專利名稱：時(shí)間分辨熒光免疫分析中檢測(cè)洗滌殘留干擾的一種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種對(duì)時(shí)間分辨熒光免疫分析中洗滌殘留干擾進(jìn)行檢測(cè)的方 法，具體內(nèi)容是采用在銪標(biāo)試劑中添加釤離子為對(duì)照物判斷是否有洗滌殘留干擾的方法，屬于時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域超微量檢測(cè)中一項(xiàng)新興的檢測(cè) 技術(shù)，是利用免疫反應(yīng)的高度特異性和標(biāo)記示蹤物的高度靈敏性相結(jié)合而建立 的一類微量物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。TRFIA法的原理為用三價(jià)稀土離子(最常用的是銪 離子)標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽、抗體、激素等，當(dāng)體系反應(yīng)發(fā)生后，用時(shí)間分辨熒 光儀，測(cè)定最后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度或相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，來(lái)判斷 反應(yīng)體系被分析物的濃度，達(dá)到定量分析之目的。在DELFIA的免疫分析中， 增強(qiáng)液具有非常重要的作用，結(jié)合于免疫復(fù)合物上的稀土離子熒光信號(hào)非常微 弱，增強(qiáng)液可使免疫復(fù)合物上的稀土離子解離下來(lái)，熒光信號(hào)可放大100萬(wàn)倍 以上，起到放大熒光效果的作用。在TRFIA免疫分析中，由于增強(qiáng)液的強(qiáng)烈增強(qiáng)效果， 一方面提高了檢測(cè)的 靈敏度，同時(shí)也容易放大誤差，所以在洗滌時(shí)，有可能會(huì)殘留未結(jié)合的稀土離 子，如果大于0.1%，就會(huì)明顯造成結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。由于銪離子和釤 離子在溶液中是同時(shí)均勻分布的，銪離子的殘留比例與釤離子相同，由于銪離 子和釤離子的發(fā)射光的波長(zhǎng)不同，銪離子最大激發(fā)波長(zhǎng)340nm，最大發(fā)射波長(zhǎng) 613nm，釤離子的最大激發(fā)波長(zhǎng)340nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)600nm，因此釤離子對(duì)銪 離子沒(méi)有干擾，用時(shí)間分辨熒光儀(DELFIA1235、 DELFIA1420等)進(jìn)行銪離 子和釤離子的雙波長(zhǎng)檢測(cè)，所以釤離子可作為在銪標(biāo)記的TRFIA試劑反應(yīng)中洗 滌殘留的示蹤劑。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的，旨在找到一種靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，對(duì)分析過(guò)程不造成影 響的方法，對(duì)銪標(biāo)記的TRFIA中的洗滌殘留干擾進(jìn)行檢測(cè)，從而避免一些由于 操作誤差造成的分析結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案 一種在常用的銪離子標(biāo)記的時(shí)間分 辨熒光免疫分析法TRFIA中檢測(cè)洗滌殘留的方法，它采用如下工作步驟(1)在銪離子標(biāo)記的TRFIA試劑中的標(biāo)記物中添加2-6萬(wàn)cps/pL的釤離 子，添加無(wú)生物活性的釤離子僅用于示蹤洗滌殘留的量；當(dāng)用反應(yīng)緩沖液稀釋銪離子標(biāo)記物時(shí)，同時(shí)稀釋釤離子，釤離子的最終熒光強(qiáng)度計(jì)數(shù)控制在100000-200000 cps /孔；(2) 在微孔板上進(jìn)行的TRFIA分析過(guò)程中當(dāng)含有釤離子的銪標(biāo)試劑與微孔 板上的物質(zhì)反應(yīng)完畢之后，用洗液洗板6次，通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的銪標(biāo)記物， 同時(shí)也洗滌去除釤離子；(3) 洗滌結(jié)束后加增強(qiáng)液，5分鐘后檢測(cè)，用進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)量的時(shí)間分辨 熒光儀分別測(cè)定每一孔的銪離子和釤離子的熒光強(qiáng)度cps，計(jì)算釤離子的殘留量， 判斷殘留中銪離子是否超標(biāo)；計(jì)算釤離子的殘留比例實(shí)測(cè)值/理論值x100。/。， 如果大于0.1%，則判定有洗滌殘留的干擾，該孔結(jié)果不可信。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明方法是一種靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，對(duì)分析過(guò)程 不造成影響的方法，對(duì)銪標(biāo)記的TRFIA中的洗滌殘留干擾進(jìn)行檢測(cè)，從而避免 一些由于操作誤差造成的分析結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)測(cè)定時(shí)的洗滌殘留干擾的檢測(cè)，該方法包括如下工作步驟1、釤離子的添加在銪標(biāo)CEA單抗的溶液中，加入一定量的釤離子，使 釤離子濃度達(dá)到5萬(wàn)cps/VL。2、銪標(biāo)抗體的反應(yīng)取CEA單抗包被板12孔，每孔加入25pL的標(biāo)準(zhǔn)或樣品， 再加入20(HiL緩沖液(含8mmol/LNaCl、 0.1%BSA、 5Onmol/L DTPA、 O.lml/L Tween-80和0.1。/。NaN3的50mmol/LTris-HClpH7.8) ， 25。C振蕩孵育3小時(shí)， 洗滌2次(洗滌液為14.5mmol/L NaCl、 0.2mL/L Tween-80和0.2% NaN3的 50mmol/LpH7.8的Tris-HCl緩沖液，下同)，再加入用緩沖液1 : IOO稀釋的含 有釤離子的銪標(biāo)CEA單抗溶液200pL， 25"C振蕩孵育1小時(shí)，洗滌6次，去除 孔內(nèi)多余的液體。每孔加入增強(qiáng)液(1升pH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液含15pmo1 卩-萘甲酰三氟丙酮(P-NTA) ， 50nmo1三正辛基氧化膦(TOPO)和lmL曲拉通 X-100) 200nL， 25'C振蕩孵育5分鐘后進(jìn)行熒光檢測(cè)用DELFIA1235時(shí)間分 辨熒光儀測(cè)定每一孔的銪離子和釤離子的熒光強(qiáng)度cps，銪離子的熒光強(qiáng)度cps 用于CEA含量的檢測(cè)，釤離子的熒光強(qiáng)度cps用于計(jì)算釤離子的殘留比例實(shí) 測(cè)值/理論值xlOOQ/。(表l)，如果大于0.1%，則判定有洗滌殘留的干擾，該孔結(jié) 果不可信。表1:CEA測(cè)定時(shí)釤離子的殘留判定釤離子實(shí)測(cè)值cps50827432618147203921256572釤離子理論值cps100000/孔釤離子殘留比例％0. 050.080. 070. 030. 060. 080. 050. 200.090. 130. 070. 07是否有洗滌殘留的干擾無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)有無(wú)有無(wú)無(wú)4實(shí)施例2:甲胎蛋白(AFP)測(cè)定時(shí)的洗滌殘留干擾的檢測(cè)，該方法包括如下工作步驟1、 釤離子的添加在銪標(biāo)AFP單抗的溶液中，加入一定量的釤離子，使釤 離子濃度達(dá)到3.75萬(wàn)cps/pL。2、 銪標(biāo)抗體的反應(yīng)取AFP單抗包被板12孔，每孔加入25nL的標(biāo)準(zhǔn)或 樣品，再加入用緩沖液(緩沖液組成同實(shí)施例1) 1 : 75稀釋的含有釤離子的銪 標(biāo)AFP單抗溶液200^L， 25'C振蕩孵育1小時(shí)，洗漆6次，去除孔內(nèi)多余的液 體。每孔加入增強(qiáng)液(增強(qiáng)液組成同實(shí)施例l) 20(HiL， 25t:振蕩孵育5分鐘后 進(jìn)行熒光檢測(cè)用DELFIA1420時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定每一孔的銪離子和釤離子 的熒光強(qiáng)度cps，銪離子的熒光強(qiáng)度cps用于CEA含量的檢測(cè)，釤離子的熒光強(qiáng) 度cps用于計(jì)算釤離子的殘留比例實(shí)測(cè)值/理論值><100%(表2)，如果大于0.1%, 則判定有洗滌殘留的干擾，該孔結(jié)果不可信。表2:AFP測(cè)定時(shí)釤離子的殘留判定釤離子實(shí)測(cè)值cps80272645251614753926355172釤離子理論值cps100000/孔釤離子殘留比例％0.80.080. 060. 050. 050. 060. 050. 050. 090. 060. 060. 17是否有洗滌殘留的干擾有無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)有權(quán)利要求
1、一種在常用的銪離子標(biāo)記的時(shí)間分辨熒光免疫分析法TRFIA中檢測(cè)洗滌殘留的方法，其特征在于，它采用如下工作步驟(1)在銪離子標(biāo)記的TRFIA試劑中的標(biāo)記物中添加2-6萬(wàn)cps/μL的釤離子，添加無(wú)生物活性的釤離子僅用于示蹤洗滌殘留的量；當(dāng)用反應(yīng)緩沖液稀釋銪離子標(biāo)記物時(shí)，同時(shí)稀釋釤離子，釤離子的最終熒光強(qiáng)度計(jì)數(shù)控制在100000-200000cps/孔；(2)在微孔板上進(jìn)行的TRFIA分析過(guò)程中當(dāng)含有釤離子的銪標(biāo)試劑與微孔板上的物質(zhì)反應(yīng)完畢之后，用洗液洗板6次，通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的銪標(biāo)記物，同時(shí)也洗滌去除釤離子；(3)洗滌結(jié)束后加增強(qiáng)液，5分鐘后檢測(cè)，用進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)量的時(shí)間分辨熒光儀分別測(cè)定每一孔的銪離子和釤離子的熒光強(qiáng)度cps，計(jì)算釤離子的殘留量，判斷殘留中銪離子是否超標(biāo)；計(jì)算釤離子的殘留比例實(shí)測(cè)值/理論值×100％，如果大于0.1％，則判定有洗滌殘留的干擾。
全文摘要
時(shí)間分辨熒光免疫分析中檢測(cè)洗滌殘留干擾的一種方法，屬于時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法采用如下工作步驟1.在銪離子標(biāo)記的TRFIA試劑中的標(biāo)記物中添加一定量的釤離子；2.在微孔板上進(jìn)行的TRFIA分析過(guò)程中通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的銪標(biāo)記物，同時(shí)也清洗釤離子；3.洗滌結(jié)束后加增強(qiáng)液，5分鐘后檢測(cè)，用可進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)量的時(shí)間分辨熒光儀(DELFIA1235、DELFIA1420等型號(hào)儀器)分別測(cè)定每一孔的銪離子和釤離子的熒光強(qiáng)度cps，計(jì)算釤離子的殘留量，如果大于設(shè)定的殘留比例，則判定有洗滌殘留的干擾。本方法可有效的發(fā)現(xiàn)TRFIA中由于洗滌殘留造成的干擾，避免一些由于操作失誤造成的假陽(yáng)性或假陰性。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101324574SQ200810022619
公開(kāi)日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2008年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日
發(fā)明者彬 周, 玨 張, 藝 張, 嵐 朱, 柯 王, 馬智鴻, 飚 黃 申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所