專利名稱：重金屬鎘多克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫吸附測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重金屬鎘多克隆抗體的制備以及基于抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定方法(ELISA)。
技術(shù)背景由重金屬造成的污染稱為重金屬污染，目前對環(huán)境污染最嚴重的重金屬為 鉛、鎘、汞、鉻和砷，簡稱為"五毒"。重金屬進入人體后，不易排泄，逐漸蓄積， 當超過人體的生理負荷時，就會引起生理功能改變，導(dǎo)致急、慢性疾病或產(chǎn)生遠 期危害。近年來隨著我國經(jīng)濟的迅猛發(fā)展，越來越多的環(huán)境突發(fā)事故頻繁發(fā)生， 其中主要的一類污染物即為重金屬污染物，尤其是食物中毒、飲水中毒、水體突 發(fā)污染事故等。因此，建立快速便捷的重金屬檢測方法，對重金屬污染進行長期 監(jiān)測，對控制污染，保護環(huán)境和人類生命安全與健康具有十分重要的意義。當前，國際上對重金屬檢測的發(fā)展方向是靈敏、準確、實時、快速、選擇性 好和適用范圍廣等。而傳統(tǒng)的重金屬檢測技術(shù)大多需要大型或?qū)ｉT儀器(原子吸 收光譜法、原子發(fā)射光譜法等)才能完成，且前處理過程復(fù)雜，耗時較多，分析 工作只能在室內(nèi)進行，難以滿足高通量快速和在線檢測的需要。免疫學檢測方法 是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合作用來選擇性識別和測定可以作為抗體或抗原 的待測物。它是免疫學長期發(fā)展的一個重要分支，具有檢測速度快、費用低廉、 儀器簡單易攜、靈敏度高和選擇性強等優(yōu)點。己廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學、生命科學 以及環(huán)境中有機有毒物質(zhì)的檢測。同時，也為重金屬的檢測提供了新的思路，對 傳統(tǒng)的重金屬檢測方法進行了有效的補充。自從1985年Reardan等人在Nature上發(fā)表文章，首次通過金屬-螯合劑制備 單克隆抗體以來，國外對于重金屬免疫學檢測方法的研究越來越多，至目前為止， Cd2+、 Co2+、 U6+、 Pb2+、 Cu2+、 Hg2+、 Zn2+和ln3+金屬-螯合劑復(fù)合物抗體被研 制出來，并建立了相應(yīng)的酶聯(lián)免疫檢測方法。專利CN1769893公開了一種重金 屬Pb"完全抗原的制備方法，朱曉霞等制備了鎘，鉛的單克隆抗體，并建立了相 應(yīng)的酶聯(lián)免疫檢測方法。上述方法均是基于重金屬單克隆抗體進行的研究。目前，對重金屬免疫檢測的研究大多集中在單克隆抗體及相應(yīng)酶聯(lián)免疫檢測方法方面， 對多克隆抗體研究相對較少。單克隆抗體的制備相對多克隆抗體而言制備成本 高，周期更長，風險大。雖然在特異性方面較多克隆抗體稍高，但就建立的檢測 方法來說，多克隆抗體亦能達到檢測的要求，且方法的檢測限與靈敏度與基于單 克隆抗體的檢測方法接近。文獻檢索表明，國外只有David K. Johnson在1999年以四乙二胺五乙酸酸酐 為螯合劑制備了鎘多克隆抗體，采用熒光偏振免疫法對鎘進行檢測(Johnson, D.K., A fluorescence polarization immunoassay for cadmium(ll). Analytics ChimicaActa, 1999. 399: p. 161-172)。發(fā)明內(nèi)容1. 發(fā)明要解決的技術(shù)問題針對現(xiàn)有的重金屬鎘免疫學檢測方法存在的問題，本發(fā)明提供了重金屬鎘多 克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫吸附測定方法，制備一種重金屬鎘的多克隆抗體，并 通過抗體抗原反應(yīng)，建立一種用于重金屬鎘檢測的酶聯(lián)免疫吸附測定方法，用于 環(huán)境水樣的快速檢測。2. 技術(shù)方案本發(fā)明的原理制備重金屬鎘的多克隆抗體，并建立了一種間接競爭酶聯(lián)免 疫吸附測定方法(CI-ELISA)。重金屬的免疫學檢測方法的關(guān)鍵在于抗重金屬抗 體的制備，包括多克隆抗體和單克隆抗體，而抗體制備的關(guān)鍵又在于重金屬免疫 原的制備。重金屬鎘多克隆抗體制備與間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定方法的基本原 理是通過選擇性雙功能螯合劑的一端與重金屬螯合生成重金屬-螯合劑復(fù)合物，作為半抗原，半抗原再通過螯合劑的另一端與載體蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、 卵清白蛋白(OVA)等偶聯(lián)后形成重金屬-螯合劑-蛋白完全抗原(免疫原和包被 原)。以免疫原免疫新西蘭大白兔，獲得多克隆抗體。CI-ELISA的基礎(chǔ)是抗原的 固相化及抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原仍保持其免疫學活性，酶標 記的抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，可溶性抗原包被酶 標板，加入系列濃度的待測物的標準溶液與抗體等體積混合孵育后的混合溶液， 混合溶液中的待測抗原與固相載體表面的抗原競爭抗體表面的結(jié)合位點。再加入酶標記的抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與混合溶液 中待測物標準溶液的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為 有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與混合溶液中待測物標準溶液的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色 的深淺進行定性或定量分析。抗原制備反應(yīng)方程式為本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下 重金屬鎘多克隆抗體的制備方法，其步驟包括(A) 完全抗原的合成，完全抗原的合成是多克隆抗體制備的關(guān)鍵，以1-(4-異硫氰基苯甲基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)作為雙功能螯合劑，采用異硫氰酯法 和重金屬與載體蛋白偶聯(lián)，獲得完全抗原，包括免疫原Cd-ITCBE-BSA和包被 原Cd-ITCBE-OVA;(B) 抗體的制備，以免疫原Cd-ITCBE-BSA，選取三只1.5-2.0kg的純種雄性新西蘭大白兔作為試驗動物，試驗前一周采集陰性血清，常規(guī)免疫方法對大 白兔進行免疫，免疫約3個月后心臟采血，制備血清，用間接非競爭ELISA法 測定抗體效價，間接競爭ELISA法鑒定其對金屬鎘的特異性，血清添加終濃度 為0.01%的硫柳滎，分裝后于一20'C凍存，即得到重金屬鎘的多克隆抗體。步驟(A)中采用紫外吸收法對完全抗原進行全波掃描，以確定抗原是否合 成功。對完全抗原中蛋白含量與重金屬鎘的含量進行測定，分別采用考馬斯靚藍 法和火焰原子吸收分光光度法。酶聯(lián)免疫吸附測定方法，其步驟包括(1) 采用方陣滴定法確定包被原Cd-ITCBE-OVA與抗體最佳反應(yīng)濃度，以 最佳濃度的包被原Cd-ITCBE-OVA包被96孔酶標板；(2) 用含EDTA的PBS溶液配制鎘標準溶液，與等體積的1/2最佳工作濃 度的抗體混合，作為反應(yīng)液加入酶標板中進行間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定試驗；(3) 考察螯合劑EDTA及其濃度、鹽離子強度、pH值、封閉液和預(yù)混時間對CI-ELISA的影響，優(yōu)化反應(yīng)條件；(4)在已優(yōu)化的反應(yīng)條件下，建立CI-ELISA，繪制標準抑制曲線。對方法的檢測限，檢測范圍，精密度和準確度、與其他金屬如Pl)S+、 Ni2+、 Mg2+、 Ca2+、 Cu2+、 Mn2+、 Zn2+、 Co2+、 Cr3+、 Hg"和Fe3+的交叉反應(yīng)率等進 行分析；以建立的方法對自來水、長江水進行加標回收實驗。3.有益效果本發(fā)明提供了重金屬鎘多克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫吸附測定方法，在制備 了重金屬鎘多克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立了測定環(huán)境水樣中鎘含量的間接競爭酶聯(lián) 免疫吸附測定方法。本發(fā)明的檢測限為0.04|jg/L，線性范圍為1(T1~103|jg/L， 對鎘具有特異性，與Pb2+、 Ni2+、 Mg2+、 Ca2+、 Cu2+、 Mn2+、 Zn2+、 Co2+、 Cr3+、 和Fe"的交叉反應(yīng)率低于1%，與Hg"交叉反應(yīng)率為7.4%;加標回收率在 85.5%~116.3%之間。本方法適合環(huán)境水樣中痕量鎘的測定。同時為重金屬污染 突發(fā)事故的現(xiàn)場快速檢測提供技術(shù)支持，便于及時對污染事故進行補救和恢復(fù)工 作，且可以發(fā)展成為環(huán)境中其他樣品和農(nóng)產(chǎn)品食品安全檢測的重要檢測手段，具 有重大的現(xiàn)實意義。
具體實施方式
以下通過實例進一步說明本發(fā)明。實施例1抗體的制備步驟1:完全抗原的合成稱取10mg ITCBE溶于10mL pH 9.5的磷酸鈉緩沖溶液中形成2.275 mM 的金屬螯合劑溶液。稱取40 mg BSA蛋白溶于pH 7.4 PBS( 137mM NaCI, 3mM KCI， 8mM Na2HP04, 1mM KH2P04)緩沖溶液中形成40 mg/mL的蛋白溶液。 鎘(99.999%)溶于熱的硝酸中，稀釋成4.7mM的使用液。取2.5 mL ITCBE與1.5 mL4.7mM鎘使用液反應(yīng)，得到CcMTCBE復(fù)合物。 復(fù)合物逐滴滴加至1 mL40 mg/mL BSA蛋白溶液中。反應(yīng)液在緩慢攪拌下室溫 反應(yīng)24小時后裝入EDTA預(yù)處理過的透析袋中，PBS緩沖液透析三次，純水透 析二次，4X:下透析三天，以去除未反應(yīng)的Cd， ITCBE以及Cd-ITCBE復(fù)合物。準確量取透析液，透析液即為免疫原Cd-ITCBE-BSA，低溫下保存。相同方法 制備包被原Cd-ITCBE-OVA。紫外分光光度計檢測結(jié)合物中蛋白的含量。原子吸收法測定其中鎘含量。紫 外分光光度計掃描透析液，對偶聯(lián)物進行分析鑒定。結(jié)果表明成功合成了完全抗原。紫外分光光度計檢測結(jié)合物中蛋白的含量。取0.5mL抗原于比色管中，加 入3.5mL的蒸餾水。采用標準曲線法進行測定。樣品的。原子吸收光度法測抗 原中Cd離子含量。免疫原Cd-ITCBE-BSA中蛋白濃度濃度為7.024 mg/mL, 鎘濃度為62.49 ppm;包被原Cd-ITCBE-OVA中蛋白濃度濃度為5.27 mg/mL， 鎘濃度為8.866 ppm。步驟2:抗體的制備與鑒定Cd-ITCBE-BSA作為免疫原，選取三只1.5-2.0 kg的純種雄性新西蘭大白兔 作為試驗動物，試驗前一周采集陰性血清。具體免疫程序如下首免采用每只1 mg免疫原與等體積弗氏完全佐劑混和，乳化成油包水結(jié)構(gòu)后進行背部皮下多點 注射(20點左右)。三周后用同樣劑量的免疫原與等體積不完全弗氏佐劑進行加 強。此后每隔兩周加強一次，加強后一周耳緣靜脈采血測效價。最后一次用等體 積的生理鹽水稀釋免疫原，直接耳緣靜脈注射。8天后心臟采血，制備血清，添 加重量百分比濃度為0.01 %的硫柳汞，分裝后于一20 'c凍存。通過間接elisa(i-elisa)法測抗體效價，以此確定是否有針對金屬離子的抗 體生成。比較三只大白兔的效價，最后選擇抗體效價較高的白兔血清用于建立 ci-elisa檢測方法。間接非競爭ELISA(I-ELISA)法操作步驟(1)包被，100jjL/孔，4'c過夜，洗滌3次，拍干；(2)封閉，200 pL/ 孔，37'c孵育1 h，洗滌3次，拍干；(3)加入抗血清(分別稀釋成4000、 8000、 12000、 20000、 30000、 40000倍)100 ijL/孔，37。c孵育2h,洗滌3次，拍 干；(4)加入羊抗兔酶標二抗(1: 10000稀釋)37'c孵育1h,洗滌3次，拍干； (5)加顯色液37。c作用15min。 (6) 50pL/孔濃度為2M的硫酸溶液終止顯色 反應(yīng)；(7)酶標儀測OD450值，以空白對照調(diào)零，以陰性血清作為對照，以待 測孔OD450值大于或等于陰性孔的2.1倍定為陽性。經(jīng)測定后，抗體效價達到了 1:128x104，能進行酶聯(lián)免疫吸附測定實驗。 實施例2:酶聯(lián)免疫吸附測定方法步驟一效價的測定采用方陣滴定法來確定抗原抗體最佳工作濃度包被抗原(Cd-ITCBE-OVA) 系列稀釋為1500倍、2500倍、5000倍、10000倍包被酶標板的AB， CD， EF， GH行；用1%0VA作為封閉液；抗血清分別稀釋為20000倍、40000倍、80000 倍、160000、 320000倍和640000倍，加入酶標板的1 2， 3 4， 5 6， 7 8, 910， 11 12列；加羊抗兔-辣根過氧化物酶酶標二抗(1: 10000， 1。/。0VA稀釋)；TMB 顯色，2M硫酸終止，測OD450值。以O(shè)D450值為0.8~1.2的抗原抗體濃度作 為最佳工作濃度。最后確定最佳包被原Cd-ITCBE-OVA與抗體濃度分別為1.05 |jg/mL和1:30x104。步驟二 ELISA方法的建立在包被原與抗體的最佳工作濃度條件下，用間接競爭ELISA法(CI-ELISA) 建立抗體對重金屬鎘的檢測方法。用1.0mMEDTA的PBS溶液配制濃度為0.00， 0.10， 1.00， 10.00, 100,00， 1000.00pg/mL的鎘標準溶液，與抗體混合過夜 進行前抑制。繪制標準抑制曲線，并計算敏感度(IC50)及最低檢測限(IC20)。間接競爭ELISA法的步驟如下(1) 抗體與標樣(待測樣)預(yù)混用PBS稀釋抗體到兩倍工作濃度(如工 作濃度1:10000，應(yīng)稀釋為1:5000)后與等體積標樣(待測樣品)室溫預(yù)混。(2) 包被CBS包被緩沖液將包被原稀釋到工作濃度，分別加入96孔酶 標板的ab、 cd、 ef、 gh八行，100ijL/孔，4。c過夜。(3) 封閉每孔加封閉液200ML, 37'c溫浴1h。(4) 加樣品將預(yù)混液體加入酶標板，100ijL/孔，于37X:溫浴2h。(5) 加酶標二抗用封閉液將酶標二抗稀釋到工作濃度，100jjL/孔加入醇 標板，37。c溫浴1h。(以上每一步結(jié)束都用洗滌液洗3次)(6) 顯色底物溶液100ML/孔加到酶標板，顯色15min。(7)終止反應(yīng)50pL/孔2M H2S04快速加到酶標板，450nm下讀取吸光值。步驟三條件優(yōu)化改變金屬標液稀釋緩沖液中EDTA濃度，使反應(yīng)體系中EDTA濃度分別為 0.1mM， 0.5mM， 1.0mM， 5.0Mm， 20mM， 20.0mM， 50.0mM，比較不同EDTA 濃度對陽性血清的抑制作用。競爭ELISA反應(yīng)中，在抗原抗體最佳工作濃度的條件下，改變基質(zhì)中鹽離 子強度，使反應(yīng)體系中NaCI的濃度依次為0M、 0.05M、 0.15M、 0.5M、 1.0M 比較不同離子強度對ELISA檢測曲線的影響。封閉液的作用是消除非特異性吸附。競爭ELISA反應(yīng)中，在抗原抗體最佳 工作濃度及最適鹽離子強度的條件下，本發(fā)明分別采用了 1%明膠、1%0VA、 及3%脫脂奶粉作為封閉液(200yL/孔)，比較其對檢測曲線的影響。競爭ELISA反應(yīng)中，在抗原抗體最佳工作濃度、最適鹽離子強度及最佳封 閉物封閉的條件下，通過改變反應(yīng)基質(zhì)中的pH值來反映對競爭ELISA結(jié)果的 影響。反應(yīng)體系中pH值分別取5.7、 6.5、 7.4、 8.5，比較不同pH值對ELISA 檢測曲線的影響。在間接競爭ELISA反應(yīng)中，設(shè)定金屬標液與陽性血清的預(yù)混時間為室溫過 夜和室溫1小時，比較其對抑制曲線的影響。 步驟四方法評價通過對對間接競爭ELISA方法最佳條件的確定，本發(fā)明以1: 5000 (蛋白 濃度為1.05叩/mL)的包被原包被96孔酶標板，以1%明膠作為封閉液?？贵w 濃度為1: 300000?？乖贵w反應(yīng)體系中螯合劑EDTA濃度選擇為1.0mM， pH 值為7.4，離子強度為0.15M NaCI?？贵w與標液的預(yù)混時間為1小時。作為最 佳反應(yīng)條件。在最佳工作條件下，得到了抑制曲線，抑制中濃度IC50為33.0ppb， IC20為2,7ppb， R2為0.9976。以Logit (B/BO)為縱坐標(Y)，才。(12+濃度 (ppb)的負對數(shù)值為橫坐標(X)，做標準曲線。Cd"在0.1ppb-1000ppb范圍 內(nèi)，Logit (B/BO)與CcP濃度(ppb)的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，得到回歸 方程Y = 0.6834X + 0.4107，相關(guān)系數(shù)達0.998。在以上最佳反應(yīng)條件下，進行方法特異性實驗。配制其他金屬如Pb2+、 Ni2+、Mg2+、 Ca2+、 Cu2+、 Mn2+、 Zn2+、 Co2+、 Cr3+、 Hg2+和Fe3+的標準溶液，實驗 操作同步驟二。與Pb"、 Ni2+、 Mg2+、 Ca2+、 Cu2+、 Mn2+、 Zn2+、 Co2+、 Cp+、 Fe"的交叉反應(yīng)率低于1%，與Hg^交叉反應(yīng)率為7.4%?？贵w對金屬鎘具有很有 的特異性。取自來水和長江水進行加標回收率實驗，根據(jù)步驟三中確定的最佳條件下進 行試驗，操作過程同步驟二。自來水和長江水的加標回收率分別為103.5% 116.3%和85.5% 112.5%。
權(quán)利要求
1.一種重金屬鎘多克隆抗體的制備方法，其包括以下步驟(A)抗原的合成，以1-(4-異硫氰基苯甲基)-乙二胺四乙酸作為雙功能螯合劑，采用異硫氰酯法和重金屬鎘與載體蛋白偶聯(lián)，獲得完全抗原，包括免疫原Cd-ITCBE-BSA和包被原Cd-ITCBE-OVA；(B)抗體的制備與鑒定，以免疫原Cd-ITCBE-BSA，選取三只1.5-2.0kg的純種雄性新西蘭大白兔作為試驗動物，試驗前一周采集陰性血清，常規(guī)免疫方法對大白兔進行免疫，免疫3個月后心臟采血，制備血清，用間接非競爭ELISA法測定抗體效價，間接競爭ELISA法鑒定其對金屬鎘的特異性，血清添加濃度為0.01％的硫柳汞，分裝后于-20℃凍存，即得到重金屬鎘的多克隆抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重金屬鎘多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的 步驟(A)抗原的合成中采用紫外吸收法對完全抗原進行全波掃描，以確定 抗原是否合成功。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重金屬鎘多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的 步驟(A)抗原的合成中分別采用考馬斯靚藍法和火焰原子吸收分光光度法 對完全抗原中蛋白含量與重金屬鎘的含量進行測定。
4. 一種酶聯(lián)免疫吸附測定方法，其步驟包括(1) 采用方陣滴定法確定包被原Cd-ITCBE-OVA與抗體的最佳反應(yīng)濃度， 以最佳濃度的包被原Cd-ITCBE-OVA包被96孔酶標板；(2) 用含EDTA的PBS溶液配制鎘標準溶液，與等體積的1/2最佳工作濃 度的抗體混合，作為反應(yīng)液加入酶標板中進行間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定試 驗；(3) 考察螯合劑EDTA及其濃度、鹽離子強度、pH值、封閉液、預(yù)混時 間對CI-ELISA的影響，優(yōu)化反應(yīng)條件；(4) 在已優(yōu)化的反應(yīng)條件下，建立CI-ELISA，繪制標準抑制曲線。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的酶聯(lián)免疫吸附測定方法，其特征在于在抗原抗體反應(yīng) 體系中螯合劑EDTA濃度為1.0mM，離子強度為0.15M NaCI，基質(zhì)及待測 液pH值為7.4，以1%明膠為封閉液、抗體與標液的預(yù)混時間為1小時的最 佳反應(yīng)條件下進行，獲得競爭抑制標準曲線。
全文摘要
本發(fā)明公開了重金屬鎘多克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫吸附測定方法。其中重金屬鎘多克隆抗體的制備方法，步驟包括(A)完全抗原的合成，完全抗原的合成是多克隆抗體制備的關(guān)鍵；(B)抗體的制備。酶聯(lián)免疫吸附測定方法步驟包括(1)采用方陣滴定法確定包被原Cd-ITCBE-OVA與抗體最佳反應(yīng)濃度，以最佳濃度的包被原Cd-ITCBE-OVA包被96孔酶標板；(2)間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定試驗；(3)考察各種條件對CI-ELISA的影響，優(yōu)化反應(yīng)條件；(4)在已優(yōu)化的反應(yīng)條件下，建立CI-ELISA，繪制標準抑制曲線。本發(fā)明的檢測限為0.04μg/L，線性范圍為10^-1～10³μg/L，對鎘具有特異性，適合環(huán)境水樣中痕量鎘的測定。同時為重金屬污染突發(fā)事故的現(xiàn)場快速檢測提供技術(shù)支持，便于及時對污染事故進行補救和恢復(fù)工作。
文檔編號G01N33/53GK101240023SQ200810019780
公開日2008年8月13日 申請日期2008年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日
發(fā)明者歡 何, 劉振宇, 劉賢進, 成 孫, 川 張, 楊紹貴, 成 陳 申請人:南京大學