專利名稱：單胺氧化酶診斷試劑盒及單胺氧化酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧 化酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，測定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有熒光法、免
疫抑制法和化學(xué)分光光度法。熒光法是以e -苯乙胺作為底物來檢測單胺氧化
酶，其依據(jù)是e-苯乙胺在10 100mg時反應(yīng)速度最大，高于芐胺和5-羥色 胺的反應(yīng)速度。免疫學(xué)方法則利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應(yīng)， 測定反應(yīng)后形成的單胺氧化酶同工酶，目前應(yīng)用較多的單克隆抗體有 MAO-A3C9、 MAO-A4F10、 MAO-A7B10、 MAO-A7E10和MAO國BlC2等。
相對而言，化學(xué)分光光度法應(yīng)有更為普遍?？梢杂脝伟费趸复呋奉?釋放出的過氧化氫(H202)去氧化10-N-甲基氨基甲?；?3， 7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)等發(fā)色劑進(jìn)行測定，也可以應(yīng)用芐胺(Benzylamine)、 對苯甲胺-P-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、 P-苯 乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine，又稱"3-對羥基苯乙胺"， 3-parahdroxyphenylethylamine)、 5國羥色胺(5-hydroxytryptamine)等作為反應(yīng) 底物來測定單胺氧化酶的活性。其中，應(yīng)用苯甲胺類型底物測得的單胺氧化 酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、3-苯乙基胺作底物測得的活 性約為3-對羥基苯乙胺作底物的30%。目前，單胺氧化酶測定多用芐胺和對 苯甲胺-P -偶氮萘酚作為底物。芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生 成芐醛，然后在強堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應(yīng)，生成醛苯腙， 這在生化儀上測定較困難；對苯甲胺-P -偶氮萘酚方法則需要用環(huán)乙烷提取， 限制了該方法的實用性，且不能應(yīng)用全自動生化儀分析。

發(fā)明內(nèi)容
5本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定單 胺氧化酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的單胺氧 化酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動 生化分析儀上進(jìn)行單胺氧化酶活性濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高， 因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測定方法原理如下
胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨離子+
過氧化氫
過氧化氫+氨離子+ 2-酮戊二酸谷氨酸氧化酶L-谷氨酸+
氧+水
L-谷氨酸+水+輔酶谷氨酸脫氫酶氨離子+ 2-酮戊二酸酯+
還原型輔酶
這種方法應(yīng)用單胺氧化酶(Monoamine oxidase; EC 1.4.3.4; EC 1.4.3.6) 酶(偶)聯(lián)谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11)、谷氨酸 脫氫酶(Glutamate dehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4丄3)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān) 測法。單胺氧化酶酶解胺類化合物反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合谷 氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰) 還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在 340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測 算單胺氧化酶的活性濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷試劑較為 理想
緩沖液100 mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
谷氨酸氧化酶6000 U/L
谷氨酸脫氫酶12000U/L
胺類化合物6 mmol/L
酮戊二酸12 mmol/L
氯化銨8 mmol/L
本發(fā)明的單胺氧化酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、胺類化合物、 酮戊二酸、氯化銨。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶。 輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨在
試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶。 輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨在
試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定單胺氧化酶活性濃度的方法，其 輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實施例一
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為單試劑，包括-
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
谷氨酸氧化酶 6000 U/L
谷氨酸脫氫酶 10000 U/L
胺類化合物 6 mmol/L
酮戊二酸 12mmol/L氯化銨 8 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，
加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度
《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑
的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左
右，檢測時間2分鐘左右，理論K值4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃
度大小。
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
胺類化合物
酮戊二酸
氯化銨
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
谷氨酸氧化酶
簡mmol/L 500 mmol/L 6000 U/谷氨酸脫氫酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度
《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑
1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大
約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃
度大小。
實施例三
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑
胺類化合物
酮戊二酸
氯化銨
50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L
12 mmol/L 8 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L
試劑3
10三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
谷氨酸氧化酶 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定單胺氧化酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反 應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右， 理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃 度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá) 到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.002;吸光度 時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線上升；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)200U/L; 試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過±5%;試劑測試的精密度(重復(fù)性) 的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.0003 ± 0.00015 AA/min/U/L ——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶活性濃度測定方法，其方法原理如下胺類化合物+水+氧 <u>單胺氧化酶</u> 相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨離子+過氧化氫過氧化氫+氨離子+2-酮戊二酸 <u>谷氨酸氧化酶</u> L-谷氨酸+氧+水L-谷氨酸+水+輔酶 <u>谷氨酸脫氫酶</u> 氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出單胺氧化酶的活性濃度大小測定結(jié)果。
2. —種單胺氧化酶診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000 mmol/L輔酶1_6 mmol/L谷氨酸氧化酶1000———80000 U/L谷氨酸脫氫酶IOOO-——80000 U/L胺類化合物1—50 mmol/L酮戊二酸1_50 mmol/L氯化銨1—50 mmol/L本發(fā)明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當(dāng)中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以下物質(zhì)之一芐胺、對苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、3-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。所述"氨離子"可以用氯化銨或其他胺鹽取代。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶組成。輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶組成。輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1一4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨 (Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、胺類化合物、酮戊二酸、氯化銨、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464392SQ20071019218
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司