專利名稱：Sars病毒抗體檢測方法及快速診斷試劑盒和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于診斷、檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，以及用于該方法的SARS冠狀病毒抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒和其制備方法。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)是一種近期發(fā)生于世界許多國家的人類突發(fā)性傳染病，是人類所面臨的一種突如其來的災(zāi)難。SARS的防治已成為當(dāng)前最重要的工作，廣大的醫(yī)務(wù)工作者正在奮戰(zhàn)抗擊SARS的前線，世界各國科學(xué)家正在研究SARS的防治辦法，包括診斷方法、治療藥物和預(yù)防疫苗。美國《科學(xué)》雜志5月1日刊登了兩份SARS病毒基因組系列研究論文，這是首批經(jīng)過同行評議SARS病毒基因組研究結(jié)果。美國和加拿大研究人員組成的兩個科研小組在研究結(jié)果中證實SARS病毒是一種全新的冠狀病毒。我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所與中國科學(xué)院北京基因組研究所合作，也于4月15日完成了對SARS冠狀病毒的全基因組序列測定，基因組序列為29，727個核苷酸。SARS冠狀病毒基因組序列的測定，對于抗SARS藥物篩選、疫苗研制和建立快速診斷試劑具有重大的意義。
目前對SARS要做到早發(fā)現(xiàn)、早治療、早隔離。所以要求既檢測SARS病人的抗原，又要檢測SARS病人的抗體。抗體檢測除了IgG外，還要檢測其病毒特異的IgM，因為IgM在發(fā)病早期或急性期即可檢測到，有的甚至在潛伏末期即可檢測到。
SARS目前診斷方法主要有三種(1)病毒核酸檢測-PCR擴增方法，早期檢測，(2)抗體檢測ELISA和免疫熒光技術(shù)。(3)SARS病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)模型。以上免疫檢測技術(shù)均采用SARS病毒感染細(xì)胞為抗原，培養(yǎng)的病毒抗原存在制備困難，有一定的危險性，不能大量生產(chǎn)，并可出現(xiàn)特異性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是為了提供一種SARS冠狀病毒變異株抗體的檢測方法，該方法為一步法檢測方法，靈敏度高、特異性強而且速度快、操作簡便，無需專門設(shè)備，適用于臨床檢測、流行病學(xué)調(diào)查和場地檢疫等多種場合。
本發(fā)明的第二目的是為了提供一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒，該試劑盒針對SARS冠狀病毒變異株抗體檢測提供一種簡便而且直接的一步法檢測盒，利用該試劑盒檢測SARS冠狀病毒變異株抗體的靈敏度高、特異性強，而且速度快、操作簡便，無需專門設(shè)施。
本發(fā)明的第三目的是為提供一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，該方法簡便、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。
本發(fā)明的第一目的可通過如下措施來實現(xiàn)一種SARS冠狀病毒變異株抗體檢測方法，包括下述步驟(1)將膠體金標(biāo)記的抗人Ig抗體包括IgG和IgM載于玻璃纖維或無紡部布載體上并在與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測載體上包被SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線(2)取人血清滴于膠體金標(biāo)記抗體的載體上，如血清中含有SARS冠狀病毒變異株抗體則在檢測載體上形成檢測線、控制線雙線為陽性，否則為陰性。
本發(fā)明的第二目的可通過如下措施來實現(xiàn)一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒內(nèi)設(shè)SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)檢測板。
所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)檢測板是在襯板上設(shè)有加樣端吸水層、檢測層和吸水端吸水層，在檢測層和吸水端吸水層之間設(shè)有金標(biāo)抗人Ig抗體層；檢測層上包被有由SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線。
本發(fā)明的第三目的可通過如下措施來實現(xiàn)一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法主要包括制備金標(biāo)抗體層和檢測層的控制線和檢測線的包被，然后在襯板上組合SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)測試條和檢測板。
所述的金標(biāo)抗體層的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備在濃度為0.004-0.012％的氯金酸中加入其體積的1.3-2％、濃度為1-3％的擰檬酸三鈉，煮沸10-20分鐘，可得到15-50納米的膠體金溶液ii膠體金標(biāo)記抗人Ig(IgG，IgM)抗體，在膠體金溶液中用0.2mol碳酸鉀溶液調(diào)pH8.0-8.4，按4-12mg/100ml加入抗人Ig抗體，攪拌后，再在溶液中按0.1-0.6g/100ml加入動物血清蛋白，4℃靜置2-4小時iii將上述混合溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-15分鐘，去沉淀物，得上清液iv將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60-80分鐘離心得沉淀物v將沉淀物按4-10ml/100ml溶于0.02M、Ph7.4 Tris-HCl緩沖液得金標(biāo)抗體溶液該緩沖液中含0.2-0.6％的動物血清蛋白和0.01-0.06％疊氮鈉vi將金標(biāo)抗體溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止而形成金標(biāo)抗體層。
所述膠體金標(biāo)記抗體為抗人Ig(IgG，gM)。
所述的檢測層是在纖維素膜上設(shè)有基因工程SARS冠狀病毒變異株抗原構(gòu)成的檢測線和有羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。其制備方法是在濃度為0.8-2.4mg/ml的抗原或抗體溶液中加入1-3％的固定劑，再利用噴膜機將抗原或抗體噴在纖維素膜上，噴膜后37℃干燥，再用0.01ml pH7.0含10％小牛血清的PBS，在37℃下封閉30分鐘，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點1、本發(fā)明檢測、診斷SARS冠狀病毒變異株抗體的方法為一步法，具有較高的特異性和靈敏性，且操作簡便，無需專門設(shè)施。
2、本發(fā)明的診斷試劑盒檢測SARS冠狀病毒變異株抗體時具有較高的特異性和靈敏性，檢測過程操作訊速、快捷、方便，適用于臨床檢驗、流行病學(xué)調(diào)查和場地檢疫等多種場合，3、本發(fā)明的診斷試劑盒的制備方法簡便、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。


圖1是本發(fā)明檢測板的外觀結(jié)構(gòu)示意圖1—檢測板2—加樣孔3—觀察孔圖2是本發(fā)明檢測板的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖4—加樣端吸水層5—金標(biāo)抗體層6—控制線7—檢測線8—檢測層9—吸水端吸水層10—襯板具體的實施方式本發(fā)明還將結(jié)合實施例作進(jìn)一步詳述實施例一一種SARS冠狀病毒變異株抗體檢測方法包括下述步驟(1)將膠體金標(biāo)記的抗人Ig抗體包括IgG和IgM載于玻璃纖維或無紡部布載體上并在與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測載體上包被基因工程SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線(2)取人血清滴于膠體金標(biāo)記抗體的載體上，如血清含有SARS冠狀病毒變異株抗體則在檢測載體上形成檢測線、控制線雙線為陽性，否則為陰性。
參照圖1，一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒內(nèi)設(shè)SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)檢測板1。
參照圖2，所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)檢測板1是在襯板10上設(shè)有加樣端吸水層4、檢測層8和吸水端吸水層9，在檢測層和吸水端吸水層9之間設(shè)有金標(biāo)抗人Ig抗體層5在檢測層8上包被有檢測線7和控制線6。其中加樣端吸水層4和吸水端吸水層9由多層濾紙制成；檢測層8為纖維素膜，該纖維素膜可為硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜；金標(biāo)抗體層為玻璃纖維或無紡布浸取膠體金標(biāo)記抗體制成。
一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法主要包括制備金標(biāo)抗體層(5)和檢測層(8)的控制線(6)和檢測線(7)的包被，然后在襯板(10)上組合SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)測試條和檢測板(1)。在塑料墊板10的兩端分別粘貼加樣端吸水紙層4和吸水端吸水層9；在其中段粘貼包被抗體的纖維素膜層8，在加樣端吸水紙層4于纖維素膜層8的交接部位，夾貼含金標(biāo)抗體5的玻璃纖維，玻璃纖維的4/5部分在加樣端吸水紙層4中間，1/5部分在纖維素膜層8上。然后按4毫米寬、8厘米長規(guī)格切條，再組裝在塑料盒內(nèi)。盒蓋上加樣孔2正對測試條的加樣端吸水紙層4，觀察孔3正對纖維素膜的檢測層8。
所述的金標(biāo)抗體層5的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，取100mg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入15ml、濃度為1％的擰檬酸三鈉，煮沸15分鐘，冷卻后得到15-50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記抗人Ig抗體，取100ml膠體金溶液，用0.2mol碳酸鉀溶液調(diào)pH8.4，加入6mg抗人IgG單克隆抗體，攪拌20分鐘，再加入240mg牛血清白蛋白，繼續(xù)攪拌5分鐘，4℃靜置2-4小時iii將上述混合溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去沉淀物，得上清液iv將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60分鐘離心得沉淀物v將沉淀物按4m10ml溶于0.02M Ph7.4 Tris-HCl緩沖液得金標(biāo)抗體溶液該緩沖液中含0.25％的牛血清白蛋白和0.02％疊氮鈉vi將金標(biāo)抗體溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止，在37℃下2小時干燥而形成金標(biāo)抗體層5。
所述膠體金標(biāo)記抗體為抗人IgG單克隆抗體。
所述的檢測層8是在纖維素膜上設(shè)有基因工程SARS冠狀病毒變異株抗原構(gòu)成的檢測線和有羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線6。其制備方法是取基因工程SARS冠狀病毒變異株抗原，調(diào)濃度為1mg/ml，加入2％的甲醛，用噴膜機在纖維素膜中段噴檢測線7；再取羊抗鼠IgG抗體調(diào)濃度為2mg/ml，加入2％的甲醛，用噴膜機在纖維素膜中段，距檢測線0.5cm處，噴控制線6，按20ul/10cm設(shè)置噴膜量，噴膜37℃干燥，2小時，再用0.01mpH7.0含10％小牛血清的PBS，在37℃下封閉30分鐘，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
實施例二SARS冠狀病毒變異株抗體檢測方法及其金標(biāo)快速診斷試劑盒與例一同。
該試劑盒的制備方法除制備膠體金標(biāo)記的抗體為抗人IgM單克隆抗體外，其他條件與例一同。
權(quán)利要求
1.一種SARS冠狀病毒變異株抗體檢測方法，包括下述步驟(1)將膠體金標(biāo)記的抗人Ig抗體包括IgG和IgM載于玻璃纖維或無紡部布載體上并在與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測載體上包被SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線(2)取人血清滴于膠體金標(biāo)記抗體的載體上，如血清中含有SARS冠狀病毒變異株抗體則在檢測載體上形成檢測線、控制線雙線為陽性，否則為陰性。
2.一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒內(nèi)設(shè)SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)檢測板(1)。
3.如權(quán)利要求2所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒，其特征在于所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)檢測板(1)是在襯板(10)上設(shè)有加樣端吸水層(4)、檢測層(8)和吸水端吸水層(9)，在檢測層(8)和吸水端吸水層(9)之間設(shè)有金標(biāo)抗人Ig抗體層(5)在檢測層(8)上包被有由SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線(7)和由抗鼠IgG抗體形成的控制線(6)。
4.一種權(quán)利要求2所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于主要包括制備金標(biāo)抗體層(5)和檢測層(8)的控制線(6)和檢測線(7)的包被，然后在襯板(10)上組合SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)測試條和檢測板(1)。
5.如權(quán)利要求4所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述的金標(biāo)抗體層(5)的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，采用公知的膠體金制備工藝制備膠體金ii膠體金標(biāo)記抗人Ig(IgG，IgM)抗體，在膠體金溶液中按4-12mg/100ml加入抗人Ig抗體，經(jīng)攪拌后再在溶液中按0.1-0.6g/100ml加入動物血清蛋白；iii將上述混合液經(jīng)離心去沉淀物，得上清液iv將上清液離心得沉淀物v將沉淀物按4-10ml/100ml溶于0.02M、Ph7.4 Tris-HCl緩沖液得到金標(biāo)抗體溶液該緩沖液中含0.2-0.6％的動物血清蛋白和0.01-0.06％疊氮鈉vi將金標(biāo)抗體溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止而形成金標(biāo)抗體層(5)。
6.如權(quán)利要求4或5所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述膠體金標(biāo)記抗體為抗人Ig(IgG，gM)。
7.如權(quán)利要求4所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述的檢測層(8)是在纖維素膜上設(shè)有SARS冠狀病毒變異株抗原構(gòu)成的檢測線(7)和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線(6)。
8.如權(quán)利要求7所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述的SARS冠狀病毒變異株抗原是采用基因工程制備而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種SARS病毒抗體檢測方法及快速診斷試劑盒和制備方法，其檢測方法包括(1)將膠體金標(biāo)記的抗人Ig抗體載于載體上并在與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測載體上包被SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線(2)取人血清滴于膠體金標(biāo)記抗體的載體上，如血清中含有SARS冠狀病毒變異株抗體則在檢測載體上形成檢測線、控制線雙線為陽性，否則為陰性；該診斷試劑盒包括SARS冠狀病毒變異株抗體金標(biāo)檢測板；該檢測板是包括加樣端吸水層、檢測層和吸水端吸水層，在檢測層和吸水端吸水層之間設(shè)有金標(biāo)抗人Ig抗體層；檢測層上包被有由SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線；本發(fā)明的方法為一步法檢測方法，靈敏度高、特異性強；而且速度快、簡便，無需專門設(shè)施。
文檔編號G01N33/531GK1570638SQ03134419
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月22日
發(fā)明者李克生, 杜惠芬, 劉奇 申請人:李克生