專利名稱：改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法。
背景技術(shù)：
1956年singer和plotz開始使用直徑為微米級的粒子，通過附著在膠乳粒子上的抗原或者抗體與血清中的抗體或抗原進行定性的玻片凝集法檢測一些存在于體液中的微量被測物，主要包括類風(fēng)濕，前白蛋白，黃體酮等。隨著粒子合成技術(shù)的發(fā)展，粒子直徑由微米級提高到納米級，同時粒子表面可以根據(jù)需要進行一些特殊的處理，產(chǎn)生活性基團，納米級的粒子被應(yīng)用于免疫比濁測定中，開發(fā)出一系列定量測定的診斷試劑，包括類風(fēng)濕，抗O，Lp(a)，尿微球蛋白，前白蛋白，C反應(yīng)蛋白，黃體酮，β2微球蛋白，肌鈣蛋白，糖化血紅蛋白等。隨著臨床檢測要求的提高，國內(nèi)外已廣泛采用膠乳增強試劑對微量蛋白進行定量測定。
膠乳增強法是一種新的臨床診斷方法，通過將抗原或者抗體與膠乳粒子進行共價交聯(lián)后與對應(yīng)的抗體或者抗原進行抗原抗體反應(yīng)，大幅度增強了普通免疫法的靈敏度，比普通免疫比濁至少提高一個數(shù)量級，可以達到放射免疫測定法(RIA)的水平，但沒有放射污染，操作簡單，可以用普通生化分析儀進行測定，符合現(xiàn)代臨床檢驗的要求，實現(xiàn)了一些低含量物質(zhì)的定量測定。由于使用了膠乳顆粒，并在顆粒上結(jié)合了蛋白，形成的膠乳增強粒子體積通常為0.05～0.5um，但是，它們在溶液中是以懸浮狀態(tài)存在，并不能在溶液中長期穩(wěn)定，所以必須解決膠膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法，它在對生物體液樣本進行定量測定以及分析樣本中的分析物濃度時處于穩(wěn)定狀態(tài)，可以使臨床診斷試劑測量結(jié)果重復(fù)性更好，并且不會出現(xiàn)存放一定時期的試劑底部出現(xiàn)少量沉淀，空白升高等問題。
本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供了一種改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法，用于臨床診斷試劑的配制，其特征在于該試劑溶液中加入0.1～2％的封閉劑和2～20％的穩(wěn)定劑。
在上述試劑中，封閉劑指多種封閉蛋白，包括白蛋白，凝膠蛋白等；穩(wěn)定劑指特殊的調(diào)節(jié)密度的物質(zhì)，包括甘油，蔗糖等，調(diào)節(jié)密度為1.01～1.09g/ml。
上述試劑中，所述封閉劑最佳濃度為0.3％～1.2％。
上述試劑中，所述穩(wěn)定劑最佳濃度為6～10％。
上述試劑中，所述穩(wěn)定劑調(diào)節(jié)的最佳密度為1.03～1.07g/ml。
本發(fā)明基于下列原理本發(fā)明主要應(yīng)用于使用膠乳增強法的臨床診斷試劑的穩(wěn)定，其實質(zhì)就是通過調(diào)節(jié)試劑的密度，并使用封閉蛋白保證粒子所帶電荷一致均勻，使得膠乳離子能夠穩(wěn)定的長期懸浮。已知結(jié)合蛋白后的膠乳粒子并不是完全被蛋白封閉的，需要使用一定量對反應(yīng)影響很小的水容性強，帶電荷比較多的蛋白保證膠乳增強粒子充分的封閉和均一，這里使用的封閉蛋白包括白蛋白，凝膠蛋白等，含量一般為0.1～2％。調(diào)節(jié)密度主要使用相對惰性的物質(zhì)甘油和蔗糖，含量一般為2～20％，由于膠乳粒子本身的密度一般為1.05g/ml，所以需要調(diào)節(jié)密度最佳為1.03～1.07g/ml，保證帶有均一電荷的粒子更容易長期穩(wěn)定懸浮存在。利用本發(fā)明配制的膠乳增強試劑在4℃貯存9～12個月后，仍能符合臨床要求，故在臨床檢驗學(xué)上有著廣泛的應(yīng)用前景。
本發(fā)明應(yīng)用于臨床診斷的試劑品種主要有類風(fēng)濕，抗O，Lp(a)，尿微球蛋白，前白蛋白，C反應(yīng)蛋白(包括普通增強和超敏)，黃體酮，β2微球蛋白，肌鈣蛋白，糖化血紅蛋白等，但不限于這些試劑，試劑通常是用蛋白進行封閉的，也包括一些非蛋白的封閉劑，封閉蛋白包括白蛋白，凝膠蛋白等，但不限于這幾種。調(diào)節(jié)密度物質(zhì)一般是相對惰性的物質(zhì)，通常是甘油，蔗糖等，但不限于這幾種。
在實施本專利時，根據(jù)檢測試劑的組成，合理組合合適的封閉劑與恰當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)密度的物質(zhì)，根據(jù)所要檢測對象使用的不同緩沖液，以反應(yīng)的要求不同來選擇不同濃度的封閉劑和調(diào)節(jié)密度物質(zhì)。
具體實施例方式
實施例一配制穩(wěn)定的膠乳增強法類風(fēng)濕試劑(RF)該試劑分A，B兩部分，使用時先將4份試劑A和樣品混合，37℃孵育300秒，再將一份試劑B加入，反應(yīng)300秒后，通過計算570nm下(或者600nm也可)終點和剛加入試劑B的時候的吸光度變化，對照校準品的吸光度變化，計算出樣本中類風(fēng)濕因子的含量。該計算可以在自動分析儀上自動進行。試劑配方如下膠乳增強粒子的制備準備好處理過的人IgG，0.124um帶活化基團的粒子(濃度10％mg/ml)，并配制好500mM的MES緩沖液(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid 106.7g/L)，去離子水。配制膠乳增強粒子如下加入含10％膠乳粒子的溶液 1ml500mM的MES溶液1ml人IgG 14mgEDAC(N-(3-dimethylaminopropyl)N’-ethylcarbodiimidehydrochloride)100mg去離子水加至10ml混勻3小時后離心去上清，加入如下緩沖液至40mlEDTA Na2 0.0298gBSA 0.4mg蔗糖 3.2mgPBS緩沖液pH＝8.0 100mM(Na2HPO4·12H2O 33.9155g/l，KH2PO40.721275g/lNaCl 8.8g/l)至40ml。
攪拌均勻即可獲得試劑B。
試劑APBS緩沖液pH＝8.0 100mMEDTA Na2 2mMPEG8000 2％BSA 1％試劑BPBS緩沖液pH＝8.0 100mMEDTA Na2 2mMBSA 1％蔗糖 8％膠乳增強粒子 0.25％上述試劑A和B為配制溶液的各組分濃度，可根據(jù)具體的溶液量折算各組分的量。
配制好的試劑放置4℃貯存1，3，6，12月后，測量同一份標準質(zhì)控血清，其變異度＜5％實施例二配制穩(wěn)定的膠乳增強法C反應(yīng)蛋白試劑(CRP)該試劑分A，B兩部分，使用時先將4份試劑A和樣品混合，37℃孵育300秒，再將一份試劑B加入，反應(yīng)300秒后，通過計算570nm下(或者600nm也可)終點和剛加入試劑B的時候的吸光度變化，對照校準品的吸光度變化，計算出樣本中C反應(yīng)蛋白的含量。該計算可以在自動分析儀上自動進行。試劑配方如下膠乳增強粒子的制備準備好處理過的C反應(yīng)蛋白抗體，0.201um帶活化基團的粒子(濃度10％)，并配制好500mM的MES緩沖液，去離子水。配制膠乳增強粒子如下加入含10％膠乳粒子的溶液 1ml500mM的MES溶液1mlC反應(yīng)蛋白抗體 21mg
EDAC 100mg去離子水加至10ml混勻3小時后離心去上清，加入如下緩沖液至40mlEDTA Na2 0.0298gBSA 0.36mg蔗糖 3.6mgPBS緩沖液pH＝8.0 100mM(同實例一)至40ml攪拌均勻即可獲得試劑B。
試劑APBS緩沖液pH＝8.0 100mMEDTA Na2 2mMPEG6000 2.4％BSA 1％試劑BPBS緩沖液pH＝8.0 100mMEDTA Na2 2mMBSA 0.9％蔗糖 9％膠乳增強粒子 0.25％上述試劑A和B為配制溶液的各組分濃度，可根據(jù)具體的溶液量折算各組分的量。
配制好的試劑放置4℃貯存1，3，6，12月后，測量同一份標準質(zhì)控血清，其變異度＜5％。
實例三利用本發(fā)明配制的膠乳增強試劑與普通溶液條件下保存的膠乳增強粒子進行對比研究(本處膠乳增強粒子對比使用的是實例一中制備的RF膠乳增強粒子)，結(jié)果如下封閉蛋白 調(diào)節(jié)密度溶液10.1％BSA 無溶液20.3％BSA 無溶液31％BSA 無溶液42％BSA 無溶液50.1％BSA 蔗糖5％溶液60.1％BSA 蔗糖8％溶液70.1％BSA 蔗糖12％溶液8 0.3％封閉蛋白 蔗糖8％溶液91％封閉蛋白蔗糖8％溶液102％封閉蛋白蔗糖8％測量時使用分光光度計，空白為試劑A和試劑B按4∶1混合，加樣品為生理鹽水時的吸光度。把0時間測定的初始吸光度定為100％(初始吸光度Abs這里為0.7211)，把校準品吸光度作為100％(這里選擇的靶值為150U/L的校準品，初始吸光度變化ΔA為1.0278)表1實際測量的空白吸光度和相對靶值的百分比(％)如果不加封閉蛋白，膠乳粒子一周后全部沉淀并分層，所以下表對照研究至少使用0.1％的封閉蛋白。

上表結(jié)果表明，在僅加0.1％封閉蛋白并不調(diào)節(jié)密度的情況下，膠乳增強粒子很不穩(wěn)定，同時測量空白吸光度可以看到明顯的空白吸光度增加，這是由于膠乳粒子發(fā)生凝聚所引起的。溶液2～4是加封閉蛋白的梯度，可以看到1％左右最佳，高于2％以后明顯的空白比較高，低于0.2％的時候，效果也不是很明顯。溶液5～7是調(diào)節(jié)密度后的結(jié)果，高于8％以后雖然同樣對膠乳增強粒子穩(wěn)定效果很好，但從實際應(yīng)用角度考慮，只需要選擇能達到效果的最合適濃度即可，也就是調(diào)節(jié)密度到適合膠乳增強粒子穩(wěn)定的密度即可，稍微多一些幾乎不影響穩(wěn)定性。通過封閉蛋白封閉和調(diào)整密度相對不進行穩(wěn)定的膠乳粒子穩(wěn)定性都有非常明顯的提高。溶液8～10是同時進行了調(diào)節(jié)密度和封閉蛋白的對比，當(dāng)使用1％封閉，含8％蔗糖的溶液中，12月后空白吸光度只增加了9％，同時校準品的吸光度變化僅僅下降了8％。實際應(yīng)用中可以根據(jù)使用的不同直徑，密度的粒子，以及粒子上包含不同量的蛋白，調(diào)整最佳的封閉蛋白濃度和調(diào)節(jié)最佳密度。
因而，利用本發(fā)明技術(shù)配制的膠乳增強試劑在4℃貯存9～12月后，仍能符合臨床檢驗的要求。
權(quán)利要求
1.一種改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法，其特征在于在配制的診斷試劑溶液中加入0.1～2％的封閉劑和2～20％的穩(wěn)定劑。
2.一種改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法，其特征在于在配制的診斷試劑溶液中加入0.3～1.2％的封閉劑和6～10％的穩(wěn)定劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法，其特征在于加入封閉劑和穩(wěn)定劑之后的診斷試劑溶液的調(diào)節(jié)密度為1.01～1.09％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法，其特征在于加入封閉劑和穩(wěn)定劑之后的診斷試劑溶液的調(diào)節(jié)密度為1.03～1.07％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法，其特征在于其中所述的封閉劑為白蛋白或凝膠蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法，其特征在于其中所述的穩(wěn)定劑為甘油或蔗糖。
7.一種權(quán)利要求1所述的改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法在類風(fēng)濕、抗O、LP(α)、尿微球蛋白、前白蛋白、C反應(yīng)蛋白、黃體酮、β2微球蛋白、肌鈣蛋白或糖化血紅蛋白診斷試劑液配制中的應(yīng)用。
全文摘要
一種改進膠乳結(jié)合的抗原或抗體粒子穩(wěn)定性的方法，用于臨床診斷試劑的配制，其特點是在該試劑溶液中含0.1～2％的封閉劑和2～20％的穩(wěn)定劑。封閉劑為多種封閉蛋白，包括白蛋白，凝膠蛋白等；穩(wěn)定劑指特殊的調(diào)節(jié)密度的物質(zhì)，包括甘油，蔗糖等，調(diào)節(jié)密度為1.01～1.09g/ml。本發(fā)明對使用膠乳增強法的生物體液診斷試劑可以確保穩(wěn)定性，在臨床檢驗學(xué)上，有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/531GK101046473SQ20061002535
公開日2007年10月3日 申請日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者范小建 申請人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團)股份有限公司, 上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司