專利名稱：用于藥物發(fā)現(xiàn)的單分子平臺(tái)用于包括抗癌和抗病毒劑的發(fā)現(xiàn)的藥物發(fā)現(xiàn)的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耙向包括DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的酶的藥物候 選物的篩選和驗(yàn)證。
背景技術(shù)：
在臨床使用中，大約百分之三十的藥物抑制疾病相關(guān)酶促過程(瑞.艾.科 普蘭(Copeland，R.A.),藥物發(fā)現(xiàn)中的酶抑制劑的評(píng)估藥物化學(xué)家和藥理學(xué) 家指南(Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery: a guide for medicinal chemists and pharmacologists).(威立國際-牛學(xué)公司 (^Wiley-Interscience )， 2005))。因此，新穎酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)是生物化學(xué)和藥理學(xué)中的重要研究領(lǐng)域。
聚合酶抑制劑在臨床和研究設(shè)定中具有價(jià)值。這些抑制劑有助于闡明轉(zhuǎn)錄 和DNA復(fù)制的機(jī)理方面，有助于繪制結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，且有助于表征蛋白質(zhì)活 性。聚合酶抑制劑還是最吸引人的藥物靶之一。關(guān)于這些抑制劑、其結(jié)構(gòu)和其 機(jī)制的知識(shí)使得能夠設(shè)計(jì)將有效抵抗新病原體和已知病原體的抗生素抗性突 變體的新藥物，諸如抗癌劑、抗病毒劑和抗生素。因?yàn)橐褕?bào)道這些抑制劑中的 一些誘導(dǎo)和/或抑制細(xì)胞凋亡，所以其也提供用于研究細(xì)胞凋亡的有價(jià)值工具。 同樣，因?yàn)檫@些藥劑中的一些阻斷DNA轉(zhuǎn)錄的特定步驟，所以聚合酶抑制劑 可有助于闡明在各種健康和疾病狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄控制在調(diào)控靶基因表達(dá)中的作用。
靶向特定疾病路徑所涉及的聚合酶蛋白質(zhì)的藥物為本領(lǐng)域所熟知。舉例來 說，逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(reverse transcriptase inhibitors, RTI)是一種通過抑制逆 轉(zhuǎn)錄酶的活性而耙向病毒DNA的構(gòu)建的抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒藥物。存在兩種具有 不同作用機(jī)制的RTI亞型核苷和核苷酸類似物RTI被并入病毒DNA中，從
4而導(dǎo)致鏈終止，而非核苷類似物RTI則充當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶的竟?fàn)幮砸种苿?。?dāng)前通 過抑制fflV逆轉(zhuǎn)錄酶而起作用的AIDS治療劑在本領(lǐng)域中有所描述(參見例如， 賓(Bean)等人，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl Environ Microbiol) 72:5670-5672
(2005 ))，且包括依發(fā)韋侖(Efavirenz)(商標(biāo)名稱SUSTIVA⑧和STOCRIN ) 和奈韋拉平(Nevirapine)(也以商品名稱VIRAMUNE辦肖售)。耙向聚合酶蛋 白質(zhì)(例如利福平(rifampin))的抗生素和耙向聚合酶蛋白質(zhì)(例如順柏
(cisplatin ))的癌癥藥物也為本領(lǐng)域中所已知。
已發(fā)現(xiàn)許多藥物有效治療癌癥。這些藥物包括不同化合物，諸如抗代謝物
(例如，曱氨蝶呤(methotrexate)和氟尿嘧吱(fluorouracil))、 DNA損傷劑
(例如，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide )、順鉑和阿霉素(doxorubicin))、有絲 分裂抑制劑(例如，長春新堿(vincristine ))、核苷酸類似物(例如，6-巰基噪 呤)、DNA修復(fù)所涉及的拓樸異構(gòu)酶的抑制劑(例如，依托泊苷(etoposide))、 DNA聚合酶的抑制劑(例如，博萊霉素(bleomycin))和嵌入劑(intercalating agent, ^口米4乇'蒽酉昆(mitoxantrone))。
目前，正在研究數(shù)種靶向哺乳動(dòng)物DNA復(fù)制的酶的藥物來作為用于癌癥 化學(xué)療法的有前途候選物或作為用于了解特定酶在DNA復(fù)制和修復(fù)中的作用 的探針。這些潛在藥物候選物包括補(bǔ)骨脂曱素(corylifolin)、補(bǔ)骨脂酚
(bakuchiol)、白藜聲醇(resveratrol )、新補(bǔ)骨脂異黃酮(Neobavaisoflavone) 和黃豆苦元(daidzein)(參見孫(Sun)等人，天然產(chǎn)物化學(xué)雜志(J. Nat. Prod.) 61,362-366 ( 1998))。
DNA和RNA聚合酶抑制劑的其它實(shí)例包括放線菌素D( Actinomycin D )、 鏈霉菌屬的種(浙e/7tom戸s sp.); a-鶴膏毒肽(a-Amanitin )、我鳥膏屬(爿應(yīng)w'to sp.);阿非迪霉素(Aphidicolin)、 HSV復(fù)制抑制劑、BP5; a-鵝膏毒肽油酸曱 酯；新生霉素(Novobiocin).鈉鹽；利福平；RNA聚合酶III抑制劑；和7-氨基-放線菌素D。目前在II期試驗(yàn)中用于抵抗丙型肝炎病毒的三種聚合酶抑 制劑是艾德尼克斯公司/諾華公司(Idenix/Novartis )的瓦洛他濱(valopicitabine )
(NM283 );維諾公司(ViroPharma)的HCV-796;和羅氏公司(Roche)的 R1626。羅氏公司(Roche)/艾德尼克斯公司(Idenix)也在作為HBV治療初 始成功后的II期HCV試驗(yàn)中研究伐托他濱(valtorcitabine， val-LdC )，第一鏈病毒DNA合成抑制劑。
DNA損傷劑提供一些用于癌癥的最成功治療。多聚(ADP-核糖)聚合酶 (即PARP)可有助于修復(fù)由用于治療癌癥的DNA損傷劑引起的DNA損傷。 因?yàn)镻ARP活性常常在癌細(xì)胞中增加，所以其提供這些細(xì)胞的存活機(jī)制。舉例 來說，ABT-888 (雅培腫瘤學(xué)公司(Abott Oncology ))是由雅培公司(Abbott) 開發(fā)用于防止癌細(xì)胞中的DNA修復(fù)且增加常見癌癥療法(諸如放射和烷基化 劑)的有效性的口服PARP抑制劑。此外，臨床前數(shù)據(jù)表明ABT-888改善放 射和許多類型的化學(xué)療法在動(dòng)物癌癥模型中的有效性。
這些選自最近5年的公開出版物說明關(guān)于聚合酶抑制劑的活性、機(jī)制和生 物化學(xué)的當(dāng)前技術(shù)水平
杰 艾 布朗(Brown JA),威 瓦.杜姆(DuymWW),杰 德 福勒 (Fowler JD )，佐.索(Suo， Z.) . (2007)"在由人類DNA聚合酶X和卩催化 的縫隙填補(bǔ)合成期間8-氧代-7，8-二氫-2'-脫氧烏苷的誘變潛力的單轉(zhuǎn)換動(dòng)力學(xué) 分才斤 (Single-turnover Kinetic Analysis of the Mutagenic Potential of 8國Oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine during Gap-filling Synthesis Catalyzed by Human DNA Polymerases lambda and beta)."分子生物學(xué)雜志(J Mol Biol.)[電 子出版先于印刷]。
佐.索(Suo，Z.),瑪 艾 阿卜杜拉(AbdullahMA) . (2007)"丙型肝 炎病毒NS2-3蛋白酶的獨(dú)特復(fù)合活性位點(diǎn)抗病毒藥物設(shè)計(jì)的新時(shí)機(jī)(Unique Composite Active Site of the Hepatitis C Virus NS2- 3 Protease: a New Opportunity for Antiviral Drug Design).，，化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)(ChemMedChem.) 2(3), 283-284。
瑪.普.勒特格(RoettgerMP),卡.瑪 費(fèi)埃拉(FialaKA),斯.桑帕 理(Sompalli S )，伊.東(Dong Y)，佐 索(Suo Z) . (2004)"人類DNA 聚合酶mu的保真度的穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)研究(Pre-steady-state kinetic studies of the fidelity of human DNA polymerase mu)"，生物化學(xué)(Biochemistry) 43(43)， 13827-38。
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卡.瑪 費(fèi)埃拉(Fiala,K. A)和佐 索(SuoZ) .* (2004)疏磺礦疏化 葉菌P2 DNA聚合酶IV的保真度的穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)研究(Pre-Steady State Kinetic
學(xué)(Biochemistry) 43,2106-2115。
卡 瑪.費(fèi)埃拉(Fiala，K.A)和佐 索(Suo Z ) .* (2004)由碌u^礦硫 化葉菌P2 DNA聚合酶IV催化的DNA聚合的4幾制(Mechanism of DNA
物化學(xué)(Biochemistry ) 43,2116-2125。
卡.瑪.費(fèi)埃拉(Fiala,K.A),威.阿布戴爾-加瓦德(Abdel-Gawad, W.) 和佐.索(Suo Z) * ( 2004 )由截短人類DNA聚合酶X催化的聚合的保真度 和機(jī)制的穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)研究(Pre-Steady國State Kinetic Studies of the Fidelity and Mechanism of Polymerization Catalyzed by Truncated Human DNA Polymerase Lambda).生物化學(xué)(Biochemistry),已接收和付印。
阿 杰 艾力森(Allison, A. J.)，艾'雷(Ray,A.)，佐 索(SuoZ..), 杰.瑪.哥拉仙奴(Colacino, J. M.)，卡.斯.安德森(Andeson, K. S.)，卡'艾'約 翰遜(Johnson, KA.) (2001 )"抗病毒核苷類似物和人類線粒體聚合酶的毒性 (Toxicity of Antiviral Nucleoside Analogs and the Human Mitochondrial DNA Polymerase)",生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 276,40847-40857。
新藥物是長期且復(fù)雜的藥物開發(fā)工藝的產(chǎn)物，其中第一步是發(fā)現(xiàn)具備有前 途活性的化合物。新穎酶抑制劑可通過篩選抵抗靶酶的藥物候選化合物的文庫 來發(fā)現(xiàn)。常規(guī)藥物篩選和驗(yàn)證方法利用微米級(jí)到毫米級(jí)生物化學(xué)或細(xì)胞測(cè)定來 檢測(cè)酶促干擾的下游生物化學(xué)或細(xì)胞特征。鑒于常規(guī)藥物篩選方法的局限性， 本領(lǐng)域中仍需要用于^r測(cè)有前途的藥物候選物的方法和裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)揭示了用于單分子藥物篩選、發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的方法和裝置。這些方法 和裝置允許使用者使用單分子的觀察結(jié)果快速檢測(cè)藥物候選物是否和如何干擾特定疾病路徑所涉及的靶酶。本文所述的方法和裝置利用單分子操縱和檢測(cè) 技術(shù)(例如，光4聶或磁4聶)來直接檢測(cè)靶酶-底物相互作用的特征動(dòng)力學(xué)或"機(jī)
械特征(mechinal signature )"是否實(shí)質(zhì)上由藥物候選物改變或調(diào)節(jié)。此外，所 述方法和裝置適用于分析機(jī)械特征的調(diào)節(jié)以便鑒別藥物候選物的潛在干擾機(jī)制。
本發(fā)明的一方面中，本文所揭示的方法和裝置涉及監(jiān)測(cè)在抑制或者調(diào)節(jié)聚 合過程的藥物候選物存在下個(gè)別聚合酶分子(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶 和逆轉(zhuǎn)錄酶)沿多核苦酸底物的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)機(jī)械特征。所述藥物候選物的鑒別 和分析對(duì)于抗病毒、抗癌和抗生素藥物的發(fā)展至關(guān)重要。


圖1說明本發(fā)明的用于篩選多種靶向特定酶的藥物候選物的方法方面的 示例性流程圖。
圖2說明在各種藥物候選物(諸如聚合酶抑制劑)存在下DNA聚合酶的 示例性機(jī)械特征。圖2的A板(panel)展示預(yù)期來自不存在聚合酶抑制劑的 對(duì)照樣品的代表信號(hào)。在這種情況下，聚合酶結(jié)合單鏈(ss) DNA且將這個(gè) 模板轉(zhuǎn)化為雙鏈(ds)DNA，從而穩(wěn)定地隨時(shí)間縮短總模板長度。B板展示預(yù) 期來自將指示藥物候選物已減慢復(fù)制過程的光鑷裝置的示例性機(jī)械特征。應(yīng)注 意，對(duì)應(yīng)于聚合速度的模板長度圖(plot)的總斜率已變小。C板展示來自指 示藥物候選物已誘導(dǎo)失敗轉(zhuǎn)錄/提前終止的光鑷裝置的示例性機(jī)械特征，其中 所述藥物候選物在其正常完成點(diǎn)前突然中止或停止復(fù)制過程。D板展示來自指 示DNA復(fù)制起始由藥物候選物抑制的光鑷裝置的示例性機(jī)械特征。E板展示 來自指示藥物候選物誘導(dǎo)聚合酶以核外溶解(exonucleolysis )模式操作的光鑷 裝置的示例性機(jī)械特征，其中其切去堿基而不是使堿基對(duì)聚合。這個(gè)特征將僅 可能出現(xiàn)于具有活性核外溶解或"校對(duì)"位點(diǎn)的聚合酶中。
圖3說明本發(fā)明的用于篩選多種靶向特定聚合酶的藥物候選物(包括DNA 和RNA聚合酶抑制劑以及逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)的方法方面的示例性流程圖。
圖4a說明用于通過基于光鑷的單分子測(cè)量系統(tǒng)獲得對(duì)聚合酶沿核酸模板 的位置的測(cè)量的示例性實(shí)驗(yàn)幾何形狀。此時(shí)，DNA分子保持固定且當(dāng)聚合酶 沿DNA模板移動(dòng)時(shí)，所迷分子在兩個(gè)塑料膠乳珠粒之間延伸。在DNA復(fù)制
8的情況下，兩個(gè)珠粒之間的距離在特定力下減小，因?yàn)槟０錎NA從單鏈轉(zhuǎn)化 為雙鏈DNA。將核酸附著于珠粒的方法可通過抗生蛋白鏈菌素-生物素或地高 辛(dig) -抗-dig或其它共價(jià)鍵進(jìn)行。
圖4b說明用于通過基于光鑷的單分子測(cè)量系統(tǒng)獲得在由聚合酶加工核酸 時(shí)核酸的長度的另外示例性實(shí)驗(yàn)幾何形狀。此時(shí)，DNA分子保持固定且在塑 料膠乳珠粒與抗生蛋白鏈菌素包被的(三角形)玻璃表面之間延伸。當(dāng)在DNA 復(fù)制中聚合酶沿DNA模板移動(dòng)時(shí)，DNA范圍的長度在特定力下減小，因?yàn)楣?定的模板DNA從單鏈轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA。
圖4c說明本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，其中核酸模板附著于通過左側(cè)所示的 第二固定光阱(optical trap)固持的電介質(zhì)珠粒，所述光阱發(fā)揮比聚合酶對(duì)核 酸模板所施加的力大得多的強(qiáng)捕獲力。此時(shí)，通過相關(guān)親和力化學(xué)使聚合酶附 著于另一珠粒。圖4-d證明核酸如何可通過核酸模板與剛性表面的互補(bǔ)功能化 作用而固定于諸如蓋玻片或微孔板的剛性表面上，同時(shí)再次使聚合酶附著于第 二個(gè)珠粒。
圖5a示意地說明單分子檢測(cè)系統(tǒng)，其包括包含捕獲、力檢測(cè)、波束控制 (beam steering)和等張力能力的代表性光鑷裝置和維持所捕獲的珠粒上的恒 力(甚至當(dāng)珠粒由于聚合酶的酶促活性而經(jīng)受其它力時(shí))的力反饋光學(xué)捕獲子 系統(tǒng)。
圖5b說明單分子跟蹤系統(tǒng)中的檢測(cè)系統(tǒng),通過所述系統(tǒng)利用四象限光電 二極管來檢測(cè)電介質(zhì)球距離光阱中心的位移。將珠粒相對(duì)于光阱的位置記錄在 這個(gè)四象限光檢測(cè)器上。 -使用從這個(gè)光井(optical well)中心產(chǎn)生的偏移來量 化作用于珠粒的皮牛頓(picoNewton)大小的力。
圖6a和圖6b說明證明用光鑷裝置觀察DNA聚合酶馬達(dá)在沿DNA模板 向前(聚合，圖6a)和向后(核酸外切酶活性，圖6b)移動(dòng)時(shí)的動(dòng)力學(xué)的能 力的數(shù)據(jù)。約0.5微米/分鐘的速度對(duì)應(yīng)于約25個(gè)聚合的堿基對(duì)/秒。在所述圖 中，聚合酶沿DNA的位置是以時(shí)間函數(shù)展示。斜率給出在特定力下DNA模 板在復(fù)制時(shí)的長度的變化速率。這正是聚合酶馬達(dá)的單分子速度。
圖7說明探測(cè)DNA聚合的更精細(xì)結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)的能力。為達(dá)到這個(gè)分辨率 程度，優(yōu)選利用聲光偏轉(zhuǎn)器系統(tǒng)來達(dá)到在聚合期間沿DNA鏈的等張力條件。在所述圖中，展示DNA的延長(pm)與時(shí)間(min)的關(guān)系。在左圖中，黑線展示完整數(shù)據(jù)集，包括在收縮(右側(cè)方框區(qū)域)開始前由流動(dòng)引起的松弛(左方框區(qū)域)。在右圖中，展示收縮區(qū)域的延長與時(shí)間的關(guān)系。原始數(shù)據(jù)線展示原始長度-時(shí)間數(shù)據(jù)，而平滑線展示這個(gè)數(shù)據(jù)的100-pt鄰近平均值。直線表示這個(gè)收縮區(qū)域中的平均斜率，約300個(gè)堿基對(duì)/秒。圖8說明藥物篩選和發(fā)現(xiàn)的常規(guī)方法的關(guān)鍵特點(diǎn)。圖9說明本文所述的新穎藥物篩選和發(fā)現(xiàn)技術(shù)的關(guān)鍵特點(diǎn)。圖10說明本文所述的新穎藥物篩選和發(fā)現(xiàn)技術(shù)與藥物篩選和發(fā)現(xiàn)的常規(guī)方法相比的一些優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
DNA和RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)抑制劑在臨床和研究設(shè)定中具有價(jià)值。這些抑制劑有助于闡明轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制的機(jī)理方面，有助于繪制結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，且有助于表征蛋白質(zhì)活性。這些聚合酶和RT抑制劑還是最吸引人的藥物靶之一。關(guān)于這些抑制劑、其結(jié)構(gòu)和其機(jī)制的知識(shí)使得能夠設(shè)計(jì)將有效抵抗新病原體和已知病原體的抗生素抗性突變體的新藥物，諸如抗癌劑和抗生素。因?yàn)橐褕?bào)道這些抑制劑中的一些誘導(dǎo)和/或抑制細(xì)胞凋亡，所以其也提供用于研究細(xì)胞凋亡的有價(jià)值工具。同樣，因?yàn)檫@些藥劑中的一些阻斷DNA轉(zhuǎn)錄的特定步驟，所以聚合酶抑制劑可有助于闡明在各種健康和疾病狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄控制在調(diào)控把基因表達(dá)中的作用。
靶向特定疾病路徑所涉及的聚合酶蛋白質(zhì)的藥物為本領(lǐng)域所熟知。舉例來說，逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(RTI)是一種通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性而靶向病毒DNA的構(gòu)建的抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒藥物。存在兩種具有不同作用機(jī)制的RTI亞型核苷和核苷酸類似物RTI被并入病毒DNA中，從而導(dǎo)致鏈終止，而非核苷類似物RTI則充當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶的竟?fàn)幮砸种苿．?dāng)前通過抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶而起作用的AIDS治療劑在本領(lǐng)域中有所描述(參見例如，賓(Bean)等人，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl Environ Microbiol) 72:5670-5672 (2005 )),且包括依發(fā)韋侖(商標(biāo)名稱SUSTIVA⑧和STOCRIN )和奈韋拉平(也以商品名稱VIRAMUNE⑧銷售)。
已發(fā)現(xiàn)許多藥物有效治療癌癥。這些藥物包括不同化合物，諸如抗代謝物
10(例如，曱氨蝶呤和氟尿嘧啶)、DNA損傷劑(例如，環(huán)磷酰胺、順鉑和阿霉 素)、有絲分裂抑制劑(例如，長春新堿)、核苷酸類似物(例如，6-巰基噪呤)、 DNA修復(fù)所涉及的拓樸異構(gòu)酶的抑制劑(例如，依托泊芬)、DNA聚合酶的 抑制劑(例如，博萊霉素)或嵌入劑(如米托蒽醌)。
目前，正在研究數(shù)種靶向哺乳動(dòng)物DNA復(fù)制的酶的藥物來作為用于癌癥 化學(xué)療法的有前途候選物或作為用于了解特定酶在DNA復(fù)制和修復(fù)中的作用 的探針。這些潛在藥物候選物包括但不限于補(bǔ)骨脂曱素、補(bǔ)骨脂酚、白藜,醇、 新補(bǔ)骨脂異黃酮和黃豆苷元。(引用孫(Sun)等人)
DNA和RNA聚合酶抑制劑的其它實(shí)例包括放線菌素D,鏈霉菌屬；a-鵝膏毒肽，鵝膏屬；阿非迪霉素;HSV復(fù)制抑制劑，BP5; a-鵝膏毒肽油酸曱 酯；新生霉素，鈉鹽；利福平；RNA聚合酶III抑制劑；7-氨基-放線菌素D。 目前在II期試驗(yàn)中用于抵抗丙型肝炎病毒的三種聚合酶抑制劑是艾德尼克斯 公司/諾華公司(Idenix/Novartis)的瓦洛他濱(NM283 );維諾公司(ViroPharma) 的HCV-796;和羅氏公司(Roche )的Rl626。
羅氏公司(Roche)/艾德尼克斯公司(Idenix)也在作為HBV治療初始成 功后的II期HCV試驗(yàn)中研究伐托他濱(val-LdC ),第一鏈病毒DNA合成抑 制劑。
DNA損傷劑提供一些用于癌癥的最成功治療。多聚(ADP-核糖)聚合酶 (即PARP )可有助于修復(fù)由用于治療癌癥的DNA損傷劑所引起的DNA損傷。 因?yàn)镻ARP活性常常在癌細(xì)胞中增加，所以其提供這些細(xì)胞的存活機(jī)制。舉例 來說，ABT-888是由雅培腫瘤學(xué)公司(Abott Oncology )開發(fā)用于防止癌細(xì)胞 中的DNA修復(fù)且增加常見癌癥療法(諸如放射和烷基化劑)的有效性的口服 PARP抑制劑。此外，臨床前數(shù)據(jù)表明ABT-888改善放射和許多類型的化學(xué)療 法在動(dòng)物癌癥模型中的有效性。
新藥物是長期且復(fù)雜的藥物開發(fā)工藝的產(chǎn)物，其中第 一步是發(fā)現(xiàn)具備有前 途活性的化合物。新穎酶抑制劑可通過篩選抵抗靶酶的藥物候選化合物的文庫 來發(fā)現(xiàn)。藥物候選物包括自然界中所見的化合物，通過組合化學(xué)方法合成的化 合物，以及通過合理的藥物設(shè)計(jì)形成的化合物。常規(guī)藥物篩選和驗(yàn)證方法利用 微米級(jí)到毫米級(jí)生物化學(xué)或細(xì)胞測(cè)定來檢測(cè)酶促干擾的下游生物化學(xué)或細(xì)胞特征。舉例來說，測(cè)定可通過放射性標(biāo)記來測(cè)量通過靶酶催化合成的反應(yīng)產(chǎn)物的量的任何變化。
單分子技術(shù)提供相對(duì)于用于藥物篩選的常規(guī)試管內(nèi)測(cè)定方法的數(shù)種關(guān)鍵益處，因?yàn)槠涫褂幂^少試劑且提供較多關(guān)于藥物作用于靶的機(jī)制的斧清。舉例來說，單分子技術(shù)使得能夠觀察到瞬時(shí)狀態(tài)，從而使分離這些步驟的化合物的選擇性篩選成為可能。因此，單分子方法使得能夠鑒別、檢驗(yàn)和驗(yàn)證靶向生物化學(xué)過程中的關(guān)鍵階段(例如，轉(zhuǎn)錄或復(fù)制起始)的聚合酶或酶抑制劑。許多生物化學(xué)過程由多個(gè)瞬時(shí)步驟組成，諸如轉(zhuǎn)錄中的啟動(dòng)子結(jié)合、起始、延伸和終止。因?yàn)闈撛谒幬锇械目倲?shù)可能極高，所以單分子方法提供通過在早期僅致力于藥物篩選和發(fā)現(xiàn)工藝中受藥物候選物影響最大的那些步驟來加速所述工藝的關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)。
通過闡明DNA/RNA復(fù)制、修復(fù)所涉及的酶的動(dòng)力學(xué)機(jī)制，可基于合理的
藥物設(shè)計(jì)來鑒別抗病毒和抗癌藥物候選物。動(dòng)力學(xué)研究使用各種穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)
方法，包括快速化學(xué)中止流動(dòng)(quench-flow)和停流(stopped-flow)技術(shù)。
這些方法允許反應(yīng)中止幾毫秒，iU是供比傳統(tǒng)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)方法更多的動(dòng)力學(xué)信息。單分子技術(shù)闡明在酶的活性位點(diǎn)處進(jìn)行的反應(yīng)的基本步驟且可顯著增強(qiáng)合
理的藥物設(shè)計(jì)。
每個(gè)人體細(xì)胞中的DNA每天自發(fā)地受損10,000次以上。DNA修復(fù)對(duì)維持細(xì)胞中的基因組完整性起主要作用。
對(duì)于生物恐怖分子有可能釋放天花的擔(dān)心已導(dǎo)致密集地努力尋找有效抑制尚不存在的病毒感染的分子。因?yàn)樘旎ú《?smallpox virus/variola virus )和天花疫苗(牛痘病毒)高度同源，所以后者已用作極好的代替模型。舉例來說，牛痘病毒DNA聚合酶與天花病毒中的聚合酶約99%—致。
丙型肝炎病毒已感染至少2-3°/。的人口 。已集中研究病毒基因組復(fù)制。RNA依賴性RNA聚合酶NS5B是病毒復(fù)制的核心，且是主要抗病毒藥物靶。盡管存在對(duì)這個(gè)聚合酶的廣泛生物化學(xué)和穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)研究，但由NS5B催化的核苷酸合并的基本步驟仍然不明確。這些研究調(diào)查使核苷抑制劑的合理設(shè)計(jì)成為可能。 -
在最近十年中，已開發(fā)出新工具(例如光鑷、原子力顯微術(shù)和小玻璃纖維)
12來操縱小物體以及研究所研究的系統(tǒng)所涉及的力(參見例如，史密斯(Smith)等人，科學(xué)(Science )271:795 ( 1996 )和克魯澤爾(Cluzel )等人，科學(xué)(Science)271,795 ( 1996))。尤其，光或磁"鑷"或"阱"用通過光強(qiáng)梯度所產(chǎn)生的力捕獲粒子，且可用于在單分子水平上操縱和研究顯微鏡可見的分子。強(qiáng)到足以形成三維阱的用光學(xué)方法所產(chǎn)生的力可通過用高數(shù)值孔徑透鏡使具有適當(dāng)成形波陣面的激光束達(dá)到緊密焦點(diǎn)來獲得。光學(xué)捕獲的原理為本領(lǐng)域所熟知且總結(jié)于(例如)諾埃曼(Neuman)和布洛克(Block),科學(xué)儀器研究(Rev. Sci.Instr.) 75:2787-2809 ( 2004)中。
在生物科學(xué)中，已使用光鑷來測(cè)量在尺寸范圍為lOnm到超過lOOmm的分子的nm范圍內(nèi)的位移。為大多數(shù)光鑷生物物理學(xué)實(shí)驗(yàn)所通用的是電介質(zhì)珠粒附著于生物分子(例如底物和/或酶)，以致所述生物分子可由光阱操縱且可進(jìn)行機(jī)械測(cè)量。各種生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法為用于將核酸、其它底物、酶和其它生物大分子附著于功能化表面和珠粒的技術(shù)所已知。舉例來說，DNA可用將結(jié)合市售的包被抗生蛋白鏈菌素、微米涂層的電介質(zhì)球(例如，來自邦斯實(shí)驗(yàn)室(Bangs'Laboratories))的生物素部分進(jìn)行標(biāo)記。
如DNA和RNA聚合酶的分子馬達(dá)的研究(參見例如，達(dá)文波特(Davenport)等人，科學(xué)(Science) 287:2497-2500 (2000);馬耶爾(Maier)等人，PNAS97:12002-12007 ( 2000 );王(Wang)等人，科學(xué)(Science ) 283:902-907 ( 1998 );懷特(White)等人，自然(Nature) 404:103-106 (2000);和殷(Yin)等人，科學(xué)(Science) 270:1653-1656- ( 1995 ))。舉例來說，研究人員已能夠測(cè)量"拉開"雙鏈DNA所必需的力的序列依賴性(沃爾伽拉基斯(Voulgarakis)等人，納米通訊(Nano Letters) 6,1483-1486 (2006))。另外，使用光鑷來闡明運(yùn)動(dòng)蛋白沿微管移動(dòng)的機(jī)制(郭(Kuo)和希茲(Sheetz),科學(xué)(Science) 260, 232(1993)和布洛克(Block)等人，自然(Nature) 348， 348-352 ( 1990))。最近，研究人員以單堿基對(duì)分辨率檢測(cè)RNA聚合酶沿DNA分子的步進(jìn)動(dòng)作(阿邦丹謝里(Abbondanzieri)等人，自然(Nature) 438,460-465 (2005))。在納米生物公司(Nanobiosym)，已利用高分辨率光鑷在實(shí)驗(yàn)上證明各種環(huán)境因素對(duì)聚合酶的動(dòng)力學(xué)的作用(高爾(God)等人，自然(Nature),已付印的納
13米技術(shù)綜述文章(Nanotechnology review article in press ))。
在所有所述研究中，都利用光^l聶直接測(cè)量底物-酶相互作用的機(jī)械動(dòng)力學(xué)。 在這些研究中，所采用的實(shí)驗(yàn)設(shè)置和測(cè)量的詳情取決于所涉及的酶和/或底物 的生物功能。舉例來說，所關(guān)注的機(jī)械測(cè)量可包括底物聚合物的彈性，包括 拉伸和松弛動(dòng)力學(xué)；酶(諸如結(jié)合核酸的聚合酶)"加工"線性底物的時(shí)間依 賴性速度；由酶促結(jié)合引起的底物的變形；和/或底物結(jié)合和加工的效率或準(zhǔn) 確度。通過將位置和/或力感應(yīng)子系統(tǒng)整合到光鑷裝置中，使所有所述測(cè)量成 為可能。
本文揭示用于單分子藥物篩選、發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的新穎方法和裝置。這些方法 和裝置允許使用者在單分子水平上快速^f企測(cè)藥物候選物是否和如何千擾特定 疾病路徑所涉及的酶-底物相互作用。尤其是，可觀察到候選物藥物與單靶酶 分子之間的相互作用。本文所述的方法和裝置利用單分子操縱技術(shù)(例如光或 磁鑷或阱)在單分子水平上直接檢測(cè)藥物候選物是否可用機(jī)械方法或用化學(xué)方 法改變酶-底物相互作用。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，可利用本發(fā)明的方法和裝置來快速篩選、檢驗(yàn)和驗(yàn)證 修飾、抑制或者干擾諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA逆轉(zhuǎn)錄酶等聚合 酶的新藥物候選物且較好地闡明抑制聚合酶/底物相互作用的機(jī)制。
對(duì)底物的正常酶促活性產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)"機(jī)械特征(mechanical signature )，，。 如本文所使用，術(shù)語"機(jī)械特征"指的是酶的單分子在與其底物相互作用時(shí)的 生物機(jī)械痕跡。所述生物機(jī)械痕跡可使用可檢測(cè)nm范圍內(nèi)的位移的儀器(諸 如光鑷)來測(cè)量。如上文所述，這個(gè)動(dòng)力學(xué)機(jī)械特征可通過進(jìn)行"機(jī)械測(cè)量"， 例如通過測(cè)量以下變化來確定底物聚合物的彈性，包括拉伸和松弛動(dòng)力學(xué)； 酶(諸如結(jié)合核酸的聚合酶)"加工，，線性底物的時(shí)間依賴性速度；由酶促結(jié) 合引起的底物的變形；和/或底物結(jié)合和加工的效率或準(zhǔn)確度。
如本文所使用，術(shù)語"機(jī)械測(cè)量"意指對(duì)底物-酶相互作用的機(jī)械動(dòng)力學(xué) 的測(cè)量，其中所述機(jī)械測(cè)量檢測(cè)靶酶的單分子和/或所述靶酶的底物的單分子 的機(jī)械特征。"進(jìn)行機(jī)械測(cè)量"包括(例如)測(cè)量以下變化底物聚合物的彈 性，包括拉伸和松弛動(dòng)力學(xué)；酶(諸如結(jié)合核酸的聚合酶)"加工，'線性底物 的時(shí)間依賴性速度；由酶促結(jié)合引起的底物的變形；和/或底物結(jié)合和加工的效率或準(zhǔn)確度。
優(yōu)選"機(jī)械測(cè)量"是對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶或RNA聚合酶沿多核苷酸 (例如DNA或RNA )底物的移動(dòng)的測(cè)量。因此，在下文更詳細(xì)i侖述的所述方 法的特定實(shí)施例中，通過光學(xué)捕獲技術(shù)來監(jiān)測(cè)在藥物候選物存在和不存在下聚 合酶沿核S吏序列的實(shí)時(shí)單分子動(dòng)力學(xué)。本文未明確描述、但也可通過單分子?xùn)焤 測(cè)技術(shù)(例如光鑷)測(cè)量的聚合酶/底物相互作用的其它機(jī)械測(cè)量也是有可能 的。
機(jī)械測(cè)量可在藥物候選物存在或不存在下進(jìn)行。"基線機(jī)械特征"是通過 在藥物候選物不存在下進(jìn)行的機(jī)械測(cè)量確定的機(jī)械特征。
如本文所使用，術(shù)語"耙"或"藥物耙"指的是疾病路徑所涉及的生物分 子。抑制或者千擾所述靶的活性可有益于治療和/或預(yù)防所述疾病。如本文所 使用，術(shù)語"靶酶"指的是疾病路徑所涉及的酶。通常，靶酶是對(duì)疾病狀況或
所涉及的關(guān)鍵酶。"耙酶的活性"意指所述耙酶與靶酶的底物的相互作用。
適合于本發(fā)明的靶酶包括結(jié)合DNA和/或RNA且與DNA和/或RNA相互 作用的酶。實(shí)例包括聚合酶，諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶；拓 樸異構(gòu)酶；促旋酶；核酸外切酶；和解旋酶。靶酶可為人類酶，舉例來說，諸 如癌癥的疾病路徑所涉及的人類酶。在另一實(shí)施方式中，靶酶可為病毒或細(xì)菌 酶，諸如病毒和/或細(xì)菌介導(dǎo)的疾病所涉及的病毒或細(xì)菌酶。也涵蓋其它4效生 物酶作為適合于本發(fā)明的輩巴酶。
優(yōu)選把酶為聚合酶，諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。癌癥路
徑所涉及的聚合酶，特別是人類癌癥路徑所涉及的人類DNA聚合酶尤其優(yōu)選。 病毒介導(dǎo)的疾病路徑所涉及的聚合酶，特別是人類的病毒介導(dǎo)的疾病路徑所涉
及的病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(例如嗜肝DNA病毒(hepadnaviral)逆轉(zhuǎn)錄酶，諸如乙型 肝炎逆轉(zhuǎn)錄酶，和逆轉(zhuǎn)錄酶病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，諸如HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶)也尤其優(yōu)選。
本發(fā)明也適合于篩選可與疾病路徑所涉及的非酶靶相互作用的藥物候選 物。非酶靶的代表性實(shí)例為微管和核糖酶(諸如核糖體)。尤其是，核糖體使 用RNA作為模板來構(gòu)造多肽鏈，且因此可被視為巨酶。
如本文所使用，術(shù)語"靶酶的底物"(或"酶底物"或"底物")指的是靶酶產(chǎn)生作用的分子。酶催化涉及一種或一種以上底物的化學(xué)反應(yīng)。酶底物為本 領(lǐng)域所熟知。
優(yōu)選底物包括聚合酶底物，諸如多核香酸(例如DNA和RNA )。多核苷 酸底物在本文中又稱為多核苷酸或核酸"模板"。多核苦酸底物可為雙鏈或單 鏈DNA或RNA序列。
如本文所使用，術(shù)語"藥物候選物"或"候選物"指的是可抑制或者干擾 靶(尤其是靶酶)的活性的化合物。藥物候選物包括自然界中所見的化合物， 通過組合化學(xué)方法合成的化合物，以及通過合理的藥物設(shè)計(jì)形成的化合物。藥 物候選物的實(shí)例包括與多核苷酸(例如DNA和/或RNA)相互作用或可與其 相互作用的化合物，和/或干擾或可干擾與多核苦酸相互作用的酶的活性的化 合物。所述化合物可為已知或潛在DNA改性劑，包括DNA損傷劑(例如干 擾核酸結(jié)構(gòu)的嵌入劑)；DNA彎曲劑；錯(cuò)配結(jié)合蛋白；和/或烷基化劑。
在另一實(shí)施例中，藥物候選物可為與疾病路徑所涉及的非酶耙相互作用或 可與其相互作用的化合物。實(shí)例包括與微管和/或核糖體相互作用或可與其相 互作用的化合物。
接著描述可通過本發(fā)明方法探測(cè)的藥物候選物的一些示例性種類。第一， 數(shù)種抗生素藥物適合于由本發(fā)明方法進(jìn)行詢問，包括抑制或者干擾細(xì)菌聚合酶
(諸如細(xì)菌DNA聚合酶、細(xì)菌RNA聚合酶(例如利福平)和/或細(xì)菌逆轉(zhuǎn)錄 酶)的活性的藥物。第二，本發(fā)明方法也可用于快速篩選、4企驗(yàn)和-驗(yàn)證抑制或 以某種方式干擾病毒聚合酶(特別是病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)的新穎抗病毒藥物候選物
(例如依發(fā)韋侖和奈韋拉平)，且較好地闡明抑制RNA-逆轉(zhuǎn)錄酶相互作用的 機(jī)制。第三，數(shù)種抗癌藥物也適合于由我們的方法進(jìn)行詢問。這些藥物包括抑 制或者干擾DNA聚合酶、RNA聚合酶、拓樸異構(gòu)酶、核糖體和/或微管的活 性的藥物(例如微管拮抗劑，諸如長春新堿和紫杉醇(taxol))。另外，也可通 過本文所述的我們的方法來發(fā)現(xiàn)和闡明迄今未知的完全新穎的藥物機(jī)制。
如本文所使用，術(shù)語"單分子檢測(cè)裝置"(或"單分子檢測(cè)設(shè)備")指的是 可用于在單分子水平上進(jìn)行酶-底物相互作用的機(jī)械測(cè)量的裝置。適合于本發(fā) 明的單分子檢測(cè)裝置包括用于磁性或光學(xué)捕獲(例如光鑷)、高分辨率熒光成 像聯(lián)合量子點(diǎn)標(biāo)記和原子力顯微術(shù)的裝置。可容易設(shè)想其它裝置和本文所揭示
16的裝置的變型。
優(yōu)選單分子檢測(cè)裝置為包含光阱或光鑷的裝置。
本文所述的方法，雙NANO-VALIDTM通過直接的單分子觀察結(jié)果來確定 藥物候選物是否改變靶酶的正常"機(jī)械特征"，從而代替用于酶促干擾的下游 效應(yīng)的篩選。此外，本文所述的方法使得能夠分析和確定影響酶促動(dòng)力學(xué)的機(jī) 制。所述方法利用單分子操縱、檢測(cè)和分析裝置來確定藥物候選物是否和如何 以指示酶促抑制的方式調(diào)節(jié)這個(gè)"機(jī)械特征"。
NANO-VALIDTM篩選工藝中的第一步是選擇捕捉把酶的功能且可在單分 子水平上可靠地測(cè)量的機(jī)械特征。下文中，我們更詳細(xì)論述適合于可用單分子 檢測(cè)和操縱技術(shù)提取的特定種類的酶的示例性特征。NANO-VALIDtm方法中 的第二步是用實(shí)驗(yàn)方法確定在任何抑制劑(包括藥物候選物)不存在下靶酶的 正?；€機(jī)械特征。如上文所討論，通過使用單分子檢測(cè)裝置進(jìn)行機(jī)械測(cè)量來 確定所述基線機(jī)械特征。由于所述方法的單分子性質(zhì)，這可涉及采用數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn) 的總平均值。下文中，我們論述使得能夠單分子機(jī)械測(cè)量數(shù)種酶的動(dòng)力學(xué)的示 例性技術(shù)和裝置。
為篩選各藥物候選物，用相同實(shí)驗(yàn)技術(shù)和裝置且在與用于確定基線機(jī)械特 征的條件相同的條件下進(jìn)行耙酶的所選機(jī)械測(cè)量，但在單分子測(cè)定中存在所述 藥物候選物。視靶酶的性質(zhì)而定，可能需要首先將靶、靶的底物或兩者與藥物 候選物一起培養(yǎng)一段受控時(shí)期，隨后進(jìn)行此測(cè)量。
接著，進(jìn)行廣泛信號(hào)處理以比較候選物特異性機(jī)械特征與基線機(jī)械特征。 下文中，我們?cè)敿?xì)論述這種適合于各種酶的分析的示例性變型。如果檢測(cè)到與 所述特征并無明顯偏差，那么排除候選物而不必使其經(jīng)受進(jìn)一步篩選。這一特 點(diǎn)徹底地減少與藥物候選物篩選、檢驗(yàn)和驗(yàn)證相關(guān)的時(shí)間和成本，因?yàn)榭稍诠?藝中更早地，在昂貴臨床試驗(yàn)開始前更長時(shí)間即將失敗的藥物候選物從檢驗(yàn)中 排除。這導(dǎo)致在更早期選擇更多特定藥物候選物，以致僅使那些更有可能成功 的候選物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。在藥物發(fā)現(xiàn)工藝早期的這個(gè)增加的選擇性標(biāo)準(zhǔn)與常規(guī) 藥物驗(yàn)證和發(fā)現(xiàn)方法相比顯著減少單分子藥物發(fā)現(xiàn)工藝的成本和時(shí)間。
然而，如果檢測(cè)到與基線機(jī)械特征存在明顯偏差，那么進(jìn)行進(jìn)一步分析和 加工以鑒別干擾的潛在機(jī)制。下文中，我們?cè)敿?xì)論述這種適合于各種酶的二次
17分析的特定實(shí)施例。如果所鑒別的機(jī)制不是疾病路徑所需的，那么排除候選物 而不必使其經(jīng)受進(jìn)一步篩選。否則，認(rèn)為候選物可用于進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證。
圖1中總結(jié)了這種NANO-VALIDtm工藝。 用于聚合酶耙的NANO-VALIDTM
這里我們描述NANO-VALID方法的優(yōu)選實(shí)施例，其適合于篩選耙向聚合 酶的藥物候選物。圖3中總結(jié)了所述實(shí)施例。在這個(gè)方法實(shí)施例中，始終在步 驟1中選擇聚合酶沿核酸模板的時(shí)間依賴性位置以便隨后在步驟2和步驟3a 中進(jìn)行測(cè)量。
聚合酶主要以線性方式加工核酸模板。因此，所有聚合酶所通用的機(jī)械特 征是聚合酶沿這個(gè)底物的線性進(jìn)程。當(dāng)所述核酸模板與固定線對(duì)準(zhǔn)且保持恒定 張力時(shí)，接著聚合酶的進(jìn)程僅與聚合酶沿這個(gè)作為時(shí)間函數(shù)的固定線的位置有 關(guān)。
在抑制劑不存在下，聚合酶通常在起始點(diǎn)處結(jié)合，以相對(duì)恒定速度繼續(xù)進(jìn) 行且接著終止聚合。 一些次要的隨機(jī)行為通常在正常聚合的過程中出現(xiàn)。這些 異?？砂ù蠹s幾毫秒或更短時(shí)間的短暫中止、大約小于100個(gè)堿基(20-55 納米，取決于實(shí)驗(yàn)條件)的短暫換向，和大約每秒幾百個(gè)堿基對(duì)的聚合速度變 化。
圖6中展示證明用光鑷裝置觀察DNA聚合酶馬達(dá)在沿DNA模板向前(聚 合)和向后(核酸外切酶活性)移動(dòng)時(shí)的動(dòng)力學(xué)的能力的數(shù)據(jù)。約0.5微米/ 分鐘的速度對(duì)應(yīng)于約25個(gè)聚合的堿基對(duì)/秒。在不希望受理論束縛的情況下， 推測(cè)聚合酶抑制劑通過數(shù)種機(jī)制中的一種沖擊DNA聚合酶(DNAp ),每一機(jī) 制在模板長度-時(shí)間圖和/或聚合速度-時(shí)間圖中具有不同"機(jī)械特征"?？煞治?所述圖以鑒別所述機(jī)制。另外，可能存在到此為止未預(yù)見到的其它完全新穎的 機(jī)制，其也可能通過本文所述的我們的方法來發(fā)現(xiàn)。
圖2說明哪種聚合可能看來像存在或不存在藥物候選物。應(yīng)注意對(duì)于所示 的圖，起始點(diǎn)是y = 200 pm且假定聚合酶在約200分鐘內(nèi)從右側(cè)(y = 200 pm ) 移動(dòng)到左側(cè)(y = 0 iam)。當(dāng)藥物候選物干擾聚合酶靶時(shí)，明顯以數(shù)種方式中 的一種影響所述聚合酶沿核酸模板的動(dòng)力學(xué)，所述方式可包括調(diào)節(jié)聚合速率， 使酶不能結(jié)合或聚合，改變酶的連續(xù)性，改變酶對(duì)所述模板的結(jié)合親和力，或改變酶的序列依賴性保真度。這些情況的每一種都產(chǎn)生不同于正常聚合的機(jī)械
特征。因此，用于聚合酶靶的NANO-VALIDTM方法的這一優(yōu)選實(shí)施例使用酶 的時(shí)間依賴性位置作為步驟2和步驟3a中的機(jī)械特征(參見圖3， NANO-VALIDTM藥物篩選和驗(yàn)證工藝圖)。圖2b展示將指示藥物候選物已減 慢聚合過程的示例性機(jī)械特征。應(yīng)注意，對(duì)應(yīng)于平均聚合速度的圖的平均斜率 已變小。 一些DNA聚合酶抑制劑可(例如)僅通過減慢DNA復(fù)制的總速度 來起作用。這個(gè)痕跡將指示通過這種機(jī)制起作用的聚合酶抑制劑藥物候選物。 圖2c展示指示藥物候選物已誘導(dǎo)提前終止的示例性機(jī)械特征，其中所述藥物 候選物已在其正常完成點(diǎn)之前突然中止或停止聚合過程。 一些DNA聚合酶抑 制劑候選物可通過所述機(jī)制來起作用。這個(gè)痕跡將指示通過這種機(jī)制起作用的 聚合酶抑制劑藥物候選物。圖2d展示指示聚合酶的起始受藥物候選物抑制的 示例性機(jī)械特征。這個(gè)痕跡將指示通過這種機(jī)制起作用的聚合酶抑制劑藥物候 選物。圖2e展示指示藥物候選物誘導(dǎo)聚合酶以核外溶解模式操作的示例性機(jī) 械特征，其中其切去堿基而不是使堿基對(duì)聚合。這個(gè)標(biāo)記將僅可能出現(xiàn)于具有 活性核外溶解或"校對(duì)"位點(diǎn)的聚合酶中。這個(gè)痕跡將指示通過這種機(jī)制起作 用的聚合酶抑制劑藥物候選物。
為避免錯(cuò)誤的篩選結(jié)果，用于NANO-VALIDTM方法的這一實(shí)施例的機(jī)械 特征應(yīng)按照遠(yuǎn)超過正常聚合的隨機(jī)事件的尺度的長度和時(shí)間尺度。通常，對(duì)于 大多數(shù)聚合酶來說，應(yīng)在所選實(shí)驗(yàn)條件下在使靶穿越至少5000個(gè)堿基或堿基 對(duì)的核酸模板的時(shí)間窗口上采集機(jī)械特征。
在優(yōu)選實(shí)施例中，我們利用軟件算法來實(shí)施步驟3b,以致我們可在步驟 3c中以高準(zhǔn)確度確定是否應(yīng)排除藥物候選物。
正常聚合的隨機(jī)性質(zhì)要求我們?cè)诓襟E2和3a中選取聚合酶動(dòng)力學(xué)的顯著 特點(diǎn)，而不是使用或比較原始數(shù)據(jù)痕跡。靶酶的性質(zhì)以及所需干擾機(jī)制將決定 選取和分析哪些顯著特點(diǎn)。這些特點(diǎn)可包括馬達(dá)暫停的總時(shí)間、終點(diǎn)聚合速 度、終止效率、平均速度。通常，對(duì)于所有聚合酶來說，截止頻率為100-1000 Hz的低通濾波器也將應(yīng)用于原始信號(hào)以濾除酶的動(dòng)力學(xué)中隨機(jī)波動(dòng)的效應(yīng)。
使用模板長度測(cè)量的用于DNA聚合酶靶的NANO-VALID
這里，我們描述先前所述的適合于作用于單鏈DNA模板的DNA聚合酶靶的NANO-VALIDtm方法的變型實(shí)施例。單鏈DNA模板中的每一堿基在標(biāo)準(zhǔn) 環(huán)境條件下和約0-1 pN的恒定模板張力下具有約0.7 nm的長度。DNA聚合酶 將模板上的每一未配對(duì)的堿基轉(zhuǎn)化為在相同環(huán)境和恒定張力條件下具有約 0.34 nm長度的堿基對(duì)。因此，在等張力條件下，當(dāng)DNA聚合酶復(fù)制線性模 板，從而使單鏈DNA轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA時(shí)，兩種狀態(tài)的彈性的差異引起DNA 鏈中每一在特定力下聚合的堿基對(duì)縮短約0.36nm。因此，在聚合期間在恒定 DNA模板張力下跟蹤DNA鏈的長度類似于跟蹤聚合酶沿固定模板的位置。因 此，在這種方法變型的步驟2和步驟3a中，直接通過單分子測(cè)量裝置所獲得 的機(jī)械特征是DNA模板隨時(shí)間的長度。先前對(duì)于分析步驟3b和步驟3d中聚 合酶的位置和速度所述的信號(hào)處理方法可再次用于這種變型方法中。
用于執(zhí)行藥物候選物的NANO-VALIDTM篩選的裝置
這里，我們描述本發(fā)明的用于執(zhí)行NANO-VALIDtm方法的裝置方面，所 述裝置方面包含通過快速端口 (例如USB端口 )與個(gè)人計(jì)算機(jī)連接的單分子 測(cè)量系統(tǒng)，所述個(gè)人計(jì)算機(jī)允許接近實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集和控制所述單分子裝置系 統(tǒng)。參見圖9a和步驟9b。通過軟件驅(qū)動(dòng)器，控制這個(gè)裝置且通過具有圖形使 用者界面(graphical user interface, GUI)的常規(guī)軟件程序來詢問。在這一實(shí) 施例中，單分子測(cè)量系統(tǒng)將具有用于在單個(gè)板(例如96孔微板)上裝載和處 理數(shù)個(gè)個(gè)別樣品的容器。所述測(cè)量系統(tǒng)將整合溫度控制以確?？煽亢涂稍佻F(xiàn)的 環(huán)境條件。測(cè)量系統(tǒng)可包含下列中的一個(gè)或一個(gè)以上原子力顯微鏡、掃描電 子顯微鏡等。
為利用所述裝置，使用者將所述板裝入單分子測(cè)量中。通過GUI,其將初 始化單分子測(cè)量系統(tǒng)，包括任何必需校準(zhǔn)。接著，使用者將選擇機(jī)械特征，和 任何關(guān)于所述特征的控制參數(shù)(例如，測(cè)量特征的時(shí)間長度)。接著，通過GUl, 其將指導(dǎo)單分子測(cè)量系統(tǒng)詢問對(duì)照樣品以獲得靶酶的基線機(jī)械特征。這種測(cè)量 的精確執(zhí)行可能需要一些人工控制和人類使用者通過鍵盤、操縱桿或其它計(jì)算 機(jī)輸入設(shè)備來輸入。接著，常規(guī)軟件程序?qū)@得這個(gè)特征，且通過信號(hào)處理慣 例，選取和存儲(chǔ)所述信號(hào)的顯著特點(diǎn)。GUI將顯示顯著特點(diǎn)，或許包括原始機(jī) 械特征痕跡。
接著，GUI將允許使用者穿越板的其余部分，以獲得來自各候選物的機(jī)械信號(hào)；這可能需要數(shù)次個(gè)別測(cè)量。如前所述，這個(gè)特征采集步驟可能需要使用
者直接輸入。在每一步驟中，將獲得原始機(jī)械特征，將通過信號(hào)處理選取機(jī)械 特征的顯著特點(diǎn)，將其存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中且向使用者顯示，并與參照基線 信號(hào)作比較。
用于執(zhí)行靶向聚合酶的藥物候選物的NANO-VALIDTM篩選的裝置 為執(zhí)行用于聚合酶靶的NANO-VALIDtm方法，有必要使單分子測(cè)量裝置 準(zhǔn)確地捕捉聚合酶沿核酸模板的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)。數(shù)種技術(shù)可用于完成這種功能。 舉例來說，可利用聚合酶的高分辨率熒光成像聯(lián)合量子點(diǎn)標(biāo)記?；蛘撸衫?原子力顯微術(shù)來測(cè)量這些聚合酶動(dòng)力學(xué)(這是真的)。磁或光"鑷"或"阱" 也可用于在皮牛頓下控制模板張力和測(cè)量聚合酶沿DNA模板的納米級(jí)位移。 可容易設(shè)想其它變型。
用于執(zhí)行靶向聚合酶的藥物候選物的NANO-VALIDTM篩選的基于光鑷的
裝置
在優(yōu)選實(shí)施例中，用于聚合酶靶的NANO-VALIDtm裝置將利用基于光鑷 的單分子測(cè)量子系統(tǒng)。光鑷用通過光強(qiáng)梯度所產(chǎn)生的力捕獲粒子。強(qiáng)到足以形 成三維阱的用光學(xué)方法所產(chǎn)生的力可通過用高數(shù)值孔徑透鏡使具有適當(dāng)成形
波陣面的激光束達(dá)到緊密焦點(diǎn)來獲得。光鑷技術(shù)已廣泛地用于DNA的聚合物 特性的單分子研究和生物分子馬達(dá)(包括聚合酶)的力依賴性動(dòng)力學(xué)。由于這 些廣泛的生物物理學(xué)研究，使用光鑷沿等張力核酸模板跟蹤聚合酶的實(shí)驗(yàn)方案 已相當(dāng)成熟且為本領(lǐng)域所熟知(布洛克(Block )等人，自然(Nature )348, 348-352 (1990))。
為沿模板跟蹤聚合酶，有效固定核酸模板的一端，同時(shí)將聚合酶分子附著 于可電子操縱光鑷裝置中所捕獲的珠粒上。當(dāng)聚合進(jìn)行時(shí)，設(shè)計(jì)光阱使其自動(dòng) 移動(dòng)以維持聚合酶珠粒上的恒力。接著，阱在這些等張力條件下的動(dòng)力學(xué)位置 與在聚合期間聚合酶沿模板的動(dòng)力學(xué)相關(guān)。這種"力反饋光學(xué)捕獲子系統(tǒng)"的 優(yōu)選實(shí)施例在下文中廣泛地詳細(xì)描述?？扇菀自O(shè)想數(shù)種其它變型。
圖4展示這一實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)變型；其在其核酸固定方法方面有變化。在圖 4-C中，使核酸模板附著于通過左側(cè)所示的第二固定光阱固持的電介質(zhì)珠粒， 所述光阱發(fā)揮比聚合酶對(duì)核酸模板所施加的力大得多的強(qiáng)捕獲力。圖4-D證明
21核酸如何可通過核酸模板與剛性表面的互補(bǔ)功能化作用而固定于諸如蓋玻片 或微孔板的剛性表面上。
用于使核酸和聚合酶附著于珠粒或其它表面的方法為本領(lǐng)域所熟知；下文 給出的一些實(shí)例說明完成這種任務(wù)的示例性方法。一種所述方法通過標(biāo)準(zhǔn)方法 生物素標(biāo)記核酸或聚合酶，以致其可附著于包被抗生蛋白鏈菌素的微珠(例如， 邦斯實(shí)驗(yàn)室(Bang's Laboratories))或包被抗生蛋白鏈菌素的蓋玻片(例如， 塞諾泊公司(Xenopore Corporation))上。
用于通過核酸模板長度的單分子測(cè)量執(zhí)行NANO-VALIDTM篩選的基于光 鑷的裝置
先前所述的優(yōu)選裝置實(shí)施例可用于執(zhí)行用于DNA聚合酶沿單鏈DNA模 板的變型NANO-VALIDTM方法。如先前所論述，這種方法變型測(cè)量DNA模板 的長度，從而代替直接跟蹤聚合酶移動(dòng)。為進(jìn)行這種方法變型，必須如前所述 固定DNA的一端；然而，現(xiàn)在使DNA模板的另一端附著于通過可操縱的恒 力光阱詢問的電介質(zhì)珠粒上。酶仍游離在溶液中。
在這種變型方法中，甚至當(dāng)模板分子由于聚合而縮短時(shí)，阱也將移動(dòng)以維 持DNA模板上的恒力，從而代替阱響應(yīng)聚合酶沿模板移動(dòng)的力而移動(dòng)。如先 前所論述，這是幾乎類似的測(cè)量。雖然所述方法變型需要樣品制備的微小差異， 但這種方法變型既不需要裝置的差異，也不需要控制軟件的差異。圖4a-b概 括了用于執(zhí)行這種方法變型的實(shí)驗(yàn)變型。
力反饋光學(xué)捕獲子系統(tǒng)
圖5A說明甚至當(dāng)所捕獲珠粒由于聚合酶的酶促活性而經(jīng)受其它力時(shí)也會(huì) 維持所述珠粒上的恒力的光學(xué)捕獲系統(tǒng)的示例性設(shè)計(jì)。通過一 系列透鏡和鏡面 (B)使IR激光源(A)聚焦于樣品平面中的位置(xo， yo)。通過雙軸聲光 偏轉(zhuǎn)器(AOD) (L)的偏轉(zhuǎn)角來確定這個(gè)聚焦位置(xo, yo )。樣品載玻片(C ) 上的高斯光束(Gaussian beam)分布捕獲附著于聚合酶(未圖示)或核酸模板 (如圖所示)上的珠粒。
四象限光電二極管或QPD(D)檢測(cè)從珠粒散射出的IR信號(hào)的干擾圖案， 且輸出這個(gè)信號(hào)的x和y擾動(dòng)。將這些信號(hào)擴(kuò)增(E),通過數(shù)據(jù)采集卡(data acquistion card, DAQ)獲得，與個(gè)人計(jì)算機(jī)(G)連接。隨后，以數(shù)據(jù)采集和分析程序(例如在來自國家儀器公司(National Instruments )的Labview⑧中編 程)處理這個(gè)數(shù)據(jù)，以在近納米分辨率下確定珠粒相對(duì)于光阱中心的位置和測(cè) 量珠粒上的以皮牛頓計(jì)的捕獲力。(也參見圖5B)
通過靈敏CCD相機(jī)(例如，庫克(Cooke)的PixelFly )聯(lián)合光學(xué)顯微鏡 (F)來捕捉珠粒的直接圖像。常規(guī)數(shù)據(jù)分析計(jì)算機(jī)程序提供珠粒的納米級(jí)位 置檢測(cè)；圖像分析程序提供樣品平面的圖像，包括所捕獲的珠粒。
在力反饋系統(tǒng)操作(L， K)下，激光對(duì)珠粒所施加的力甚至在作用于珠 粒的酶促力存在下也保持恒定，從而在阱內(nèi)移動(dòng)其位置。這通過確定珠粒相對(duì) 于激光阱中心的瞬時(shí)位置且比較其與參照位置(對(duì)應(yīng)于所捕獲珠粒上的特定 力)的軟件程序來完成。將這個(gè)當(dāng)前位置與所需珠粒位置之間的差異轉(zhuǎn)化為射 頻(RF )驅(qū)動(dòng)器(K)輸入到雙軸AOD晶體中的雙通道頻率信號(hào)(△&， Afy )。 這個(gè)射頻在晶體中形成駐波，接著衍射入射的激光束。 一級(jí)衍射光束的位置隨 射頻而變。
因此，激光束可通過控制輸入到AOD晶體中的RF來準(zhǔn)確且快速地調(diào)向。 數(shù)據(jù)采集程序計(jì)算應(yīng)由射頻驅(qū)動(dòng)器(K)產(chǎn)生以偏轉(zhuǎn)足以補(bǔ)償珠粒位置的酶促 驅(qū)動(dòng)移動(dòng)的光束的新反饋頻率?？蓪?duì)這個(gè)輸出頻率的記錄進(jìn)行后處理以輸出阱 位置隨聚合時(shí)間的時(shí)間演化。
NANO-VALID 藥物驗(yàn)證工藝與常規(guī)方法相比的獨(dú)特特點(diǎn)是 NANO-VALIDTM系統(tǒng)使得能夠高分辨率實(shí)時(shí)跟蹤藥物候選物如何改變或干擾 聚合酶沿核酸模板的移動(dòng)。進(jìn)一步將這個(gè)系統(tǒng)高度整合和自動(dòng)化，從而使其容 易升級(jí)用于高通量藥物篩選應(yīng)用。
本文所述的方法和裝置還提供許多相對(duì)于常規(guī)藥物篩選和驗(yàn)證技術(shù)的成 本相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。如圖8至圖10所說明，本發(fā)明方法和裝置使得能夠快速篩選， 從而使勞動(dòng)時(shí)間減少約115倍。另夕卜，本發(fā)明的單分子方法使試劑體積減少約 130倍，且減少的儀器循環(huán)時(shí)間導(dǎo)致處理時(shí)間減少約10到50倍。因此，總之， 本發(fā)明使得總成本改進(jìn)約20到100倍。
實(shí)施例
使用模板長度的動(dòng)力學(xué)來檢測(cè)DNA復(fù)制的抑制的方法和裝置
在本實(shí)例中，我們說明通過DNA模板長度的單分子測(cè)量來檢測(cè)DNA復(fù)
23制的抑制的方法和裝置。在本實(shí)例中，我們?cè)O(shè)法篩選通過以下兩種機(jī)制中的一
種來抑制DNA聚合的藥物干擾聚合酶結(jié)合或超低連續(xù)性。圖2-A展示預(yù)期 的正常特征，而2-B展示預(yù)期來自有效藥物候選物的結(jié)果。用于單分子測(cè)量的 裝置包含如先前所述的力反饋光學(xué)捕獲子系統(tǒng)。用于此機(jī)械特征測(cè)量的實(shí)驗(yàn)設(shè) 置在圖5a和5b中展示。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，用抗生蛋白鏈菌素涂覆光學(xué)透明多孔微板的內(nèi)表面。制備 長度超過5 kb的生物素標(biāo)記ssDNA模板的樣品(羅森伯格(Rothenberg)-全 文引用)且使其懸浮于緩沖溶液中。也設(shè)計(jì)可起始聚合的DNA引物。制備包 被抗生蛋白鏈菌素的0.5-1微米珠粒(可得自邦斯實(shí)驗(yàn)室(Bang's Laboratories )) 的懸浮液且將其分配到各孔中；隨后，也將ssDNA模板的溶液分配到各孔中。 為了發(fā)生抗生蛋白鏈菌素-生物素結(jié)合，將所述板培養(yǎng)約30分鐘，以致形成 DNA范圍的足夠群體，其使核酸的一端附著于微板，另一端附著于包被抗生 蛋白鏈菌素的珠粒。將藥物候選物如下分配到各孔中各孔含有至多一種候選 物；將各候選物加入N個(gè)孔中以提供冗余度。 一組C孔并未添加有任何候選 物以致其可用作對(duì)照樣品。
啟動(dòng)光鑷裝置且根據(jù)圖形使用者界面進(jìn)行校準(zhǔn)。將微孔板裝入光鑷裝置， 以致其底部與光阱的聚焦平面齊平。使用GUI來設(shè)定詢問時(shí)間且將捕獲力設(shè) 定為0-35 pN的所需值。也使用GUI來鑒別哪些候選物(如果有)存在于各微 孔中。
向GUI提供輸入數(shù)據(jù)以驅(qū)動(dòng)微孔板，使得光鑷光束詢問第一對(duì)照微孔。 使用操縱桿和樣品平面的CCD圖像，手動(dòng)捕獲合適的珠粒。嚙合力反饋系統(tǒng) 且隨后立即將DNA引物、dNTP混合物和靶DNA聚合酶的緩沖懸浮液加入這 個(gè)單微孔中。這同樣可應(yīng)用于RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。使力反饋系統(tǒng)運(yùn)行以 便在所選時(shí)間間隔期間跟蹤阱的位置；將這些結(jié)果存儲(chǔ)于存儲(chǔ)器中以致其可通 過孔位址和作為對(duì)照結(jié)果來定址和識(shí)別。對(duì)于對(duì)照孔的其余部分重復(fù)這個(gè)過 程。從GUI可見，運(yùn)行程序以分析多個(gè)對(duì)照樣品，以便選取數(shù)個(gè)為聚合酶靶 所共有的顯著特點(diǎn)。首先，對(duì)這些對(duì)照組應(yīng)用截止頻率在100-1000 Hz范圍內(nèi) 的不同低通濾波器的選擇，且顯示結(jié)果以致使用者可選擇產(chǎn)生最高信號(hào)平滑程 度、同時(shí)維持靶聚合酶的總動(dòng)力學(xué)的完整性的具有截止頻率coc的濾波器。一旦過濾，數(shù)值微分方案確定每一點(diǎn)的瞬時(shí)速度。接著，對(duì)于范圍為整個(gè)
采集窗口 (即，t=
)到大致對(duì)應(yīng)于100個(gè)堿基對(duì)(約二分之一長度的窗 口 ，這取決于聚合酶的速度)的窗口的不同窗口尺寸確定速度的最鄰近平均值。
向GUI提供輸入數(shù)據(jù)以驅(qū)動(dòng)微孔板，以致光鑷光束詢問第一非對(duì)照微孑L。 使用操縱桿和樣品平面的CCD圖像，手動(dòng)捕獲合適的珠粒。嚙合力反饋系統(tǒng) 且隨后立即將DNA引物、dNTP混合物和靶DNA聚合酶的緩沖懸浮液加入這 個(gè)單微孔中。力反饋系統(tǒng)繼續(xù)在所選時(shí)間間隔期間跟蹤阱的位置；將這些結(jié)果 存儲(chǔ)于存儲(chǔ)器中以致其可通過孔位址以及存在的藥物候選物來定址和識(shí)別。對(duì) 于對(duì)照孔的其余部分重復(fù)這個(gè)過程。
用具有截止頻率coc的低通濾波器過濾所有獲得的結(jié)果。用GUI對(duì)結(jié)果進(jìn) 行數(shù)值微分，且關(guān)于與對(duì)照組相同的時(shí)間尺度來計(jì)算最鄰近速度圖。依次考慮 各藥物候選物。對(duì)于N個(gè)樣品中的任一個(gè)來說，在任何時(shí)間尺度上的實(shí)質(zhì)上 非零速度都將指示藥物候選物并不可靠地或有效地干擾DNA復(fù)制過程。為此， 排除對(duì)于N個(gè)樣品中的任一個(gè)來說，在任何時(shí)間尺度上都顯示實(shí)質(zhì)上非零速 度(例如，所有對(duì)照組的平均速度為1%)的那些候選物。
使用聚合酶沿DNA鏈的動(dòng)力學(xué)來檢測(cè)RNA聚合酶耙的提前終止的方法 和設(shè)備
在本實(shí)例中，我們說明通過RNA聚合酶來檢測(cè)RNA轉(zhuǎn)錄的提前終止的 方法和裝置。在本實(shí)例中，我們篩選誘導(dǎo)RNA聚合在特定位點(diǎn)起始后提前終 止的藥物候選物。圖2-A展示預(yù)期的正常特征，而2-B展示預(yù)期來自有效藥物 候選物的結(jié)果。用于單分子測(cè)量的裝置是包含力反饋光學(xué)捕獲子系統(tǒng)和較高功 率可操縱光阱的雙光束光4聶裝置。
通過標(biāo)準(zhǔn)方法來制備雙鏈(ds) DNA的樣品以使其包含停止轉(zhuǎn)錄復(fù)合物
(包含生物素標(biāo)記)，以及位于DNA的下游端的生物素標(biāo)簽(卡 崔 諾埃 曼(Neuman，K.C.)等，細(xì)胞(Cell) , 115:437-447,2003 )。隨后使轉(zhuǎn)錄因子標(biāo) 簽附著于包被抗生蛋白鏈菌素的1微米直徑電介質(zhì)珠粒(例如，邦斯實(shí)驗(yàn)室
(Bang's Laboratories))上，且使DNA標(biāo)簽附著于包被抗生蛋白鏈菌素的0.5 微米直徑電介質(zhì)珠粒(例如，邦斯實(shí)驗(yàn)室(Bang's Laboratories ))上。這形成 在每一端都具有珠粒"柄，，的DNA "啞鈴體(dumbell)"的樣品 一個(gè)附著于DNA的末端，另一個(gè)附著于RNA聚合酶上。將藥物候選物如下分配到光 學(xué)透明微孔板的孔中各孔含有至多一種候選物；將各候選物加入N個(gè)孔中 以提供冗余度。 一組C孔并未添加有任何候選物以致其可用作對(duì)照樣品。
啟動(dòng)光鑷裝置且根據(jù)圖形使用者界面進(jìn)行校準(zhǔn)。將微孔板裝入光鑷裝置 中，以致其底部與光阱的焦點(diǎn)平面齊平。使用GUI來設(shè)定詢問時(shí)間T，且將 力反饋光束的捕獲力設(shè)定為0-35 pN的所需值。也使用GUI來鑒別哪些候選物 (如果有)存在于各微孔中，以致微孔隨后可通過其位置和含量來定址。
向GUI提供輸入數(shù)據(jù)以驅(qū)動(dòng)微孔板，以致光鑷光束詢問第一對(duì)照微孔。 使用操縱桿和樣品平面的CCD圖像，通過捕獲力反饋光阱中的較大珠粒和強(qiáng) 次級(jí)阱中的較小珠粒來手動(dòng)捕獲啞鈴體。嚙合力反饋系統(tǒng)且隨后立即將RNA dNTP混合物的緩沖懸浮液加入這個(gè)單微孔中。力反饋系統(tǒng)繼續(xù)在所選時(shí)間間 隔期間跟蹤阱的位置；將這些結(jié)果存儲(chǔ)于存儲(chǔ)器中，以致其可通過孔位址和作 為對(duì)照結(jié)果來定址和識(shí)別。對(duì)于對(duì)照孔的其余部分重復(fù)這個(gè)過程。從GUI可 見，運(yùn)行程序來分析多個(gè)對(duì)照樣品，以便選取數(shù)個(gè)為聚合酶靶所共有的顯著特 點(diǎn)。首先，對(duì)這些對(duì)照組應(yīng)用截止頻率在100-1000 Hz范圍內(nèi)的不同低通濾波 器的選擇，且顯示結(jié)果以致使用者可選擇產(chǎn)生最高信號(hào)平滑程度、同時(shí)維持靶 聚合酶的總動(dòng)力學(xué)的完整性的具有截止頻率coc的濾波器。
一旦過濾，數(shù)值微分方案確定每一點(diǎn)的瞬時(shí)速度。接著，對(duì)于范圍為整個(gè) 采集窗口 (即，t-
)到大致對(duì)應(yīng)于100個(gè)堿基對(duì)(約二分之一長度的窗 口，這取決于聚合酶的平均速度)的窗口的不同窗口尺寸確定速度的最鄰近平 均值。接著，使用者通過GUI選擇對(duì)應(yīng)于聚合仍應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間最大值(即， 超過后聚合應(yīng)被有效藥物候選物終止的時(shí)間)的時(shí)間點(diǎn)，To<T。
向GUI提供輸入數(shù)據(jù)以驅(qū)動(dòng)微孔板，以致光鑷光束詢問第一非對(duì)照微孔。 使用操縱桿和樣品平面的CCD圖像，手動(dòng)捕獲合適的珠粒。嚙合力反饋系統(tǒng) 且隨后立即將RNA dNTP混合物的緩沖懸浮液加入這個(gè)單微孔中。使力反饋 系統(tǒng)運(yùn)行以在所選時(shí)間間隔期間跟蹤阱的位置；將這些結(jié)果存儲(chǔ)于存儲(chǔ)器中， 以致其可通過孔位址以及存在的藥物候選物來定址和識(shí)別。對(duì)于對(duì)照孔的其余 部分重復(fù)這個(gè)過程。
用具有截止頻率coc的低通濾波器過濾所有獲得的結(jié)果。用GUI對(duì)結(jié)果進(jìn)
26行數(shù)值微分，且關(guān)于與對(duì)照組相同的時(shí)間尺度來計(jì)算最鄰近速度圖。依次考慮 各藥物候選物。如果藥物候選物可靠地以所需方式干擾轉(zhuǎn)錄，那么所有相關(guān)的
N個(gè)樣品都應(yīng)在時(shí)間To后顯示實(shí)質(zhì)上非零速度。因此，排除對(duì)于To后的任何 時(shí)間窗口來說N個(gè)樣品中的任一個(gè)都顯示實(shí)質(zhì)上非零速度(例如，所有對(duì)照 組的平均速度為1%)的那些候選物。
雖然本發(fā)明已參考其特定實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述，但對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人 員將顯而易見的是在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下可進(jìn)行各種變化，和利用等 效物。
本文所論述的公開出版物僅僅在本申請(qǐng)的申請(qǐng)日期之前提供其揭示內(nèi)容。 本文中無任何內(nèi)容可解釋為承認(rèn)本發(fā)明無權(quán)先于根據(jù)先前發(fā)明之所述公開內(nèi) 容公開。此外，所提供的
公開日期可能不同于實(shí)際
公開日期，這可能需要獨(dú)立 地加以i正實(shí)。
本文所引用的所有^Hf出版物都以全文引用的方式并入。
權(quán)利要求
1. 一種用于篩選藥物候選物的方法，其中所述方法包含(a)使靶酶與所述靶酶的底物接觸；(b)通過使用單分子檢測(cè)裝置進(jìn)行機(jī)械測(cè)量來確定在所述靶酶的所述底物存在下所述靶酶的基線機(jī)械特征；(c)使所述靶酶和所述靶酶的所述底物與一種或一種以上藥物候選物接觸；(d)通過使用單分子檢測(cè)裝置進(jìn)行機(jī)械測(cè)量來確定在所述靶酶的所述底物和一種或一種以上藥物候選物存在下所述靶酶的機(jī)械特征；以及(e)比較步驟(b)的所述基線機(jī)械特征與步驟(d)的所述機(jī)械特征；其中步驟(b)的所述基線機(jī)械特征和步驟(d)的所述機(jī)械特征使用同一單分子檢測(cè)裝置和相同機(jī)械測(cè)量得以確定。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述機(jī)械測(cè)量選自由下列測(cè)量所 組成的組中對(duì)所述耙酶沿所述把酶的所述底物的時(shí)間依賴性速度的測(cè)量、對(duì) 所述把酶的所迷底物的長度的時(shí)間依賴性變化的測(cè)量、對(duì)所述靶酶的所述底物 的彈性的變化的測(cè)量，以及對(duì)通過所述靶酶進(jìn)行底物結(jié)合和加工的效率或準(zhǔn)確 度的測(cè)量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述單分子檢測(cè)裝置選自由下列 裝置所組成的組中利用磁性或光學(xué)捕獲的裝置、利用高分辨率熒光成像聯(lián)合 量子點(diǎn)標(biāo)記的裝置和利用原子力顯微術(shù)的裝置。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述靶酶是聚合酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶選自由下列酶所組成 的組中DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶是人類聚合酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶是病毒聚合酶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述病毒聚合酶是病毒逆轉(zhuǎn)錄酶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述病毒逆轉(zhuǎn)錄酶是HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述聚合酶是細(xì)菌聚合酶。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述靶酶是聚合酶，所述靶酶的 所述底物是多核苷酸，且所述分子測(cè)量是對(duì)所述聚合酶沿所述多核香酸底物的 移動(dòng)的測(cè)量或?qū)酆掀陂g所述多核苷酸底物的長度的時(shí)間依賴性變化的測(cè)量。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述分子測(cè)量使用利用磁性或 光學(xué)捕獲的單分子檢測(cè)裝置來進(jìn)行。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法提供準(zhǔn)確地表征所檢驗(yàn) 的藥物候選物的抑制和/或干擾機(jī)制的詳細(xì)酶促動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
全文摘要
本申請(qǐng)揭示了用于單分子藥物篩選、發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的方法和裝置。這些方法和裝置允許使用者使用單分子的觀察結(jié)果快速檢測(cè)藥物候選物是否和如何干擾特定疾病路徑所涉及的靶酶。本文所述的方法和裝置利用單分子操縱和檢測(cè)技術(shù)(例如，光鑷或磁鑷)來直接檢測(cè)靶酶-底物相互作用的特征動(dòng)力學(xué)或“機(jī)械特征(mechinal signature)”是否實(shí)質(zhì)上由藥物候選物改變或調(diào)節(jié)。此外，所述方法和裝置適用于分析機(jī)械特征的調(diào)節(jié)以便鑒別藥物候選物的潛在干擾機(jī)制。本發(fā)明的一方面中，本文所揭示的方法和裝置涉及監(jiān)測(cè)在抑制或者調(diào)節(jié)聚合過程的藥物候選物存在下個(gè)別聚合酶分子(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶)沿多核苷酸底物的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)機(jī)械特征。所述藥物候選物的鑒別和分析對(duì)于抗病毒、抗癌和抗生素藥物的開發(fā)至關(guān)重要。
文檔編號(hào)G01N33/567GK101479605SQ200780022986
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2007年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者阿妮塔·高爾 申請(qǐng)人:納諾拜希姆公司