專利名稱：一種層粘連蛋白診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及肝纖維化診斷技術領域，特別是一種層粘連蛋白診斷試劑盒。
背景技術：
肝纖維化是人體對肝臟損傷后的一種修復瘢痕反應，是諸多慢性肝病發(fā)展至肝硬化過程中所共有的病理改變。肝纖維化形成過程受基質降解及基質積聚兩方面因素制約，受細胞因子調控。肝纖維化在理論上是可逆的，采用有效抗纖維化治療，包括消除病因，加速降解過程或誘導星狀細胞凋亡，均有可能逆轉病程。所以早期診斷肝纖維化并動態(tài)監(jiān)測其變化對慢性肝病的治療，改善預后有著重要的意義。
血清學診斷是目前研究最廣泛的肝纖維化診斷方法。由于該法取材方便，無創(chuàng)傷性，價格低廉，因而較為實用。目前公認具有較高診斷價值的有III型前膠原氨基端前肽(PIIINP)，IV型膠原，層粘連蛋白(LN)，透明質酸(HA)等，報道較多。其中，層粘連蛋白(LN)屬結構性糖蛋白，存在于基底膜的透明層中。研究發(fā)現(xiàn)其與肝纖維化形成有重要關系，是門脈高壓發(fā)生的主要基礎。血清層粘連蛋白水平常與IV型膠原、透明質酸等相平行，在肝纖維尤其門脈高壓診斷方面有重要價值。但是，現(xiàn)有產品的靈敏度和特異性有待提高，特別是能達到所需血清量較少，易于操作，無放射性污染的目的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種層粘連蛋白診斷試劑盒，為臨床肝纖維化的診斷和鑒別診斷提供一種靈敏度和特異性較高，所需血清量較少，易于操作，無放射性污染的手段。
為解決上述技術問題，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種層粘連蛋白診斷試劑盒，其特征在于采用雙抗體夾心-ELISA法，用抗人層粘連蛋白單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的層粘連蛋白與單抗結合，加入兔抗人層粘連蛋白多抗，形成免疫復合物連接在板上，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體與之結合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm處測OD值，層粘連蛋白濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中層粘連蛋白濃度。
所述的層粘連蛋白診斷試劑盒，其特征在于采用已包被抗人層粘連蛋白單抗96孔微孔板。
具體實施例方式
本發(fā)明提供了一種層粘連蛋白診斷試劑盒，它采用雙抗體夾心-ELISA法用抗人層粘連蛋白單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的層粘連蛋白與單抗結合，加入兔抗人層粘連蛋白多抗，形成免疫復合物連接在板上，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體與之結合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm處測OD值，層粘連蛋白濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中層粘連蛋白濃度。
本發(fā)明層粘連蛋白診斷試劑盒主要由96孔微孔板(已包被抗人層粘連蛋白單抗)、樣品稀釋液、第一抗體工作液、酶標抗體工作液、底物稀釋液、終止液、洗滌液(20x)、標準品、坐標紙、OPD片、封板紙、使用說明書組成。
使用本發(fā)明層粘連蛋白診斷試劑盒，其操作步驟是1.實驗前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫(20-25℃)。
2.取出所需數(shù)量的板條，傾去孔中液體，用洗滌液洗板1次，濾紙上拍干。剩余板條密封好，4℃保存(孔中保留保護液)。
3.建立標準曲線設標準孔8孔，每孔中各加入稀釋好的標準品100ul。
4.加樣待測品孔中每孔各加入待測樣品100ul。
5.將反應板置37℃120分鐘。
6.洗板用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
7.每孔中加入第一抗體工作液50ul。
8.將反應板充分混勻后置37℃ 60分鐘。
9.洗板同前。
10.每孔加酶標抗體工作液100ul。
11.將反應板置37℃ 60分鐘。
12.洗板同前。
13.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應5-10分鐘。
14.每孔加入50ul終止液混勻。
15.在492nm處測吸光值。
結果判斷1.所有OD值都應減除空白值后再行計算。
2.以標準品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、0ng/ml之OD值在半對數(shù)紙上作圖，畫出標準曲線。將濃度作為X軸(對數(shù)軸)，OD值作為Y軸(線性軸)。曲線應為一光滑曲線。
3.根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應人層粘連蛋白含量。
與現(xiàn)有產品相比，本發(fā)明的特點是靈敏度高(＜8ng/ml)、特異性好(同III型前膠原肽、IV型膠原、透明質酸等無交叉反應)，所需血清量較少(100微升)，易于操作，便捷快速。對人體無創(chuàng)傷性，結合IV型膠原、透明質酸、III型前膠原肽的聯(lián)合檢測，用于肝纖維化的診斷和鑒別診斷。
用本發(fā)明試劑盒經上海瑞金、曙光、龍華等三家醫(yī)院，共計檢測1006例樣本，統(tǒng)計結果如下


實驗結果表明正常對照組同可疑異常組LN平均含量有較明顯差異。認為其可對早期診斷肝纖維化有較高的輔助診斷意義。
綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內容所作的等效變化與修飾，都應為本發(fā)明的技術范疇。
權利要求
1.一種層粘連蛋白診斷試劑盒，其特征在于采用雙抗體夾心-ELISA法，用抗人層粘連蛋白單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的層粘連蛋白與單抗結合，加入兔抗人層粘連蛋白多抗，形成免疫復合物連接在板上，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體與之結合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm處測OD值，層粘連蛋白濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中層粘連蛋白濃度。
2.根據(jù)權利要求1所述的層粘連蛋白診斷試劑盒，其特征在于采用已包被抗人層粘連蛋白單抗96孔微孔板。
全文摘要
一種層粘連蛋白診斷試劑盒，采用雙抗體夾心－ELISA法，用抗人層粘連蛋白單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的層粘連蛋白與單抗結合，加入兔抗人層粘連蛋白多抗，形成免疫復合物連接在板上，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體與之結合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm處測OD值，層粘連蛋白濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中層粘連蛋白濃度。它為臨床肝纖維化的診斷和鑒別診斷提供一種靈敏度和特異性較高，所需血清量較少，易于操作，無放射性污染的手段。
文檔編號G01N33/543GK101074958SQ200610026620
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月17日 優(yōu)先權日2006年5月17日
發(fā)明者馮志榮, 沈劍 申請人:上海森雄科技實業(yè)有限公司