專利名稱：：一種診斷方法和用于此的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及診斷領(lǐng)域并且提供用于精確評(píng)估來(lái)自受試者的樣品中特定細(xì)胞類型，其細(xì)胞結(jié)合蛋白或其可溶(細(xì)胞外)形式的存在或數(shù)量的方法和試劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及快速的，自足的診斷，所述診斷可以在大部分環(huán)境中使用，例如診所，實(shí)驗(yàn)室，在野外，在家和在資源貧乏的地區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于評(píng)估來(lái)自受試者的樣品中的CD4T細(xì)胞數(shù)目的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：主題說(shuō)明書中的參考文獻(xiàn)的著書目錄的詳細(xì)資料還列于說(shuō)明書結(jié)尾。這樣的承認(rèn)或任何形式的暗示，即該現(xiàn)有技術(shù)在任何國(guó)家中構(gòu)成公知常識(shí)的部分。不同領(lǐng)域的技術(shù)用于研究，分析，開發(fā)并且臨床上用于檢測(cè)目的細(xì)胞。手動(dòng)或自動(dòng)技術(shù)可用于對(duì)特別設(shè)計(jì)的小室中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，其允許評(píng)估樣品中的細(xì)胞數(shù)目?？梢杂锰厥獾娜旧珓?duì)細(xì)胞進(jìn)行染色以區(qū)別細(xì)胞類型。組織化學(xué)技術(shù)可以用于進(jìn)一步區(qū)分樣品中的細(xì)胞。還可以診斷細(xì)胞通過(guò)增殖或產(chǎn)生細(xì)胞因子響應(yīng)特定抗原，結(jié)合其他細(xì)胞，吞噬(engulf)其他細(xì)胞或通過(guò)趨化作用進(jìn)行移動(dòng)的能力。細(xì)胞表面標(biāo)記對(duì)于區(qū)分細(xì)胞類型和評(píng)估樣品中特定細(xì)胞的數(shù)目來(lái)說(shuō)特別有用。4艮多技術(shù)使用抗體以;險(xiǎn)測(cè)標(biāo)記的存在。原核和真核生物體的細(xì)胞在其所有不同的形式下包含細(xì)胞膜，其將細(xì)胞內(nèi)容物與細(xì)胞外環(huán)境分隔開。細(xì)胞膜是選擇性屏障，其決定進(jìn)出細(xì)胞的物質(zhì)并且其還與其他細(xì)胞和細(xì)胞的環(huán)境中的分子一起承擔(dān)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)。細(xì)胞膜包含磷脂雙層并且大多數(shù)跨雙層膜或與雙層膜相互作用的分子在插入雙層膜中的蛋白的幫助下實(shí)現(xiàn)跨雙層膜或與雙層膜相互作用，所述的蛋白具有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外部分。通常，細(xì)胞與其環(huán)境的最初的相互作用經(jīng)由在質(zhì)膜上表達(dá)的受體或細(xì)胞表面結(jié)合分子而產(chǎn)生。不管是通過(guò)結(jié)合內(nèi)源性配體(例如細(xì)胞因子或激素)還是外源性配體(例如抗原)，這些受體的活化引發(fā)從細(xì)胞膜經(jīng)細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的生化級(jí)聯(lián)。已知大量受體或細(xì)胞表面結(jié)合蛋白質(zhì)分子介導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞相互作用和細(xì)胞分子相互作用。這些包括，例如，MHC蛋白，細(xì)胞因子，激素或神經(jīng)遞質(zhì)受體，束縛配體，G蛋白偶聯(lián)受體，受體蛋白酪氨酸激酶，受體蛋白酪氨酸磷酸酶，蛋白-絲氨酸/蘇氨酸激酶和受體鳥苷酸環(huán)化酶。在免疫系統(tǒng)中介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞識(shí)別或抗原識(shí)別的大多數(shù)蛋白包含Ig或Ig樣結(jié)構(gòu)域，暗示它們具有共同的進(jìn)化歷史。這些蛋白包括抗體，T細(xì)胞受體，分化簇(CD)抗原例如CD4，CD8和CD28蛋白，B和T細(xì)胞受體以及與淋巴細(xì)胞和其他白細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合的恒定多肽鏈。已表征在白細(xì)胞表面上的蛋白約一半屬于這一超家族。因此，免疫系統(tǒng)的細(xì)胞表達(dá)一系列細(xì)胞表面蛋白，所述細(xì)胞表面蛋白的同一性可以用于評(píng)估樣品中不同細(xì)胞的數(shù)目和狀態(tài)。例如，可以用抗B和T細(xì)胞抗原受體的恒定區(qū)的抗體鑒別B和T淋巴細(xì)胞?？煞謩e基于共受體蛋白CD4和CD8的表達(dá)的基礎(chǔ)上鑒別T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞。術(shù)檢測(cè)并計(jì)數(shù)經(jīng)過(guò)激光束的流中的單獨(dú)的細(xì)胞。通過(guò)檢查大量細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)可以對(duì)具有不同分子(例如表征B細(xì)胞的表面免疫球蛋白，稱為CD3的T細(xì)胞受體相關(guān)分子，和區(qū)別主要T細(xì)胞亞群(subset)的CD4和CD8共受體蛋白)的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)提供定量數(shù)據(jù)。用經(jīng)熒光過(guò)特異性抗體接著通過(guò)經(jīng)標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體對(duì)混合群內(nèi)的單獨(dú)的細(xì)胞加標(biāo)簽。然后經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞的懸浮混合物被迫經(jīng)過(guò)孔，產(chǎn)生每流。當(dāng)各個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)激光束，細(xì)胞散射激光，并且結(jié)合到細(xì)胞上的任何染料分子將被激發(fā)并且發(fā)出熒光。靈敏型光電倍增管檢測(cè)散射光(提供細(xì)胞的大小和粒度的信息)和熒光發(fā)射(提供經(jīng)標(biāo)記的抗體的結(jié)合信息從而提供各個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)的信息)。如果使用兩個(gè)或更多抗體，各個(gè)抗體與不同焚光染料偶聯(lián)，則數(shù)據(jù)可以以二維散點(diǎn)圖的形式或作為等值線圖展示，其中對(duì)比第二個(gè)染料標(biāo)記的抗體的熒光對(duì)第一個(gè)染料標(biāo)記的抗體的焚光作圖，從而用一個(gè)抗體標(biāo)記的細(xì)胞群體可以基于其與第二個(gè)抗體的反應(yīng)性進(jìn)一步細(xì)分。免疫測(cè)定是另一種特別有用的測(cè)定形式，其利用抗體-抗原反應(yīng)的特異性，強(qiáng)度和差異來(lái)分析樣品并且檢測(cè)其中的特異性組分。大量的免疫測(cè)定技術(shù)是可獲得的，例如在WildD."Me/邁/z7ww"a/^3/7C^O(^"NaturePublishingGroup,2001中描述的那些4支術(shù)。用于檢測(cè)抗特定抗原的抗體的大量方法也是已知的。例如，在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和放射免疫測(cè)定(RIA)。還使用陣列和高通量篩選方法。這些方法通常需要在實(shí)驗(yàn)室技術(shù)上具有高水平的技術(shù)人員。還開發(fā)了多種方法，其不太要求技能并且快速完成，因此，其適用于在即席檢驗(yàn)時(shí)(atthepointofcare)檢測(cè)抗特定抗原的抗體，和/或^r測(cè)特定抗原。特別地，已經(jīng)開發(fā)側(cè)向流動(dòng)(lateralflow),測(cè)驗(yàn)片(dipstick)和毛細(xì)管試劑盒以測(cè)定許多感染，包括病毒感染。患有免疫缺陷性疾病例如AIDS的受試者中，表達(dá)CD4的T細(xì)胞的水平是何時(shí)開始抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療的指標(biāo)。病毒感染這些T細(xì)胞并且最終破壞它們。低CD4+T細(xì)胞水平還是臨床進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)和機(jī)會(huì)性感染的易感性的指標(biāo)。在一種4企測(cè)CD4細(xì)胞的方法中，用抗CD4抗體包被的免疫磁珠(dynabeads)用于結(jié)合CD4+T淋巴細(xì)胞。用經(jīng)抗CD14抗體包被的珠粒將表達(dá)CD14和CD4的單核細(xì)胞從新鮮血液樣品中除去。之后，分離的CD4T淋巴細(xì)胞被裂解，用吖啶橙進(jìn)行染色并且經(jīng)染色的細(xì)胞核通爭(zhēng)人，Clin.Diagn.Lab.Immunol.,2(1):104-114，1995中描述。該試劑盒為基于ELISA的方法，用于測(cè)量全血樣品中的總CD4。所用的抗體不區(qū)別細(xì)胞結(jié)合的和可溶的CD4(參見(jiàn)Lyamuya爭(zhēng)乂，J.Imm.Methods.,103-112，1996)。國(guó)際公開號(hào)2006/115866描述用于測(cè)量CD4抗原的免疫層析裝置。然而，在該文獻(xiàn)中仍沒(méi)有公開能夠在來(lái)自受試者的樣品中區(qū)別細(xì)胞結(jié)合的CD4和缺失細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶的CD4的捕獲試劑。此外，在W02006/115866中描述的裝置依賴于樣品流經(jīng)一系列有限的捕獲區(qū)域以通過(guò)滲透試紙條上的連續(xù)的捕獲區(qū)域來(lái)捕獲CD4，從而提供樣品中的CD4細(xì)胞的濃度的可視化指標(biāo)。需要測(cè)量特定細(xì)胞類型或它們的細(xì)胞結(jié)合蛋白的改進(jìn)的方法，特別是可以用于即席檢驗(yàn)(pointofcare)和提供快速而精確的結(jié)果的方法。發(fā)明概述貫穿整個(gè)說(shuō)明書和接著的權(quán)利要求書，除非上下文另外要求，詞語(yǔ)"包含"和其變體例如"含有"和"包括"應(yīng)理解為表示包括所述的整體或步驟或整體或步驟的組，但不排除任何其他的整體或步驟或整體或步驟的組。"由……組成"表示包括并且僅限于短語(yǔ)"由……組成"所陳述的任何事物。因此，短語(yǔ)"由……組成"指列出的要素是必需的或者必要的，并且不可以存在其他要素。"基本由……組成，，表示包括該短語(yǔ)所陳述的任何要素，并且限于不干擾或不促成公開內(nèi)容中指定的列出的要素的活性或作用的其他要素。因此短語(yǔ)"基本由......組成，，指列出的要素是必需的或必要的，但有沒(méi)有其他的要素是任選的并且依賴于它們是否影響所列出的要素的活性或作用，其他的要素可以存在或不可以存在。應(yīng)注意的是，如在主題說(shuō)明書中所用的，單數(shù)形式"一個(gè)"，"一種"，"這個(gè)"，"這種"，"該"包括復(fù)數(shù)方面，除非上下文明確另外指出。例如，"樣品墊"包括一個(gè)樣品墊或一個(gè)以上的樣品墊?？捎糜诿總€(gè)其他實(shí)施方案，除非特別另外說(shuō)明。核苷酸和氨基酸序列通過(guò)序列標(biāo)識(shí)編號(hào)(SEQIDNO:)指明。SEQIDNO:數(shù)字上對(duì)應(yīng)于序列標(biāo)識(shí)符<400>1(SEQIDNO:1)，<400>2(SEQIDN0:2)等。序列標(biāo)識(shí)符的總結(jié)在表l中提供。序列表在權(quán)利要求書之后提供。在概括性的實(shí)施方案中，本說(shuō)明書描述用于評(píng)估來(lái)自受試者的樣品中包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白(CSAP)的水平或存在或具有CSAP的細(xì)胞的水平或存在的方法，該方法包括(i)任選地將樣品與能夠裂解或透化具有CSAP的細(xì)胞的試劑接觸；(H)將樣品與和CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的CSAP結(jié)合試劑接觸；和(iii)直接地或間接地評(píng)估樣品中結(jié)合的CSAP的水平或存在。在一些實(shí)施方案中，至少包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合的CSAP的水平或存在指示受試者中具有CSAP的細(xì)胞的數(shù)目。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本說(shuō)明書描述了用于評(píng)估來(lái)自受試者的樣品中包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白(CSAP)的水平或具有CSAP的細(xì)胞的水平的方法，該方法包括a)將測(cè)試樣品用于免疫層析裝置的樣品部分，其中樣品部分可操作地與裝置的捕獲部分連接并且其中測(cè)試樣品的組分從樣品部分流向和流經(jīng)捕獲部分，所述的捕獲部分包含與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，以便只有包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CSAP(而非不包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶的CSAP)與抗體或其片段結(jié)合從而形成被捕獲的CSAP;b)將捕獲部分與第二結(jié)合試劑接觸，所述的第二結(jié)合試劑與其能夠與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三或隨后的結(jié)合伴侶結(jié)合；c)任選地將第二結(jié)合試劑與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三或隨后的結(jié)合試劑接觸；評(píng)估檢測(cè)標(biāo)記的存在。在舉例說(shuō)明性的實(shí)施方案中，該方法用于評(píng)估來(lái)自受試者的血液樣品中包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞結(jié)合CD4，將樣品與能夠裂解或透化CD4T細(xì)胞的試劑接觸；(ii)將樣品與和CD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；和(iii)直接地或間接地評(píng)估樣品中結(jié)合的CD4的水平或存在。在該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法用于評(píng)估來(lái)自受試者的包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞結(jié)合CD4的水平或CD4T細(xì)胞的水平并且包括a)將測(cè)試樣品用于免疫層析裝置的樣品部分，其中樣品部分可操作地與裝置的捕獲部分連接并且其中測(cè)試樣品的組分從樣品部分流向和流經(jīng)包含與CD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段的捕獲部分，以便只有包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CD4(而非不包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶的CD4)與抗體或其片段結(jié)合從而形成捕獲的CD4;b)將捕獲部分與第二結(jié)合試劑接觸，所述的第二結(jié)合試劑與CD4結(jié)合，包括與細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且其包含檢測(cè)標(biāo)記或其能夠與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三或隨后的結(jié)合伴侶結(jié)合；和c)任選地，將第二結(jié)合試劑與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三或隨后的結(jié)合試劑接觸；評(píng)估4企測(cè)標(biāo)記的存在。與CSAP或sCSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑可以是與CSAP特異性結(jié)合的任何形式的分子。CSAP結(jié)合試劑，例如配體，適體或抗體，是特別預(yù)期的。對(duì)CSAP的部分具有高特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段可方^更地制備。另外，抗體可以方便地綴合到可檢測(cè)標(biāo)記或與可檢測(cè)標(biāo)記一起產(chǎn)生或與綴合至可檢測(cè)標(biāo)記的第二或隨后的抗體結(jié)合。其功能為直接或間接地檢測(cè)試劑-CSAP復(fù)合物的任一形式的抗體可以稱為檢測(cè)抗體。在另一個(gè)概括性的實(shí)施方案中，該方法包括(i)任選地，將樣品與能夠裂解或透化具有CSAP的細(xì)胞的試劑接觸，(ii)將待測(cè)試的樣品與和CSAP的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑接觸，以便通過(guò)試劑結(jié)合全長(zhǎng)(CSAP)和可溶形式(sCSAP)的CSAP并且形成包含試劑-CSAP和/或試劑-sCSAP的復(fù)合物(Ui)任選地，如果試劑不是已經(jīng)與固體或半固體支持物的區(qū)域結(jié)合或關(guān)聯(lián)，則將樣品與固體或半固體支持物接觸，以便試劑和任何試劑-CSAP復(fù)合物和/或試劑-sCSAP復(fù)合物與固體支持物結(jié)合(iii)將樣品或支持物的適當(dāng)區(qū)域與和CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的第二試劑接觸和(iv)直接或間接地確定結(jié)合的第二試劑的存在或水平。在另一個(gè)概括性的實(shí)施方案中，本說(shuō)明書提供用于檢測(cè)來(lái)自受試者的樣品中a)包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白(CSAP)或具有CSAP的細(xì)胞的水平或存在和b)在待測(cè)試的樣品中可溶的非細(xì)胞膜結(jié)合的細(xì)胞外形式的CSAP(sCSAP)的存在水平的方法。該方法包括(i)任選地，將待測(cè)試的樣品與能夠裂解或透化具有CSAP的細(xì)胞的試劑接觸，(ii)將樣品與和CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑以及和缺失細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶形式的CSAP結(jié)合的第二試劑接觸，(Hi)直接或間接地評(píng)估樣品中的結(jié)合的CSAP和結(jié)合的sCSAP的水平。在其中還測(cè)量sCSAP的水平或存在的實(shí)施方案中，評(píng)估步驟(iii)區(qū)別試劑-CSAP復(fù)合物和試劑-sCSAP復(fù)合物。在這個(gè)實(shí)施方案中，可以確定來(lái)自受試者的樣品中細(xì)胞結(jié)合的和可溶的sCSAP的相對(duì)存在或數(shù)量。在另一個(gè)方面中，主題說(shuō)明書描述了用于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)來(lái)自受試者的樣品中的細(xì)胞數(shù)目的試劑盒，其中所述細(xì)胞的特征在于包含含有細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白(CSAP)。在概括性的實(shí)施方案中，試劑盒包括(i)包括與樣品部分可操作連接的多孔膜，測(cè)試(捕獲)部分，綴合部分，吸取部分，任選的對(duì)照部分和任選的裂解部分的層析裝置；(ii)CSAP結(jié)合試劑，例如與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中試劑或抗體固定(結(jié)合)于一個(gè)或多個(gè)測(cè)試部分和/或包含在綴合部分內(nèi)；和(iii)使用裝置以檢測(cè)或監(jiān)測(cè)樣品或受試者中具有CSAP的細(xì)胞的水平或存在的說(shuō)明書。在舉例說(shuō)明性的實(shí)施方案中，提供用于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)來(lái)自受試者的血液樣品中的CD4T細(xì)胞的數(shù)目的試劑盒。在概括性的實(shí)施方案中，試劑盒包括(i)包括可操作地與樣品部分連接的多孔膜，測(cè)試(捕獲)部分，綴合部分，吸取部分，任選地對(duì)照部分和任選地裂解部分的層析裝置；(ii)CD4結(jié)合試劑，例如與CD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中試劑或抗體固定(結(jié)合)于一個(gè)或多個(gè)測(cè)試部分和/或包含在綴合部分內(nèi)；和(iii)使用裝置以檢測(cè)或監(jiān)測(cè)樣品或受試者中的CD4細(xì)胞的水平或存在的說(shuō)明書。如免疫層析裝置領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，主題試劑盒可以設(shè)計(jì)為任何適當(dāng)?shù)男问?，包括反向或?cè)向流動(dòng)免疫層析形式。所有實(shí)施方案的窮舉。附圖簡(jiǎn)介圖1(A)是與T淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面膜結(jié)合的人CD4的圖示。展示了包含氨基酸1-395的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與其二硫鍵區(qū)域一起排列為四個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。展示了包含氨基酸396-420的跨膜結(jié)構(gòu)域，其跨T淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面膜。還展示了包含氨基酸421-458的細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))結(jié)構(gòu)域。圖1(B)表示包含細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域并且缺失跨膜結(jié)構(gòu)域加上細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的前兩個(gè)氨基酸的TMACD4的結(jié)構(gòu)，這樣該TMACD4蛋白表示與氨基酸423-458融合的氨基酸1-395。圖2為人CD4細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的圖示和為了產(chǎn)生抗細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的抗體而合成的亞序列肽的序列。肽1包含來(lái)自氨基酸436至454的缺失了氨基酸446至447(QC)的17個(gè)氨基酸(SEQIDNO:1)。肽2包含來(lái)自人CD4的氨基酸422至441的20個(gè)氨基酸(SEQIDNO:2)。氨基酸的編號(hào)如實(shí)施例1中所描述的。圖3為測(cè)量抗CD4細(xì)胞質(zhì)肽的綿羊多克隆抗體的特異性和滴度的ELISA測(cè)定的結(jié)果的圖示。圖3A和3B表示分別來(lái)自綿羊G-6和綿羊G-7的結(jié)果。血液為預(yù)取血(PB),兩次測(cè)試中取血(TBI和TB2)和終取血(FB)的樣品。圖4為測(cè)量抗肽1和肽2的CD4多克隆抗體特異性的ELISA測(cè)定的結(jié)果的圖示。如其中所示，綿羊通過(guò)ELISA對(duì)兩個(gè)肽具有相似的反應(yīng)性。TB2是來(lái)自G-7或G-6綿羊免疫后的第二次測(cè)試取血的血液。圖5為比較抗CD4—肽2的抗CD4—單克隆抗體(MAb)反應(yīng)性的ELISA測(cè)定的結(jié)果的圖示。如其中所示，三個(gè)單克隆抗體顯示與肽2結(jié)合。圖6為評(píng)估抗CD4。yt。單克隆抗體ID2和4B4與新鮮的(非固定化/透化)CD4+T細(xì)胞(A，B，C和D)結(jié)合的能力的流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果的圖示?？贵w不能結(jié)合新鮮的細(xì)胞。圖7為評(píng)估抗CD4。yt。單克隆抗體ID2和4B4與固定化/透化的CD4+T細(xì)胞(A，B，C，D)結(jié)合的能力的流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果的圖示?？贵w與固定化/透化的細(xì)胞結(jié)合并且92%的CD4+細(xì)胞被選擇。圖8為適合于實(shí)施本發(fā)明的兩種免疫測(cè)定形式的圖示。圖9為測(cè)量抗CD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體包括商業(yè)可獲得的抗CD4cyto單克隆抗體(chemicon)的反應(yīng)性的ELISA的結(jié)果的圖示。圖10為測(cè)量抗CD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體1D2的特異性和其從JC53細(xì)胞裂解物捕獲CD4的能力的捕獲ELISA的結(jié)果的圖示和用抗CD4胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體(RPAT4);險(xiǎn)測(cè)的結(jié)果的圖示。1D2從JC53細(xì)胞裂解物捕獲用RPAT4可檢測(cè)的CD4，但是可溶CD4沒(méi)有被捕獲。圖11為測(cè)量抗CD4細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體1D2的特異性和其從JC53細(xì)胞裂解物捕獲CD4的能力的捕獲ELISA的結(jié)果的圖示和用抗CD4胞外結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體檢測(cè)的結(jié)果的圖示。1D2從JC53細(xì)胞裂解物捕獲用抗CD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體可檢測(cè)的CD4，但是可溶CD4沒(méi)有被捕獲。圖12為來(lái)自供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的細(xì)胞CD4的捕獲ELISA的結(jié)果的圖示。A表示來(lái)自供體1至6的通過(guò)單克隆抗體4B4捕獲的P麗C裂解物的滴度，所述的供體在總PBMC群中具有不同比例的CD4T細(xì)胞。B表示富含細(xì)胞CD4的淋巴細(xì)胞的捕獲。圖13為來(lái)自供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的細(xì)胞CD4的捕獲ELISA的結(jié)果的圖示。展示了來(lái)自三個(gè)供體的結(jié)果以及OD450-620與每微升的004+T細(xì)胞的數(shù)目之間的關(guān)聯(lián)。圖14為來(lái)自供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的細(xì)胞CD4的捕獲ELISA的結(jié)果的圖示。展示了來(lái)自5個(gè)不同HIV感染患者的結(jié)果并且證明0D450-620與每微升全血的CD4+T細(xì)胞的數(shù)目之間的緊密的關(guān)聯(lián)。圖15為用于檢測(cè)全長(zhǎng)的細(xì)胞結(jié)合CD4并且由此評(píng)估CD4+細(xì)胞數(shù)目的免疫層析裝置的圖示。圖16為編碼一種形式的TMACD4的核酸序列的圖。下劃線文本(text)為His標(biāo)簽。加框文本為腸激酶識(shí)別位點(diǎn)。粗體文本為CD4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域以及斜體字文本為CD4的細(xì)胞質(zhì)尾部。圖17為一種形式的TMACD4的氨基酸序列的圖。下劃線文本為His標(biāo)簽。加框文本為腸激酶識(shí)別位點(diǎn)。粗體文本為CD4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域以及斜體字文本為CD4的細(xì)胞質(zhì)尾部。圖18為展示示通過(guò)ELISA(A)和通過(guò)Western免疫印跡(B)檢測(cè)重組TMACD4的數(shù)據(jù)的圖表和照片示意。(A)全長(zhǎng)(FL)CD4或TMACD4通過(guò)各自的pcDNA4/HisMax構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染或模擬轉(zhuǎn)染在293T細(xì)胞中表達(dá)。用所述的方法通過(guò)CD4ELISA測(cè)試細(xì)胞裂解物和細(xì)胞上清液。結(jié)果顯示，全長(zhǎng)CD4在細(xì)胞中有效表達(dá)但不被釋放到上清液中，而TMACD4在細(xì)胞中有效表達(dá)并且大部分重組蛋白釋放到上清液中，從而允許簡(jiǎn)單純化(如果需要)。(B)通過(guò)Western免疫印跡用抗CD4細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的定制(custom)的MAb4B4(3|ug/ml)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的TMACD4。圖19為展示通過(guò)ELISA和免疫層析的快速的，即席檢驗(yàn)測(cè)定檢測(cè)TMACD4的數(shù)據(jù)的圖表和照片示意。連續(xù)稀釋來(lái)自用TMACD4的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的上清液(以1:5開始稀釋)，用于ELISA測(cè)定(A),在ELISA中顯示出線性反應(yīng)，證明TMACD4可作為對(duì)照試劑在CD4ELISA測(cè)定中用于評(píng)估總的CD4T細(xì)胞數(shù)目。在該圖中，在相同的測(cè)定中測(cè)試四個(gè)不同的全血樣品(樣品IDS72，51,40，49),與標(biāo)準(zhǔn)相比較的CD4的相對(duì)數(shù)量可以用所示的回歸曲線或其他方法來(lái)評(píng)估。為了能夠?qū)D4的數(shù)量轉(zhuǎn)換為每微升的CD4T細(xì)胞的數(shù)目，通次測(cè)試全血參比樣品并與TMACD4標(biāo)準(zhǔn)比壽交，從而允許確定正確的轉(zhuǎn)換因子(數(shù)據(jù)未顯示)。(B)通過(guò)快速即席檢驗(yàn)測(cè)定檢測(cè)來(lái)自兩個(gè)不同的穩(wěn)定HEK293-TNTCD4細(xì)胞系克隆(H5和F5)的上清液，表明在此類測(cè)定中TNTCD4可以用作對(duì)照試劑或標(biāo)準(zhǔn)。圖20為展示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和ELISA計(jì)算的CD4細(xì)胞數(shù)目之間的良好關(guān)聯(lián)的圖示。使用重組可溶形式的CD4作為CD4ELISA的內(nèi)在測(cè)定對(duì)照，并且使用基于通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和ELISA平行測(cè)定參比樣品而確定的轉(zhuǎn)換因子，對(duì)于評(píng)估的CD4T細(xì)胞數(shù)目來(lái)說(shuō)，用CD4ELISA與用CD4流式細(xì)胞術(shù)相比獲得非常緊密的關(guān)聯(lián)。特別地，注意到當(dāng)大于或少于每微升250個(gè)T細(xì)胞時(shí)，所有樣品都被正確鑒別，如在加框區(qū)域中所示的。在該測(cè)定中，在通過(guò)ELISA測(cè)定全血的CD4T細(xì)胞前，用CD14磁珠從全血中除去單核細(xì)胞。圖21為快速免疫層析形式中的結(jié)果的圖示，其展示TMACD4(作為包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CD4的替代物)的不同的數(shù)量和信號(hào)強(qiáng)度之間的良好關(guān)聯(lián)。這證明TMACD4可作為對(duì)照試劑用于CD4測(cè)定的ELISA和快速的即席檢驗(yàn)形式的制備，測(cè)試和質(zhì)量控制。該圖還證明Cheraicon3706抗細(xì)力包質(zhì)結(jié)構(gòu)域Mab,和定制的4B4抗細(xì)力包質(zhì)結(jié)構(gòu)域Mab可以獨(dú)立地或作為混合物用于在測(cè)定的快速形式中捕獲CD4。此外，這證明在快速形式中信號(hào)強(qiáng)度與樣品中的CD4的數(shù)量是成比例的，允許快速即席檢驗(yàn)形式用于CD4T細(xì)胞數(shù)目的定量或半定量評(píng)估。圖22為快速免疫成像(immunographic)裝置中的結(jié)果的照片示意。(A)提供快速即席檢驗(yàn)測(cè)定形式的測(cè)試結(jié)果，以所示的每微升的細(xì)胞數(shù)使用純化的T細(xì)胞(在測(cè)試線反應(yīng))。(B):通過(guò)用與抗生物素金綴合物(goldconjugate)直接反應(yīng)的生物素化的單克隆抗體劃條帶，制備與500個(gè)T細(xì)胞/微升和250個(gè)T細(xì)胞/微升等價(jià)的對(duì)照線。圖23(A)為根據(jù)本發(fā)明的全血CD4快速即席檢驗(yàn)測(cè)定的圖示。(B)在如A中所示的全血測(cè)定中測(cè)試包含高CD4T細(xì)胞水平(通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定為1452/|li1)的全血樣品，如通常在裂解墊中具有去污劑("+TX，，)，或從裂解墊除去去污劑("-TX")。在該實(shí)施例中，當(dāng)存在去污劑以裂解墊中的T細(xì)胞時(shí)，僅在快速測(cè)試中見(jiàn)到CD4信號(hào)。(C)在CD4快速即席檢驗(yàn)測(cè)定中測(cè)定的代表性全血樣品的實(shí)例。展示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定的各個(gè)樣品的CD4數(shù)量，并且在該全血形式中可見(jiàn)高CD4T細(xì)胞數(shù)給出較強(qiáng)的信號(hào)而低CD4T細(xì)胞數(shù)給出弱的信號(hào)。圖24為展示樣品中的單核細(xì)胞的減少的數(shù)據(jù)的示意。在ELISA形式的測(cè)定中，可以如上述通過(guò)在本領(lǐng)域^^知的方法中^f吏用為此目的而設(shè)計(jì)的抗CD14磁珠和強(qiáng)磁體，在測(cè)定之前從全血中除去單核細(xì)胞。該方法還可以用于即席檢驗(yàn)測(cè)定之前的全血的預(yù)處理，但是為了即席檢驗(yàn)測(cè)試要求優(yōu)選避免樣品處理和加工。還沒(méi)有描述過(guò)通過(guò)使用與快速的即席檢驗(yàn)測(cè)定中的內(nèi)容相容的方法除盡特定白細(xì)胞類型或其他細(xì)胞類型的方法。本發(fā)明人設(shè)計(jì)了如實(shí)施例12中所述的用于有效除去快速即席檢驗(yàn)測(cè)試的樣品墊中的單核細(xì)胞的方法。在圖中，純化的單核細(xì)胞和純化的外周血淋巴細(xì)胞(PBL，除盡單核細(xì)胞)分別用紅外熒光染料標(biāo)記-單核細(xì)胞用綠色(MiniCellVueNIR815，PTIResearch,Inc)，PBL用紅色(MiniCel1VueBurgundy,PTIResearchInc.)。圖像展示了在Licor0dyssey紅外熒光掃描儀上經(jīng)不同的濾光器觀察到的相同的樣品墊(A)=組合濾光器，(B)=Em800,(C)=Em700。磁體使其中使用它的樣品墊的掃描變暗。將1.5x104個(gè)單核細(xì)胞(結(jié)合到磁珠)和除盡單核細(xì)胞的2xl(T個(gè)PBL組合并點(diǎn)樣到無(wú)磁體(左)或有磁體(右)的抗血型糖蛋白A包被的樣品墊上。用60ulPBS沖洗樣品以允許樣品流入吸收墊(此處用于代替實(shí)際的裂解墊和硝酸纖維素試紙條，用于舉例說(shuō)明性目的)。在存在磁體的情況下在圖(A)和(B)中可以看到保留〉80%的單核細(xì)胞(綠色)，而沒(méi)有綠色細(xì)胞進(jìn)入吸收墊，同時(shí)在存在或不存在磁體的(A)和(C)中證明除盡了單核細(xì)胞的PBL流入吸收墊。(D)展示如(A)-(C)中所示的測(cè)試的示意圖。表格簡(jiǎn)介表1提供本文提供的SEQIDNO的描述。表2提供氨基酸亞分類。表3提供示例性的氨基酸取代。優(yōu)選的實(shí)施方案的詳述在準(zhǔn)備本發(fā)明的工作中，發(fā)明人已開發(fā)了用于精確計(jì)數(shù)來(lái)自受試者的細(xì)胞樣品中的特定細(xì)胞類型的策略。本發(fā)明部分以這樣的認(rèn)識(shí)為基礎(chǔ)，即用于檢測(cè)特定細(xì)胞類型的蛋白標(biāo)記的現(xiàn)有技術(shù)方法使用與細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞外部分結(jié)合的試劑。因?yàn)楹芏嗉?xì)胞表面結(jié)合分子以細(xì)胞結(jié)合的和可溶的形式存在，這些試劑檢測(cè)可溶形式的標(biāo)記，導(dǎo)致假陽(yáng)性或特定細(xì)胞類型的數(shù)目的過(guò)高估計(jì)。在一些實(shí)施方案中，該方法不檢測(cè)缺失細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶CSAP(其可能存在于樣品中)。在其他實(shí)施方案中，該方法區(qū)別包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞結(jié)合的CSAP和缺失細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶的CSAP。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供測(cè)定，例如免疫測(cè)定，其包含區(qū)別可溶和全長(zhǎng)形式的細(xì)胞表面標(biāo)記的試劑。在本發(fā)明的特別有用的實(shí)施方案中，提供不需要樣品加工，顯微術(shù)，使用其他儀器或科學(xué)的專門技能的快速即席檢驗(yàn)(RP0C)方法和試劑盒。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于評(píng)估來(lái)自受試者的樣品中包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白(CSAP)或具有CSAP的細(xì)胞的水平或存在的方法，該方法包括(i)任選地，將樣品與能夠裂解或透化具有CSAP的細(xì)胞的試劑接觸，(ii)將樣品與和CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑接觸(iii)直接或間接地評(píng)估樣品中結(jié)合的CSAP的水平。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，該方法允許在也包含可溶CSAP的樣品中檢測(cè)或測(cè)量細(xì)胞結(jié)合的CSAP。試劑-CSAP復(fù)合物的水平可以用于證明樣品中特定細(xì)胞結(jié)合的CSAP的存在或定量樣品中特定細(xì)胞結(jié)合的CSAP分子的數(shù)量。通過(guò)使用關(guān)于平均多少CSAP分子存在于特定細(xì)胞類型的表面上的信息，可以評(píng)估樣品中存在的具有CSAP的細(xì)胞的數(shù)目。與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或可溶形式的CSAP結(jié)合的試劑可以是任何CSAP結(jié)合試劑，例如配體，適體或抗體，然而方便地制備特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。特別地，抗體可以方便地與可檢測(cè)標(biāo)記綴合或與可檢測(cè)標(biāo)記一起產(chǎn)生或與綴合至可檢測(cè)標(biāo)記的第二或隨后的抗體結(jié)合?？梢砸员绢I(lǐng)域已知的任何方便的形式進(jìn)行免疫測(cè)定。其包括Western印跡，免疫組織化學(xué)測(cè)定和ELISA測(cè)定。由于大量產(chǎn)生單克隆抗體的能力和產(chǎn)物的同質(zhì)性，免疫測(cè)定中特別優(yōu)選使用單克隆抗體。然而，如本文所示，也可以使用多克隆抗體。用于產(chǎn)生單克隆抗原的雜交瘤細(xì)胞系的制備通過(guò)將永生細(xì)胞系和敏化的抗目的抗原的淋巴細(xì)胞融合而得到(在非限制性實(shí)例中，在CD4多肽的情況下，抗體為肽1或2或其同源物，衍生物，變體)或可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的4支術(shù)進(jìn)4亍(參見(jiàn)，例如Doui1lard和Hoffman,BasicFactsaboutHybridomas,CompendiumofImmunology第II巻，由Schwartz編輯，1981;Kohler和Milstein，Nature256:495-499，1975;EuropeanJournalofImmunology6:511-519，1976或更新的參考文獻(xiàn)Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition,CSHLP,CSH，NY,2001)。本發(fā)明的另一個(gè)方面關(guān)注用于檢測(cè)來(lái)自受試者的生物樣品中的CSAP的方法，所述的方法包括在足以使抗體-CSAP復(fù)合物形成的條件下，將所述生物樣品與對(duì)CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異的抗體接觸一段時(shí)間，然后檢測(cè)所述復(fù)合物?？梢杂?艮多方式，例如通過(guò)Western印跡和ELISA方法評(píng)估CSAP的存在。可使用大量的免疫測(cè)定技術(shù)，如可以參見(jiàn)美國(guó)專利4，016，0434,424,279和4,018,653。這些包括非竟?fàn)幮偷膯蝹€(gè)位點(diǎn)和兩個(gè)位點(diǎn)或"夾心"測(cè)定，以及傳統(tǒng)的竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定。夾心測(cè)定為最有用的和普遍使用的測(cè)定之一并且適合用于本發(fā)明。存在很多夾心測(cè)定技術(shù)的變形，并且本發(fā)明意欲包括所有變形。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在通常的正向測(cè)定中，將抗體固定于固體或半固體基底上并且使待測(cè)試的樣品與結(jié)合的分子接觸。在溫育合適的時(shí)間(一段足以允許抗體-抗原復(fù)合物形成的時(shí)間)后，然后添加用能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)告分子標(biāo)記的對(duì)抗原特異的第二抗體并溫育，進(jìn)行足以形成另一個(gè)抗體-抗原-經(jīng)標(biāo)記的抗體的復(fù)合物的時(shí)間。清洗掉任何未反應(yīng)的物質(zhì)，并且通過(guò)觀察由可檢測(cè)的標(biāo)記.(報(bào)告分子)產(chǎn)生的信號(hào)確定CSAP的存在。通過(guò)簡(jiǎn)單觀察可視信號(hào)，結(jié)果可以是定性的或定量的，或可以通過(guò)與包含已知數(shù)量的CSAP的對(duì)照樣品比較，定量結(jié)果。正向測(cè)定的變形包括同時(shí)測(cè)定，其中同時(shí)添加樣品和經(jīng)標(biāo)記的抗體至結(jié)合的抗體。這些技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的，其包括任何小的明顯的變化。根據(jù)本發(fā)明，樣品為可能包含CSAP的樣品，例如細(xì)胞提取物或活組織檢查樣品。因此，樣品通常為包含生物體液的生物樣品。在通常的正向夾心測(cè)試中，針對(duì)CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域具有特異性的第一抗體共價(jià)或被動(dòng)地與固體或半固體支持物結(jié)合。支持物通常為玻璃或聚合物，最常用的聚合物為硝酸纖維素，纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚丙烯或這些物質(zhì)的混合物或衍生物。固體支持物可以為管，珠，盤或微孔板的形式，或任何其他適合于進(jìn)行免疫測(cè)定的表面。結(jié)合過(guò)程是本領(lǐng)域公知的并且通常由交聯(lián)共價(jià)結(jié)合或物理吸附聚合物-抗體復(fù)合物到固體表面組成，所述表面然后在測(cè)試樣品的制備中進(jìn)行清洗。然后，將待測(cè)試的樣品的等分試樣添加到固相復(fù)合物并且在合適的條件(例如從室溫至約37°C包括25°C)下溫育一段足夠的時(shí)間(例如2-40分鐘或如果適宜，過(guò)夜)以允許存在于抗體中的任何亞基的結(jié)合。溫育后，清洗抗體亞基固相并且與對(duì)抗原的部分特異的第二抗體一起溫育。第二抗體連接到用于指示第二抗體與抗原的結(jié)合的可檢測(cè)的標(biāo)記?？蛇x的方法包括固定生物樣品中的靶分子然后將固定化的靶暴露于特異性抗體，所述的抗體可以用或者可以不用可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。取決于耙的數(shù)量和可一企測(cè)標(biāo)記的信號(hào)強(qiáng)度，可以通過(guò)直接用抗體標(biāo)記檢測(cè)結(jié)合的耙。可選地，將對(duì)第一抗體特異的經(jīng)標(biāo)記的第二抗體暴露于靶-第一抗體復(fù)合物以形成靶-第一抗體-第二抗體三聯(lián)(tertiary)復(fù)合物。通過(guò)由報(bào)告分子發(fā)出的信號(hào)檢測(cè)復(fù)合物?；诘淖R(shí)別標(biāo)簽(例如寡核苷酸或電泳標(biāo)簽)標(biāo)記各個(gè)珠粒，以便促進(jìn)各個(gè)文庫(kù)成員的氨基酸序列的鑒別。這些改進(jìn)的基于珠粒的方法在國(guó)際公開號(hào)W093/06121中描述。在其他實(shí)施方案中，該方法為液相方法。在液相免疫測(cè)定的一個(gè)實(shí)例中(參見(jiàn)例如美國(guó)專利6,632,603)，將樣品與能夠結(jié)合CSAP的細(xì)胞質(zhì)部分的試劑和包含視覺(jué)可檢測(cè)的試劑(例如標(biāo)記的膠體金或銀)的檢測(cè)子試劑接觸。通過(guò)流到不溶多孔支持膜的指定區(qū)域上來(lái)應(yīng)用測(cè)試樣品，所述的不溶多孔支持膜具有不能使CSAP(如果存在)與結(jié)合物和檢測(cè)子物質(zhì)形成的復(fù)合物通過(guò)，但可以使結(jié)合物和檢測(cè)子物質(zhì)(當(dāng)不存在期望的CSAP時(shí)保持未復(fù)合)通過(guò)的孔徑。如果在測(cè)試樣品中存在CSAP，檢測(cè)子物質(zhì)與CSAP和結(jié)合物結(jié)合以在多孔支持膜表面形成視覺(jué)可檢出的復(fù)合物。在將測(cè)試樣品應(yīng)用到多孔支持物后，直觀檢查多孔支持物的表面的顏色以確定測(cè)定的CSAP的存在和數(shù)量或不存在。在另一個(gè)測(cè)定中，與CSAP標(biāo)記結(jié)合的磁性抗體用于標(biāo)記CSAP并且使用高L超導(dǎo)量子千涉儀以測(cè)量游離和結(jié)合的抗體的數(shù)量并且因此測(cè)量CSAP的存在或水平。例如，脂質(zhì)體免疫遷移，液相竟?fàn)幵嚰垪l免疫測(cè)定在Gl。rio-Paulet爭(zhēng)乂/^g,/cT^oVC力e/zzM(5):1678-1682，2000中描述。用于進(jìn)行不同形式的ELISA的通用的形式和方案已在本領(lǐng)域中公開并且對(duì)診斷學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。例如，可以參考Ausubel(Ed)(wrre/7f/^rofoco/y//^/o/ecw/srA/o/o(^jr，5thEdition:JohnWiley&Sons,Inc，NY，2002的第11章。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑用于將CSAP連接到固體或半固體支持物。這允許將樣品中的任何可溶CSAP從CSAP物理分離，然后CSAP可以用與CSAP的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括(i)任選地，將樣品與能夠裂解或透化具有CSAP的細(xì)胞的試劑接觸，(ii)將待測(cè)試的樣品與和CSAP的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑接觸，從而CSAP和CSAP的可溶形式與試劑結(jié)合并且形成包含試劑-CSAP和/或試劑-sCSAP的復(fù)合物(iii)任選地，如果試劑不是已經(jīng)結(jié)合至或另外與固體或半固體支持物的區(qū)域相關(guān)聯(lián)，則將樣品與固體或半固體支持物接觸以便試劑和任何試劑-CSAP復(fù)合物和/或試劑-sCSAP復(fù)合物與固體支持物結(jié)合(iii)將樣品與特異性和CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的第二試劑接觸和(iv)直接或間接地確定結(jié)合的第二試劑的存在或水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于確定來(lái)自受試者的樣品中a)包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的在細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白(CSAP)或具有CSAP的細(xì)胞的水平或存在和b)樣品中CSAP的可溶的非膜結(jié)合的細(xì)胞外形式的存在水平的方法。在該實(shí)施方案中，將樣品進(jìn)一步與結(jié)合可溶形式的CSAP的試劑接觸。在其中還測(cè)量可溶CSAP的水平或存在的實(shí)施方案中，評(píng)估步驟(iii)區(qū)別試劑-CSAP復(fù)合物和試劑-sCSAP復(fù)合物。在該實(shí)施方案中，可以確定來(lái)自受試者的樣品中細(xì)胞結(jié)合的CSAP和可溶CSAP的相對(duì)存在或數(shù)量。在一些實(shí)施方案中，該方法包括(i)將來(lái)自受試者的樣品用于具有特異性與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體的層析或免疫成像裝置的部分，以便基本上只有包含細(xì)胞質(zhì)部分的細(xì)胞結(jié)合的CSAP被捕獲到測(cè)試部分上。在其中需要檢測(cè)可溶CSAP的存在或水平的一些實(shí)施方案中，層析裝置的另一個(gè)部分具有結(jié)合可溶CSAP的抗體，以便任何可溶CSAP被捕獲到層析裝置的另外的測(cè)試部分。當(dāng)然，與可溶CSAP細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體也能夠與CSAP的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。然而，如果存在于樣品中的所有CSAP經(jīng)由抗細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的抗體與裝置的其他部分結(jié)合，則抗可溶CSAP的抗體將只結(jié)合CSAP的可溶形式。在一些實(shí)施方案中，待測(cè)試的樣品包含得自身體(例如脊髓液，骨或組織樣品，血清，血漿，唾液，淚液和乳液)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試樣品為全血或稀釋的全血為全血衍生物。在一些實(shí)施方案中，可以在抗凝血?jiǎng)?例如肝素，檸檬酸鈉或乙二胺四乙酸(EDTA))存在的條件下保存血液。在一種或多種上述方法中，檢測(cè)步驟包括將結(jié)合的CSAP與和CSAP結(jié)合且包含檢測(cè)標(biāo)記或能夠與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三結(jié)合試劑結(jié)合的第二結(jié)合試劑接觸，和檢測(cè)檢測(cè)標(biāo)記。在一些特別的實(shí)施方案中，CSAP結(jié)合試劑為抗體或其抗原結(jié)合片段。類似地，在一些實(shí)施方案中第二結(jié)合試劑為與CSAP結(jié)合(包括與CSAP的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合)的抗體或其抗原結(jié)合片段。如上所述，該方法的特別的實(shí)施方案包括評(píng)估樣品中具有CSAP的細(xì)胞的數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，這通過(guò)將結(jié)合的CSAP的水平或存在，或結(jié)合的檢測(cè)標(biāo)記的水平或存在與預(yù)先確定的對(duì)照比較而實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，預(yù)先確定的對(duì)照為預(yù)先確定量的對(duì)照多肽，當(dāng)與可視的檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合時(shí)，其足以產(chǎn)生信號(hào)，提供與由預(yù)先確定數(shù)目的CSAP細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)等價(jià)的可視的內(nèi)標(biāo)。用于評(píng)估細(xì)胞的方法取決于所用的方法的形式并且ELISA類型，流式細(xì)胞術(shù)或?qū)游龇ǘ际穷A(yù)期的。在其中所述方法為ELISA或?qū)游龇椒ǖ囊恍?shí)施方案中，與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的CSAP結(jié)合試劑固定在固體或半固體支持物上。在其他實(shí)施方案中，所述方法為ELISA或?qū)游龇ú⑶遗cCSAP結(jié)合包括與CSAP的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的笫二結(jié)合試劑固定于固體或半固體支持物上。所述方法適合在免疫層析裝置中使用。在這方面的一些實(shí)施方案中，提供了用于評(píng)估來(lái)自受試者的樣品中包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白(CSAP)的水平或具有CSAP的細(xì);^包的水平的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括a)將測(cè)試樣品用于免疫層析裝置的樣品部分，其中的樣品部分可操作地與裝置的捕獲部分連接并且其中測(cè)試樣品的組分從樣品部分流向并通過(guò)捕獲部分，所述的捕獲部分包含與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，以便只有包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CSAP(而非不包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶CSAP)與抗體或其片段結(jié)合從而形成捕獲的CSAP;b)將捕獲部分與和CSAP結(jié)合(包括與細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合)且包含檢測(cè)標(biāo)記或能夠與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三或隨后的結(jié)合伴侶結(jié)合的第二結(jié)合試劑接觸。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括c)任選地，將第二結(jié)合試劑與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三結(jié)合試劑接觸；評(píng)估檢測(cè)標(biāo)記的存在。當(dāng)然，如果需要，可以使用進(jìn)一步的結(jié)合伴侶。在舉例說(shuō)明性的實(shí)施方案中，本說(shuō)明書提供用于評(píng)估來(lái)自受試者的血液樣品中包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞結(jié)合CD4的水平或CD4T細(xì)胞的水平的方法，該方法包括(i)任選地，將樣品與能夠裂解或透化CD4T細(xì)胞的試劑接觸；(ii)將樣品與和CD4細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸；和(iii)直接地或間接地評(píng)估樣品中結(jié)合的CD4的水平或存在。在一些實(shí)施方案中，步驟(iii)包括將CD4-抗體復(fù)合物與第二抗體或其抗原結(jié)合片段接觸，所述的第二抗體或其抗原結(jié)合片段與其能夠與包括檢測(cè)標(biāo)記的第三結(jié)合伴侶結(jié)合，和檢測(cè)檢測(cè)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)將結(jié)合的CD4或結(jié)合的檢測(cè)標(biāo)記的水平或存在與預(yù)先確定的對(duì)照進(jìn)行比較來(lái)確定樣品中具有CD4的細(xì)胞的數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，預(yù)先確定的對(duì)照為預(yù)先確定量的對(duì)照多肽，當(dāng)與可視的檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合時(shí)，其足以產(chǎn)生信號(hào)，提供與由預(yù)先確定數(shù)目的CD4細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)等價(jià)的可視內(nèi)標(biāo)。然而如上所述，在一些實(shí)施方案中，該方法為ELISA,流式細(xì)胞術(shù)或?qū)游龇?。在一些?shí)施方案中，所述方法為ELISA或?qū)游龇ú⑶夷軌蚺cCD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段(抗-cytoCD4抗體)固定于固體或半固體支持物上。關(guān)于層析裝置，可以使用很多不同的形式。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于評(píng)估來(lái)自受試者的血液樣品中包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞結(jié)合CD4的水平或CD4T細(xì)胞的水平的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括a)將測(cè)試樣品用于免疫層析裝置的樣品部分，其中樣品部分可操作地與裝置的捕獲部分連接并且其中測(cè)試樣品的組分從樣品部分流向并且通過(guò)捕獲部分，所述的捕獲部分包含與CD4細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，以便只有包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CD4(而非不包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶CD4)與抗體或其片段結(jié)合從而形成捕獲的CD4;b)將捕獲部分與這樣的第二結(jié)合試劑接觸，所述的第二結(jié)合試劑與CD4結(jié)合(包括與細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合)并且其包含檢測(cè)標(biāo)記或其能夠與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三或隨后的結(jié)合伴倡結(jié)合；c)任選地，將第二結(jié)合試劑與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三或隨后的結(jié)合試劑接觸；評(píng)估檢測(cè)標(biāo)記的存在。對(duì)于對(duì)照多肽來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，對(duì)照多肽為至少包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CD4多肽。關(guān)于CD4細(xì)胞的數(shù)目，在一些實(shí)施方案中，其為小于200，小于250,大于250，250至350，350至500,250至500和大于500個(gè)細(xì)胞/|a1血液中的一種或多種。在其他實(shí)施方案中，CD4T細(xì)胞的數(shù)目為少于200，少于500,500至1000，1000至2000，和大于2000個(gè)細(xì)胞/iu1血液中的一種或多種。如果需要，可以用多種方法從血細(xì)胞中除盡單核細(xì)胞或紅細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將樣品與結(jié)合到固體或半固體支持物的抗CD14抗體接觸來(lái)除盡樣品中的單核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將樣品與結(jié)合到固體或半固體支持物的抗血型糖蛋白抗體接觸來(lái)除盡樣品中的紅細(xì)胞。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了適合于實(shí)施主題方法的裝置或試劑盒。在一些實(shí)施方案中，提供了層析裝置，其包括具有這樣的孔徑的材^K所述的孔徑允許或促進(jìn)該方法的組分的毛細(xì)流動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，該裝置包括這樣的部分，所述部分包含不同孔徑的材料，或非多孔材料，緊鄰第一材料并且設(shè)計(jì)用于回收樣品或回收或儲(chǔ)存該方法的組分的材料。在一些實(shí)施方案中，層析裝置的部分為分離的，緊鄰的或重疊的或設(shè)計(jì)成在使用中集合。在一些實(shí)施方案中，樣品墊層析法地與裝置的測(cè)試部分連接，所述測(cè)試部分包含抗體或其抗體結(jié)合片段。在舉例說(shuō)明性的實(shí)施方案中，受試者為哺乳動(dòng)物并且測(cè)試部分包含抗體，所述抗體在適宜的條件下識(shí)別并結(jié)合CSAP多肽的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，樣品墊層析法地與裝置的測(cè)試部分連接，所述測(cè)試部分包含抗體或其抗體結(jié)合片段。在舉例說(shuō)明性的實(shí)施方案中，受試者為哺乳動(dòng)物并且測(cè)試部分包含抗體，所迷抗體在適宜的條件下識(shí)別并結(jié)合包含Ig或Ig樣結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在其他實(shí)施方案中，CSAP為受體，例如但不限于細(xì)胞因子，激素或神經(jīng)遞質(zhì)受體，束綽配體，G蛋白偶聯(lián)受體，受體蛋白酪氨酸激酶，受體蛋白酪氨酸磷酸酶，蛋白-絲氨酸/蘇氨酸激酶和受體鳥苷酸環(huán)化酶。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)待測(cè)試的樣品的層析活性部分從樣品墊移向并通過(guò)測(cè)試部分時(shí)，包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CSAP被捕獲到裝置的測(cè)試或?qū)φ詹糠植⑶襾?lái)自樣品墊的樣品的剩余部分不被捕獲。這種安排確保在該實(shí)施方案中基本上只有待檢測(cè)的非可溶CSAP允許與檢測(cè)抗體相互作用，因此，其可以關(guān)注于可溶或非可溶CSAP。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用與CSAP的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體檢測(cè)CSAP以避免與和CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體所用的位點(diǎn)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試樣品的未捕獲的組分層析法地收集到吸收墊中，所述的吸收墊位于所涉及的測(cè)試部分的任意方向?？梢酝ㄟ^(guò)例如選擇合適的網(wǎng)眼或孔徑的墊和/或通過(guò)包含特定試劑例如抗體或凝集素以結(jié)合和保留這些組分來(lái)將受試者樣品的組分，例如紅細(xì)胞或特定的白細(xì)胞保留在樣品墊中。例如可以用抗CD14抗體保留單核細(xì)胞?？寡吞堑鞍卓贵w可以用于保留/除去紅細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，一旦免疫層析裝置的測(cè)試部分暴露于受試者樣品中的CSAP,通過(guò)允許^r測(cè)標(biāo)記和測(cè)試部分接觸，該方法開始進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記儲(chǔ)存在分離的檢測(cè)標(biāo)記墊中。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記包括視覺(jué)可檢測(cè)報(bào)告分子并且在免疫層析裝置的測(cè)試和/或?qū)φ詹糠种?，?yáng)性結(jié)果基本上可以立即被觀察到。在其他實(shí)施方案中，可以使用另外的檢測(cè)方案和裝置(例如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的那些)檢測(cè)檢測(cè)標(biāo)記。例如，除膠體金以外，如本文所示例的，方便地使用其他膠體金屬或金屬氧化物顆?；蚰z體非金屬顆?；蛉玖匣蛴猩槟z。在舉例說(shuō)明性實(shí)施方案中，本說(shuō)明書描述了用于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)來(lái)自受試者的樣品中的細(xì)胞數(shù)目的試劑盒，其中所述細(xì)胞的特征在于包含含有細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白(CSAP)。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括(i)層析裝置，其包括與樣品部分可操作連接的多孔膜，測(cè)試(捕獲)部分，綴合部分，吸取部分，任選地對(duì)照部分和任選地裂解部分；(ii)CSAP結(jié)合試劑，例如與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述試劑或抗體固定(結(jié)合)于一個(gè)或多個(gè)測(cè)試部分和/或包含在綴合部分內(nèi)；和(iii)使用裝置以檢測(cè)或監(jiān)測(cè)樣品或受試者中具有CSAP的細(xì)胞的水平或存在的說(shuō)明書。在另外的非限制性的舉例說(shuō)明性實(shí)施方案中，所述試劑盒包括(i)層析裝置，其包括與樣品部分可操作地連接的多孔膜，測(cè)試(捕獲)部分，綴合部分，吸取部分，任選地對(duì)照部分和任選地裂解部分；(ii)CD4結(jié)合試劑，例如與CD4細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述試劑或抗體固定(結(jié)合)于一個(gè)或多個(gè)測(cè)試部分和/或包含于綴合部分內(nèi)；和(Hi)使用裝置以檢測(cè)或監(jiān)測(cè)樣品或受試者中CD4細(xì)胞的水平或存在的說(shuō)明書。當(dāng)然，此類試劑盒可以以任何合適的形式存在，例如反向或側(cè)向流動(dòng)的免疫層析形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，綴合部分包含可視的檢測(cè)標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，對(duì)照部分包含預(yù)先確定數(shù)量的對(duì)照多肽，當(dāng)與可視的檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合時(shí)，其足以產(chǎn)生信號(hào)，提供與由預(yù)先確定數(shù)目的細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)等價(jià)的內(nèi)標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照部分包含預(yù)先確定量的至少包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的對(duì)照CD4多肽，當(dāng)與可視檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合時(shí)，其足以產(chǎn)生信號(hào)，提供預(yù)先確定數(shù)目的CD4細(xì)胞的可視標(biāo)準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，CD4多肽是缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的重組CD4。對(duì)于CD4T細(xì)胞的評(píng)估，在一些實(shí)施方案中，該試劑盒有利地提供一種或多種以下的預(yù)先確定的數(shù)目小于200,小于250,大于250，250至350，350至500，250至500和大于500個(gè)細(xì)胞/y1血液。可選地，預(yù)先確定的數(shù)目為小于200，小于500，500至1000，1000至2000，和大于2000個(gè)細(xì)胞/jj1血液中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中除去紅細(xì)胞和/或單核細(xì)胞并且試劑盒使用試劑以實(shí)現(xiàn)紅細(xì)胞和/或單核細(xì)胞的除盡。在一些實(shí)施方案中，樣品墊包含紅細(xì)胞捕獲試劑(例如血型糖蛋白A)和/或抗CD14磁珠，其他單核細(xì)胞特異性試劑。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)確定廉價(jià)的或一次性磁體在本免疫層析試紙條中有效地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離。在一些實(shí)施方案中，所用的磁體具有小于約5mm的通過(guò)樣品的磁場(chǎng)強(qiáng)度范圍。在一些實(shí)施方案中，磁體包括在試劑盒中。在一些實(shí)施方案中，磁性材料連接或可連接到樣品墊或免疫層析裝置的能夠接觸到樣品墊的部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在試劑盒中評(píng)估具有CSAP的細(xì)胞的數(shù)目，其通過(guò)(i)在一定條件下，將來(lái)自受試者的測(cè)試樣品用于樣品部分，在所述條件中，具有CSAP的細(xì)胞流過(guò)捕獲部分流向吸取部分；(ii)使用可視檢測(cè)標(biāo)記直接或間接地檢測(cè)捕獲部分中捕獲的CSAP的存在；和(iii)將(ii)中檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)的強(qiáng)度與對(duì)照部分的信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行比較，所述的對(duì)照部分包含對(duì)照多肽，提供與由預(yù)先確定數(shù)目的具有CSAP的細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)等價(jià)的內(nèi)標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試樣品與裂解緩沖液接觸或通過(guò)能夠裂解或透化具有CSAP的細(xì)胞的裂解部分。缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的重組CD4用作或適于用作所述方法或試劑盒中的對(duì)照以確定CD4T細(xì)胞的數(shù)目。因此，本發(fā)明預(yù)期缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的重組CD4在制備用于定量來(lái)自受試者的樣品中CD4T細(xì)胞的數(shù)目的固體或半固體支持物或試劑盒中的用途。在一些實(shí)施方案中，主題方法和/或試劑盒用于評(píng)估AIDS或其他免疫缺陷疾病患者。在一些實(shí)施方案中，受試者為人。然而，本發(fā)明擴(kuò)展到靈長(zhǎng)類，家畜動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物，伴侶動(dòng)物和鳥類還有非哺乳動(dòng)物，例如爬行類動(dòng)物。因此，該方法用于人，家畜，獸醫(yī)和野生動(dòng)物治療和診斷。本發(fā)明進(jìn)一步以分割為若干部分的形式提供試劑盒，其包括進(jìn)行主題方法所需的試劑和層析裝置。通常，所述試劑盒還包含一套說(shuō)明書。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于評(píng)估來(lái)自受試者的樣品中的水平或存在或具有CSAP的細(xì)胞的水平或存在的試劑盒，其以分割為若干部分的形式包含免疫層析裝置，所述的免疫層析裝置包含回收樣品的部分，回收或包含檢測(cè)標(biāo)記的部分，及包含試劑(例如與在細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白(CSAP)的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段)的裝置的測(cè)試和對(duì)照部分。在一些實(shí)施方案中，所述裝置的部分是分離的，緊鄰的或重疊的。在一些實(shí)施方案中，試劑盒使用反向流動(dòng)免疫層析。在其他實(shí)施方案中，試劑盒使用側(cè)向流動(dòng)免疫層析。在一些實(shí)施方案中，CSAP為特定細(xì)胞類型的標(biāo)記，例如包含Ig或Ig樣結(jié)構(gòu)域的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞標(biāo)記選自分化簇(CD)抗原。在示例性的實(shí)施方案中，CSAP為CD4。在本發(fā)明的這一方面中，CD4或具有CD4的細(xì)胞的水平是受試者需要抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的指標(biāo)。特別地，在患有HIV感染的受試者的情況下，小于約200個(gè)細(xì)胞/n1血液或小于250個(gè)細(xì)胞/y1血液的水平表示需要抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，提供了這樣的免疫層析裝置，其允許在i降床有用的范圍中，例如小于250,大于250，250至350，350至500,250至500和大于500個(gè)細(xì)胞/ja1血液，定量評(píng)估CD4T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，這些范圍或其修改版本(amendedversions)用于監(jiān)測(cè)HIV患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，適合于監(jiān)測(cè)兒科HIV患者的裝置允許定量評(píng)估少于500，500至1000，1000至2000，和大于2000個(gè)細(xì)胞/y1血液的CD4T細(xì)月包。在另一個(gè)實(shí)施方案中，CSAP為受體，例如細(xì)胞因子，激素或神經(jīng)遞質(zhì)的受體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，受體為TNF受體。本文涉及的術(shù)語(yǔ)"造血細(xì)胞，，包括未分化的造血干細(xì)胞(HSC)和任意一種或多種源自HSC的血細(xì)胞類型。該術(shù)語(yǔ)涉及多潛能細(xì)胞和最形式的髓性或淋巴性多能細(xì)胞(myeloid-orlymphoid-restrictedcell)。在成人中，HSC存在于骨髓，外周血，肺，肝，脾和其他器官中。HSC為祖細(xì)胞等級(jí)(hierarchy)的第一級(jí)。它們能夠長(zhǎng)期自我更新(長(zhǎng)期(LT)-HSC)。LT-HSC分化為短期多潛能HSC(ST-HSC),其保留產(chǎn)生所有血細(xì)胞類型的能力但是只增殖相對(duì)短的時(shí)間。其次，產(chǎn)生淋巴祖細(xì)胞(其最終產(chǎn)生免疫細(xì)胞)，以及產(chǎn)生骨髓祖細(xì)胞(其最終主要產(chǎn)生紅細(xì)胞和血小板及一些先天性免疫細(xì)胞)。這些祖細(xì)胞具有不同的增殖和分化能力并且從這些細(xì)胞最終產(chǎn)生終末分化細(xì)胞。因此，涉及的HSC和造血祖細(xì)胞包括所有上述祖細(xì)胞并且涉及的造血或血細(xì)胞包括它們的任何終末分化后代(descendant)。這些包括但不限于HSC，造血干細(xì)胞；CLP,淋巴共同前體細(xì)胞(函畫lymphoidprecursor);CMP，髓共同前體細(xì)胞(commonmyeloidprecursor);GMP，粒細(xì)胞巨鬼細(xì)胞前體(granulocyte-macrophageprecursor);MEP,巨核細(xì)胞-類纟工纟田月包前體(megakaryocyte—erythroidprecursor);CFU—GM，4立纟田月包/巨#纟田月包集落生成單4立(colonyformingunit-granulocytic/macrophage);CFU-G，粒細(xì)胞集落生成單位(colonyformingunit-granulocytic);CFU-M,巨口盆細(xì)月包集落生成單位(colonyforming皿it-macrophage);CFU-Mk,巨核細(xì)胞集落生成單位(colonyformingunit-raegakaryocytic);BFU-e，類纟工纟田月包火暴發(fā)集落開j成單^f立(Burst—forminguniterythroid);和CFU-E，類紅細(xì)胞集落生成單位(colonyformingunit-erythroidcells)，和它們的后4戈。本文涉及的"CD"蛋白或多肽包括一種或多種選自以下的CD抗原CDla，b，c，d，CD2，CD3，CD4，CD5，CD6,CD7，CD8,CD9,CD10,CDlla，CDllb，CDllc，CDlld，CDwl2,CD13，CD14,CD15,CD15s，CD15u，CD16，CDwl7，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25,CD26，CD28，CD29，CD30,CD31，CD32，CD33,CD34,CD35，CD36，CD37，CD38,CD39，CD40,CD41,CD42a,b，c，d，CD43,CD44，CD45，CD45R0，CD45RA，CD45RB，CD46，CD47，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e,CD49f,CD50，CD51，CD52,CD53,CD54，CD55，CD56，CD57，CD58,CD59，CD60a，CD60b，CD60c，CD61,CD62E，CD62L，CD62P，CD63，CD64CD65，CD66a，CD66b，CD66c，CD66d，CD66e，CD66f，CD68，CD69，CD70CD71,CD72,CD73,CD74，CD75,CD75s，CD77，CD79a,P，C謂，CD81CD82,CD83，CDw84，CD85，CD86,CD87,CD88,CD89，CD90，CD91，CD92,CD93，CD94,CD95，CD96,CD97，CD98,CD97，CDIOO，CD101,CD102，CD103，CD104，CD105，CD106，CD107a，CD107b，CD108,CD109CDllO，CDlll，CD112,CD114,CD115,CD116,CD117,CD118,CD119,CD120a，CD120b，CD121a，CDwl21b,CD122,CD123,CD124,CD125,CD126,CD127,CDwl28，CD129，CD130，CDwl31，CD132,CD133,CD134CD135，CDwl36，CDwl37，CD138,CD139,CD140a，b，CD141，CD142，CD143,CD144,CD145,CD146,CD147，CD148，CD150，CD151，CD152，CD153,CD154,CD155，CD156a，CD156b，CD157,CD158,CD158a，CD158b，CD159a，CD160,CD161，CD162，CD162R，CD163,CD164,CD165,CD166，CD167a，CD168,CD169,CD170,CD171,CD172a，CD173CD174,CD175,CD175s，CD176，CD177，CD178，CD179a，CD179b，CD180，CD183，CD184，CD195，CDwl97,CD200,CD201,CD202b，CD203c，CD204,CD205,CD206,CD207,CD208,CD209,CDw210，CD212CD213al，CD213a2,CDw217，CD220，CD221，CD222，CD223，CD224，CD225,CD226,CD227,CD228，CD229，CD230,CD231,CD232,CD233，CD234，CD235a，CD235b，CD236，CD236R，CD238，CD239,CD240CE,CD240D，CD241,CD242,CD243,CD244,CD245,CD246和CD247。此類分子和在其上發(fā)現(xiàn)此類分子的細(xì)胞在Janeway爭(zhēng)乂，J/7/e/^/x//.C"〃ge/7S,Imnmnology，GarlandPublishing,NewYork,5thedition,2001中描述，其以其全文通過(guò)引用并入本文。本文涉及的"層析裝置"包括本領(lǐng)域已知的用于促進(jìn)或支持層析流動(dòng)或分離的任何固體，半固體，基質(zhì)或凝膠材料的的裝置。如本文所用的，樣品的組分(包括抗體)，和檢測(cè)標(biāo)記-抗原復(fù)合物和其組分，通過(guò)毛細(xì)流動(dòng)或經(jīng)由層析材料的擴(kuò)散相對(duì)于彼此移動(dòng)?？梢怨倌芑虬徊牧弦栽试S例如試劑的交聯(lián)。用于將抗體固定到固體支持物的方法是本領(lǐng)域公知的并且例如在美國(guó)專利4，168,146，Cautrecases/.i^i":3059，1970中描述。預(yù)期用于本文的材料包括無(wú)機(jī)材料，例如二氧化硅，玻璃，聚合材料例如纖維素，淀粉，右旋糖，瓊脂糖，特殊的纖維紙(過(guò)濾/層析紙)，硝酸纖維素，醋酸纖維素，PVC,聚丙烯酰胺，多糖，聚丙烯酸酯，聚乙烯基磺酸酯(polyethylensulphonate)，聚乙烯等。"層析活性"組分簡(jiǎn)單地指能夠流經(jīng)免疫層析裝置的全部或部分的組分。本文涉及的"得自"、"源自"表示樣品獲得自特定來(lái)源但并非必須直接來(lái)自該來(lái)源。"抗體"包括與抗原相互作用的免疫球蛋白基因產(chǎn)物，即抗原結(jié)合試劑，其片段和得自非免疫球蛋白基因的能夠用作抗原結(jié)合試劑的蛋白分子。因此，術(shù)語(yǔ)抗體包括多克隆和單克隆抗體和其部分，包括Fab部分和抗原結(jié)合決定簇。免疫球蛋白基因包括k，入，a，y，(IgG,，IgG2，IgG3，IgG4，)5，e，和m恒定區(qū)和多種可變區(qū)基因。通常，免疫球蛋白包含兩對(duì)相同的免疫球蛋白鏈，每對(duì)包含具有抗原結(jié)合區(qū)的輕鏈(Vl)和重鏈(VH)可變部分。每對(duì)還包含提供種屬(generic)抗體功能的恒定區(qū)。免疫球蛋白的其他形式為Fv，scFv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab'，和(Fab')2形式。涉及的抗體的"類(class)"包括涉及的任何類例如IgM,IgG，IgA等。快速而精確地確定CD4+細(xì)胞水平的能力對(duì)于評(píng)估受試者響應(yīng)抗病毒劑或發(fā)起免疫反應(yīng)的能力是重要的。如本文所用的，涉及的"檢測(cè)"，"評(píng)估"，"計(jì)數(shù)"指它們的最廣泛的意思以包括這樣的測(cè)定，其在sCSAP存在下對(duì)CSAP的存在或水平和由此的CSAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行定性地或定量地或半定量地測(cè)試，或其通過(guò)使用能夠區(qū)別CSAP和sCSAP的試劑定性或定量測(cè)試CSAP和sCSAP的存在或水平。層析測(cè)定特別成熟并且可以使用很多不同的形式，其經(jīng)裁制適合于任何特別的研究中所需要的特別的試劑和儀器和結(jié)果。使用層析原理的"快速"測(cè)定經(jīng)裁制適合于精確，快速和容易地使用。特別優(yōu)選免疫測(cè)定或基于酶的層析測(cè)定并且這些在WildD"TheImmunoassayHandbook'1,NaturePublishingGroup,2001中描述并且可參考并入本文的美國(guó)專利4,016,043;4，590，159;5，266，497;4,962,023;5,714,389;5，877，028，5，922，537，6,168,956和6，548，309,6,180,417，和5,266,497以及其中引用的文獻(xiàn)所公開的信息。免疫層析方法的各種改進(jìn)在公開的美國(guó)專利申請(qǐng)20010006821，20040087036和20040214347中描述，其以其全文通過(guò)引用并入本文。20030165970中描述。"檢測(cè)標(biāo)記"或"報(bào)告分子"指這樣的分子或顆粒，所述分子或信號(hào)。如所公認(rèn)的，可以使用大量不同的報(bào)告系統(tǒng)并且允許快速的可視檢測(cè)的那些報(bào)告系統(tǒng)顯然在即席檢驗(yàn)診斷的環(huán)境中是最有用的。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記為膠體顆粒或微粒。膠體金屬和類金屬顆粒包括包含金，銀，鉑，鐵，銅，硒的那些顆粒；金屬?gòu)?fù)合物(例^口三叛基5不戊二歸4孟(I)(cyclopentadienylmanganese(I)tricarbonyl),金蔟(goldcluster));和微粒(例如乳月交和染色的乳膠顆粒)。本發(fā)明擴(kuò)展到^^泉刑例如酶，定量檢測(cè)。在酶免疫測(cè)定的情況下，酶通常通過(guò)戊二醛或高碘酸與第二抗體綴合。常用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶，葡萄糖氧化酶，e半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。與特異性酶一起使用的底物通常就可檢測(cè)的顏色變化的產(chǎn)生(基于由相應(yīng)的酶進(jìn)行的水解)進(jìn)行選擇。合適的酶的實(shí)例包括堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶。還可以使用熒光底物，其產(chǎn)生焚光產(chǎn)物而非上述生色底物。在所有情況下，將酶標(biāo)記的抗體添加到第一抗體抗原復(fù)合物，允許它們結(jié)合，并且清洗掉過(guò)量的試劑。然后，將包含合適的底物的溶液添加到抗體-抗原抗體復(fù)合物。底物將與連接至第二抗體的酶反應(yīng)，產(chǎn)生定性的可視信號(hào)，其可以進(jìn)一步定量(通常利用分光光度法定量)以提供存在于樣品中的抗原的數(shù)量的指示?？蛇x地，將熒光化合物，例如熒光素和羅丹明化學(xué)偶聯(lián)至抗體而不改變它們的結(jié)合能力。當(dāng)通過(guò)照射特定波長(zhǎng)的光進(jìn)行激活時(shí)，熒光染料標(biāo)記的抗體吸收光能誘導(dǎo)分子的可激發(fā)的狀態(tài)，接著發(fā)出用顯微鏡視覺(jué)可檢測(cè)的具有特征性波長(zhǎng)的光。涉及的"抗體"包括人源化的，重組的，合成的，雜合的和單鏈抗體?？贵w可以方^f更地進(jìn)行制備和使用，如例如在Harlow和Lane，"爿/〃6ofl7es,.爿Za6or"or/船/wa/"(ColdSpringHarborLaboratory,1988)中所述。單克隆抗體可以方便地以純化形式大量制備。用于生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系通過(guò)融合敏化的淋巴細(xì)胞和永生細(xì)胞系并且選擇特異性抗體產(chǎn)生細(xì)胞來(lái)制備，該制備如Harlow和Lane(同上)；以及Kohler和Milstein，Awrc^ea//c^r朋7ofT/柳W70/0《7,(5:511-519，1976中所述，其在該領(lǐng)域中是常規(guī)的。用于構(gòu)建噬菌體抗體展示文庫(kù)和入噬菌體表達(dá)文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域公知的(Kang等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:4363，1991;Clacks。n等人，Nature,352:624，1991;Lowman等人，Biochemistry,30:10832，1991;Burton等人，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,88:10134，1991;Hoogenboom等人，NucleicAcidsRes.,19:4133，1991，以其全文通過(guò)引用并入本文)。一個(gè)特別有利的方法使用scFv嗟菌體文庫(kù)(Huston等人.，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,85:5879—5883，1988;Chaudhary等人，Proc,Natl.Acad.Sci.U,S,A.，87:1066—1070，1990;Clackson等人，1991，(同上))。展示在噬菌體外殼蛋白上的scFv文庫(kù)的各種實(shí)施方案已經(jīng)被描述。其他的噬菌體展示方法也是已知的，例如，如國(guó)際公開號(hào)WO96/06213和WO92/01047(MedicalResearchCouncil等人)和國(guó)際公開號(hào)WO97/08320(Morphosys)中所述，其通過(guò)引用并入本文。可以克隆并在例如酵母的表面上表達(dá)抗體單鏈Fv片l殳。通過(guò)篩選和分選來(lái)選擇高親和力的scFv。使用鏈替換策略開發(fā)高親和力抗體，即通過(guò)用來(lái)自未免疫供體的全套(repertoire)v-基因順序取代重鏈和輕鏈可變(v)區(qū)基因。可以使用來(lái)自任何物種的包含csFv的抗體。展示系統(tǒng)特別有用，其使得能夠?qū)⒑怂徇B接至它表達(dá)的多肽。用于從大文庫(kù)分離期望的成員的選擇方案是本領(lǐng)域已知的，如由噬菌體展示技術(shù)所代表的。此類系統(tǒng)(其中不同的肽序列展示在絲狀噬菌體的表面上)用于產(chǎn)生抗體片段(和編碼它們的核苷酸序列)的文庫(kù)，所述文庫(kù)用于體外選擇和擴(kuò)增與靶抗原結(jié)合的特異性抗體片段。編碼Vh和VL區(qū)的核普酸序列與這樣的基因片段連接，所述的基因片段編碼將它們導(dǎo)向大腸桿菌(E.coli)的周質(zhì)空間的前導(dǎo)信號(hào)從而所得的抗體片段展示在噬菌體的表面上(通常與噬菌體外殼蛋白(例如pIII或pVIII)融合)?？蛇x地，抗體片段外向地展示在入噬菌體衣殼(噬菌體)上?；谑删w的展示系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于所選擇的文庫(kù)成員可以通過(guò)在細(xì)菌細(xì)胞中培養(yǎng)包含所選擇的文庫(kù)成員的噬菌體容易地進(jìn)行擴(kuò)增。此外，由于編碼多肽文庫(kù)成員的核苷酸序列包含在噬菌體或噬菌粒載體上，因此，測(cè)序，表達(dá)和后續(xù)的遺傳操作相對(duì)容易。本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)下列非限制性實(shí)施例進(jìn)行描述。實(shí)施例1抗CD4的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的多克隆和單克隆抗體在綿羊中產(chǎn)生抗兩種人CD4胞外結(jié)構(gòu)域亞序列P1和P2(SEQIDN0:1和SEQIDNO:2)的抗CD4多克隆抗體。肽序列和肽在細(xì)胞質(zhì)CD4序列中的位置在圖2中展示。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，用P1和P2注射兩只綿羊，G-6和G-7。使用固定的生物素化的肽通過(guò)ELISA確定并使用與辣根過(guò)氧化物酶綴合的鏈霉親合素檢測(cè)抗CD4。yt。的多克隆抗體的特異性和滴度。結(jié)果在圖3(A)綿羊G-6和(B)綿羊G-7中進(jìn)行圖示。來(lái)自任一綿羊的血清同等良好地識(shí)別肽1和肽2(見(jiàn)圖4)。還產(chǎn)生抗肽2的單克隆抗體并且通過(guò)ELISA測(cè)試其抗CD4eyt。的肽2(見(jiàn)圖5)。在免疫熒光測(cè)定中，在HeLa細(xì)胞和JC53T細(xì)胞上測(cè)試單克隆抗體1D2和4B4的反應(yīng)性。兩種單克隆抗體(10微克每微升)都沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)HeLa細(xì)胞的反應(yīng)性。然而，抗體識(shí)別固定的T細(xì)胞上的細(xì)胞內(nèi)組分。識(shí)別CD4的胞外結(jié)構(gòu)域的SIM2單克隆抗體不識(shí)別HeLa細(xì)胞但在IO微克每微升的濃度下表現(xiàn)出與JC53細(xì)胞的表面結(jié)合。如所預(yù)期的，單克隆抗體1D2和4B4不能結(jié)合新鮮的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞(圖6)。相反，單克隆抗體1D2和4B4都檢測(cè)透化的(permeablised)細(xì)胞(見(jiàn)圖7C和D)?？梢詮牟煌锓N產(chǎn)生抗CD4分子的抗體或抗原結(jié)合片段。在舉例說(shuō)明性的實(shí)例中來(lái)自小鼠，兔，雞，綿羊的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列提供如下。人CD4:421rcrh;r;rrqaermsqikrllsek)ctcqcphrfqktcspi"8i"7小鼠CD4:420rcrhj^rqa§rmsqikrllsekktcqcphr^)qk|shnl兔CD4:422園crhrrgqaqrmsqikgllsekktcqcphrfljqktlynlll^雞CD4:455rj^^|rrp^]arrmgqgk]^l國(guó)ekktcqc回r0k487綿羊CD4:"ar;rrqaermsqikxllsekktcqcphr國(guó)qkt園s[^455加框的殘基突出人CD4和其他物種CD4之間的區(qū)別。Key:人&小鼠(~79%的保守序列30/38)人&兔(~76%的保守序列29/38)人&雞(~55%的保守序列18/33)人&綿羊(~84%的保守序列32/38)NB.序列"ekktcqc"為推定的p56'"結(jié)合位點(diǎn)，在所有物種中保守。實(shí)施例2CD4ELISA開發(fā)CD4捕獲ELISA以允許定量細(xì)胞結(jié)合CD4而不受缺失細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶CD4的干擾?？笴D4細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的抗體用作"捕獲"抗體，其與作為"檢測(cè)"抗體的抗CD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體結(jié)合使用。只測(cè)量細(xì)胞結(jié)合CD4而排除缺失細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶CD4或被抗CD4。yt。的抗體識(shí)別的表位。CD4捕獲ELISA表現(xiàn)出與流式細(xì)胞術(shù)緊密關(guān)聯(lián)并且適于提供如本文所示的快速即席檢驗(yàn)診斷測(cè)試。圖9展示測(cè)量抗CD4細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，包括商業(yè)可獲得的抗CD4單克隆抗體(Chemicon)的反應(yīng)性的ELISA的結(jié)果。產(chǎn)生抗如圖2中所示的肽l(SEQIDNO:1)和肽2(SEQIDNO:2)抗體。圖IO展示測(cè)量抗CD4細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體1D2的特異性和從JC53細(xì)胞裂解物捕獲CD4的能力的捕獲ELISA的結(jié)果和用抗CD4胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體(PMT4)檢測(cè)的結(jié)果。圖11展示測(cè)量抗CD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體1D2的特異性和從JC53細(xì)胞裂解物捕獲CD4的能力的捕獲ELISA的結(jié)果和用抗CD4的胞外結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體檢測(cè)的結(jié)果。圖12展示來(lái)自供體外周血單核細(xì)胞(PBMC)的細(xì)胞CD4的捕獲ELISA的結(jié)果。A)展示由單克隆抗體4B4從供體1至6捕獲的PBMC裂解物的滴定。B)展示富含細(xì)胞CD4的淋巴細(xì)胞的捕獲。在舉例說(shuō)明性實(shí)施方案(ELISA方案)中，標(biāo)準(zhǔn)量的包含細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的CD4在PBS+0.5%Tween2Q中稀釋用作對(duì)照。將全血或稀釋的血液添加到等體積的包含10%Triton-X100裂解緩沖液的裂解緩沖液中并且分配到用抗CD4cyt?？贵w包被的標(biāo)準(zhǔn)ELISA板的指定孔中。密封ELISA板并且在室溫(18至23DC)下溫育60分鐘?？笴D4胞外結(jié)構(gòu)域的生物素化的抗CD4單克隆抗體在0.05%Tween20中進(jìn)行稀釋以得到0.25微克每微升的終濃度。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA清洗緩沖液清洗ELISA板并且排干然后往各個(gè)孔添加稀釋的抗CD4生物素化單克隆抗體100樣￡升。密封平板并且在室溫下溫育60分鐘。之后，用ELISA清洗緩沖液清洗平板(6次)并且排干。鏈霉親合素-辣根過(guò)氧化物酶綴合物以1:1000稀釋于PBS0.05%Tween20中并且往各個(gè)孔添加IOO微升。密封ELISA板并且在室溫下溫育60分鐘。之后，在根據(jù)廠商說(shuō)明書添加稀釋于底物緩沖液中的酶生色(chromogene)底物四曱基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzldine)(TMB)之前，清洗平板并且排干。允許酶反應(yīng)在黑暗中在室溫下進(jìn)行大約15分鐘并且在底物溫育結(jié)束時(shí)，向各個(gè)孔添加100微升原液(stocksolution),之后使用具有450毫米濾光器和620毫米濾光器的雙人ELISA酶標(biāo)儀(ELISAreader)讀取平板的光密度作為參考。計(jì)算平均標(biāo)準(zhǔn)偏差和。/。CV并且使用散點(diǎn)圖產(chǎn)生平均OD讀數(shù)(reading)。實(shí)施例3捕獲ELISA測(cè)定展示0D和CD4+T細(xì)胞的數(shù)目之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行來(lái)自供體外周血單核細(xì)胞(PBMC)的細(xì)胞CD4的ELISA并且結(jié)果示于圖13和圖14中。來(lái)自三個(gè)供體的結(jié)果示于圖13上并且展示OD450-620和每微升CD4+T細(xì)胞數(shù)目之間的關(guān)聯(lián)。來(lái)自5個(gè)單獨(dú)的HIV感染患者的臨床樣品的結(jié)果示于圖14中并且證明OD450-620和每微升全血的CD4+T細(xì)胞的數(shù)目之間的正關(guān)聯(lián)。實(shí)施例4根據(jù)本發(fā)明的使用抗CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的抗體的免疫層析裝置免疫層析或免疫成像裝置提供了在由全世界很多不同公司生產(chǎn)的大量的快速的即席檢驗(yàn)診斷測(cè)試中使用的有力的技術(shù)。其在生產(chǎn)能力上過(guò)剩并且在目標(biāo)國(guó)家中使該技術(shù)容易被接受。已經(jīng)使用免疫層析裝置作為測(cè)試平臺(tái)以測(cè)量作為CD4T細(xì)胞數(shù)目的關(guān)聯(lián)物的細(xì)胞結(jié)合CD4。在于血液中))被排除。另外，在一些實(shí)施方案中，在主題測(cè)定中排除在單核細(xì)胞上表達(dá)的CD4。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)與各個(gè)試紙條中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行視覺(jué)比較，免疫層析裝置提供了CD4T細(xì)胞數(shù)目的定量評(píng)估(小于250，大于250，250至350，350至500，250至500和大于500個(gè)細(xì)胞每微升)。這滿足了目前用于成年患者開始使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的標(biāo)準(zhǔn)。具有檢測(cè)適當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)目的適當(dāng)?shù)姆椒ǖ钠渌臏y(cè)試用相同的方法進(jìn)行制備，其用于監(jiān)測(cè)兒科HIV患者，所述的兒科HIV患者具有平均較高的CD4T細(xì)胞數(shù)(即小于500，500至1000和1000至2000個(gè)細(xì)胞每微升)。因此，在圖15中示意性描述用于檢測(cè)全長(zhǎng)細(xì)胞結(jié)合CD4和評(píng)估CD4+細(xì)胞數(shù)目的免疫層析裝置。通過(guò)劃出由抗人CD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體組成的測(cè)試線，由抗小鼠IgG組成的對(duì)照線(或其他對(duì)照)，和在測(cè)定進(jìn)行期間提供指導(dǎo)的惰性限制線(inertlimitline)來(lái)制備多孔膜(例如硝酸纖維素)。將硝酸纖維素與下列裝配在一起在一端的"樣品墊"(樣品部分)，所述的樣品墊由多孔材料組成，對(duì)其應(yīng)用指定量的血液并且可以對(duì)其添加試劑以捕捉樣品中的紅細(xì)胞或單核細(xì)胞和其他外來(lái)物質(zhì)，包含裂解緩沖液的第二樣品墊(裂解部分)，和在另一端的"綴合墊"(綴合部分)，其由多孔材料組成，對(duì)其應(yīng)用由與抗CD4抗體綴合的檢測(cè)試劑組成的綴合物(檢測(cè)標(biāo)記)，和吸收材料(吸取部分)。在一些實(shí)施方案中，裂解步驟在某些情況下是任選的，例如當(dāng)使用能夠穿透細(xì)胞的抗體或其它試劑時(shí)或當(dāng)受試者患病并且無(wú)論如何，大部分特定細(xì)胞類型允許抗CSAP的試劑滲透通過(guò)時(shí)。實(shí)施例5全長(zhǎng)CD4和缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的重組可溶全長(zhǎng)CD4(7￥"0^)的克隆和表達(dá)要求CD4的ELISA和快速即席檢驗(yàn)測(cè)試定量或半定量測(cè)量存在于樣品中的細(xì)胞結(jié)合的和/或可溶/細(xì)胞外CD4的總量，提供CD4T細(xì)胞的數(shù)目的評(píng)估。為此，具有明確來(lái)源的CD4是有用的，其可以用于質(zhì)量控制并且用作測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。人T細(xì)胞或用全長(zhǎng)人CD4轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以用作CD4的來(lái)源，但是其產(chǎn)量可能不一致并且需要大量純化膜結(jié)合CD4分子。本發(fā)明人推斷，以可溶形式從細(xì)胞中釋放同時(shí)保留對(duì)于CD4捕獲ELISA中的反應(yīng)性來(lái)說(shuō)是必需的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的重組形式的CD4將更適用于該目的。本領(lǐng)域已知蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的缺失可以導(dǎo)致融合的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域-細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域蛋白的分泌。因此，制備缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的CD4變體，將其稱為TMACD4。該蛋白的示意性結(jié)構(gòu)示于圖1中。CD4序列獲得自T4pmV7質(zhì)粒，該質(zhì)粒獲得自NIHAIDSresearchandreferenceprogramCatNo158。為了制備CD4的可溶TMACD4形式，設(shè)計(jì)引物以便它們產(chǎn)生兩個(gè)單獨(dú)的PCR產(chǎn)物。第一產(chǎn)物使用引物RL1和RL3，產(chǎn)生1.2kb的條帶，其在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的5'末端具有EcoRl限制性位點(diǎn)并且在3，末端具有相應(yīng)于細(xì)胞質(zhì)尾的一些重疊序列。第二PCR產(chǎn)物使用引物RL2和RL4，產(chǎn)生120bp的條帶，其在細(xì)胞質(zhì)尾的5，末端具有一些重疊的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列并且在3，末端具有Xbal限制性位點(diǎn)。為了制備最終的PCR產(chǎn)物，將兩種PCR產(chǎn)物用作第三次PCR反應(yīng)的模板并且使用RL1和RL2引物。使用引物RL1和RL2與質(zhì)粒T4pmV7—起在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中產(chǎn)生全長(zhǎng)CD4構(gòu)建體。引物RL15'CGGGAATTCACAATGAACCGGGGAGTCCC(有義)SEQIDNO:3RL25,GGCTCTAGATCAAATGGGGCTACATGTCTTC(反義)SEQIDNO:4RL35，GCCTTCGGTGCCGGCACC丁CTGOiCaGG"(rCG4CC"幻SEQIDNO:5RL45'7TCCTGCTGGAGGTGCCGGCACCGAAGGC(有義)SEQIDNO:6引物RL1中的限制性位點(diǎn)EcoRl和引物RL2中的限制性位點(diǎn)Xbal為以粗體和下劃線突出。在引物RL3和RL4中的細(xì)胞外區(qū)域以粗體和斜體突出并且細(xì)胞質(zhì)尾為正常字體。將全長(zhǎng)CD4構(gòu)建體(FLCD4)和具有細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域而不具有TM區(qū)域的可溶CD4構(gòu)建體(CD4ATM)克隆到pcDNA4/HisMaxversionC(Invitrogen)的EcoRl和Xbal限制性位點(diǎn)之間。通過(guò)限制性消化和測(cè)序鑒別克隆。TMACD4的插入物和編碼的蛋白的完整的核苷酸序列和氨基酸序列分別示于圖16(SEQIDN0:7)和圖17中(SEQIDN0:8)。所詳述的序列的變體是預(yù)期的，例如得自不同的天然存在的序列或得自1個(gè)或多達(dá)20個(gè)核苷酸修飾或氨基酸修飾的那些變體。在一些實(shí)施方案中優(yōu)選導(dǎo)致保守氨基酸改變的修飾并且這些如在表2和3中所列出。實(shí)施例6TNTCD4在CD4捕獲ELISA和Western免疫印跡中的檢測(cè)通過(guò)ELISA和Western免疫印跡檢測(cè)重組TNTCD4(參見(jiàn)圖18)。通過(guò)各自的pcDNA4/HisMax構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染或模擬轉(zhuǎn)染在293T細(xì)胞中表達(dá)全長(zhǎng)CD4或TMACD4，并且使用所描述的方法，通過(guò)CD4ELISA測(cè)試細(xì)胞裂解物和細(xì)胞上清液。結(jié)果(參見(jiàn)圖18A)表明全長(zhǎng)CD4在細(xì)胞中有效表達(dá)但是沒(méi)有釋放到上清液中，而TMACD4在細(xì)胞中有效表達(dá)并且大部分重組蛋白釋放到上清液中，允許容易地純化(如果需要)。用抗CD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的定制的MAb4B4(3pg/ml)通過(guò)Western免疫印跡檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的TMACD4(參見(jiàn)圖18B)。實(shí)施例7在ELISA和快速即席檢驗(yàn)測(cè)定中作為對(duì)照試劑的TMACD4連續(xù)稀釋來(lái)自用TNTCD4質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的上清液(以1:5開始稀釋)以用于ELISA測(cè)定(A)(參見(jiàn)圖19),在ELISA中顯示出線性反應(yīng)，證明TNTCD4可作為對(duì)照試劑用于在CD4ELISA測(cè)定中評(píng)估總的CD4T細(xì)胞數(shù)目。例如，在相同的測(cè)定中測(cè)試四個(gè)不同的全血樣品(樣品IDS72，51，40，49)，并且使用所示的回歸曲線(紅色)或其他方法可以評(píng)估與標(biāo)準(zhǔn)相比較的CD4的相對(duì)量。為了能夠?qū)D4的量轉(zhuǎn)換為每微升的CD4T細(xì)胞的數(shù)目，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和ELISA多次測(cè)試全血的參比樣品，并與TMACD4標(biāo)準(zhǔn)相比較，從而允許確定正確的轉(zhuǎn)換因子(數(shù)據(jù)未顯示)。如圖19B中所示，通過(guò)免疫層析快速即席檢驗(yàn)測(cè)定，檢測(cè)來(lái)自兩個(gè)不同的穩(wěn)定的HEK293-TMACD4細(xì)胞系克隆(H5和F5)的上清液，表明TMACD4還可以在此類測(cè)定中用作陽(yáng)性對(duì)照試劑或標(biāo)準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，TNTCD4用作抗原用于制備Ab。實(shí)施例8在CD4T細(xì)胞數(shù)的評(píng)估中使用TMACD4作為標(biāo)準(zhǔn)的CD4捕獲ELISA和流式細(xì)胞術(shù)之間的強(qiáng)關(guān)聯(lián)使用重組TMACD4作為CD4ELISA的內(nèi)在測(cè)定對(duì)照，并且使用基于通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和ELISA平行測(cè)定參比樣品而確定的轉(zhuǎn)換因子，對(duì)于評(píng)估的CD4T細(xì)胞數(shù)目來(lái)說(shuō)，使用CD4ELISA與使用CD4流式細(xì)胞術(shù)相比獲得非常緊密的關(guān)聯(lián)。如圖20中所示，當(dāng)大于或小于250個(gè)T細(xì)月包每農(nóng)i升時(shí)，如加框區(qū)域中所示，所有的樣品都^皮正確鑒別。在該測(cè)定中，在通過(guò)ELISA測(cè)定全血的CD4T細(xì)胞之前，用CD14磁珠(DynabeadsCD14(DynalBiotechCatNo111.49))除去全血中的單核細(xì)胞。不除去單核細(xì)胞通常也可以獲得精確的數(shù)目。實(shí)施例9在快速即席檢驗(yàn)測(cè)定中CD4(ZTYY^)的量和信號(hào)強(qiáng)度之間的關(guān)聯(lián)使用重組TNTCD4，與測(cè)定中的TMACD4的量相比，在快速形式中，針對(duì)信號(hào)強(qiáng)度可以看到明顯的劑量-反應(yīng)曲線(參見(jiàn)圖21)。這證明TMACD4可作為對(duì)照試劑用于CD4測(cè)定的EUSA和快速即席檢驗(yàn)形式的制備，測(cè)試和質(zhì)量控制。本實(shí)施例還證明在測(cè)試的快速形式中，Chemicon3706抗細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域Mab和定制的4B4抗細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域Mab可以獨(dú)立地或作為混合物用于捕獲cytoCD4。此外，這證明快速形式中信號(hào)強(qiáng)度與樣品中的細(xì)胞結(jié)合CD4的量成比例，允許快速即席檢驗(yàn)形式用于CD4T細(xì)胞數(shù)目的定量或半定量評(píng)估。實(shí)施例10在快速即席檢驗(yàn)測(cè)定中CD4T細(xì)胞的數(shù)目和信號(hào)強(qiáng)度之間的關(guān)聯(lián)實(shí)際測(cè)試快速即席檢驗(yàn)測(cè)試形式的結(jié)果，以所示的每微升的細(xì)胞數(shù)目使用純化的T細(xì)胞(在測(cè)試線反應(yīng))(見(jiàn)圖22A)。通過(guò)用與抗生物素金綴合物直接反應(yīng)的生物素化的單克隆抗體劃條帶，制備與500個(gè)T細(xì)胞/微升和250個(gè)T細(xì)胞/微升等價(jià)的對(duì)照線?？捎^察到(參見(jiàn)圖22B)視覺(jué)區(qū)別允許樣品中的CD4T細(xì)胞的水平被正確地鑒別為大于或小于250個(gè)細(xì)胞每微升或大于或小于500個(gè)細(xì)胞每微升。在Millipore,90賄酸纖維素膜上用ChemiconMAb3706(測(cè)試線捕獲)以0.5mg/ml劃條帶進(jìn)行測(cè)試；樣品1%Tx100/PBS中的50)nLCD4十veT細(xì)胞；檢測(cè)13B8.2-生物素/抗生物素金。顯然，任何反應(yīng)性蛋白可以用作對(duì)照線，例如但不限于TNTCD4蛋白，或生物素化的蛋白或抗體或與選擇的檢測(cè)系統(tǒng)反應(yīng)的其他分子。還顯然的是，可以調(diào)整對(duì)照線和其他測(cè)定參數(shù)以允許檢測(cè)任何期望的每微升的細(xì)胞水平，例如可用于監(jiān)測(cè)兒科樣品的較高的水平(大約2000個(gè)細(xì)胞每微升或者甚至更高)。實(shí)施例11全血中CD4T細(xì)胞的快速即席檢驗(yàn)測(cè)定檢測(cè)圖23A提供全血CD4快速即席檢驗(yàn)測(cè)定的一個(gè)實(shí)施方案的圖示。使用本領(lǐng)域公知的方法通過(guò)RBC保留墊中的抗血型糖蛋白A(Epiclonant卜Nwith0.1%azardCatNo00992311(腿l)CommonwealthSer簡(jiǎn)Laboratories(CSL))捕獲紅細(xì)胞，而血漿和白細(xì)胞(包括CD4T細(xì)胞)流入去污劑浸漬的裂解墊，其中細(xì)胞被裂解并釋放CD4，其然后流入試紙條以與抗CD4CytoMab反應(yīng)，隨后用生物素抗CD4胞外Mab和抗生物素膠體金檢測(cè)(見(jiàn)圖23)。(B)在如A中所示的全血測(cè)定中測(cè)試包含高CD4T細(xì)胞水平(通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定為1452/pl)的全血的樣品，如通常在裂解墊中具有去污劑("+TX，，)，或從裂解墊除去去污劑("-TX")。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)存在去污劑例如Triton-XI00以裂解墊中的T細(xì)胞時(shí)，僅在快速測(cè)試中見(jiàn)到CD4信號(hào)(參見(jiàn)圖23)。這取決于抗CD4結(jié)合試劑的性質(zhì)并且可以透過(guò)細(xì)胞膜的試劑與可以透過(guò)細(xì)胞膜的檢驗(yàn)試劑一起不需要細(xì)胞裂解。(C)在CD4快速即席檢驗(yàn)測(cè)定中測(cè)定的代表性全血樣品的實(shí)例。展示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定的各個(gè)樣品的CD4的數(shù)量，并且在這一全血形式中可見(jiàn)高CD4T細(xì)胞數(shù)給出較強(qiáng)的信號(hào)而低CD4T細(xì)胞數(shù)給出弱的信號(hào)。實(shí)施例12除去特定細(xì)胞群(單核細(xì)胞)以防止在快速即席檢驗(yàn)測(cè)定中檢測(cè)它們單核細(xì)胞也包含CD4，在CD4T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其為大約10%的量，并且在基于CD4蛋白的測(cè)定中單核細(xì)胞的存在在一些情況下由于單核細(xì)胞CD4的影響可導(dǎo)致對(duì)CD4T細(xì)胞的4昔誤評(píng)估。在ELISA形式的測(cè)定中，可如上所述在測(cè)定前通過(guò)在本領(lǐng)域公知的方法中使用為此目的而設(shè)計(jì)的抗CD14磁珠和強(qiáng)磁體，從全血中除去單核細(xì)胞。該方法還可以用于即席檢驗(yàn)測(cè)定前的全血的預(yù)處理，但是為了即席檢驗(yàn)測(cè)試，要求優(yōu)選避免樣品的加工和處理。還沒(méi)有被描述過(guò)這樣的方法，該方法使他細(xì)胞類型。本發(fā)明人已設(shè)計(jì)出用于有效除去快速即席檢驗(yàn)測(cè)試的樣品墊中的單核細(xì)胞的方法。該方法利用令人驚訝的觀察結(jié)果，即通過(guò)在薄樣品塾中進(jìn)行磁性分離(通過(guò)在樣品墊上或下放置磁體)，使用弱得多的磁場(chǎng)(廉價(jià)的"冰箱磁體(fridgemagnet)")足以使已經(jīng)與磁珠反應(yīng)的細(xì)胞保留，而無(wú)須使用昂貴的強(qiáng)磁體(當(dāng)在樣品管中進(jìn)行保留時(shí)，其在本領(lǐng)域廣泛使用)。這將允許，例如在用于各個(gè)單獨(dú)的測(cè)定的廉價(jià)的，一次性使用的裝置中，或在用于進(jìn)行多次測(cè)定的廉價(jià)的多次使用的裝置或殼(housing)中包含合適的磁體。在一些實(shí)施方案中，磁體具有小于約5mm的磁場(chǎng)以便磁場(chǎng)擴(kuò)展通過(guò)免疫層析裝置的樣品墊但是不通過(guò)，例如在lcm或更大直徑的試管或容器中的所有細(xì)胞懸浮液。合適的》茲體的一個(gè)實(shí)例為鐵磁體，其在不存在磁場(chǎng)時(shí)保持磁化。在圖24中，分別除盡單核細(xì)胞)-單核細(xì)胞用綠色(MiniCellVueNIR815,PTIResearch,Inc)，PBL用紅色(MiniCellVueBurgundy,PTIResearchInc.)。圖像展示在LicorOdyssey紅外焚光掃描儀上經(jīng)不同濾光器觀察到的相同樣品墊(A)-組合濾光器，(B)=Em800，(C)-Em700。磁體使其中使用它的樣品墊的掃描變暗。將1.5xl(T個(gè)單核細(xì)胞(與磁珠結(jié)合)和2x104個(gè)除盡單核細(xì)胞的PBL組合并點(diǎn)樣到不具有(左)或具有(右)磁體的抗血型糖蛋白A包被的樣品墊上。用60ulPBS沖洗樣品以允許樣品流入吸收墊(此處用于代替實(shí)際的裂解墊和硝酸纖維素試紙條，用于舉例說(shuō)明性目的)。在存在磁體的情況下在圖(A)和(B)中可以看到保留〉80%的單核細(xì)胞(綠色)，而沒(méi)有綠色細(xì)胞進(jìn)入吸收墊，同時(shí)在存在或不存在磁體的(A)和(C)中證明除盡了單核細(xì)胞的PBL流入吸收墊。(D)展示如(A)-(C)中所示的測(cè)試的示意圖。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，在裂解或測(cè)定期望的細(xì)胞之前，類似的方法可用于在濾器或樣品墊形式中選擇性保留或富集任何細(xì)胞群。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本文描述的發(fā)明容許除了那些特別描述的變化和改進(jìn)以外的變化和改進(jìn)。應(yīng)理解本發(fā)明包括所有此類變化和步驟，特征，組合物和化合物，以及任意兩個(gè)或多個(gè)所述的步驟或特征的任意的和所有的組合。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>Ausubel(Ed)Cwrre"/iVo/ocoAy/"A/o/ecw/。r所o/ogy，5'hEdition,JohnWiley&Sons,Inc，NY，2002,BishopWfl/.,JWn/.Afe/Ao叔47:203-116.994.Burtone/</.，尸/w.WoW.Jco/.<SWf/5"乂，朋:1034'〗991,Chaudhary。/.,尸roc.Wo",/icorf"SA,《7:1066-1070,1990.ClacksonW。/"Wwwe,3":624，1991.Douillard肌dHofftn叫BasicFactsaboutHybridomas,inC柳pe"W謂o//順w"o/ogyVol.II,ed.bySchwartz,1981.Glorio-Paulete/a/J/^ncFoodC7ewM(5):1678-1682,2000,Janewaye/"/.,々戸rf/;c//.C￡)Jw/g抓，Immunology,GarandPublishing,NewYork,5"1edition,2001.HarlowandLatK，"/l"〃6orfi'es.'月￡a6ora/ofyA/aw/a/"ColdSpringHarborLaboratory,1988.Hoogenboomwa/.,W"c/e,"c/力/9:4133，1991.Hustonwa/.,戶roc.Wfl//./4corf.^:5879-5883,1988.K肌g/Voc.Wo,/.爿cW.aSA,199；KohlerandMi,stein,￡wn7/e""/o"w"/#/wwww/(gv,(:5-59,976.LowmanW。/.,firoc/w/n/W^,JO:10832,1991,Lyamuyawa/"J.Imm.Methods.,/W:103-112,訓(xùn).MacGregorC〃".A//croWo/.,即):1237-1243,簡(jiǎn)；S咖brook,胸ecu/。fC/o"/wg:/!￡a6ora/o"Mj卿/，3rdEdition,CSHLP,CSH,NY,2001.Paxtone,o/.,Clin,Diagn.Lab.Immunol.,2(1):104-114,1995.WildD."77ie/mwKmowoy〃o"必oofNaturePublishingGroup,2001.權(quán)利要求1.一種用于評(píng)估來(lái)自受試者的樣品中包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白(CSAP)的水平或存在或具有所述CSAP的細(xì)胞的水平或存在的方法，該方法包括(i)任選地，將樣品與能夠裂解或透化具有CSAP的細(xì)胞的試劑接觸；(ii)將樣品與CSAP結(jié)合試劑接觸，所述的CSAP結(jié)合試劑與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合；和(iii)直接或間接地評(píng)估樣品中結(jié)合的CSAP的水平或存在；和其中至少包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合的CSAP的水平或存在指示受試者中具有CSAP的細(xì)胞的數(shù)目。2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(Hi)包括將結(jié)合的CSAP與第二結(jié)合試劑接觸，所述的第二結(jié)合試劑與CSAP結(jié)合并且其包含檢測(cè)標(biāo)記或其能夠結(jié)合包含檢測(cè)標(biāo)記的第三結(jié)合試劑，并且檢測(cè)所述檢測(cè)標(biāo)記。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中該方法包括通過(guò)將結(jié)合的CSAP的水平或存在或結(jié)合的檢測(cè)標(biāo)記的水平或存在與預(yù)先確定的對(duì)照進(jìn)行比較來(lái)評(píng)估樣品中具有CSAP的細(xì)胞的數(shù)目。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述CSAP結(jié)合試劑為抗體或其抗原結(jié)合片段。5.權(quán)利要求2的方法，其中所述第二結(jié)合試劑為抗體或其抗原結(jié)合片段，所述的抗體或其抗原結(jié)合片段與CSAP結(jié)合，包括與CSAP的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。6.權(quán)利要求1或2的方法，其中該方法為ELISA類型，流式細(xì)胞術(shù)或?qū)游龇ā?.權(quán)利要求6的方法，其中該方法為ELISA或?qū)游龇ú⑶遗cCSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的CSAP結(jié)合試劑固定于固體或半固體支持物上。8.權(quán)利要求6或7的方法，其中該方法為ELISA或?qū)游龇ú⑶移渲信cCSAP，包括與CSAP的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的第二結(jié)合試劑固定于固體或半固體支持物上。9.權(quán)利要求l的方法，其中待測(cè)試的樣品選自脊髓液，骨或組織樣品，血液，血清，血漿，唾液，淚液和乳液。10.權(quán)利要求9的方法，其中血液為全血或經(jīng)稀釋的全血或血液衍生物。11.權(quán)利要求1的方法，其中CSAP為分化簇(CD)蛋白。12.權(quán)利要求11的方法，其中CSAP為CD4。13.權(quán)利要求l的方法，其中細(xì)胞為造血細(xì)胞。14.權(quán)利要求1的方法，其中該方法不檢測(cè)可能存在于樣品中的缺失細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶的CSAP。15.權(quán)利要求l的方法，其中該方法能夠區(qū)別包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞結(jié)合的CSAP和缺失細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶的CSAP。16.—種用于評(píng)估來(lái)自受試者的樣品中包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白(CSAP)的水平或具有CSAP的細(xì)胞的水平的方法，該方法包括a)將測(cè)試樣品用于免疫層析裝置的樣品部分，其中所述樣品部分可操作地與所述裝置的捕獲部分連接并且其中測(cè)試樣品的組分從樣品部分流向并流經(jīng)捕獲部分，所述的捕獲部分包含與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，以便只有包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CSAP，而非不包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶的CSAP，與所述抗體或其片段結(jié)合從而形成捕獲的CSAP;b)將捕獲部分與第二結(jié)合試劑接觸，所述的第二結(jié)合試劑與CSAP結(jié)合，包括與細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且其包含檢測(cè)標(biāo)記或其能夠與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三結(jié)合伴倡結(jié)合；c)任選地，將第二結(jié)合試劑與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三結(jié)合試劑接觸；評(píng)估所述檢測(cè)標(biāo)記的存在。17.權(quán)利要求3的方法，其中預(yù)先確定的對(duì)照為預(yù)先確定量的對(duì)照多肽，當(dāng)與可視檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合時(shí)，其足以產(chǎn)生信號(hào)，提供與由預(yù)先確定數(shù)目的CSAP細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)等價(jià)的可視內(nèi)標(biāo)。18.—種用于評(píng)估來(lái)自受試者的血液樣品中包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞結(jié)合CD4的水平或CD4T細(xì)胞的水平的方法，該方法包括(i)任選地，將樣品與能夠裂解或透化CD4T細(xì)胞的試劑接觸；(ii)將樣品與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸，所述的抗體或其抗原結(jié)合片段與CD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合；和(iii)直接或間接地評(píng)估樣品中結(jié)合的CD4的水平或存在。19.權(quán)利要求18的方法，其中步驟(iii)包括將CD4-抗體復(fù)合物與第二抗體或其抗原結(jié)合片段接觸，所述的第二抗體或其抗原結(jié)合片段與CD4結(jié)合，包括與細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且其包含檢測(cè)標(biāo)記或其能夠與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三結(jié)合伴侶結(jié)合，并且檢測(cè)所述檢測(cè)標(biāo)記。20.權(quán)利要求18或19的方法，其中該方法包括通過(guò)將結(jié)合的CD4或結(jié)合的檢測(cè)標(biāo)記的水平或存在與預(yù)先確定的對(duì)照進(jìn)行比較來(lái)確定樣品中具有CD4的細(xì)胞的數(shù)目。21.權(quán)利要求18或19的方法，其中該方法為ELISA，流式細(xì)胞術(shù)或?qū)右唤锓ā?2.權(quán)利要求21的方法，其中該方法為ELISA或?qū)游龇ú⑶遗cCD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段(抗cytoCD4抗體)固定于固體或半固體支持物上。23.—種用于評(píng)估來(lái)自受試者的血液樣品中包含細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞結(jié)合CD4的水平或CD4T細(xì)胞的水平的方法，該方法包括a)將測(cè)試樣品用于免疫層析裝置的樣品部分，其中所述樣品部分可操作地與所述裝置的捕獲部分連接并且其中測(cè)試樣品的組分從樣品部分流向并流經(jīng)捕獲部分，所述的捕獲部分包含與CD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，以便只有包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CD4，而非不包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的可溶的CD4，與所述抗體或其片段結(jié)合從而形成捕獲的CD4;b)將捕獲部分與第二結(jié)合試劑接觸，所述的第二結(jié)合試劑與CD4結(jié)合，包括與細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且其包含檢測(cè)標(biāo)記或其能夠與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三或隨后的結(jié)合伴侶結(jié)合；c)任選地，將第二結(jié)合試劑與包含檢測(cè)標(biāo)記的第三或隨后的結(jié)合試劑接觸；評(píng)估所述檢測(cè)標(biāo)記的存在。24.權(quán)利要求20的方法，其中預(yù)先確定的對(duì)照為預(yù)先確定量的對(duì)照多肽，當(dāng)與可視檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合時(shí)，其足以產(chǎn)生信號(hào)，提供與由預(yù)先確定數(shù)目的CD4T細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)等價(jià)的可視內(nèi)標(biāo)。25.權(quán)利要求24的方法，其中對(duì)照多肽為至少包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CD4多肽。26.權(quán)利要求20的方法，其中CD4T細(xì)胞的數(shù)目為小于200,小于250，大于250,250至350，350至500，250至500和大于500個(gè)細(xì)胞/n1血液中的一種或多種。27.權(quán)利要求20的方法，其中CD4T細(xì)胞的數(shù)目為小于200,小于500，500至1000，1000至2000,和大于2000個(gè)細(xì)胞/|i1血液中的一種或多種。28.權(quán)利要求18的方法，其進(jìn)一步包括通過(guò)將樣品與結(jié)合至固體或半固體支持物的抗CD14抗體接觸來(lái)除盡樣品中的單核細(xì)胞。29.權(quán)利要求18的方法，其進(jìn)一步包括通過(guò)將樣品與結(jié)合至固體或半固體支持物的抗血型糖蛋白抗體接觸來(lái)除盡樣品中的紅細(xì)胞。30.—種用于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)來(lái)自受試者的樣品中細(xì)胞的數(shù)目的試劑盒，其中所述細(xì)胞的特征在于包含含有細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白(CSAP)，其中該試劑盒包括(i)層析裝置，其包括與樣品部分可操作地連接的多孔膜，測(cè)試(捕獲)部分，綴合部分，吸取部分，任選地對(duì)照部分和任選地裂解部分；(ii)CSAP結(jié)合試劑，例如與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述試劑或抗體固定(結(jié)合)于一個(gè)或多個(gè)測(cè)試部分和/或包含于綴合部分內(nèi)；(iii)使用所述裝置以檢測(cè)或監(jiān)測(cè)樣品或受試者中具有CSAP的細(xì)^^的水平或存在的^L明書。31.用于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)來(lái)自受試者的血液樣品中CD4T細(xì)胞的數(shù)目的試劑盒，其中該試劑盒包括(i)層析裝置，其包括與樣品部分可操作地連接的多孔膜，測(cè)試(捕獲)部分，綴合部分，吸取部分，任選地對(duì)照部分和任選地裂解部分；(ii)CD4結(jié)合試劑，例如與CD4的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述試劑或抗體固定(結(jié)合)于一個(gè)或多個(gè)測(cè)試部分和/或包含于綴合部分內(nèi)；(iii)使用所述裝置以檢測(cè)或監(jiān)測(cè)樣品或受試者中CD4細(xì)胞的水平或存在的說(shuō)明書。32.權(quán)利要求30或31的試劑盒，其中所述試劑盒使用反向或側(cè)向流動(dòng)免疫層析。33.權(quán)利要求32的試劑盒，其中綴合部分包含可視檢測(cè)標(biāo)記。34.權(quán)利要求30或31的試劑盒，其包括對(duì)照部分，所述的對(duì)照部分包含預(yù)先確定量的對(duì)照多肽，當(dāng)與可視檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合時(shí)，其足以產(chǎn)生信號(hào)，提供與由預(yù)先確定數(shù)目的細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)等價(jià)的內(nèi)標(biāo)。35.權(quán)利要求31的試劑盒，其包括對(duì)照部分，所述的對(duì)照部分包含預(yù)先確定量的至少含有細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的對(duì)照CD4多肽并且當(dāng)與可視檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合時(shí)，其足以產(chǎn)生信號(hào)，提供預(yù)先確定數(shù)目的CD4細(xì)胞的可視才示準(zhǔn)。36.權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述CD4多肽為缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的重組CD4。37.權(quán)利要求34或35的試劑盒，其中預(yù)先確定的數(shù)目為以下的一種或多種小于200，小于250，大于250，250至350，350至500，250至500和大于500個(gè)細(xì)胞/|a1血液。38.權(quán)利要求34或35的試劑盒，其中預(yù)先確定的數(shù)目為以下的一種或多種小于200，小于500,500至1000，1000至2000，和大于2000個(gè)細(xì)胞/ju1血液。39.權(quán)利要求30或31的試劑盒，其中樣品墊包含紅細(xì)胞捕獲試劑，例如血型糖蛋白A。40.權(quán)利要求30或31的試劑盒，其中樣品墊包含抗CD14磁珠。41.權(quán)利要求40的試劑盒，其進(jìn)一步包括廉價(jià)的或一次性的磁性材料。42.權(quán)利要求41的試劑盒，其中磁體連接到或可連接到樣品墊或能夠與樣品墊接觸的免疫層析裝置的部分。43.權(quán)利要求30或31的試劑盒，其中具有CSAP的細(xì)胞的數(shù)目通過(guò)如下步驟進(jìn)行評(píng)估(i)將來(lái)自受試者的測(cè)試樣品在其中具有CSAP的細(xì)胞流過(guò)捕獲部分流向吸取部分的條件下用于樣品部分；(ii)用可視檢測(cè)標(biāo)記直接或間接地檢測(cè)捕獲部分中捕獲的CSAP的存在；(iii)將來(lái)自(ii)中的檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)強(qiáng)度與來(lái)自對(duì)照部分的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，所述的對(duì)照部分包含對(duì)照多肽，提供與由預(yù)先確定數(shù)目的具有CSAP的細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)等價(jià)的內(nèi)標(biāo)。44.權(quán)利要求33的試劑盒，其中測(cè)試樣品與能夠裂解或透化具有CSAP的細(xì)胞的裂解緩沖液接觸。45.缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的重組CD4，用作或適合用作確定CD4T細(xì)胞數(shù)目的方法或試劑盒中的對(duì)照。46.缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的重組CD4在制備用于定量來(lái)自受試者的樣品中的CD4T細(xì)胞的數(shù)目的固體或半固體支持物或試劑盒中的用途。47.權(quán)利要求23的方法或權(quán)利要求31的試劑盒，用于評(píng)估AIDS或其他免疫缺陷疾病患者。全文摘要本發(fā)明提供用于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)樣品中細(xì)胞的數(shù)目的試劑盒和方法。所述細(xì)胞包含含有細(xì)胞質(zhì)(胞質(zhì))和細(xì)胞外(胞外)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白(CSAP)。所述試劑盒包括(i)層析裝置；(ii)CSAP結(jié)合試劑。所述方法包括(i)任選地，將樣品與能夠裂解或透化具有CSAP的細(xì)胞的試劑接觸；(ii)將樣品與CSAP結(jié)合試劑接觸，所述的CSAP結(jié)合試劑與CSAP的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合；和(iii)直接或間接地評(píng)估樣品中結(jié)合的CSAP的水平或存在。文檔編號(hào)G01N33/68GK101558309SQ200780041426公開日2009年10月14日申請(qǐng)日期2007年9月28日優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日發(fā)明者A·L·藍(lán)黛,D·A·安德森,M·L·加西亞,R·E·勞埃德,S·M·克羅申請(qǐng)人:麥克法蘭布奈特醫(yī)療研究與公共健康研究所有限公司