專利名稱：用于診斷t1dm的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷T1DM的新方法和試劑盒。
糖尿病是一組慢性代謝性疾病，其特征在于高血糖(葡萄糖)水 平，這是由于胰島素分泌或者胰島素作用或者二者的缺陷所致。如果 不進行治療，那么糖尿病可能會造成嚴重的健康并發(fā)癥，包括腎衰竭、 心臟病、中風(fēng)和失明。大約一千五百萬美國人(人口的大約8%)患 有糖尿病。從經(jīng)濟學(xué)的角度而言，據(jù)估計，在美國在1997年，糖尿 病的總的年經(jīng)濟成本為980億美元。
1型糖尿病(T1DM)，也被稱作青少年糖尿病或胰島素依賴型 糖尿病，始于兒童期或青春期且最常見于8-12歲的年齡。在美國，大 約5 %至10 %的診斷糖尿病是T1DM。
T1DM是胰島中分泌胰島素的(3細胞的器官特異性自身免疫破壞 的結(jié)果，其導(dǎo)致身體不產(chǎn)生胰島素。已清楚T1DM是T細胞所介導(dǎo)的 多因素自身免疫性疾病，其中(3細胞破壞需要CD4+和CD8+T細胞和 巨噬細胞。促炎介質(zhì)和黏附分子參與引導(dǎo)這些自身反應(yīng)性白細胞侵入 和累積到胰島內(nèi)。
T1DM的特定亞群被稱作成人隱匿性自身免疫性糖尿病[LADA; 也被稱作成人遲發(fā)自身免疫糖尿病，"遲發(fā)型"l糖尿病或"1.5型" (一點五型)糖尿病]。這種醫(yī)學(xué)病癥與胰島自身抗體相關(guān)聯(lián)，類似于 1型糖尿病，但是由于其遲發(fā)性，常常被誤診為2型糖尿病(T2DM)。
在早期，LADA典型地呈現(xiàn)為非肥胖2型糖尿病表型(患者較瘦 或為正常重量)。令人遺憾的是，在其生理表現(xiàn)中，LADA更像青少 年(1型)糖尿病且與胰島素依賴型疾病具有代謝紊亂、遺傳學(xué)和自 身免疫特點等共同特征。T1DM的當前診斷是基于檢測谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞 抗原(ICA)512/IA-2和胰島素的自身抗體。令人遺憾的是，這些測試 的敏感性不足以覆蓋所有的T1DM患者。在發(fā)病時，使用抗GAD、 1A-2A和抗胰島素(IAA)抗體的組合提供>85 %的敏感性。只使用抗 GAD的敏感性為70-80%,只使用1A-2A的敏感性為50-70%,以及 只使用抗胰島素(IAA)的敏感性為30-50%,且這些范圍中的變化反 映研究之間的種群差異(Clive等人，Autoimmunity reviews, 5:424-428， 2006; Polly等人，Diabetes Care, 24:398， 2001 );因此這些測試并不提 供充分的診斷準確性和可靠性。
而且，在糖尿病診斷之后，患者并不顯示對胰島素或ICA512顯 著的抗體滴度，且只是有限數(shù)量的患者顯示對GAD的抗體滴度。因 此，成人自身免疫糖尿病的診斷并不容易且通常在用口服降血糖藥物 對患者進行治療失敗后才會考慮(在糖尿病診斷后的若干年)。在此 情況下，僅小部分患者具有抗GAD抗體的陽性滴度。
如上文所述，LADA患者常常被基于診斷時他們的年齡而錯誤地 診斷為2型糖尿病且目前可用的診斷工具包括自身抗體產(chǎn)生和C肽水 平的工具(其給出胰腺所產(chǎn)生的胰島素水平的表示)。這種誤診常常 會導(dǎo)致錯誤的治療方案(在發(fā)病時給予磺酰脲或其它糖尿病藥丸，而 不是口服胰島素)。應(yīng)注意的是，盡管LADA患者可能會對口服糖尿 病藥物和生活方式改變產(chǎn)生反應(yīng)，但他們的(3細胞繼續(xù)遭到破壞且應(yīng) 密切地監(jiān)測LADA患者。因此，能夠正確地診斷1型糖尿病(包括 LADA)以便給予正確治療是非常重要的。
趨化因子是介導(dǎo)自身免疫性疾病的促炎蛋白質(zhì)。這種作用使得這 些蛋白質(zhì)為療法的有效靶位。在小鼠實驗?zāi)Ｐ椭校赥1DM期間，發(fā) 現(xiàn)趨化因子CCL2 (MCP-I) 、 CCL3(MIP- la)和CCL4 (MIP- ip)在發(fā) 炎的胰腺中表達[Cameron, M. J.等人，J Immunol 165: 1102 (2000)]。
此外，發(fā)現(xiàn)CCL3和CCL4在有T1DM風(fēng)險(家族史)的個體中 上調(diào)，其展示了高水平的T1DM特異性自身抗體(ICA、 GAD和IA-2自身抗體)[Hanifi-Moghaddam等人，Diabetic Medicine 231: 56 (2006)]。
重要的是，在之前研究中并未確定CCL3的自身抗體的存在，而且 CCL3的自身抗體也沒有被建議為潛在的診斷工具。
因此，廣泛地認識到需要不具有上述局限性的用于診斷T1DM糖 尿病的方法和試劑盒，而且開發(fā)出這種方法和試劑盒對于診斷T1DM 糖尿病非常有利。
發(fā)明概要
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種用于診斷有需要的受試者中的 1型糖尿病(T1DM)的方法，該方法包括確定受試者的生物樣品中 CCL3抗體的存在或水平，其中存在或水平超過預(yù)定閾值表明為 T1DM，從而診斷受試者患有T1DM。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于診斷T1DM的試劑盒，該 試劑盒包括包裝材料和用于確定受試者的生物樣品中的抗CCL3抗體 的至少一種試劑。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供一種用于監(jiān)測有需要的受試者的抗 糖尿病治療的方法，該方法包括使受試者經(jīng)受抗糖尿病治療；以及確 定受試者的生物樣品中抗CCL3抗體的存在和/或水平，其中在受試者 經(jīng)受抗糖尿病治療后生物樣品中抗CCL3抗體水平的改變表明療效。
根據(jù)下文所述的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的另外的特點，在使受試 者經(jīng)受抗糖尿病治療的步驟之后和任選地在使受試者經(jīng)受抗糖尿病 治療的步驟之前，確定抗CCL3抗體的存在和/或水平。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的另外的特點，抗糖尿病治療包含選自胰 島素、胰高血糖素、葡萄糖、雙胍類藥物、鉻、人參、鎂和釩的藥物。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的另外的特點，抗糖尿病治療選自胰腺移 植、胰島細胞移植以及生活方式方案。
根據(jù)所述優(yōu)選的實施方案的另外的特點，在體外確定抗CCL3抗體的存在或水平。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的另外的特點，T1DM包含成人隱匿性自 身免疫性糖尿病(LADA)。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的另外的特點，在引發(fā)對T1DM疾病狀態(tài) 特異的自身抗體之前確定抗CCL3抗體的存在或水平。
根據(jù)在所述優(yōu)選的實施方案的另外的特點，該方法包含確定對 T1DM疾病狀態(tài)特異的自身抗體的存在或水平。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的另外的特點，試劑盒還包含用于確定對 T1DM疾病狀態(tài)特異的自身抗體的存在或水平的至少一種試劑。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的另外的特點，對T1DM疾病狀態(tài)特異的 自身抗體對于選自谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞抗原(ICA) 512/IA-2和胰島素的抗原是特異的。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的另外的特點，閾值包含log2Ab 10 - 15 的抗CCL3滴度。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它的特點，試劑盒包含如下的說明 其中l(wèi)og2Ab 10 - 15的抗CCL3滴度表明T1DM。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的另外的特點，通過ELISA來確定抗 CCL3抗體的存在和/或水平。
本發(fā)明通過提供用于診斷T1DM的新方法和試劑盒來成功地解 決目前已知配置的缺點。
除非另有不同定義，本文所用的所有科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬 的領(lǐng)域的技術(shù)人員一般理解的意義。在下文中描述了適合的方法和材 料，但與本文所描述的這些方法或材料類似或等效的方法和材料也可 用于本發(fā)明的實踐或測試。在有沖突的情況下，以專利發(fā)明書，包括 定義，為主。此外，材料、方法和實施例僅是說明性的且并無限制意 義。
附圖簡述參看附圖，僅以舉例說明的方式在本文中描述了本發(fā)明?，F(xiàn)具體 地參看特定附圖，應(yīng)強調(diào)的是，所示特定方面是舉例說明且僅用于說 明性討論本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的目的，且呈現(xiàn)這些特定方面是為了 提供最適用于和易于理解本發(fā)明的原理和概念方面的內(nèi)容。在這點 上，只是給出了本發(fā)明的基本理解所必要的本發(fā)明的詳細的結(jié)構(gòu)細 節(jié)，且結(jié)合附圖的描述使得本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地理解在實踐中本發(fā)
明的若干形式如何實施。在附圖中


圖1是描繪新診斷為T1DM (在診斷的一個星期內(nèi))的10個受 試者的自身抗體滴度的條線圖。對于每個患者，條自左向右描繪了 IP-IO、 CXCL8 (IL-8)、 CCL2 (MCP-1)、 CCL3 (MIP- lot)和CCL4 (MCP-1 卩)的自身抗體滴度。應(yīng)注意的是，IO個受試者中的9個對CCL3有高 且選擇性的自身抗體反應(yīng)。
圖2是描繪示出了新發(fā)病糖尿病的受試者(n=30)、前驅(qū)糖尿病 受試者(n=20)、長時間的T1DM (n=38)和正常對照(n=20 )中陽 性CCL3自身抗體滴度的受試者的百分比的條線圖。
圖3是描繪示出了在患有新發(fā)病糖尿病的30個患者中T1DM相 關(guān)的自身抗體(抗胰島素(CIAA)、抗ICA、抗GAD，所有三個診 斷標記的組合與抗CCL3)的陽性自身抗體滴度的受試者的百分比的 條線圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明是用于診斷T1DM的方法和試劑盒。 參看附圖和所附描述，可更好地理解本發(fā)明的原理和操作。 在詳細解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應(yīng)了解本發(fā)明在應(yīng) 用方面并不限于在下文的描述中所陳述或?qū)嵤├镜募毠?jié)。本發(fā) 明能夠具有其它的實施方案或能夠以各種方式實踐或執(zhí)行。而且，應(yīng) 了解本文所采用的措詞和術(shù)語是出于描述目的且不應(yīng)被理解為具有 限制意義。1型糖尿病(T1DM)是胰島中分泌胰島素的卩細胞的器官特異 性自身免疫破壞的結(jié)果，其最終會導(dǎo)致身體不產(chǎn)生胰島素，卩細胞破 壞在表現(xiàn)出疾病癥狀的數(shù)年前就開始了 。據(jù)估計在臨床發(fā)病時僅剩余 10%的總卩細胞質(zhì)量。因此，當最終診斷疾病時，可能早已發(fā)生關(guān)鍵 的卩細胞耗竭和胰島素依賴性。
成人隱匿性自身免疫性糖尿病(LADA)是T1DM的亞群，由于 其遲發(fā)性，其經(jīng)常被誤診為非肥胖2型糖尿病，因為遲發(fā)性是2型糖 尿病(T2DM)的特征。LADA患者通常比典型T1DM的患者表現(xiàn)有 更多的保留的卩細胞功能，但一般會在診斷后的3年內(nèi)經(jīng)歷顯著的卩 細胞功能的損失，這最終會導(dǎo)致胰島素依賴性。盡管LADA患者可能 會對抗T2DM的治療有反應(yīng)(口服降血糖糖尿病藥物和生活方式改 變)，但他們的p細胞繼續(xù)遭到破壞，且因此治療常常需要口服治療 的快速升級和胰島素的早期使用。然而，繼續(xù)的卩細胞破壞使這些患 者經(jīng)受健康惡化，這可能會導(dǎo)致威脅生命的狀態(tài)。使用篩選工具來在 早期識別LADA將改進血糖生成控制且防止不希望的并發(fā)癥。
如果不進行治療，那么糖尿病可能會造成嚴重的健康并發(fā)癥，包 括腎衰竭、心臟病、中風(fēng)和失明。因此，需要準確且在早期識別T1DM 的方法以便在癥狀出現(xiàn)和疾病進展之前診斷T1DM。
當前的基于抗體的"^斷T1DM的方法(例如，GAD、 ICA 512/IA-2 和胰島素)敏感程度不足以覆蓋所有的T1DM患者。
CCL3是一種趨化因子，在小鼠實驗?zāi)Ｐ椭性赥1DM期間，發(fā)現(xiàn) 其與其它的趨化因子一起在發(fā)炎的胰腺中表達[Cameron, M. J.等人，J Immunol 165:1102 (2000)]。在人研究中獲得了類似的結(jié)果 [Hanifi-Moghaddam,等人，Diabetic Medicine 231: 56 (2006)]。
當將本發(fā)明付諸實施時，本發(fā)明人揭示了在一般診斷為T1DM的 受試者和特別地患有T1DM持續(xù)5年的受試者中抗CCL3自身抗體的 引發(fā)。
如在下文的實施例部分中所說明，本發(fā)明人已示出早期診斷的T1DM受試者出現(xiàn)了對CCL3而不是對其它的炎癥介質(zhì)專有的自身抗 體反應(yīng)(實施例部分的實施例1)。本發(fā)明人還示出抗CCL3自身抗 體在卯％的受試者中存在(實施例部分的實施例2)，其具有與常規(guī) 使用的自身抗體的組合表現(xiàn)(抗ICA、 GAD和CIAA自身抗體，其中 被測試的受試者中93%是陽性的)所發(fā)現(xiàn)的相同的百分比。此外，本 發(fā)明人還示出抗CCL3自身抗體在前驅(qū)糖尿病(例如，具有陽性自身 抗體的T1DM的患者的一級親屬)以及自從診斷5年或更長時間的受 試者中以高百分比存在(參看實施例部分的實施例2 )。
總之，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)可用于最好在出現(xiàn)嚴重疾病癥狀之前診斷出 T1DM，且其敏感性使得其可代替當前使用的基于所有三種抗體的檢 測方法的組合每丈感性。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種診斷有需要的受試者中 的1型糖尿病(T1DM)的方法。該方法包括確定受試者的生物樣品 中抗CCL3抗體的存在或水平，其中存在或水平超過預(yù)定閾值表明 T1DM，從而診斷受試者患有T1DM。
如本文所用的術(shù)語"T1DM"是指一種糖尿病，這種糖尿病的特 征在于胰島素產(chǎn)生的減少或完全不產(chǎn)生胰島素。T1DM也被稱作"兒 童期"、"青少年"或"胰島素依賴型，，糖尿病。病理生理學(xué)可為自 身免疫介導(dǎo)的或與自身免疫無關(guān)的。后者可包括向維生素D3、特異 地破壞胰腺細胞的化學(xué)品和藥物(例如，N-3-吡咬基曱基-N'-p-硝基苯 基脲和鏈脲佐菌素)暴露和其它胰腺問題，包括外傷、胰腺炎和腫瘤。 根據(jù)本發(fā)明的T1DM可在早期的兒童期和在成年(例如，超過25歲 的個體)展示出發(fā)病。疾病可表現(xiàn)為非胰島素依賴性階段。因此，根 據(jù)本發(fā)明的T1DM還包括成人隱匿性自身免疫性糖尿病(LADA )和 年青的成年發(fā)病糖尿病(MODY)。
如本文所用的短語"有需要的受試者"是指哺乳動物，優(yōu)選地為 有患T1DM風(fēng)險的人受試者(例如，遺傳上有患T1DM傾向的受試者， 具有T1DM的醫(yī)療和/或家族史的受試者，已向誘導(dǎo)T1DM的藥物、化學(xué)品或病原體暴露的受試者)和/或展示出T1DM的可疑臨床癥狀 (例如，多尿、煩渴、體重減輕和血糖水平超過200mg/dl或在禁食8 小時后^126mg/dl的)的受試者。此外，或替代地，有需要的受試者 可能是經(jīng)歷常規(guī)檢查的健康人受試者。
如本文所用的術(shù)語"診斷"是指將疾病或癥狀歸類為炎癥性疾病， 確定該疾病的嚴重性，監(jiān)測疾病進展，預(yù)^^疾病結(jié)果和/或恢復(fù)前景。
如在上文中所提到的那樣，本發(fā)明的這個方面的方法通過確定從 受試者所獲取的生物樣品中抗CCL3抗體的存在或水平而實行。
如本文所用的術(shù)語"CCL3"(在本文中也被稱作巨噬細胞炎癥 蛋白質(zhì)-la(MIP- lot))是指GenBank檢索No. NP—002974的C-C趨化 因子，其典型地參與多形核白細胞的募集和活化中的急性炎癥狀態(tài)。
如本文所用的短語"抗CCL3抗體"是指結(jié)合CCL3的任何表位 的任何自身抗體(自身)。本發(fā)明的自身抗體可以是任何類別[例如， IgG(亞類l-4)、 IgM、 IgA(亞類l-2)、 IgD和IgE))。值得注意的是， 發(fā)現(xiàn)與IgM相比IgG抗體群與小鼠疾病進展的相關(guān)性高[Hutchings等 人，Diabetes, 46， 5: 779-784 (1997)]。而且，發(fā)現(xiàn)進展為1型糖尿病的 最高的風(fēng)險與高滴度的IA-2A和IAA、IgG2、IgG3和/或子IgG4亞類， 以及IA-2-相關(guān)分子IA-2卩的抗體相關(guān)聯(lián)[Achenbach等人，DIABETES, 53: 384 -92 (2004)]。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明的自身抗體可在體外生物樣 品(從受試者移除的)中檢測或通過體內(nèi)檢測而檢測。
如本文所用的短語"生物樣品"是指從受試者取得的細胞、組織 或流體的含有抗體的樣品。在樣品中存在的抗體典型地發(fā)現(xiàn)于細胞質(zhì) 膜結(jié)合隔室內(nèi)(例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體)和在B淋巴細胞(其合成 抗體分子)和諸如單核吞噬細胞、自然殺傷(NK)細胞和肥大細胞那 樣的免疫效應(yīng)細胞的表面上，其表達用于結(jié)合抗體分子的特異性受 體?？贵w也存在于血液的血漿(即，流體部分)和組織的間質(zhì)流體中。 抗體可見于分泌流體中，諸如粘液、滑液、精子和奶，特定類型的抗體分子被特異地運輸?shù)竭@些分泌流體內(nèi)。
含有抗體的生物樣品的一般實例包括，但不限于，組織樣品，諸
如胰腺組織、消化組織，和/或生物體液，諸如血液、血清、血漿、淋 巴液、膽汁、尿、唾液、痰、滑液、精液、淚、腦脊液、支氣管肺泡 灌洗液、腹水等。
用于從受試者獲得生物樣品的程序(即，活檢)是本領(lǐng)域中熟知 的。這些程序包括，但不限于，血液取樣、關(guān)節(jié)液活檢、腦脊液活檢 和淋巴結(jié)活檢。用于獲得組織或流體的活檢的這些和其它程序在
http:〃www.healthatoz.com/healthatoz/Atoz/search.asp中詳纟田地描述。 優(yōu)選地，在糖尿病受試者中，在胰島素治療前或胰島素治療后的
7天內(nèi)取得樣品。若可能，諸如血清那樣的生物樣品可被轉(zhuǎn)移為等分
試樣且在-80。C冷凍直到進一步分析。
如上文所提到的那樣，本發(fā)明的這方面的方法通過確定受試者的
生物樣品中抗CCL3的存在或水平而實行，其中抗CCL3抗體的存在
或水平超過預(yù)定閾值(即，與從健康個體所獲得的生物樣品中的水平
相同的水平)表明T1DM。
即可。應(yīng)了解，在P-細胞破壞的很早期階段，可存在很低的自身抗體 水平。因此，任何自身抗體的存在高于陰性背景或?qū)φ账?例如， 健康樣品的水平)將被診斷為前驅(qū)糖尿病狀態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，包含10至15的抗CCL3 log2Ab滴 度的預(yù)定閾值表明T1DM。
無論采用哪種程序， 一旦獲得生物樣品，就確定了生物樣品中 CCL3的抗體分子的滴度(數(shù)目)。
可通過本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)來確定抗體滴度，諸如ELISA (直接 或間接)和4吏用固定抗原的斑點印跡(參看，例如，Lichtman和Pober "Cellular and Molecular Immunology (細胞與分子免疫學(xué))".W.B.Saunders International Edition 1994第56-59頁)。具體而言，抗原(即, 任何CCL3表位或其模擬物)優(yōu)選地固定于固相載體上。為了避免抗 體的非特異性結(jié)合，固相載體優(yōu)選地還被涂布非抗原性蛋白質(zhì)。肽典 型地通過吸附自水性介質(zhì)被固定于固相載體(基質(zhì))上，但也可使用 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知適用于蛋白質(zhì)和肽的其它固定方式。
如本文所用的短語"固相載體"是指非水基質(zhì)，相關(guān)試劑(例如， CCL3表位)可粘附至該非水基質(zhì)上。固相載體的實例包括，但不限 于，部分地或完全由玻璃(例如，可控孔度玻璃)、多糖(例如，瓊 脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮形成的固相載體。 在特定實施方案中，取決于特定情境，固相載體可包含管、板，測定 或微量滴定板的孔；諸如由聚苯乙烯或聚氯乙烯所制成的那些。在其 它情境下，其是純化柱(例如，親和層析柱)。這個術(shù)語還包括離散 粒子的不連續(xù)的固相載體，諸如描述于美國專利第4,275,149號中的 那些固相載體。這類材料是不溶于水的且包括交聯(lián)葡聚糖(例如， SEPHADEXTM， Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ.)、瓊脂斗唐、 直徑為大約lpm至大約5mm的聚苯乙烯球、聚氯乙烯、交聯(lián)聚丙烯 酰胺，基于的硝化纖維素或尼龍的織物(諸如薄板、條或明輪翼)。
CCL3表位可經(jīng)由酰胺或酯鍵通過諸如共價結(jié)合的技術(shù)而共價地 或通過吸附而非共價地結(jié)合到固相載體。在CCL3蛋白質(zhì)附到固相載 體上之后，固相載體可之后被涂布阻斷劑(例如，動物蛋白)以減小 蛋白質(zhì)對載體表面的非特異性吸附。
含有抗體的生物樣品可以是粗樣品或免疫球蛋白純化樣品(例 如，硫S吏銨沉淀級分和/或經(jīng)層析分離的)。
固相載體向生物樣品暴露使得抗體(若存在)被抗原俘獲。典型
地，在固相載體上存在過量的抗原使得全部的自身抗體可被結(jié)合。然 后，通過從血清樣品移出固相載體，所俘獲的自身抗體可從非特異結(jié) 合的樣品組分移出。
可通過添加諸如葡萄球菌蛋白質(zhì)A那樣的標記的抗體結(jié)合分子來實行免疫復(fù)合物的檢測。可檢測的標記可為能夠直接地或間接地產(chǎn) 生可檢測的信號的任一種標記。舉例而言，可檢測的標記可為放射性
同位素、熒光或化學(xué)發(fā)光化合物或標簽(諸如上文所述的那些且標記 的抗體可與該標簽結(jié)合)。
因此，標記可以是酶，諸如辣根過氧化物酶(HRP )、葡萄糖氧 化酶、堿性磷酸酶等。酶的選擇將在很大程度上取決于生物樣品的來 源。舉例而言，高水平的過氧化物酶存在于血液細胞中且這可能會導(dǎo)
致非特異性信號。但可釆用阻斷處理(例如，0.3%的H202曱醇溶液 用于過氧化物酶)。
在其中主要指示基團為諸如HRP或葡萄糖氧化酶那樣的酶的情 況下，需要額外的試劑來表明已形成了免疫復(fù)合物。用于HRP的這些 額外的試劑包括過氧化氬和諸如二氨基聯(lián)苯胺那樣的氧化染色前體。 適用于葡萄糖氧化酶的一種額外試劑為2,2,-連氮基-二-(3-乙基-苯噻 唑啉-G-磺酸)(ABTS)。
根據(jù)本發(fā)明，也可使用放射性標記。 一種示例性放射性標記試劑 為產(chǎn)生Y射線發(fā)射的放射性元素，諸如1251。蛋白質(zhì)標記的方法是本 領(lǐng)域中熟知的且由Galfre等人，Meth. Enzyol., 73:3-46 (1981)詳細地描 述。也可采用通過活化官能基的蛋白質(zhì)綴合或耦合的技術(shù)。參看，例 如，Aurameas等人，Scand, J. Immunol., 8(7):7-23 (1978); Rodwell等人, Biotech" 3:889-894 (1984);以及，美國專利第4，493，795號。根據(jù)上文 所述程序標記的肽也可用于體內(nèi)^r測，其如上文所述也涵蓋于本發(fā)明 中。
抗CCL3抗體可通過任何已知測定方法來檢測，諸如竟爭性結(jié)合 測定，直接或間接夾心式測定，以及免疫沉淀測定[Zola,單克隆抗體 技術(shù)手冊，第147-158頁(CRCPress， Inc., 1987)]。
特別優(yōu)選的為^:感的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法，該方法 在上文中描述，且在美國專利第3,791,932號、第3,839,153號、第 3,850,752號、第3,879,262號和第4,034,074號中詳細地描述。該ELISA測定可提供自身抗體很低滴度的測量。
另一典型實施方案包括放射免疫測定(RIA)，其使用已如上文 所述制備的固相載體來執(zhí)行。固相載體在存在放射標記的自身抗體的 情況下向生物制品暴露，放射標記的自身抗體可完成與固定抗原的結(jié) 合。以此方式，與固相結(jié)合的放射性標記的量可與初始存在于生物制 品中的自身抗體的量成反比。在分離固相載體后，非特異性結(jié)合的放 射標記可通過洗滌來移除，并確定與固相載體結(jié)合的放射標記的量。 而結(jié)合的放射標記的量可與初始存在于樣品中的自身抗體的量相關(guān)。
如在下文的實施例部分中的實施例2所示，在前驅(qū)糖尿病受試者
的血清中發(fā)現(xiàn)抗CCL3自身抗體。已發(fā)現(xiàn)CCL3的自身抗體的存在與 存在于前驅(qū)糖尿病患者血清中的其它自身抗原的自身抗體的存在重 疊。因此，本發(fā)明還涵蓋與本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容組合地確定抗CCL3抗 體(例如，抗GAD、 ICA和胰島素的自身抗體中的至少一種)的存在 或水平以改進診斷的準確性。
因此，根據(jù)一種實施方案，如上文所述確定抗CCL3的存在或水
而言，根據(jù)另一實施方案，檢測可能為對自谷氨酸脫羧酶(GAD)、 胰島細胞抗原(ICA) 512/IA-2和胰島素的抗原特異的自身抗體。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，在引發(fā)對T1DM疾病狀態(tài)特 異的自身抗體之前確定CCL3抗體的存在或水平。
優(yōu)選地，使用人O型血供體胰腺的冷凍切片通過間接免疫焚光來 測量ICA[如Vandewalle CL等人Diabetologia 36:1155-1162， (1993)所 述]。分別使用1251-標記的胰島素、"S-標記GAD65以及IA-2(IA-2ic) 的"S-標記胞內(nèi)域作為示蹤劑來通過液相放射結(jié)合測定確定抗胰島素 IAA、 GADA和1A-2A [Decochez K等人，Diabetes Care 23:838-844, (2000)]。
應(yīng)了解對T1DM疾病狀態(tài)特異的其它自身抗體可與抗CCL3 —起 檢測。其它的自身抗體包括，但不限于，在下表中，抗所列出的表位的自身抗體，以及最常用的自身抗體。其它的自身抗體和適合于檢測
患者血清中的這些自身抗體的方法和組合物在下表1和Devendra等人, Brit Med J 328(7442):750-754 (2004)]中詳細描述。 表1
胰島素
敏感性 49-92 %
GAD (谷氨酸脫70-80 % 羧酶)
17%
74%
61 % 10%
GAD 38 ICA512/IA-2
IA-2(Whogrin
eCarboxypeptida se H(e羧肽酶H)
GLIM A3 8 (與糖
化胰島細胞膜相
關(guān)聯(lián))
GM2-1
GT3
PM-1 (69 kD ICA蛋白質(zhì))
ICA69
ICA12/SOX13 <20%
注釋
在年輕人，兒童中較高 的水平
成人發(fā)病型1A更高的 敏感性
在前驅(qū)糖尿病、抗GAD
陰性受試者中存在
酪氨酸磷酸酶樣分子
酪氨酸磷酸酶樣分子 罕見
14-38% 低診斷敏感性
神經(jīng)節(jié)苷脂糖脂 糖脂
具有較差特異性的蛋白 質(zhì)印跡檢定 糖尿病關(guān)聯(lián)性。 并不適用于區(qū)分T1DM
參考
Palmer, J. P.等人(簡) Science 222:1337-1339 Clive 等人 Autoimmunity reviews, 5:424-428,2006; WO 92/04632 美國專利第6960448號
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本發(fā)明的方法可用于監(jiān)測有需要的受試者的抗糖尿病治療。
這可通過使受試者經(jīng)受抗糖尿病治療；以及確定受試者的生物樣 品中抗CCL3抗體的存在和/或水平(如上文所述的那樣)而實行，其 中抗糖尿病治療之后生物樣品中抗CCL3抗體水平的改變表明療效。
確定抗CCL3抗體可在抗糖尿病治療之后和任選地抗糖尿病治療 之前實行以便評價治療的影響。
可根據(jù)本發(fā)明的這個方面使用的抗糖尿病治療的實例包括，但不 限于，胰島素給藥，諸如通過注射(利用例如注射器或高空氣壓力噴 射注射器)、灌注、吸入[例如，Bellary與Brnett, Diab Vase Dis Res. Dec;3(3): 179-85, 2006)或通過外部胰島素泵，如Diabetes Forecast在 (58(l):RG16,RG19-22，RG24-6, 2005中所述]。胰島素給藥的其它途徑 包括，例如，耐消化的丸藥、皮膚帖片、鼻內(nèi)或口腔噴霧劑[如 Lassmann- Vague and Raccah， Diabetes Metab.. 32:513-22, (2006)中所 述]。此外，在某些情況下，給予用于治療T2DM的雙胍類藥物(例 如，二曱雙胍)也適用于治療T1DM。
在嚴重的情況下(例如，涉及腎衰竭或?qū)σ葝u素?zé)o反應(yīng))，T1DM 受試者經(jīng)受胰腺移植治療。移植可與腎移植同時進行以便增加器官存 活率?；蛘?，可根據(jù)受試者的特定條件和醫(yī)生建議在腎移植之后移植 胰腺或僅移植胰腺[在Morris等人，S D J Med. 57(7):269-72， (2004)中 進一步描述]。其它的替代的移植策略可為移植胰島細胞，而不是整個 器官[Bertuzzi等人，Curr Mol Med. Jun;6(4):369-74, 2006]或者移植培 養(yǎng)的胰腺/(3細胞[在Vinik等人，MedGenMed. 6:12， 2004中進一步描 述]。
用于治療糖尿病的非常規(guī)療法包括，但不限于，針灸、生物反饋， 以及鉻、人參、鎂和釩的給藥。
作為補充，且與上述治療一起，可通過改變飲食方案以平衡血糖攝入和改變運動方案以控制葡萄糖水平來治療T1DM 。這與監(jiān)測血
液葡萄糖水平一起用于降低T1DM的效應(yīng)。
上文所提到的試劑中的任一種試劑可包括于試劑盒中。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于診斷T1DM的試劑
盒。該試劑盒包含包裝材料和用于確定受試者的生物樣品中的抗
CCL3抗體的至少一種試劑。
因此，例如，可將抗體和/或化學(xué)品包裝在具有緩沖劑和防腐劑的
一或多個容器中并用于診斷。
優(yōu)選地，容器包括標記。適當容器包括，例如，瓶子、小瓶、注
射器和試管。容器可由多種材料形成，諸如玻璃或塑料。
此外，也可添加諸如穩(wěn)定劑、緩沖劑、阻斷劑等的其它添加劑。 試劑盒還可包括用于確定所測試的受試者是否患有T1DM或有
患T1DM風(fēng)險的說明。
因此，用于篩選血液的試劑盒(例如)可優(yōu)選地在單獨的容器中
包括以下組分
(a) 涂布有CCL3表位肽的固相載體。
(b) 血清或血漿樣品的稀釋液，例如，正常山羊血清或血漿的 稀釋液；
(c) 標記的抗(人IgG)抗體，例如，在含有大約1%山羊血清 或血漿的緩沖水溶液中的山羊抗(人IgG)抗體；
(d) 陽性對照，例如含有抗CCL3蛋白質(zhì)的抗體的血清；和/或
(e) 陰性對照，例如，不含抗CCL3蛋白質(zhì)的抗體的血清。 如果該標記為酶，那么，試劑盒的額外的組分可以是用于該酶的底物。
如本文所用的術(shù)語"大約，，是指±10%。
通過下文的實施例的檢查，本發(fā)明的額外的目的、優(yōu)點和新特點 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見，這些實施例并無限制意義。此 外，如在上文中所描寫的和如下文的權(quán)利要求書部分中所主張的各種實施方案中的每個實施方案和本發(fā)明的方面中的每個方面在下面的 實施例中找到了實驗支持。
實施例
現(xiàn)參看下文的實施例，與上文的描述一起來以非限制性形式說明 本發(fā)明。
一般而言，本文所用的命名和本發(fā)明所利用的實驗室程序包括分
子、生化和微生物以及重組DNA技術(shù)。在下列文獻中透徹地解釋了 這類對支術(shù)。參看， <列嗦口， "Molecular Cloning: A laboratory Manual (分 子克隆實驗室指南)"Sambrook等人，(1989); "Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)實驗指南)"第I-III巻Ausubel, R. M., 纟扁4辱(1994); Ausubel等人，"Current Protocols in Molecular Biology (分 子生物學(xué)實驗指南)"，John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (i989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning (分子克隆的實踐指導(dǎo)) "，John Wiley & Sons, New York (1988); Watson等人，"Recombinant DNA (重組DNA) ", Scientific American Books, New York; Birren等 人(eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (基因組分析 實驗室指南系列)",第l-4巻,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);方法學(xué)，如在美國專利第4,666,828號、第4,683,202 號、第4,801,531號、第5,192,659號和第5,272,057號所述；"Cell Biology: A Laboratory Handbook (分子生物學(xué)實驗室手冊)"，第I-III 巻Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology (免疫學(xué) 實驗指南)"第I-III巻Coligan J. E" ed. (1994); Stites等人(eds), "Basic and Clinical Immunology (基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué))"(第8版)， Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (編), "Selected Methods in Cellular Immunology (細胞免疫學(xué)的選定方法)"， W. H. Freeman and Co., New York (1980);可用的免疫測定廣泛地描述 于以下專利和科學(xué)文獻中，參看，例如，美國專利第3,791,932號、 第3,839,153號、第3，850，752號、第3,850,578號、第3,853,987號、第3,867，517號、第3，879,262號、第3，901，654號、第3，935,074號、 第3,984,533號、第3,996,345號、第4,034,074號、第4,098,876號、 第4,879,219號、第5,011,771號和第5,281,521號；"Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)"Gait, M. J.,編輯(1984); "Nucleic Acid Hybridization(核酸雜交)"Hames，B. D.,與Higgins S. J.,編輯(1985); "Transcription and Translation (舉爭錄和翁3i奪)"Hames， B. D.，和Higgins S. J.,編輯(1984); "Animal Cell Culture (動物細胞培養(yǎng))"Freshney， R. L,編輯(1986); " Immobilized Cells and Enzymes (固定的細胞和酶) "IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning"(分子克 隆的實踐指南)Perbal, B., (1984)和"Methods in Enzymology"(酶學(xué) 的方法)第1-317巻，Academic Press; "PCR Protocols ( PCR方案)A Guide To Methods And Applications (方法和應(yīng)用指南)"，Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak等人，"Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual (蛋白質(zhì) 純化和表征策略)"CSHL Press (1996);所有這些文獻和專利在本文 中引用的程度如同其在本文中全面陳述。在這個文件中貫穿全文提供 其它 一般參考。其中的程序被認為是本領(lǐng)域中熟知的且被提供以使讀 者方便。其中所含有的所有信息以引用的方式結(jié)合到本文中。 敘辨J
4*錄之^孩錄檢浙在T7Z)Af愛試,^^淨哞戎COJ々#《伴。
確定早期診斷為TIDM的患者的炎癥介質(zhì)的自身抗體滴度。示出 了 CCL3的高自身抗體滴度。 辨賴發(fā)舞
《^^ -確定被診斷為T1DM的10個受試者的自身抗體反應(yīng)(1 型糖尿病中心，Rambam， Haifa, Israel)。具體而言，分析下列趨化因 子的自身抗體CCL2(MCP-I)、 CCL3 (MIP-Ia)和CCL4 (M1P-1卩)。發(fā) 現(xiàn)前面的這些在小鼠實驗?zāi)Ｐ椭性赥1DM期間在發(fā)炎的胰腺中表達[Cameron MJ等人，J Immunol 165:1102 (2000)]。此外，分析只在人體 中表達且可能與炎癥自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)的趨化因子IL-8 (CXCL8) 的自身抗體[Palacios， I等人，Clin Exp Immunol 111:588 (1998)]。也檢 查可能與炎癥自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)的額外的介質(zhì)的自身抗體滴度 趨化因子RANTES(CCL5)、 MIG(CXCL9)、 ITAC (CXCLI l)和IP-10 (CXCL10);炎癥細胞因子IL-15和IL-1(3以及TNF家族成員CD40L、 FASL和TRAIL。
々,拔脊^^浙-ELISA板(NUNC, Rofkilbe， Denmark)以10 ng/ 孔被涂布CCL3 (R & D, Minneapolis, USA)且在室溫下用200 pi 1 % BSA/PBS阻斷緩沖液培育1小時。血清樣品利用上述阻斷緩沖液進行 循序(x 2 )稀釋且被添加到ELISA板(100 pl/孔)用于過夜培育且用 PBS/Tween 20 (0.05 %)洗滌四次。之后，在1 % BSA/PBS中添加50 1^1山羊抗lgG-HRP ( Jackson, Pennsylvania, USA )(根據(jù)制造方案) 且用PBS/Tween 20 (0.05 % )洗滌四次。然后以每孔50 添加底物溶 液(TMB， DAKO， CA, USA )。通過添加50 (il的H2S04 (1M)，在出 現(xiàn)藍色時終止反應(yīng)。利用設(shè)定為630nm的參考濾波器來確定OD。
潛,
在"f歡診街為77ZMf ^愛試;^f發(fā)'^Cr" W!^W《,戎伴諒
產(chǎn)-如在圖1中所示，在診斷后很快(診斷后一個星期)，在早期診斷 為T1DM的10個受試者中有9個出現(xiàn)了對CCL3的選擇性自身抗體 反應(yīng)，而對于其它炎癥介質(zhì)中的任一種炎癥介質(zhì)并未發(fā)現(xiàn)自身抗體反 應(yīng)。對照受試者并未出現(xiàn)針對包括CCL3在內(nèi)的這些介質(zhì)中的任一種 介質(zhì)的顯著的抗體滴度。
在長#/《^弄乎歡夢資^77ZM/^試者哞/^^CCXJ
,^^#-在四個不同的組中確定血液樣品中抗CCL3自身抗體的存在新診斷為T1DM的受試者(在診斷后一個星期內(nèi)；n=30); 長時間的T1DM (從診斷開始> 5年，n=38)、健康受試者(對照； n=20 )和前驅(qū)糖尿病受試者(具有陽性自身抗體的患有TIDM的受試 者的一級親屬；n=20)。對于每個患者，也確定與l型糖尿病相關(guān)的 自身抗體；抗胰島素(CIAA) 、 ICA和GAD的滴度。
《^^糸W^^y-如實施例1所述來實行自身抗體的檢測
歡#錄;^長^/《^ 凝尿>^€試,#60^ W《,戎糸義^
-如圖2所示，發(fā)現(xiàn)90%(27/30)的剛剛被診斷為TIDM的受試者對 CCL3具有陽性自身免疫反應(yīng)。前驅(qū)糖尿病受試者和長時間的TIDM 受試者也展示高百分比的陽性免疫反應(yīng)，其中19/20 (95 %)和27/38 (71 %)分別展示自身抗體反應(yīng)。如在圖2中可以看出，由于僅1/20(5 %)的健康對照對這個抗體是陽性的，因此CCL3的陽性自身抗體滴度 是T1DM受試者所特有的。
-當與用于確定TIDM的常規(guī)診斷工具相比時，如圖3所描繪，結(jié)果 證明在90%的受試者(27/30)中，CCL3自身抗體是陽性，而其它的 與1型糖尿病相關(guān)的自身抗體，抗胰島素(CIAA)、抗GAD和ICA 抗體分別在70%、 60%和63%的受試者中是陽性的(在30個受試者 中的28個中，檢測到3種與糖尿病相關(guān)的自身抗體中的至少一種)。 因此，CCL3的自身抗體是單個診斷工具，其遠比常規(guī)工具更敏感且 與三個常規(guī)工具一起使用同樣敏感。
總之，本發(fā)明的結(jié)果證實了 CCL3的陽性自身抗體滴度是可代替 目前使用的三種常規(guī)的不太敏感的診斷工具的單個高度敏感的生物 標記。在糖尿病診斷后數(shù)年，CCL3的抗體滴度繼續(xù)為陽性，這進一 步證實了本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的標記為新的且有效的診斷工具，其用于區(qū)分
成人1型糖尿病(包括LADA)與2型DM患者這個非常需要的目的。 應(yīng)了解，為了清楚起見，在單獨的多個實施方案的情形下描述的本發(fā)明的特定特點也可在單個實施方案中組合在一起提供。相反，為 了簡要起見，在單個實施方案的情形下描述的本發(fā)明的各種特點也可 單獨地或以任何適當子組合形式來提供。
雖然結(jié)合本發(fā)明的具體實施方案描述了本發(fā)明，但顯然，本發(fā)明 的許多替代、修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。因此，本發(fā) 明預(yù)期將涵蓋屬于所附權(quán)利要求書中的所有這樣的替代、修改和變
化。在本說明書中提到的所有公告、專利和專利申請以及GenBank檢 索號以其全文引用的方式結(jié)合到本說明書中的程度如同每個個別的 公告、專利或?qū)＠暾埢騁enBank檢索號具體地且個別地表示為以引 用的方式結(jié)合到本文中。此外，任何參考在本申請案中的引用或鑒定 不應(yīng)被理解為承認該參考用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
1. 一種診斷有需要的受試者中的1型糖尿病(T1DM)的方法，所述方法包括確定所述受試者的生物樣品中抗CCL3抗體的存在和/或水平，其中所述存在或水平超過預(yù)定閾值表明T1DM，從而診斷所述受試者中的T1DM。
2. —種用于診斷T1DM的試劑盒，所述試劑盒包含包裝材料和 用于確定所述受試者的生物樣品中的抗CCL3抗體的至少一種試劑。
3. —種用于監(jiān)測有需要的受試者的抗糖尿病治療的方法，所述 方法包4舌(a) 使所述受試者經(jīng)受抗糖尿病治療；以及(b) 確定所述受試者的生物樣品中抗CCL3抗體的存在和/或水 平，其中在步驟(a)之后在所述生物樣品中所述抗CCL3抗體的水平 改變表明療效。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中在步驟(a)之后和任選地 在步驟(a)之前進行步驟(b)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述抗糖尿病治療包含選 自胰島素、胰高血糖素、葡萄糖、雙胍類藥物、鉻、人參、鎂和釩的 藥物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述抗糖尿病治療選自胰 腺移植、胰島細胞移植和生活方式方案。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3中任一項所述的方法或試劑盒，其中 所述確定抗CCL3抗體的存在或水平在體外進行。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3中任一項所述的方法或試劑盒，其中 所述T1DM包括成人隱匿性自身免疫性糖尿病(LADA)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3中任一項所述的方法或試劑盒，其中 _確自身抗體之前進行。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，還包含確定對T1DM疾病 狀態(tài)特異的自身抗體的存在或水平。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，還包含用于確定對T1DM疾 病狀態(tài)特異的自身抗體的存在或水平的至少一種試劑。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9、 10或11中任一項所述的方法或試劑盒， 其中對T1DM疾病狀態(tài)特異的所述自身抗體是對選自谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞抗原(ICA)512/IA-2和胰島素的抗原特異的。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述閾值包含log2Ab 10-15 的抗CCK3滴度。
14. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，還包含如下的說明其中 log2Ab 10-15的抗CCL3滴度表明T1DM。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3中任一項所述的方法或試劑盒，其 中所述確定通過ELISA來進^f亍。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種診斷有需要的受試者中的1型糖尿病(T1DM)的方法。該方法包括確定受試者的生物樣品中抗CCL3抗體的存在和/或水平，其中存在或水平超過預(yù)定閾值表明T1DM，從而診斷受試者中的T1DM。還提供用于診斷T1DM的試劑盒和用于監(jiān)測抗糖尿病治療的方法。
文檔編號G01N33/68GK101416063SQ200780012423
公開日2009年4月22日 申請日期2007年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月6日
發(fā)明者G·威爾鮑姆, N·卡林, N·謝哈德 申請人:拉帕波特家族醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所;拉姆巴姆醫(yī)學(xué)中心研究基金會