專利名稱：鉀(離子)診斷/測定試劑盒及鉀(離子)的濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鉀(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鉀(離子)濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。
背景技術：
腎小球疾病、腎功能衰弱、糖尿病酮癥中毒、腎上腺皮質功能減退等。當
血鉀高達7.5 mmol/L或以上時病人將出現心律失常，應考慮確定適當的治療方案。血清鉀超過10 mmol/L時，即可發(fā)生心室纖顫，心臟停搏而死亡。高鉀使心臟停跳于舒張期。
目前鉀測定常用的方法有同位素稀釋質譜法、中子活化法、火焰光度計法、化學測定法、離子選擇電極法、原子分光光度法、酶動力學法。
火焰光度法1950年開始使用并一直沿用至今的火焰光度法檢測血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，是一種發(fā)射光譜分析法。測定方法分為內標準法和外標準法兩種。外標準法操作誤差較大， 一般不采用?，F在主要使用內部標準法，即標本及標準液采用加進相同濃度的內部標準元素鋰或銫進行測定。操作時，將含鋰的溶液作為稀釋液，同時測定K、 Na和Li的濃度，以標本與標準液的Na/Li與K/Li比值，計算Na、 K濃度。由于血清稀釋倍數大，血清蛋白質粘性的影響幾乎可忽略不計。
化學測定法主要利用復環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠醚，均為離子載體進行測定，由于大環(huán)結構內有空穴，分子內部氧原子有未共用電子對可與金屬離子結合，根據空穴大小，可選擇性結合不同直徑的金屬離
子，從而可達到測出離子濃度的目的。測定血清K， 一般采用普通冠醚陰離子染料進行比色定量。
離子選擇電極法ISE法是采用靈敏的特定專用電極，在專用儀器上進行
血清和尿等體液的K+、 Na+的測定，因標本用量少，快速準確，幾乎有取代其他方法的趨勢。其儀器測定原理是離子選擇電極與參比電極組合浸泡在待測
標本溶液中，進行檢測。目前已有的電極種類為①玻璃膜電極，感應材料
為玻璃薄膜的有pH電極、K+電極和Na+電極；②固相膜電極，由難溶性金屬物
質加壓成型，以固體膜或單日膜作為感應膜的電極有C1 —電極和F—電極；③液
態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹脂或內裝聚氯乙稀為感應膜的Ca"電極；④用纈氨霉素膜制成的K+電極。上述電極均有一定的壽命，因為電極使用一段時間就會自動
老化，有效期長短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于檢測血清K+、 Na+，操作繁雜，誤差較大，不及火焰光度法簡便。
鉀測定的決定性方法是同位素稀釋質譜法及中子活化法。WHO推薦的方法是火焰光度計法。目前離子選擇電極法應用較為普遍，但是電極成本昂貴。
酶測定法和火焰光度計法或離子選擇電極法均有較好的一致性，且抗干擾性強，穩(wěn)定性好，彌補了生化分析儀不能同時測定鉀鈉的不足。有較好的分析性能，易于自動化，在臨床化學分析中必定取代火焰光度計法成為常規(guī)分析項目。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鉀(離子)濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現該方法的鉀(離子)診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行鉀(離子)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明鉀(離子)濃度測定方法原理如下
色氨酸+水色氨酸酶丙酮酸+氨離子+吲哚氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+
腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶
甘油酸-l,3-雙磷酸+還原型輔酶
這種方法應用需要鉀離子激活的色氯酸酶(tryptophanase; EC4丄99.1)酶(偶)聯谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; EC 1.2.1.59)酶^足反應速率比色法。色氨酸酶酶解色氨酸反應產生氨離子，再通過(偶)聯合谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算鉀(離子)的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明鉀(離子)診斷/測定試劑
盒較為理想
緩沖液 100 mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
色氨酸酶 10000 U/L
谷氨酰胺合成酶 12000 U/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L
色氨酸 9 mmol/L
谷氨酸 16mmol/L腺苷三磷酸 3 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 5mmol/L本發(fā)明的鉀(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
輔酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-
7磷酸。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶。輔酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷二磷酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定鉀(離子)濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一
本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100 mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
色氨酸酶10000U/L
谷氨酰胺合成酶12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶12000U/L
色氨酸9 mmol/L
谷氨酸16 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L甘油醛-3-磷酸 5 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，
加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度
《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鉀(離子)樣品與試劑
的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約2分鐘左
右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀
下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大
實施例二
本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑
輔酶
腺苷三磷酸甘油醛-3-磷酸
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
50 mmol/L3 mmol/L9 mmol/L16 mmol/L3 mmol/L5 mmol/L
100mmol/L50 mmol/L10000 U/L谷氨酰胺合成酶 12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鉀(離子)樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5,反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大
實施例三
本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
腺苷三磷酸甘油醛-3-磷酸試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
谷氨酰胺合成酶
函mmol/L50 mmol/L3 mmol/L9 mmol/L16 mmol/L3 mmol/L5 mmol/L
歸mmol/L500 mmol/L12000 U/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶
12000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
雨mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
色氨酸酶
10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定鉀(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37x:，反應時
間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被 測鉀(離子)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方 向為正反應(上升反應)，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大
申請人經過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他測定方法均能達 到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.025;吸光度 時間反應曲線應呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(ID0.99)線形范圍可 達10mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過士7 %;試劑測試的 精密度(重復性)的變異系數(CV)《3%;試劑的靈敏度可達0.015 ± 0.007 AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣 應用。
權利要求
1. 一種酶比色法及酶聯法的鉀(離子)的濃度測定方法，其方法原理如下色氨酸+水 <u>色氨酸酶</u> 丙酮酸+氨離子+吲哚氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸 <u>谷氨酰胺合成酶</u> 谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶 <u>甘油醛-3-磷酸脫氫酶</u>甘油酸-1，3-雙磷酸+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出鉀(離子)的濃度大小測定結果。
2. —種鉀(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000 mmol/L輔酶1—6 mmol/L色氨酸酶1000———80000 U/L谷氨酰胺合成酶畫0_——80000 U/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶IOOO-——80000 U/L色氨酸1—50 mmol/L谷氨酸1—50 mmol/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L甘油醛-3-磷酸1—50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫 氫酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成雙劑試劑；試劑1,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘 油醛-3-磷酸脫氫酶組成。輔酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1或試 劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫 氫酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成多劑試劑；試劑 1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸 脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶組成。輔酶、色氨酸 酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷 酸、甘油醛-3-磷酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括 穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的鉀(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鉀(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、色氨酸、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、色氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464394SQ20071019218
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司