xì)管溫度25°C;進(jìn)樣方式0.5psi，5s。使用新毛細(xì)管柱前依次使用甲醇，lmol/LHCl，lmol/LNaOH，純凈水沖洗毛細(xì)管柱各10min。每天實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后分別依次用0.1mol/LNaOH和純凈水沖洗毛細(xì)管柱10min。每次運(yùn)行樣品前依次用0.1mol/LNaOH，純凈水，運(yùn)行緩沖液，在20psi下沖洗7min。3電泳緩沖液選擇緩沖液組成正辛垸1.2%，正丁醇8.5%,SDS1.5%，和硼砂溶液6mmol/L。4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和參照物的定性將纖溶酶對(duì)照品溶液和江浙蝮蛇蛇毒供試液在毛細(xì)管電泳儀上壓力進(jìn)樣5s。對(duì)比遷移時(shí)間可知11號(hào)峰為纖溶酶。在蛇毒樣品供試液中加入對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，電泳峰增益結(jié)果證明上述結(jié)論正確。故選作參照物峰。但測(cè)得纖溶酶峰的理論踏板數(shù)僅為2774，與相鄰峰分離不佳。5江浙蝮蛇蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP制作將供試品溶液進(jìn)樣分析3次，測(cè)定江浙蝮蛇蛇毒CEFP(見附圖14)。由圖可見各峰分離程度大多不佳，無(wú)法精確測(cè)定各峰的遷移時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間、峰面積、相對(duì)峰面積。故該條件不宜用于制定蛇毒標(biāo)準(zhǔn)CEFP。權(quán)利要求1.蛇毒指紋圖譜的建立方法，其特征在于將蛇毒凍干粉配制成水溶液后，經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳儀的分離檢測(cè)，獲得蛇毒中各種成分的指紋圖譜。2.如權(quán)利要求1所述的蛇毒指紋圖譜的建立方法，其特征在于它包括如下步驟1)供試品溶液的制備取蛇毒凍干粉，溶于蒸餾水后，混勻，離心，取上清液作為供試品溶液；2)對(duì)照品溶液的制備取纖溶酶對(duì)照品，溶于蒸餾水作為對(duì)照品溶液；3)制作蛇毒指紋圖譜分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，經(jīng)毛細(xì)管電泳儀分離檢測(cè)，其中電泳緩沖液的組成為正辛烷0.6%~1.0%，正丁醇4.5%~8.0%，SDS2.5%~5.0%，和硼砂溶液812mmol/L;然后以相對(duì)遷移時(shí)間和相對(duì)峰面積平均值標(biāo)定其指紋特征，從而得到蛇毒標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。3.如權(quán)利要求2所述的蛇毒指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述毛細(xì)管電泳儀分離檢測(cè)的條件為紫外檢測(cè)波長(zhǎng)195nm;運(yùn)行電壓10kV;毛細(xì)管溫度18'C。4.如權(quán)利要求2所述的蛇毒指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述供試品溶液按如下步驟制備精密稱取各種蛇毒各15mg，溶解于蒸餾水lml，超聲震蕩混勻后，以10000rpm的速度高速離心10min，取上清液。5.如權(quán)利要求2所述的蛇毒指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述對(duì)照品溶液按如下步驟制備精密稱取纖溶酶對(duì)照品10mg，溶于蒸餾水lml中。6.如權(quán)利要求2所述的蛇毒指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述供試品溶液和對(duì)照品溶液各進(jìn)樣5s。7.如權(quán)利要求2所述的蛇毒指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述電泳緩沖液的組成為正辛垸0.64%，正丁醇4.62%，SDS3.5%,和硼砂溶液10mmol/L。8.由權(quán)利要求1至7所述的蛇毒指紋圖譜的建立方法得到的指紋圖譜，其特征在于將蛇毒凍干粉配制成水溶液后，經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳儀的分離檢測(cè)，獲得蛇毒中各種成分的指紋圖譜,全文摘要本發(fā)明提供一種蛇毒指紋圖譜的建立方法，其特點(diǎn)在于將蛇毒凍干粉配制成一定濃度的水溶液后，在一定的條件下經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳儀的分離檢測(cè)，獲得蛇毒中各種成分的指紋圖譜。本發(fā)明也提供由該方法得到的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，該圖譜能夠?yàn)樯叨镜蔫b別和內(nèi)在質(zhì)量的控制提供可靠的依據(jù)。文檔編號(hào)G01N33/00GK101539555SQ20081003480公開日2009年9月23日申請(qǐng)日期2008年3月18日優(yōu)先權(quán)日2008年3月18日發(fā)明者軍馮,恒蘇,趙文杰,魏曉東申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院